鎌状赤血球病マウスにおけるSCFA/GPR41/IGF1経路を介した糞便微生物叢移植による骨量減少の改善効果
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公開日：2022年11月30日
鎌状赤血球病マウスにおけるSCFA/GPR41/IGF1経路を介した糞便微生物叢移植による骨量減少の改善効果
Liping Xiao, Yanjiao Zhou, ...Marja Hurley 著者を表示する。
Scientific Reports 12巻 記事番号: 20638 (2022) この記事を引用する
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指標詳細
概要
鎌状赤血球症（SCD）では骨量減少がよく見られるが、その分子メカニズムは不明である。血清のインスリン様成長因子1（IGF1）は、SCD患者およびSCDマウスで低値であった。SCDにおける骨量低下に伴うIGF1の低下が、腸内細菌叢によるSCFA産生の低下に起因するかどうかを明らかにするために、健常対照（Ctrl）マウスとSCDマウスの間で相互糞便微生物叢移植（FMT）を実施した。大腿骨のuCTおよび組織形態学的解析により、SCDマウスの骨量/総量（BV/TV）、海綿体数（Tb.N）、骨芽細胞表面/骨表面（Ob.S/BS）、鉱化表面/骨表面（MS/BS）、ラベル間厚（Ir.L.Th）減少が、Ctrl便を投与後著しく改善することが示された。SCDマウスの骨形成遺伝子Alp, Col1, Runx2, Dmp1は有意に低下しており、Ctrl糞からのFMT後に回復した。SCDマウスの糞便を移植すると、糞便中の酪酸、バレレート、プロピオン酸の濃度が上昇した。SCDマウスの脛骨におけるG共役タンパク質受容体41および43（GPR41およびGPR43）のmRNAの減少、骨および血清におけるIGF1の減少は、Ctrl糞からのFMT後、部分的に回復した。これらのデータは、Ctrlマウスの健康な腸内細菌叢が、障害された細菌代謝物SCFAsに応答してIGF1を調節することにより、SCD骨量減少に対して保護的であることを示している。
はじめに
SCDは世界で最も一般的な遺伝性疾患である1。骨粗鬆症や低骨密度（BMD）、骨減少症は、小児および成人の鎌状赤血球患者によく見られる合併症である2。骨関節の合併症は通常、死亡に至ることはありませんが、長期障害、骨折、慢性疼痛など、かなりの病的状態に陥ります3,4,5,6,7。成人の鎌状赤血球患者の80%はBMDが低い。SCDにおける低BMDは、閉経状態、性別、年齢などの通常の危険因子とは無関係であるため、SCDにおける骨量減少の原因は一般集団とは異なっています8。しかし、ヒトのSCDにおける骨量減少のメカニズムについては、十分に検討されていない。
微生物叢は、常在微生物、共生微生物、病原性微生物からなる生態学的共同体である9。腸内細菌叢には、細菌、真菌、ウイルス、古細菌が含まれる10。腸内細菌（100兆個以上）には、29の細菌門から約1000種が含まれています10。腸内細菌叢は、難消化性多糖類の分解、腸の健全性の強化または腸上皮の形成、エネルギーの採取、病原体からの保護、宿主免疫の調節などの役割を担っており、宿主の健康にとって非常に重要である11,12。マイクロバイオータ・ディスバイオーシス（バランスの悪い腸内細菌叢）は、炎症性腸疾患、糖尿病、肥満などの疾患と関連しています13,14,15,16。最近の腸内細菌叢解析研究により、ヒトのSCDにおけるdysbiosisが明らかになりました17。Frenetteのグループの研究では、腸内細菌叢が炎症に関連した肝臓や脾臓の損傷を媒介する好中球の老化を制御すること18、SCDマウスにおける心理的ストレスによる炎症を制御すること19が明らかにされた。我々は、抗生物質による腸内細菌叢の枯渇が、鎌状赤血球症マウスの骨量減少を一部改善することを発表しており20、腸内細菌叢とSCDにおける骨量減少の関連性を示唆している。
特定の代謝産物の産生や共生分子パターンに対する宿主応答の誘導を通じて、微生物叢は宿主の生理機能に影響を与える可能性がある21,22,23,24,25,26。短鎖脂肪酸（SCFAs）は、主に未消化の食物炭水化物から大腸で生成される細菌発酵産物であり、末梢の制御性T細胞の増加、感染防御、エネルギー恒常性及び代謝率の調節など、宿主免疫システムの成熟に関与してきた22,23,24,25,26。SCFAsは、破骨細胞（OC）および骨芽細胞（OB）の機能を直接制御することができる27。また、SCFAsはインスリン様成長因子1（IGF1）の産生を調節し、その後骨の成長に影響を与えることができる21。SCD患者では血清IGF1が減少していた28。我々は、SCDマウスの力学的特性および骨量の低下が、血清および骨中のIGF1の低下、骨芽細胞末端分化マーカー遺伝子の発現低下と関連していることを報告した29。腸内細菌叢の異常が骨量減少につながり、その中で繰り広げられる作用がSCFAやIGFの変化と関連していることは既に確立されているが、SCD患者やSCDマウスにおけるSCFAレベルに関する研究は発表されていない。SCDにおけるIGF1の減少が、腸内細菌叢を介したSCFA産生の減少によるものかどうかは不明である。
