アカハラダカハクビシン（Tachyglossus Aculeatus）の腸内細菌叢は妊娠期間を通じて安定性を示す

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微生物学オープン第12巻第6号e1392
原著論文
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アカハラダカハクビシン（Tachyglossus Aculeatus）の腸内細菌叢は妊娠期間を通じて安定性を示す

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mbo3.1392

イシニ・ブトゥガムワ、ジェーン・C・フェネロン、アリス・ローザー、ヘイリー・メール、スティーブン・D・ジョンストン、アシュリー・M・ダンガン
https://doi.org/10.1002/mbo3.1392
について
セクション

図解抄録
ハリモグラの糞便微生物叢は、糞便と卵の両方が肛門を通過する際に微生物の垂直伝播の機会を提供する。ここでは、メスのハクビシンの腸内／糞便微生物叢の特徴を明らかにし、妊娠に伴って微生物叢に生じる可能性のある変化について理解を深める。その結果、ハリモグラのマイクロバイオームは、オスとメスで微生物相組成に有意な差があるものの、異なる妊娠ステージにおいても安定していることがわかった。

詳細不明
概要
固有の腸内微生物群集（マイクロバイオータ）は健康に重要な役割を果たしており、特に妊娠中の母親と胎児にとって重要であると考えられる。ハリモグラのような単孔類は、卵を産んで孵化させ、卵は袋の中で孵化し、そこで子供が餌を食べるように進化してきた。糞便と卵はともに肛門を通過するため、ハリモグラの雌の糞便微生物叢は、子孫に微生物を垂直伝播させる機会となる。ここでは、メスのハクビシンの腸内／糞便微生物叢の特徴を明らかにし、妊娠を経たメスの微生物叢に起こりうる変化について理解を深める。メスのハリモグラ4頭とオスのハリモグラ5頭の糞便サンプルをクイーンズランド州のカランビン野生動物保護区から入手し、細菌群集構造を評価するために塩基配列を決定した。25のコアバクテリアを同定し、そのほとんどがオスとメスのサンプルに存在した。Fusobacterium属、Bacteroides属、Escherichia-Shigella属、Lactobacillus属などは、性別や妊娠ステージに関係なく一貫して多く、オスとメスのサンプルでそれぞれ58.00%と56.14%のリードを占めた。ハリモグラのマイクロバイオームは、オスとメスで微生物相組成に有意な差が見られたものの、異なる妊娠ステージにおいても安定していた。本研究は、生殖期を超えたハクビシンのマイクロバイオーム組成を初めて明らかにしたものであり、この新しい情報を健康状態の指標として用いることで、微生物叢の異常が引き金となる疾患の発見に役立てることができる。

1 背景
ハリモグラ（Tachyglossus aculeatus）はオーストラリアで最も広く生息している在来哺乳類で、単弓目（Monotremata）に属する（Pierce et al.、2007）。オーストラリアで有名な産卵哺乳類は、伝統的なアボリジニ文化において重要な役割を担っており（Nicol, 2022）、「ビギビラ」（Gamilaraay）、「ワンダヤリ」（Wiradjuri）、「ククラ」（Banbai）、「イワタ」（Nganyaywana）、「ガワーン・ガワ」（Woiwurrung）、「ジェナ・ジェナ」（Yugambeh-Bundjalung）といった先住民の呼び名がある。しかし、英語名はギリシャ神話に登場する「怪物の母」（Hesiod & Evelyn-White, 1914）である「エキドナ」に由来する。

ハリモグラは現存する5種の単弓類のうちの1種で、3種のハシナガハクビシンとカモノハシを含む（Nicol, 2017）。ハリモグラは主に蟻食性で、アリとシロアリを主食とするが、甲虫やミミズ、様々な昆虫の幼虫など他の無脊椎動物も食べることが記録されている（Griffiths & Greenslade, 1990; Perry et al., 2022）。

単孔類はおよそ1億8400万年前に真獣類の哺乳類から分岐し、独自の生殖サイクルを発達させた（Zhou et al.、2021）。ハリモグラの交尾期は6月上旬から10月にかけてで、メスは複数の交尾に参加することができる（Morrow et al.） ハリモグラの胚発生は、子宮内での妊娠期間が約16～17日間である（Dutton-Regester, Roser, Meer, Russell, et al., 2023）。Dutton-Regester, Roser, Meer, Russell, et al. (2023)による最近の研究では、妊娠期間中のハクビシンのプロゲステロンプロファイルが記録されており、そのレベルは通常交尾後12日頃にピークに達し、排卵に近づくにつれて基礎レベルまで着実に下がり始めることが明らかになった。妊娠末期、ハリモグラは革質の卵を産み、その卵は一時的な袋に入れられ、妊娠中に能力を発達させる。孵化したばかりのハリモグラの子どもは袋の中でさらに10週間発育を続け、母乳を吸う（Wallage et al.） この時期が過ぎると、子ガメは袋の中では大きくなりすぎるため、巣穴の中に残され、5～6日おきに母親がエサを食べに戻りながら、さらに約100日間成長を続ける（Morrow et al.）

他のオーストラリア固有種（Blyton et al., 2023; Burke et al., 2018; Cheng et al., 2015; Dungan & Thomas, 2023）と比較して、ハクビシンの腸内細菌叢を調査した研究はほとんどない。ハクビシンの腸内に見られる細菌群集の組成や機能性についてはほとんど知られておらず、野生および飼育下のハクビシンの腸内微生物組成全体を評価した研究が1件発表されているだけである（Perry et al.）

哺乳類では、妊娠中の母親の腸内細菌叢の変化を追跡することが重要である。出産時の垂直伝播は、子孫が初期の微生物群集を受け取る主な方法だからである（Nyangahu et al.） 単孔類の解剖学的特徴として、泌尿器系、排便系、生殖系に単一の管（肛門）が存在することが挙げられる（Graves, 1996）。このことは、卵と糞便が同じ開口部を通過することを意味し、微生物の垂直伝播の機会を提供する。これは、いくつかの爬虫類（Bunker et al. さらに、胎盤哺乳類や妊娠とマイクロバイオームに関する研究は、妊娠中に存在する微生物叢と妊娠転帰との相関関係を示唆している（Giannellaら、2023に総説あり）。腸内微生物組成がハリモグラの妊娠ステージによってどのように変化するかを理解することで、新たな情報が得られるだけでなく、これらのデータを母体と胎児の健康データと組み合わせることで、健康と妊娠の相関関係を確立することができる。この情報は、妊娠中の腸内微生物異常によって引き起こされる病気を早期発見するための健康状態の指標として使用できるため、保護管理者や保護区のスタッフにとって貴重な情報となる（DiGiulio et al., 2015; Galley et al., 2023; Gorczyca et al., 2022; Jost et al., 2014; Nyangahu et al., 2018）。

本研究は、非繁殖個体に加え、妊娠期と孵卵期にわたる細菌群集組成をマッピングすることで、妊娠期にわたるハクビシンの腸内細菌叢の最初のプロファイルを確立することを目的とする。本研究では、飼育下のハリモグラの腸内で見られるコアバクテリア分類群に関する追加情報を提供し、ハリモグラのメスとオスの腸内細菌叢の比較データを提供する。具体的には、以下の仮説を検証した：(i) 飼育環境が同じであり、繁殖期以外の食餌も同じであるため、腸内細菌叢組成はメスとオスで変化しない、(ii) 腸内細菌叢組成は胎盤哺乳類のホルモンレベルに影響されるため、妊娠期間を通じて変化する（Mallott et al.）

2 方法
2.1 動物の飼育とサンプル採取
成熟したハリモグラ (T. aculeatus) はオーストラリア、ゴールドコーストのカランビン・ワイルドライ フ・サンクチュアリ (CWS; 28.1356° S, 153.4886° E) で飼育繁殖プログラムの一環として飼育管理された (繁殖センターは Dutton-Regester, Roser, Meer, Russell, et al. [2023] に記載されている)。これらのハリモグラは飼育下と長期間野生で捕獲されたものが混在していたため、それぞれの正確な年齢は不明であった。全ての動物はビーフミンチをベースとした餌で飼育された(Jackson, 2007)。11月から3月の間、全てのハリモグラに1頭あたり100gの飼料を毎日与えた。4月から10月にかけては、メスの餌にハエの蛹とオリーブ油を加え、1頭あたり150gに増量した。また各囲いには赤外線動体検知監視カメラ（ソニー製CCD赤外線カメラ、#KTC-79C 4.3mmレンズ）を一般囲いに、KOBI製CCD赤外線ドームカメラ（#K-57HCD 4.3mm固定レンズ）を各穴箱内に取り付けた（Dutton-Regester, Roser, Meer, Russell, et al., 2023; Wallage et al., 2015）。

本研究のサンプルは2021年のハリモグラ繁殖期に採集された。2021年6月から10月までの間、主要な繁殖イベントを確認するため、ビデオ監視で継続的に モニターされたハリモグラの雌（n = 4）と雄（n = 5）から毎日糞便サンプルを採集した。これらのイベントの時期（交尾や産卵など）を既存の文献（Dutton-Regester et al. オスとメスのハリモグラが同じ囲いの中にいるとき、交尾中の糞便をさらに識別するため、オスに はクロマケーキグリーンの水溶性着色料（Baking Pleasures）を餌の20gに混ぜて与えた(Dutton-Regester, Roser, Meer, Renfree, et al., 2023; Dutton-Regester, Roser, Meer, Russell, et al., 2023)。糞便サンプルが存在する場合、サンプルはラベル付きプラスチック製ジップロックバッグに入れられ、後の処理のために-20℃で保管された。

2.2 メタバーコード化サンプルの調製
このプロジェクトで使用した糞便サンプルは、ドライアイスでCWSからメルボルン大学に送られた。メス4頭（n = 154）とオス5頭（n = 26）から採取したサンプルのサブセットを処理し、 可能な限り2日目ごとのデータを得た。到着後、各サンプル100-200 mgを秤量し、滅菌した2 mLチューブに入れた。秤量した検体からFastDNA SPIN Kits (MP Biomedicals) を用いてDNAを抽出した。抽出ブランク（n = 8）および鋳型なしPCR陰性（n = 4）を対照とした。抽出したDNAとコントロールは、細菌16S rRNA遺伝子のV4領域をターゲットとする配列決定アダプター（下線部）付きプライマー：515F（5′-GTGACCTATGAACTCAGGAGTCGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′[Caporaso et al、 2012］）および806R（5′-CTGAGACTTGCACATCGCAGCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′［Caporasoら、2011］）。これらのプライマーは、Earth's microbiomeのプロトコルに対応し、他のオーストラリア原産および蟻食動物のマイクロバイオーム研究（Briceら、2019；Perryら、2022；Zhangら、2021）と比較できるように選択した。Dunganら、2021）に従い、配列決定のためのライブラリーを調製した。簡単に説明すると、3連PCRは、1μLの鋳型DNA、7.5μLの2×MyTaq HS Mixポリメラーゼ（Bioline）、0.45μLの10μMフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および15μLの無核水から構成された。サーマルサイクラーは、1サイクル×95℃、3分、18サイクル×95℃、15秒、55℃、30秒、72℃、30秒、1サイクル×72℃、7分、4℃に設定した。アガロースゲル電気泳動でDNA抽出の成功を確認した。