ヒトの微生物叢は、骨の質の低下と関連する多くの状態に影響を与えることが示されている30,31。骨の健康を制御する腸内細菌叢の強力な役割を考慮し、我々は微生物異常にSCDマウスの骨病変が寄与していると仮定した。具体的には、健常対照（Ctrl）マウスの健康でバランスのとれた腸内細菌叢は、細菌の代謝物SCFAsに応答して骨成長因子IGF1の産生を変えることにより、SCD関連骨損失からの保護を与えることを提案した。本論文では、腸内細菌叢の異常がSCDマウスの骨量減少に寄与しているという新しい知見を報告する。さらに、腸内細菌叢の異常はSCFA産生の低下と骨および血清中のIGF1の減少を引き起こすことを示した。また、CtrlマウスからSCDマウスへの糞便微生物叢移植（FMT）により、SCDによる骨芽細胞機能障害と骨量減少が抑制されることを明らかにした。
材料と方法
マウス
C57BL/6;129バックグラウンドのTownes鎌状赤血球マウスおよびCtrlマウスは、Jackson Laboratoryから入手した（ストック番号：013071）。Townes鎌状赤血球マウスモデルはユニークで、SCD32のヒトで見られる主要な特徴を示す。このモデルは、ヒトのα-グロビン遺伝子とβ-グロビン遺伝子をマウス遺伝子座にノックインしたものである。鎌状赤血球形質（ヘテロ接合体、AS）マウスの交配により、Ctrl（健常、AA）およびSCD（ホモ接合体、SS）の同腹子を作製することができる。雄マウスと雌マウスの両方を使用し、性別ごとに独立した解析を行った。動物を用いたすべての方法は、UConn Healthの規則とガイドラインに従い、ARRIVEガイドラインに準拠して実施された。UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee は、動物が関与するすべてのプロトコルを承認した。
糞便微生物群集の分析
3ヶ月齢のCtrlおよびSCD雌マウス（18-24匹/群）から糞便ペレットを採取した。ペレットは微生物群解析のために処理するまでディープフリーザー（-80℃）で保存した。ペレットは、微生物群集プロファイリングのためにStrainID Kit（Shoreline Biome）を用いて処理された。簡単に言うと、DNAをマウス糞便ペレットから精製し、StrainIDアンプリコンを調製し、製造者の指示に従って配列決定のためにプーリングした。プールしたDNAの品質（A260/A280比）と濃度は、Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA)で測定した。StrainIDアンプリコンには、16S rRNA遺伝子、隣接する内部転写スペーサー領域、23S遺伝子の一部を含む約2500 bpの領域が含まれる。SMRTbellTM のライブラリープレパレーションとシーケンシングは、デラウェア大学の PacBio Sequel II で行われました。円形コンセンサスリードはSBanalyzerを用いてAthena 16S-23S rRNAデータベースにマップされた。
糞便微生物叢移植(FMT)
FMT は、Ctrl マウスから SCD マウスへの移植は、Ctrl マウスの微生物叢が SCD 様の骨表現型を救済できるかどうか、SCD マウスから Ctrl マウスへの移植は、SCD マウスの微生物叢が Ctrl マウスに及ぼす病原性を検証するために実施された。RECIPIENTマウスをFMT用に準備するために、CtrlまたはSCD雌マウス（3ヶ月齢、10匹/群）を1時間絶食させた後、マウスに425g/Lの200μl PEG（polyethylene glycol, Macrogol 4000）を20分間隔で4回投与して腸管洗浄した33,34（腸粘膜のxenomicrobiotaコロニー形成を促進しFMT効率を高めるためにその腸内フローラの大部分を削除するため33,34）。下剤PEGによる腸内フローラの除去効率は、普遍的に保存されている16S rRNAを用いて常在菌の存在量を定量するRT-qPCRにより確認した（Supplemental Fig.1 ）。DONOR糞便を調製するために、ドナーマウスから便サンプルを採取し、処理するまで-80℃で保存した。糞便微生物移植のための便の調製は、嫌気性フード下で行った。便サンプルは、滅菌した脳心筋梗塞（BHI）ブロスでホモジナイズした。BHIは、嫌気性ガス混合物N2/H2/CO2（90％：5％：5％）で脱気し、抗酸化剤0.1％L-システイン塩酸塩一水和物を添加して予備減菌した。さらに、0.45ミクロンフィルターを用いてろ過を行い、未溶解の粒子状物質を除去し、便懸濁液をFMT用のアリコートに保存した。FMTは、最後のPEG処理から4時間後にレシピエントマウスに経口投与して実施した。Ctrlの糞を受けたCtrlレシピエントおよびSCDの糞を受けたSCDレシピエントが対照である。FMTは週1回実施した。FMTの6週間後に骨サンプルを採取した。雄マウスでも同様のFMTを行った。
図1
図1
CtrlマウスとSCDマウスの微生物叢の構成と相互のFMT。(A-D）CtrlマウスとSCDマウスは、それぞれ異なる微生物叢を有している。3ヶ月齢の雌マウスから糞便を採取した。(A）アンプリコンシークエンスバリアント（ASV）のNMDSプロットは、2つのグループからのサンプルが別々にクラスター化しており、2つの異なる微生物叢が存在することを示している。(B,C）ASVの解析から、SCDマウスでは（B）α-diversity（C）β-diversityが有意に増加することが示された（n = 17-18マウス/グループ）。(D)上位25ファミリーの相対的存在量。データは全細菌数に対する平均値（%）。(E) 健常なCtrlマウスの微生物叢がSCD関連の骨量減少を改善できるか、またSCDからCtrlマウスへのSCD微生物叢の病原性を調べるために、相互FMTのスキームを検討した。