Nucleomag NGS Clean-up and Size Select beads (Scientifix)を用いて、各PCR産物プール20 µLをサイズセレクションにより精製した。精製したDNAを40 µLのヌクレアーゼフリー水に懸濁した。10μLの精製DNAと10μLの2×MyTaq HS Mixポリメラーゼ（Bioline社製）、1μL（5μM）のフォワードおよびリバースインデキシングプライマーを組み合わせてインデキシングPCRを作成した。サーマルサイクラーは、1サイクル×95℃、3分間、24サイクル×95℃、15秒間、60℃、30秒間、72℃、30秒間、1サイクル×72℃、7分間、4℃で保持に設定した。ランダムに選んだサンプルのサブセットについて、アガロースゲル電気泳動で産物のサイズを確認した。各反応から5 µLをプレートごとにプールし（3プール）、50 µLの最終ビーズクリーンアップを行うことで、シーケンスライブラリーを作成した。各ライブラリーの質と量をチェックし（2200 TapeStation；Agilent Technologies）、プールの正規化を行った後、オーストラリアのメルボルンにあるWalter and Eliza Hall Instituteでv3（2×300bp）試薬を用いてIllumina MiSeqを1回シーケンスした。

2.3 メタバーコードデータの処理と解析
データ解析はDungan et al. 簡単に説明すると、生の16S rRNA遺伝子配列をQIIME2 v2021.11 (Bolyen et al., 2019)にインポートし、そこで配列を非多重化し、cutadapt v2.6 (Martin, 2011)を用いてプライマーを除去した後、データをフィルタリング、ノイズ除去、キメラチェック（DADA2を使用；Callahan et al., 2016）してASVを生成した。各ASVの分類は、配列決定の対象となった同じV4領域に対してナイーブベイズ分類器で学習させたSILVAデータベース（バージョン138）に対して割り当てた（Bokulich et al.） QIIME2において、PyNAST法（Caporaso et al.、2010）を用いてASVを整列させ、中点ルーティングにより系統樹を作成した。

すべてのデータはR（v4.2.1; Team RC, 2019）で解析した。ASV、分類、メタデータ、系統樹ファイルをRにインポートし、phyloseqオブジェクト（McMurdie & Holmes, 2013）に統合した。汚染ASVを同定し、Rパッケージdecontamのp = 0.1 (Davis et al., 2018)のprevalenceメソッドを用いて、サンプルに対する抽出およびPCR陰性対照での存在量に応じてデータセットから順次除去した。

性、妊娠期、個体が細菌群集に及ぼす影響を評価するため、細菌のα多様性を調査した。Rパッケージvegan（Oksanen et al., 2020）を用いて、観察されたASV数、シャノン指数およびシンプソン指数を算出した。次にα多様性データを、Rパッケージnlme（Pinheiro et al.、2017）を用いて、性、繁殖ステージ、または個体を固定効果として線形モデルを用いて解析した。事後比較はRパッケージemmeans (Searle et al., 1980)のTukeyの正直有意差検定を用いて行った。棒グラフは、ggplot2（Wickham, 2020）を用いて、相対的な存在量に基づいて属レベルで分類群を集約して作成した。

β多様性は加重ユニフラック距離行列を用いて評価し、検定で有意差が認められた場合はPCoAを用いてデータを可視化した。群（性、繁殖期、個体）間の群集組成の差は、Rのveganパッケージ（Oksanen et al., 2020）のadonis（PERMANOVAの修正版）を用いて計算し、RパッケージのpairwiseAdonis（Arbizu, 2019）の関数 "pairwise.adonis "を用いてボンフェローニ補正後のホック一対比較を決定した。特定グループと有意に関連するASVは、特異度（サンプルが対象グループに属する確率）と忠実度（対象グループに属するサンプルでASVを見つける確率）パラメータを0.7に設定したindicspecies関数multipatt（Cáceres & Legendre, 2009）を用いて同定した。全体的な微生物相組成を可視化するバープロットは、ggplot2（Wickham, 2020）を用いて、相対的な存在量に基づいて属レベルで分類群を集約することで作成した。

3 結果
3.1 細菌のメタバーコーディング
全エキドナ糞便サンプル（n = 180）、抽出ブランク（n = 8）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）陰性コントロールサンプル（n = 4）において、細菌16S rRNA遺伝子のV4領域から4.2Mリードを得た。フィルタリング、ノイズ除去、キメラ除去を行った結果、340万リードが残り、サンプルは平均17,197リード（最小20リード、中央値14,927リード、最大99,248リード）で、Silva v138データベースを用いて1967個のアンプリコンシーケンスバリアント（ASV）が分類された。Decontamにより、PCR増幅（n = 10、総リードの0.87%）およびDNA抽出（n = 14、総リードの0.09%）から24の潜在的なコンタミが同定され、これらはデータセットから除去された（表A1）。抽出ブランク、PCR陰性、および1000リード未満の2サンプル（男性1サンプル、女性1サンプル）をデータセットから除去した結果、178サンプルで1608のASVが得られ、Rで下流解析を行った。