CtrlからSCDへのレシプロFMTを実施し、Ctrlの微生物叢がSCD関連の骨量減少を改善できるか、またSCDからCtrlへのSCDの微生物叢がCtrlマウスに与える病原性の影響を検討した。FMTのためのRECIPIENTマウスを準備するために、CtrlまたはSCD雌マウス（3ヶ月齢、10匹/群）を1時間絶食させた後、マウスに20分間隔で4回PEGを経口投与して腸管洗浄を行い、FMT効率を高めるために大部分の腸内細菌叢を除去した。DONOR糞便の調製は、年齢と性別を一致させたドナーマウス（8匹／遺伝子型）からマウス1匹あたり新鮮な糞便ペレットを採取し、プールした全糞便を2mlのPBSに溶解し、最後のPEG処理から4時間後に経口ガベージによりレシピエントマウスに投与した。Ctrlの糞便を投与したCtrlレシピエントとSCDの糞便を投与したSCDレシピエントが対照である。FMTはドナーマウスから採取した新鮮な糞を用い、週1回実施した。FMTの6週間後に骨サンプルを採取した。雄マウスにも同様のFMTを行った。 wo：週齢。(F)Ctrlマウスのベースライン時とSCDの糞を与えた後のα-diversityとβ-diversityのASVの解析、(H)SCDマウスのベースライン時とCtrlの糞を与えた後のα-diversityとβ-diversityの解析。
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マイクロCT (μCT)
マイクロCT（μCT40；Scanco Medical AG）は、皮質形態測定のために大腿骨の中骨幹部で、また海綿体形態測定のために遠位大腿骨の骨幹領域内で、我々の以前の発表29に記載されているように実施された。海綿体形態測定パラメータには、海綿体体積率（BV/TV）、海綿体間隔（Tb.Sp）、海綿体数（Tb.N）、海綿体厚（Tb.Th）などが含まれる。皮質形態計測には、皮質面積（Ct.Ar）、皮質厚（Ct.Th）、皮質面積率（Ct.Ar/Tt.Ar）、総面積（Tt.Ar）35の測定が含まれている。
骨組織形態計測
マウスにカルセインを 7 日前、キシレノールオレンジを 2 日前にそれぞれ腹腔内注射した。大腿骨は摘出し、10%ホルマリンで固定した。その後、大腿骨はPBSに溶かした30％スクロースに一晩浸し、Cryomatrixに包埋した。大腿骨の6μm縦断面を採取した。未染色の切片は動的パラメータ解析に使用した．追加の大腿骨切片は、酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（TRAP）染色に使用された。組織形態計測には、OsteoMeasure画像解析システム（R&M Biometrics社製）を使用した。使用した用語と単位は、米国骨代謝学会の組織形態学命名法委員会が推奨するものである36。鉱化面／骨面（MS／BS）、骨形成率（BFR）／BS、ラベル間厚さ（Ir.L.Th）、OC面（Oc.S／BS）、OC数／BS（N.Oc／BS）、OB面率（Ob.S／BS）が測定された。また、脱灰していない凍結切片をvon Kossa染色に使用した。
RNA解析
洗浄した脛骨からTrizol試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いてtotal RNAを抽出した。Super-Script™ First-Strand Synthesis Kit (Takara Bio USA Inc, Mountain View, CA, USA) を用いて一本鎖 cDNA を合成した。リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）には、iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix kit (BIO-RAD Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) を用いた。 β-actin は正規化および相対 mRNA レベルの算出に使用した37。プライマーの配列をTable 1に示す。
表1 RT-qPCRに使用したプライマー。
原寸表
SCFAアッセイ
CtrlまたはSCDの糞を受けたCtrlマウスおよびSCDマウスの糞便中のSCFAs濃度を、質量分析計検出器結合ガスクロマトグラフ（GC-MS）を用いて測定した。安楽死させた動物から糞便を採取し、直ちに-80℃まで凍結した後、Brigham & Women's Hospital の Massachusetts Host-Microbiome Center に輸送し、測定した。ヘプタン酸、プロピオン酸、酢酸、イソ酪酸、酪酸、カプロン酸、イソ吉草酸、吉草酸の9種類のSCFAが定量された。
ウェスタンブロット分析
フラッシュした脛骨を用い、1×radioimmunoprecipitation assay buffer (Cell Signaling)を用いてタンパク質の抽出を行った。同量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルにロードした。転写後、メンブレンを5％脱脂乾燥乳で1時間インキュベートし、ウサギ抗IGF1（Abcam）抗体とともに4℃で一晩インキュベートした後、抗ラビット二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。ブロットをSuper Signal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific) で現像し、ローディングコントロールとしてアクチン抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) で再プロービングした。
血清の測定
犠牲時に、凝固した血液から血清を採取した。血清IGF1は、マウス／ラットIGF1 Quantikine ELISAキット（R&D Systems, Inc）により、製造者の説明書に従って測定した。
統計解析
SPSSソフトウェアを用いてANOVA分析を行い、Tukeyを用いてポストホック多重比較を行った。統計的有意性はp < 0.05と定義した。マイクロバイオーム関連の統計はすべてRバージョン4.1.0を使用して実施した。CtrlマウスとSCDマウスのマイクロバイオーム全体の差はPERMANOVAで検定し、Non-metric Multi-dimensional Scaling (NMDS)で可視化した。微生物相のシャノン多様性は、wilcoxon signed-rank検定で検定した。多重比較のp値は偽発見率（FDR）で調整し、Padj < 0.05で結果を有意差とした。
結果
SCDマウスにおける腸内細菌叢組成の変化
腸内細菌叢の変化を評価するため、3ヶ月齢のCtrlおよびSCD雌マウス（18～24匹/群）から糞便ペレットを採取し、微生物群集のプロファイリングを行った。SCDマウスとCtrlマウスの腸内細菌叢プロファイルは、有意に異なることがわかった（図1A）。マイクロバイオーム多様性解析の結果、SCDではCtrlよりもαおよびβ多様性が有意に高かった（Fig.1B、C）。Familyレベルでは、糞便中の微生物叢組成がCtrlマウスとSCDマウスで顕著に異なっていた（Fig.1D）。SCDマウスでは、Family BifidobacteriaceaeとErysipelotrichaceaeの相対量がCtrlマウスに比べ有意に増加した。SCDマウスでは、Family Bacteroidia-unclassified、Clostridiales-unclassified、Oscillospiraceae、Ruminococcaceae、Muribaculaceaeの相対量がCtrlマウスと比較して有意に減少していることが示された。また、Ctrl マウスでは、Muribaculaceae（Bacteroidetes 属、S24-7、マウス腸内細菌、Homeothermaceae38 と呼ばれる）に属する細菌が最も多く含まれていた。ムリバクテリア科の多くの細菌がSCFA38,39の産生に関与していることから、これらの細菌はSCDにおける骨量減少の予防になる可能性がある。
μCTにより、SCDマウスの骨構造パラメータの障害は、CtrlマウスからFMTを受けることにより部分的に回復した。
FMTは、CtrlからSCDへ、Ctrlの微生物叢がSCD様骨表現型を救済できるかどうか、またSCDからCtrlへ、SCDの微生物叢がCtrlマウスに及ぼす病原性を検証するために行われた（図1E）。マイクロバイオーム多様性解析の結果、SCD糞便をCtrlマウスにFMTすると、移植前と比較してα多様性は増加したが、β多様性に変化はなかった（図1F,G）。また、Ctrlマウスの糞便をSCDマウスにFMTしたところ、糞便移植前と比較して、αダイバーシティには変化がなかったが、βダイバーシティは減少した（図1H、図1I）。Ctrlの微生物叢がSCD様の骨の表現型を救済できるかどうかを検証するために、FMT後6週目の大腿骨でuCT解析を行った。メスマウス（Fig.2）とオスマウス（Fig.3）の大腿骨のμCT解析では、SCDの糞便を得たSCDマウスはCtrlの糞便を得たCtrlマウスと比較して、骨量／総量（BV／TV）および海綿体数（Tb.N）の減少と、海綿体間隔（Tb.Sp）の増大が確認された。SCDマウスにCtrlの糞をFMTしたところ、SCDマウスのBV/TVとTb.Nは有意に増加した。一方、SCDの糞を受けたCtrlマウスでは、Ctrlマウスの糞を受けた場合と比較して、Tb.NおよびBV/TVが減少した。SCDレシピエントへのCtrl糞の移植はSCDマウスのCt.Ar, Ct.Ar/Tt.Ar, Tt.Arの減少に影響を与えなかった。SCD雄マウスのBV/TVとTb.Nの低下も、Ctrl雄マウスの糞便移植を受けると回復した（Fig.3）。また、Ctrl、SCDのどちらの糞も受けなかったSCDのみのマウスについてもμCT解析を行ったが、SCDのみのマウスとSCDの糞を受けたSCDレシピエントの間でBV/TVに差は見られなかった（データ未掲載）。
図2
図2
健康なCtrlマウスからの腸内細菌群の移植は、SCD雌レシピエントマウスの骨量減少を改善する。 CtrlまたはSCD雌マウスの糞を受けたCtrlおよびSCDレシピエント雌マウスの大腿骨のμCT解析。3ヶ月齢のCtrlおよびSCDレシピエントマウスに、CtrlまたはSCDドナーマウスから週1回FMTを実施。FMT後6週目にサンプルを採取した。(A)大腿骨遠位部海綿骨の代表的なμCT画像。(B) BV/TV, (C) BV, (D) TV, (E) Tb.N, (F) Tb.Th, (G) Tb.Sp, of metaphysis. (H)骨幹中央部の皮質骨の代表的なμCT画像。(I) 骨幹中央部のCtAr/TtAr, (J) Ct.Ar, (K) Tt.Ar, (L) Ct.Th. n = 9-10 マウス/グループ. データは個々のデータポイントのMean±SEMで示す。統計解析はSPSSを用いて行い、p値はTukeyのポストホック解析を用いた二元配置分散分析で算出した。*p < 0.05.