3.2 豊富な微生物相とコア微生物相
4つの門がハリモグラのマイクロバイオームの95%以上を占めている： バクテロイ ドータ（Bacteroidota）、フィミキューテス（Fimicutes）、フソバクテリオータ（Fusobacteriota）、プロテオバクテ リア（Proteobacteria）、デサルフォバクター（Desulfobacterota）である（図A1）。Fusobacterium属、Bacteroides属、Escherichia-Shigella属、Lactobacillus属などは、性別や妊娠ステージに関係なく一貫して多く、オスとメスのサンプルでそれぞれ58.00%と56.14%のリードを占めた（図1）。オスとメスの集団から得られた最も豊富な20個のASVのうち、14個は共有されていた（表A2）。25のコアASV、すなわち各妊娠ステージまたは性別のサンプルの少なくとも70%において相対存在度が0.01%以上のASVが同定された（表A2）。コアマイクロバイオームメンバーは、男性サンプル（n = 26）ではリードの49.76%、女性サンプル（n = 164）ではリードの52.23%を占め、最も豊富なASVのうち20種が含まれていた。10個のASVが男性のみのコアまたは上位20個のASVの一部であることが判明し、これらの10個は男性の微生物叢の10.79％を占めた（表A2）。

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3.3 α多様性とβ多様性
α多様性解析の前に、データを3590リードに希釈した。これにより138個のASVが解析から除外されたが、追加サンプルはなかった。性別や妊娠期にかかわらず、α多様性指標に有意差は見られなかった（図2）。

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図2
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加重ユニフラック距離行列は、ステージ（メス標本のみ）、性別（全標本）、動物（全標本）について分散の均一性の仮定を棄却できなかったため、この距離行列を並べ替え分散分析（PERMANOVA）に使用した。雌のサンプルでは、β多様性に対する生殖ステージの有意な影響は認められなかったが（p > 0.05）、雄と雌のサンプル間で細菌群集構造に有意な差が認められた（F(1,176) = 2.97, p = 0.009）。各動物間の微生物相の違いを分析するPERMANOVAでは、有意な組成の違いが示された（F(8,169) = 2.27, p = 0.005）が、一対比較では、Bonferroni補正p値でどの動物の組み合わせでも違いは見られなかった。雌雄による標本のβ多様性を可視化するために、同じ重み付けをしたUnifracの序列を用いた主座標分析（PCoA）を作成した（図A2）。

3.4 指標種の分析
PERMANOVAの結果に基づき、ASVの出現・豊度とハリモグラの性別との関係の強さと統計的 有意性を評価するために指標種分析を行った。最小陽性予測値0.7、感度0.7を用い、雄サンプルに関連する2つのASVを同定した： ASV024、Lactobacillus sp.（雄で1.48%、雌で0.58%、p = 0.002）とASV040、Bacteroides sp.（雄で0.70%、雌で0.30%、p = 0.001）である（表A2）。これら2つのASVはハリモグラに関連する優勢な細菌属のメンバーであるが、BLASTnの結果から、他の豊富なLactobacillus属やBacteroides属のASVと比較すると、ユニークな種である可能性が示唆された。雌のサンプルでは指標となるASVは同定されなかった。

4 結論
4.1 ハリモグラのマイクロバイオームにおける一貫したメンバー
コアASV（サンプルの少なくとも70%において相対存在量が0.01%以上のASV）はオスとメスで一貫性があり、25のコアASVが同定された。これらのASVのうち合計14種がオスとメスの両方で最も豊富な20種に含まれており（表A2）、これらの属の多く、Fusobacterium属、Bacteroides属、Lactobacillus属はオーストラリアの他の在来動物でも見つかっている（Chong et al.） コアラやワラビーのようなオーストラリア原産動物も、子育てのために袋を使用するが、腸内微生物の構成は似ており、特にラクトバチルス属を含む門であるファーミキューテス門（Chong et al. 我々のサンプルにこれらの属が多く含まれていることは、オーストラリア国内の他の動物園で発見された他の飼育下のハクビシンの腸内細菌叢組成と一致しており（Perry et al.

パンゴリン、オオアリクイ、ツチブタなど、アリやシロアリを主食とする他の食肉性生物にも同様の細菌門構成が見られることから（Delsuc et al.、2014；Zhang et al.、2021）、これらの主要細菌の存在は驚くべきことではない。

ハダカデバネズミは、アリ、シロアリ、時にはコガネムシの幼虫を主食として進化してきた動物であり、オーストラリアで2頭しかいない食虫哺乳類のうちの1頭である。アリやシロアリの外骨格はキチン質でできており、これはアミノ多糖類である。しかし、本研究のサンプルから同定されたバクテロイデスなどの特定の細菌群は、キチン・ポリマーを消化器系で処理可能なキチンオリゴマーに代謝できると考えられている（Beier & Bertilsson, 2013; Zhang et al.） 本研究で分離された細菌群の機能解析は行わなかったが、他の哺乳類食虫類におけるバクテロイデスの存在（Borrelli et al., 2017; Delsuc et al., 2014; Ma et al., 2018; Zhang et al., 2021）に基づいて、我々のハクビシンのサンプル内の分離株も、キチンの処理でハクビシンの消化器系を助けている可能性がある。別の食蟻性哺乳類である野生のスンダセンザンコウ（Manis javanica）の腸内微生物組成を調べたところ、ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属に属する細菌が最も多く同定された（Zhang et al.）

しかし、他の食蟻性哺乳類の結果と比較した場合、本研究で用いたハクビシンの腸内細菌叢には2つの顕著な違いがある。フソバクテリウム（Fusobacterium）属の細菌は我々のサンプル内では非常に豊富であるが、パンゴリンやツチブタなどの他の食肉哺乳類ではほとんど見られない（Delsucら、2014；Maら、2018；Zhangら、2021）。また、ほとんどの哺乳類では一般的に存在しないか存在量が少なく、ヒトで発見された場合、通常は大腸がんと関連し、日和見病原体とみなされる（Han, 2015; Ley et al.） しかし、フソバクテリウムは最近、動物園で飼育されている健康なハクビシンや、野生のハクビシン の腸内細菌叢で高い頻度で同定された (Perry et al., 2022)。これらの結果と一致し、本研究で使用したサンプルも健康なハクビシン候補から採取したものであることから、フソバクテリウムはハクビシンの中でより通性的な役割を担っている可能性が示唆された。フソバクテリウムは、ハゲワシや健康な飼い犬など、他の健康なスカベンジャーからも分離されている（Roggenbuck et al.） 腸内常在微生物としてのフソバクテリウムの役割を理解するためには、健康なハクビシンのフソバクテリウムの機能的特性を理解するためのさらなる努力が必要である。

野生個体群と比較して、飼育下における腸内細菌叢の一般的なパターンは、α-多様性が減少し、群集組成が大きく変化している（Dallas & Warne, 2023）。飼育下における多くの条件（抗生物質への曝露、食餌組成の変化、均質な環境、ストレスの増加、種内相互作用の変化）は、宿主に関連するマイクロバイオームの変化を引き起こすと考えられる。その結果、野生のハリモグラでは優勢であったアシネトバクター属が、飼育下のハリモグラには含まれていないことがわかった。） アシネトバクター属は土壌細菌として広く生息しており、ハリモグラが餌を捕食する際に摂取する可能性が高いことから、ハリモグラのマイクロバイオーム内にアシネトバクター属が出現することが予想される（Jung & Park, 2015; Perry et al.） しかし、摂食戦略は野生動物施設によって異なり、ハリモグラの土壌摂取量は制限される可能性がある。このように、微生物相の研究は保全と管理のアプローチに役立つ。我々は、飼育下のハリモグラが土の微粒子を摂取できるような給餌を行うことで、より野生個体 に近いマイクロバイオームを得ることを提案する。

4.2 雄と雌のマイクロバイオームの構造は大きく異なる
10種のASVが、雄サンプルにのみ存在する20種の最も豊富なASV、雄のコアマイクロバイオーム、指標となる分類群、またはそれらの組み合わせに属するものとして同定された。これら10種のASVは、女性サンプルにも存在する属（Bacteroides属とLactobacillus属）と、男性のみに存在すると思われるCetobacterium属とStreptococcus属から構成されている。ASV024は、そのサンプルが男性由来であることを示す分類群であり、男性に最も多く存在するASVの上位20種の1つであったが、Lactobacillus gallinarumに最も近縁であった。L. gallinarumは、マウスの腸内細菌叢に存在すると腸腫瘍の成長を遅らせることが認められており、ブロイラー鶏にプロバイオティクスとして与えるとサルモネラ菌感染を防ぐことができる（Nevelingら、2020；Sugimuraら、2021）。男性サンプルの他の指標分類群であるASV040は、ほとんどがBacteroides sartoriiに近縁であった。

Cetobacterium（ASV015）は、非常に豊富なFusobacteriumと同様にFusobacteriaceaeの一員であり、陸上動物の腸内細菌叢内では一般的ではないが、Tasmanian devils（Cheng et al., 2015）やカモノハシ（Dungan & Thomas, 2023）など他のオーストラリア固有哺乳類で見つかっている。この属は炭水化物やペプチドの発酵を助けることができ、哺乳類では生産できないヘモグロビンやミオグロビンの成分であるヘムの生合成に不可欠なビタミンB12を生産することが示唆されている（Bhuteら、2020；Suzukiら、2022）。一方、レンサ球菌 (ASV022)はハリモグラの病気に関連している (McOrist & Smales, 1986)。

繁殖期（5月末～10月）には、全ての雌のハリモグラにオリーブオイルとハエの蛹を与え、雄には牛ミンチベースの餌のみを与え続ける。食事は哺乳類における腸内／糞便微生物叢の形成に重要な役割を果たす（David et al., 2014）ため、この調整がハリモグラのオスとメスの微生物叢組成の有意差の原動力となっている可能性は大いにある。オスとメスのサンプル間の腸内微生物群集の違いは、他の種でも珍しいことではなく、マウスやヒトの研究（Kim et al.、2020；Org et al.、2016；Yurkovetskiy et al.、2013）でも個体の性別による腸内微生物相の有意差が観察されており、性ホルモンの違いによって説明されている（Kim et al.、2020）。エストロゲンなどの性ホルモンは細菌の代謝を調節し、食物の消化を助けることができる（Yoon & Kim, 2021）。オスマウスのテストステロン源を除去した結果、オスマウスがテストステロンを産生する能力を失うと、その腸内細菌叢はメスマウスの細菌叢に類似し始めた（Kim et al.） この結果は、ホルモン源を欠く雄マウスに再びテストステロンを投与すると逆転し、雄と雌の間に有意な差が確立された（Org et al.） したがって、本研究における腸内微生物の性差は、性ホルモンの影響によって説明される可能性がある。特に、雌のハリモグラはサンプリング時点において様々な妊娠時期にあり、そのため雄と比較してプロゲステロンやエストロゲンなどの雌性ホルモンに多くの変動があると考えられる(Yoon & Kim, 2021)。