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図3
図3
健康なCtrlマウスからの腸内細菌群の移植は、SCD雄レシピエントマウスの骨量減少を改善する。 CtrlまたはSCD雄マウスの糞を受けたCtrlおよびSCDレシピエント雄マウスの大腿骨のμCT解析。3ヶ月齢のCtrlおよびSCDレシピエントマウスに、CtrlまたはSCDドナーマウスから週1回FMTを実施。FMT後6週目にサンプルを採取した。(A)大腿骨遠位部海綿骨の代表的なμCT画像。(B) BV/TV, (C) BV, (D) TV, (E) Tb.N, (F) Tb.Th, (G) Tb.Sp, of metaphysis. (H)骨幹中央部の皮質骨の代表的なμCT画像。(I) 骨幹中央部のCtAr/TtAr, (J) Ct.Ar, (K) Tt.Ar, (L) Ct.Th. n = 6- マウス/グループ. データは個々のデータポイントのMean±SEMで示す。統計解析はSPSSを用いて行い、p値はTukeyのポストホック解析を用いた二元配置分散分析を用いて算出した。*p < 0.05.
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SCDマウスの骨形成と骨吸収の骨組織形態学的パラメータの変化は、CtrlマウスからFMTを得た後、部分的に改善された
FMTが骨に及ぼす影響を構造レベルで明らかにするため、実験終了時に採取した大腿骨について骨組織学的検査を実施した。Von Kossa染色により、SCDの糞を受けたSCDマウスはCtrlの糞を受けたCtrlマウスに比べ海綿体が減少していたが、SCDマウスはCtrlの糞を受けると部分的に回復した（Fig. 4A）。骨芽細胞および破骨細胞の機能を細胞レベルで調べるために、骨組織形態計測を行った。動的骨組織形態測定では、SCDマウスにCtrl糞を与えた場合と比較して、Ir.L.Th、MS/BS、BFR/BSが減少し、これらのパラメータはCtrl糞を与えたSCDマウスで一部回復した（図4B-E）。骨芽細胞表面/骨表面（OS/BS）は、SCD糞を与えたSCDマウスではCtrl糞を与えたCtrlマウスと比較して低く、Ctrl糞からのFMTで部分的に回復した（図4F）。破骨細胞表面/骨表面（Oc.S/BS）および破骨細胞数/骨表面（N.Oc/BS）は、SCDの糞便を与えられたSCDレシピエントはCtrlレシピエントに比べて高く、Ctrl糞便からのFMTにより一部回復した（図4G,H）。これらのデータは、Ctrl糞からのFMTがSCDマウスの組織形態学的指標の異常を有意に減少させることを示唆している。
図4
図4
Ctrl糞のFMTは、SCDレシピエントマウスのいくつかの骨の表現型を救助した。骨の組織形態測定。3ヶ月齢のCtrlおよびSCD雌レシピエントマウスに、CtrlまたはSCDドナーマウスからのFMTを週1回実施した。FMT後6週間経過したサンプルを採取した。(A) von Kossa染色により、SCDマウスがCtrlマウスの糞を受けた場合に比べ、SCDマウスの糞を受けた場合の海綿体の減少を示し、SCDマウスがCtrlマウスの糞を受けた場合に一部回復していることがわかった。骨組織形態計測は単離大腿骨の骨幹で行った。(B)カルセインおよびキシレノールオレンジのラベル化により、SCDマウスがSCDの糞便を受けた場合、Ctrlマウスの糞便を受けた場合と比較して二重ラベル距離が減少し、これはSCDマウスがCtrlの糞便を受けた場合に一部救済されることが示された。(C) 骨形成率/骨表面 (BFR/BS), (D) ラベル間厚み (Ir.L.Th), (E) ミネラル表面/骨表面 (MS/BS), (F) OB表面/骨表面 (ObS/BS), (G) OC数/骨表面 (N.Oc/BS), (H) OC表面/骨表面 (OcS/BS).n = 9-10 mice/group. データは、個々のデータポイントの平均値±SEMで示す。統計解析はSPSSを用いて行い、p値はTukeyのポストホック解析を用いた二元配置分散分析で算出した。*p < 0.05.
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SCDマウスにおけるOBおよびOC関連遺伝子の発現の変化は、CtrlマウスからFMTを受けると部分的に救済された
Ctrlマウスの糞便を受けたSCDマウスの骨形成の改善が、OB形成およびOC分化遺伝子の変化と関連しているかどうかを評価した。フラッシュした脛骨のmRNAを定量的にPCRした結果、SCDマウスの糞便を摂取した脛骨軸では、Ctrlマウスの糞便を摂取した場合と比較して、骨形成マーカー遺伝子Alp、1型コラーゲン（Col1）、Osteocalcin（Ocn）、Dmp1 mRNAが著しく低下していることが判明した。骨吸収マーカー遺伝子Rankl/Opg比は、SCDの糞便を摂取したSCDマウスとCtrlの糞便を摂取したCtrlマウスで有意に増加した。SCDマウスにCtrl糞を移植すると、SCDマウスのAlp、Col1、Runx2、Dmp1の発現が有意に増加した。SCDの糞をCtrlマウスにFMTすると、Col1、Runx2、Ocnの発現が有意に低下し、Rankl/OPgが上昇した（図5）。これらの結果から、腸内細菌叢はSCDによる骨量減少のメディエーターであり、健康なCtrlマウスの腸内細菌叢はSCDマウスの骨量減少に対して保護的である可能性が示唆された。
図5
図5
CtrlおよびSCDレシピエントのフラッシュ脛骨における骨マーカー遺伝子のレベルに対するFMTの効果。3ヶ月齢のCtrlおよびSCD雌レシピエントマウスに、CtrlまたはSCDドナーマウスから週1回FMTを実施した。FMT後6週目にサンプルを採取した。洗浄した脛骨をRNA単離に使用した。以下の遺伝子発現について定量的リアルタイムPCR解析を行った：（A）Alp、（B）Col1、（C）Runx2、（D）Ocn、（E）Dmp1、および（F）Rankl／Opg。データは個々のデータポイントのMean±SEMとして示す。統計解析はSPSSを用いて行い、p値はTukeyのポストホック解析を用いた二元配置分散分析を用いて算出した。*p < 0.05.
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SCDレシピエントにおけるCtrl糞の移植により、減少したCecal SCFAが改善された。
SCDマウスではCtrlマウスに比べ、Muribaculaceae科の相対量が有意に減少している。これらの菌の多くはSCFA産生菌である38,39。FMTがSCFA産生を変化させるかどうかを調べるために、糞便中のSCFAs濃度を測定した。図6に示すように、SCDマウスの糞便を与えた場合、Ctrlマウスの糞便を与えた場合と比較して、糞便中のプロピオン酸が減少していた。SCDレシピエントにCtrl糞を移植すると、糞便中の酪酸、プロピオン酸、バレレートは有意に増加した。一方、SCDの糞をCtrlのレシピエントに与えると、酢酸とイソバレートの濃度が有意に減少した。
図6
図6
CtrlマウスおよびSCDマウスの糞便を摂取したレシピエントマウスの猫背部SCFAレベル。3ヶ月齢のCtrlおよびSCD雌レシピエントマウスに、CtrlまたはSCDドナーマウスからのFMTを週1回実施した。FMT後6週間目に糞便を採取し、GC-MSでSCFA濃度を測定した。(A）プロピオン酸、（B）酪酸、（C）バレレート、（D）酢酸、（E）イソバレレート n = 9-10 マウス/グループ。データは個々のデータポイントのMean±SEMで示した。統計解析はSPSSを使用し、p値はTukeyのポストホック解析を用いた二元配置分散分析で算出した。*p < 0.05.
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SCDマウスの水洗脛骨におけるGpr41およびGpr43 mRNAレベルの低下をCtrl糞の移植により改善した
Gタンパク質共役型受容体41（GPR41）、GPR43、GPR109はSCFAsの内因性受容体として同定されており40,41,42,43、破骨細胞と骨芽細胞の両方で見つかっているため44、フラッシュした脛骨のこれらのmRNAレベルを測定した。図7A-Cに示すように、SCDレシピエントがSCDの糞を受けた場合、41（GPR41）、GPR43、GPR109 mRNAレベルはCtrlの糞を受けたレシピエントに比べ、有意に低かった。SCDレシピエントへのCtrl糞の移植は、SCDマウスのGpr41およびGpr43 mRNAレベルを有意に改善した。
図7
図7
CtrlからSCDへのFMTにより、フラッシュ脛骨のGpr41およびGpr43 mRNAレベル、ならびに骨および血清中のIGF1レベルが回復した。3ヶ月齢のCtrlおよびSCD雌マウスに、CtrlまたはSCDドナーマウスからのFMTを週1回実施した。FMT後6週間後にサンプルを採取した。フラッシュした脛骨の(A) Gpr41, (B) Gpr43, (C) Gpr109, (D) Igf1 mRNAレベルについてqPCR分析を行った。(E）フラッシュした脛骨のIGF1タンパク質をウェスタンブロットで測定した。サンプルは、1グループあたり9-10匹のマウスからプールしたものである。切り取られていないウェスタンブロットを補足図2に示す。 F）血清中のIGF1レベルをELISAによって測定した。 n＝9〜10マウス／群。データは、個々のデータポイントの平均値±SEMとして示される。統計分析はSPSSを使用して行い、p値はTukeyのポストホック分析を伴う二元配置ANOVAを使用して算出した。*p < 0.05.