4.3 ハリモグラのマイクロバイオームは妊娠期を通して安定している
妊娠中、ハリモグラは胎児の成長に最適な環境を提供するために様々な適応を行う。このような変化には全ての微生物も関与しており（Giannella et al., 2023）、我々はモニタリングした5つのステージ（非繁殖期、妊娠前、妊娠初期、妊娠後期、孵卵期）において、組成（β多様性）と多様性（α多様性）が安定していることを明らかにした。妊娠期間中の腸内細菌叢組成に関するヒトや動物の知見は様々であり、安定性を報告する研究もあれば（DiGiulioら、2015；Dunlopら、2019）、妊娠ステージ間で大きな変動を観察する研究もある（Korenら、2012；Sunら、2020）。また、健康な女性の周産期（乳児の出産の前後1年間）にわたる腸内細菌叢の安定性を示す証拠もあり、その細菌叢は特にバクテロイデス属とファーミキューテス属が優勢である（Giannella et al., 2023; Jost et al., 2014）。前述の研究で報告された大型胎盤哺乳類の妊娠期間とは異なり、ハクビシンの妊娠期間は交尾後に始まり、産卵まで〜17日間続く（Dutton-Regester et al.） ハリモグラの腸内細菌叢は変化するのに十分な時間がなかった可能性がある。食事は、ハリモグラを含む哺乳類の腸内/糞便微生物叢の形成に重要な役割を果たす（David et al. カランビンの雌のハリモグラの食性はサンプリング期間中安定しており、これが腸内細菌叢の相対的な安定性に寄与している可能性がある。

4.4 ハクビシンの腸内細菌の共進化
妊娠期間を通じてハクビシンの腸内細菌叢が比較的安定していることから、豊富な細菌 群は時間の経過とともにハクビシンと共進化したと考えられる。腸内細菌組成の変化は、栄養状態やその後の健康状態に影響を及ぼす可能性のある、生物の消化機能の変化に起因すると考えられている（Amato, 2013）。腸内細菌組成の変化は、食事などの環境要因に大きく影響され、これらの栄養素を最もよく処理する特定の細菌群の蓄積につながる（den Besten et al.） 本研究では、一般的な土壌細菌であるフソバクテリウムやバクテロイデスといった非常に豊富な細菌群集が、妊娠期間を通じて一貫して豊富に存在し、同様の微生物群集パターンがハクビシンのサンプル全体で観察された。このように複数のサンプルに一貫して細菌群集が存在することは、ハクビシンの仲間であるハリモグラとその非常に豊富な腸内細菌群集との共進化、ひいては系統共生の可能性を示唆しているのかもしれない（Brooks et al.） 野生および飼育下のハクビシンについて行われた以前の研究でも、これらの細菌群集の豊富さが確認されており、宿主に関連した細菌群集が宿主の進化と並行した軌跡をたどっている可能性を裏付けている(Brooks et al., 2016; Perry et al., 2022)。ハクビシンの腸内細菌叢の共進化経路を追跡するためには、さらなるサンプリングと研究が必要であるが、本研究の結果は、この概念をさらに発展させるための第一歩を提供するものである。微生物生態学とハリモグラの繁殖に関する今後の研究では、交尾の直前と直後のオスとメスの微生物相を追跡し、これらの行動がどのように細菌群集組成に影響されるのか、あるいは影響されるのかを理解することが有益であろう。

5 結論
マイクロバイオームは動物生理学の重要な要素であり、種の保存におけるその役割は拡大され、将来の管理方法のレパートリーに含まれるべきである（Dallas & Warne, 2023）。本研究は、妊娠期間を通じたハクビシンの微生物叢に関する新たなデータを提供し、飼育下のハクビシンの腸内細菌叢は妊娠期間を通じて比較的安定しており、中心的な細菌であるフソバクテリウム属、バクテロイデス属、ラクトバチルス属は各ステージにおいて一貫して豊富であることを明らかにした。野生のハリモグラの腸内では一般的であるアシネトバクターが、飼育下のハリモグラにはいないことが重要である (Perry et al., 2022)。このような腸内細菌叢の安定性は、特に飼育環境において、細菌群集組成を健康状態の指標として利用し、細菌叢異常の同定を通じて病気の発見に役立てる機会を提供する。飼育下で生じる問題を最小限に抑えるためには、食餌の多様性を高める、自然環境のリザーバーに暴露する、プロバイオティクスを投与するなどの方法により、微生物の多様性と組成を野生個体群と同等になるように操作する努力が必要である（Dallas & Warne, 2023）。