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Ctrl糞のFMTはSCDレシピエントマウスの骨と血清中のIGF1レベルを改善した
SCD患者28とマウス29の両方でIGF1レベルの減少が見られる。我々は腸内細菌叢の異常によるSCFAの減少を見出し（図6）、SCFAがIGF1産生を調節することが報告されている21ので、Ctrl糞の移植がSCD雌マウスのIGF1の減少を救うかどうかを検討した。図7D-Fに示すように、SCD糞を与えたSCDマウスでは、Ctrl糞を与えたCtrlマウスと比較して、フラッシュした脛骨および血清中のIGF1 mRNAおよびタンパク質レベルが有意に低下していたのに対し、SCDレシピエントにCtrl糞を移植すると骨中のIGF1レベルがCtrlマウスレベルにまで回復することが確認された。
考察
本研究では、腸内細菌叢の組成が顕著に変化することが示された。SCDマウスはCtrlマウスに比べ、ムリバクダ科の相対量が有意に減少していた。本研究は、腸内細菌叢が鎌状赤血球の骨量減少のメディエーターであることを初めて明らかにしたものである。また、SCDマウスでSCFAが減少していることを初めて報告した。特に、微生物叢の改変（FMT、微生物叢を有益なバランスに変えること）は、SCD誘発の骨量減少を有意に鈍化させた。また、健常者Ctrlの糞からのFMTにより、SCDマウスにおいて、減少した食道SCFAとその骨内受容体GPR41/43が改善し、それに伴って血清および骨内のIGF1が改善し、骨芽細胞の機能が改善することを実証した。
本研究では、Ctrlマウスにおいて、Muribaculaceae科が最も相対的に多い細菌科であることを明らかにした。SCDマウスでは、Family Muribaculaceaeの相対量がCtrlマウスと比較して有意に減少していた。これらの細菌は腸内細菌全体に占める割合が高く、Ctrlマウスでは45％、SCDマウスでは25％であり、SCDでは最も有意に減少した細菌科であった。(1)ムリバクラゲ科に属する多くの細菌はSCFAの産生に関与している38,39；(2)ムリバクラゲ科に属する分類群は腸管バリア機能45と正の相関を示し、腸管タイトジャンクションタンパク質レベルと有意な正の相関がある46；(3)ムリバクラゲ科は炎症性サイトカインレベルと負の相関も示した46から、SCDにおける骨欠損を予防できる可能性もある。SCDの骨量減少におけるプロバイオティクスとして使用できる細菌株を特定するために、さらなる研究が必要である。
マウスは FMT の前に下剤である PEG で処理された。これは、レシピエントマウスの腸内細菌叢を大きく枯渇させるために広く使用されている経済的なアプローチである。抗生物質のカクテルでマウスを治療することは、FMTの効率を高めるために腸内細菌叢を枯渇させるもう一つの方法である。しかし、抗生物質の投与は、SCDマウスの骨芽細胞に影響を与えることが示されている老化した好中球18を減少させるなど、複数の影響を及ぼす可能性がある47。我々は、PEG処理が我々の研究にとってより生理的に適切なモデルであると信じている。PEG処理は、腸内常在菌を減少させるのに使いやすい。抗生物質とは対照的に、PEGはマウスの腸内細菌叢の量を一時的に減少させる。また、腸内洗浄を行うことで、抗生物質と比較して、治療後も常在細菌を維持することができた33,48。SCDマウス由来の微生物叢を移植されたCtrlマウスは、移植前のマウスと比較して、α多様性が増加していることがわかった。これは、ベースライン時にSCDマウスで観察された高いα多様性と一致する。しかし、β多様性は移植前と移植後のCtrlマウスで同程度であった。SCDレシピエントでは、α多様性はCtrlマウス由来の微生物叢を移植する前のSCDマウスと統計的に同程度であったが、β多様性はCtrlマウス由来の微生物叢を移植する前のSCDマウスと統計的に同程度であった。しかし、SCDレシピエントマウスでは、糞便移植前に比べてβ多様性が減少しており、移植がSCDマウスの被験者間のばらつきを低減していることが示唆された。このことは、ベースライン時のCtrlマウスのβ多様性の低さとも一致する。これらの知見は、FMTがドナーの便中のαまたはβ多様性の表現型をうまく移したことを示唆している。他の研究により、SCFAが骨代謝に影響を与えることが示されている49。しかし、現在までのところ、SCFAレベルについて報告した研究や、SCD骨疾患におけるSCFAの役割に言及した研究はない。ここでは、FMTアプローチを用い、腸内細菌叢のSCFA産生がSCDマウスの骨量決定における重要なメディエーターであることを見出した。このように、SCFAはSCDの腸内細菌叢と骨のホメオスタシスを連動させていることがわかった。
SCFA は全身および局所の免疫機能に影響を与え、in vivo および vitro において骨吸収および破骨細胞分化を抑制することが報告されている49。このことと矛盾しないように、我々は健康なCtrlの糞からのFMTがSCDマウスの破骨細胞数の増加を救助し、SCDマウスの腸の炎症性サイトカインの増加を救助することを見出した（データは示されていない）。骨髄中のSCFA濃度はin vivoでの破骨細胞分化を直接阻害するのに十分な高さである49。GPR41、GPR43、GPR109はSCFAsの内因性受容体として見出されている40,41,42,43。SCFAsはGPRを活性化することにより、細胞に直接作用することができる50。さらに、SCFAである酪酸およびプロピオン酸は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤として作用することにより、GPRに依存しない作用を有する可能性がある51。破骨細胞前駆体はSCFAの受容体を発現しており、プロピオン酸や酪酸は破骨細胞の分化を直接阻害するが52、酢酸、プロピオン酸、酪酸の破骨細胞分化や骨吸収に対する抑制能はGPR41、GPR4349、GPR10952に依存しないと報告されている。したがって、SCD マウスにおいて FMT による SCFA 削減は、ヒストン脱アセチル化酵素を介して破骨細胞を直接活性化する可能性がある。今後、破骨細胞特異的GPR null SCDマウスを用いて、SCDにおけるSCFAの破骨細胞への直接的な影響を明らかにする研究が必要である。