著者の貢献
イシニ・ブトゥガムワ 概念化（支持）；データキュレーション（同等）；正式分析（同等）；執筆-原案（同等）。ジェーン・C・フェネロン Jane・C・Fenelon: 概念化(均等); 執筆-校閲・編集(均等)。アリス・ローザー 調査（支援）；執筆-校閲・編集（支援）。ヘイリー・メール 調査（支援）、執筆・校閲・編集（支援）。スティーブン・D・ジョンストン 概念化（支援）、資金獲得（同程度）、調査（同程度）、リソース（同程度）、執筆-校閲-編集（同程度）。Ashley M. Dungan： 概念化（主導）、正式解析（同等）、資金獲得（主導）、調査（同等）、監修（同等）、可視化（同等）、原案執筆（同等）、執筆-校閲-編集（同等）。

謝辞
本研究で使用したハリモグラの糞便は、元々Yugambeh族の土地で採集されたものである。私たちは、この美しい生き物を通してだけでなく、彼らの生きた経験、存在論、認識論、公理論から構築された「糸」を通して、彼らがこの研究に貢献してくれたことに感謝する。先住民の知識は私たちの学習と知識の基礎であり、この研究にインスピレーションを与え、導いてくれた。企画段階で助言をいただいたマリリン・レンフリー教授、グラフィックを手伝っていただいたローラ・ガイスラー氏に感謝する。本研究は、Environmental Microbiology Researcher Initiative Grant（A.M.D.へ）、Australian Research Council（ARC LP160101728、S.D.J.へ）、Microbiology Australia Summer Scholarship（I.B.へ）の助成を受けた。

利益相反声明
申告なし。

倫理声明
本研究はクイーンズランド大学動物倫理委員会（SAFS/334/17）の承認を得た。野生のハクビシンはクイーンズランド州政府EPA科学目的許可証（WISP153546614）に基づき入手・飼育した。

付録
表 A1 および A2、図 A1 および A2 を参照のこと。

表A1. Rパッケージdecontam（Davis et al., 2018）の有病率法を用いて、抽出ブランク（n = 14; 総リードの0.09%）およびPCR陰性対照（n = 10; 総リードの0.87%）から合計24種の潜在的汚染物質を同定した。
ASVソース 門 科 属 属 相対存在量(%)
Contam01 PCR Proteobacteria Halomonadaceae Halomonas 0.37
Contam02 PCR Proteobacteria Halomonadaceae Halomonas 0.23
Contam03 PCR Proteobacteria Moraxellaceae アシネトバクター属 0.05
Contam04 PCR Proteobacteria Moraxellaceae アシネトバクター 0.04
Contam05 PCR Proteobacteria Erwiniaceae パントエア 0.01
Contam06 PCR Proteobacteria シュードモナス科シュードモナス属 0.002
Contam07 PCR Proteobacteria シュードモナド科シュードモナス属 0.05
Contam08 PCR Actinobacteriota ノカルジア科ロドコッカス属 0.05
Contam09 PCR Proteobacteria Sphingomonadaceae スフィンゴモナス属 0.0003
Contam10 PCR Firmicutes Staphylococcaceae ブドウ球菌科 0.07
Contam11 Extraction Firmicutes Butyricicoccaceae UCG-008 1E-05
Contam12 抽出 Proteobacteria Moraxellaceae アシネトバクター 0.009
Contam13 抽出 Proteobacteria Erwiniaceae Pantoea 0.003
Contam14 抽出 Proteobacteria Pseudomonadaceae シュードモナス属 0.0003
Contam15 抽出 Proteobacteria Pseudomonadaceae シュードモナス属 0.02
Contam16 抽出 バクテロイド門 プレボテラ科プレボテラ属 0.0002
Contam17 抽出 Proteobacteria Sphingomonadaceae スフィンゴモナス科 不明 0.02
Contam18 抽出 Proteobacteria Sphingomonadaceae スフィンゴモナス属 0.01
Contam19 抽出 Proteobacteria Sphingomonadaceae スフィンゴモナス属 0.0007
Contam20 抽出 Proteobacteria Xanthobacteraceae ブラジリゾビウム 0.0004
Contam21 抽出 Proteobacteria Beijerinckiaceae メチロバクテリウム属 0.02
Contam22 抽出 Proteobacteria Beijerinckiaceae メチロバクテリウム属 0.0003
Contam23 抽出 Proteobacteria Rhodobacteraceae パラコッカス属 9E-05
Contam24 抽出ファーミキューテス Peptostreptococcales-Tissierellales Peptoniphilus 0.0009
注：除去前の全データセットにおける各ASVの相対存在量（％）を最後の列に報告する。
略号 ASV、amplicon sequencing variant; PCR、polymerase chain reaction。
表A2. SILVA v138データベース（Phylum, Family, Genus）とNCBIデータベース（BLASTn）に基づく分類学的分類 雄と雌のハリモグラ糞便サンプルの指標種分析で同定された最も豊富な20のASV（Top20）、コア分類群、ASV。
ASV分析 性別 門 科 属 属 BLASTn トップヒット 雄の相対存在量(%) 雌の相対存在量(%)
ASV001 Top20/コア分類群 共に Fusobacteriota Fusobacteriaceae Fusobacterium Fusobacterium mortiferum 10.07 8.96
ASV002 Top20/コア分類群 ともに バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス属 Massiliensis 6.91 6.41
ASV003 Top20/コア分類群ともに バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス属 Bacteroides dorei 4.17 7.73
ASV004 Top20/コア分類群 ともに Proteobacteria 腸内細菌科 Escherichia-Shigella Pseudescherichia vulneris 4.11 2.54
ASV005 Top20/Core Taxa 両方 Firmicutes 乳酸桿菌科 Lactobacillus Lactobacillus agilis 2.63 1.93
ASV006 Top20/Core Taxa Both バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス属 B. dorei 1.26 2.48
ASV007 Top20/コア分類群とも フソバクテリウム科フソバクテリウム属 F. mortiferum 1.61 2.00
ASV008 Top20/コア分類群 ともに バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス属 テタイオタオミクロン 1.77 2.02
ASV009 Top20/コア分類群 雌 バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス属 アシディファシエンス 0.86 1.87
ASV010 Top20/コア分類群 ともに Proteobacteria モルガネラ科 Proteus属 Proteus mirabilis 1.04 2.38
ASV011 Top20/コア分類群 女性 フソバクテリウム科フソバクテリウム属 Fusobacterium perfoetens 0.58 1.73
ASV012 Top20/Core Taxa とも Proteobacteria 腸内細菌科 不明 Enterobacteriaceae エンテロバクター・ホルマエケイ 2.54 1.37
ASV013 Top20/コア分類群ともに 固形細菌 ペプトストレプトコッカス科 ペプトクロストリジウム Clostridium hiranonis 1.53 1.60
ASV014 Top20/コア分類群とも バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス・チモネンシス属 1.47 1.27
ASV015 Top20 オス フソバクテリウム目 フソバクテリウム科 セトバクテリウム属 Cetobacterium somerae 4.40 0.57
ASV016 Top20/コア分類群 女性ファーミキューテス Lachnospiraceae Blautia Blautia schinkii 0.34 1.22
ASV017 Top20 女性 Proteobacteria 腸内細菌科 不明 腸内細菌科 Citrobacter freundii 0.52 1.33
ASV018 Top20/コア分類群ともに 固形細菌 アシダミノコッカス科 ファスコラクトバクテリウム Phascolarctobacterium faecium 0.87 1.03
ASV019 Top20/コア分類群 Firmicutes Lactobacillaceae 乳酸桿菌科 Lactobacillus gasseri 2.05 0.99
ASV020 Top20/コア分類群 雌性プロテオバクテリア モルガネル科 プロビデンシア属 Providencia vermicola 0.30 1.10
ASV021 Top20/コア分類群 女性 バクテロイドータ タンネレラ科 パラバクテロイデス属 Parabacteroides distasonis 0.65 0.84
ASV022 Top20/コア分類群 男性 固結性連鎖球菌Streptococcaceae Streptococcus equinus 0.92 1.05
ASV023 Top20/コア分類群 雄性バクテロイデス門 バクテロイデス科 バクテロイデス属 rodentium 0.96 0.58
ASV024 Top20/指標生物種 雄性ファーミキューテス ラクトバチルス科 ラクトバチルス・ガリナラム 1.48 0.58
ASV025 Top20 男性 固形桿菌科乳酸桿菌属 ラクトバチルス・ロイテリ 1.01 0.37
ASV026 Top20 男性 バクテロイデス門 バクテロイデス科 バクテロイデス属 クララス 0.46 0.22
ASV027 中核分類群 固体菌類 Butyricicoccaceae Butyricicoccus pullicaecorum 0.20 0.21
ASV028 中核分類群 双方 Desulfobacterota Desulfovibrionaceae Desulfovibrio Desulfovibrio piger 0.19 0.21
ASV029 コア分類群 双方 Proteobacteria Sutterellaceae Parasutterella Parasutterella secunda 0.25 0.30
ASV030 中核分類群 雄性バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス属 faecichinchillae 0.17 0.35
ASV031 中核分類群 双方 バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス属 luti 0.11 0.34
ASV032 Core Taxa Male Firmicutes Lachnospiraceae 不明 Lachnospiraceae Clostridium methoxybenzovorans 0.40 0.77
ASV033 Core Taxa Firmicutes Lachnospiraceae 未知 Lachnospiraceae Faecalimonas umbilicata 0.47 0.77
ASV034 中核分類群 硬菌類 双方 Erysipelatoclostridiaceae Erysipelatoclostridium Clostridium saccharogumia 0.51 0.33
ASV035 中核分類群 固形物雄性 ラクトバチルス科 ラクトバチルス属 ムササビ 0.50 0.52
Lachnoclostridium Enterocloster clostridioformis 0.29 0.30
ASV037 中核分類群 両方 バクテロイデス門 バルネシエラ科 バルネシエラ属 コプロバクター・ファスティディオサス 0.61 0.38
ASV038 Core Taxa 硬菌類 Erysipelotrichaceae Dielma Dielma fastidiosa 0.17 0.17
ASV039 中核分類群 雄性固形菌類 不明乳酸桿菌綱 不明乳酸桿菌綱 Enterococcus sulfureus 0.49 0.53
ASV040 指示物質種 雄性バクテロイデス目 バクテロイデス科 バクテロイデス属 sartorii 0.70 0.30
注：男女両方のサンプルでASVが同定された場合は、性別を両方と記載した。男性および女性サンプルにおける各ASVの平均相対存在量（％）を最後の2列に示す（Davis et al.）
略号： ASV、amplicon sequencing variant。
詳細は画像に続くキャプションに記載
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