IGF1 は、骨に対して内分泌作用とパラクリン/オートクリン作用の両方を持つ成長因子である21,53,54,55. 本研究では、SCDマウスにCtrlの糞便を投与したところ、骨芽細胞数、骨芽細胞活性、骨形成関連遺伝子が有意に改善し、これらはSCFAレベルおよびIGF1産生の改善に関連していることを見いだした。従って、IGF1の増加は、Ctrl糞を受けたSCDマウスの骨形成の改善に寄与していると考えられる。腸内細菌叢と酪酸ナトリウムが骨芽細胞前駆体に影響を与えることが報告されている56,57。SCDマウスにFMTを実施したところ、SCFA、GPR41、GPR43、IGF1が同時に変化したことから、SCFAの減少により骨でのGPR41/43の発現が低下し、それに伴いIGF1の産生が減少したことがSCDマウスの骨量低下の原因である可能性が示唆された。今後、骨芽細胞特異的GPR41/43欠損マウスを用いて、SCDにおける腸内細菌叢の変化から骨の変化へとつながるシグナル伝達軸へのこれらの受容体の関与について研究を進めていく予定である。
腸内細菌叢の性差に関する動物およびヒトの研究結果は一貫しておらず、腸内細菌叢に性差があることを示す研究もあれば、そのような性差がないことを示す研究もある58。他のグループによる動物およびヒトの SCD の微生物叢研究では男女両方が用いられているが17,59、 性に関連した腸内細菌叢の差は報告されていない。臨床において、男性のSCDは女性よりも鎌状赤血球の合併症を発症する可能性が2倍高いが、これは性ホルモンによる一酸化窒素(NO)の産生に一部起因している60。微生物叢が一酸化窒素を制御していることが知られている61。本研究では、16S rRNAの配列決定を雌マウスでのみ行ったため、SCDにおける腸内細菌叢が制御する骨の変化に対する性別の寄与の大きさは明らかでなく、本研究の限界である。
以上のことから、本研究では、SCDマウスの骨病変に微生物の異常が寄与していることを明らかにした。Ctrlマウスの健康な腸内細菌叢は、細菌代謝産物SCFAsの増加に応答して骨成長因子IGF1レベルを増加させることにより、SCD関連骨損失に対して保護的である。SCFAまたはSCFA産生プロバイオティクス/プレバイオティクスの治療的補充は、内因性SCFAレベルを増加させることにより、SCD患者の骨量減少を予防する強力な手段を提供する可能性がある。
データの利用可能性
本研究で作成・解析されたデータセットは、NCBIリポジトリ（Accession Number）で公開されている。PRJNA853784。
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資金提供
本研究は、NIHグラント1R56 HL147048-01（シャオ・L）の支援を受けて実施された。
著者情報
著者名および所属
UConn Health医学部医学科MC3023、263 Farmington Avenue、Farmington、CT、06030-3105、USA
Liping Xiao, Yanjiao Zhou, Suresh Bokoliya, Qingqi Lin & Marja Hurley（蕭 立平、周 延嘉、Suresh Bokoliya、林 青旗、Marja Hurley
貢献
L.X.は研究の構想、設計、データ取得、分析、解釈に貢献し、原稿を起草、批判的に改訂した。Y.Z.は研究デザイン、データ解析、解釈に貢献した。S.B.はデータ収集に貢献し、原稿を批判的に修正した。Q.L.はデータ解析に貢献し、原稿を批判的に修正した。M.H.は、研究の構想、データ解析、解釈に貢献し、原稿を批判的に修正した。すべての著者が最終的に承認し、この研究のすべての側面について責任を負うことに同意している。
著者名
Liping Xiaoにご連絡ください。
倫理的宣言
利益相反
著者は、競合する利益を宣言していない。
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この記事の引用
Xiao, L., Zhou, Y., Bokoliya, S. et al. Bone loss is ameliorated by fecal microbiota transplantation through SCFA/GPR41/ IGF1 pathway in sickle cell disease mice. Sci Rep 12, 20638 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41598-022-25244-9。
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受付終了
2022年6月20日
受理済
2022年11月28日
公開
2022年11月30日発行
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