酪酸は好中球のホメオスタシスを制御し、肺における初期の抗菌活性を損なう

2023年7月15日 12:50

https://www.mucosalimmunology.org/article/S1933-0219(23)00036-3/fulltext

アン・トゥー・ダン
クリスティーナ・ベグカ
セリーヌ・パッタローニ
R. アンドレス・フロト
ダニエル・G・ペッカム
ベンジャミン・J・マーズランド
すべての著者を表示

オープンアクセス掲載:2023年5月11日DOI:https://doi.org/10.1016/j.mucimm.2023.05.005
PlumXメトリクス
短鎖脂肪酸（SCFAs）は、食物繊維の微生物発酵後に産生される代謝産物であり、腸の局所および全身の細胞代謝および抗炎症経路に影響を与える。前臨床モデルにおいて、酪酸のようなSCFAsの投与は、アレルギー性気道炎症、アトピー性皮膚炎、インフルエンザ感染を含む様々な炎症性疾患モデルを改善する。ここでは、細菌によって誘発された気道における好中球駆動性の急性免疫反応に対する酪酸エステルの効果を報告する。酪酸塩は骨髄における造血の個別の側面に影響を与え、その結果、未熟な好中球が蓄積した。緑膿菌感染時、酪酸塩投与は肺マクロファージによるCXCL2発現の増加の結果、好中球の肺への動員を亢進させた。このように顆粒球数が増加し、貪食能が高まったにもかかわらず、好中球は初期の細菌増殖を制御することができなかった。酪酸塩はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の発現を減少させ、活性酸素の産生に必要なオキシダーゼ複合体成分を減少させ、二次顆粒酵素を減少させ、その結果、殺菌活性が損なわれた。これらのデータは、SCFAが恒常的な条件下で骨髄における好中球の成熟とエフェクター機能を調整し、過剰な顆粒球駆動性の免疫病理を緩和する可能性があることを明らかにした。
はじめに
最近の進歩により、食物繊維と腸管由来の短鎖脂肪酸（SCFAs）が宿主の免疫恒常性と免疫に及ぼす影響が明らかにされつつある。プロピオン酸、酢酸、酪酸のようなSCFAsの作用は非常に広範であり、その影響は消化管を越えて肺や皮膚のような末梢組織にまで及ぶ。SCFAは、Gタンパク質共役型受容体への関与、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害機能、あるいは細胞膜を介した拡散を介して免疫細胞に直接作用し、恒常性を維持するだけでなく、様々な慢性炎症状態を抑制することができる。
1
,
2
. 好中球は最も豊富な循環白血球集団であり、恒常性維持のために常に骨髄から補充されている。炎症性の傷害を受けると、好中球は急速に新生され、「緊急顆粒球形成」と呼ばれる循環系に配備される3。
3
. しかし、これらのエフェクター細胞の過剰かつ長期的な動員は、付随的な組織障害を引き起こす可能性がある。
これらの短命で終末分化した顆粒球は、炎症部位に最初に到着し、転写活性は限られていると考えられている4。
4
. それにもかかわらず、SCFAは、おそらくHDAC阻害を介して、腫瘍壊死因子（TNF）などの炎症性サイトカインの産生を制御することにより、転写レベルで好中球に直接影響を与えることが示されている5。
5
および走化性
6
,
7
. 我々は以前、腸管由来のSCFAが、単球-樹状細胞前駆細胞（MDP）から抗炎症性Ly6c-単球を発達させることで、インフルエンザ感染時の好中球駆動性免疫病理を間接的に抑制することを示した。この防御は、マクロファージによるCXCL1の産生を減少させることによって媒介され、肺への好中球の浸潤を抑制し、付随的な組織損傷を防いだ。しかし、好中球のエフェクター機能に対するSCFAの直接的な影響については、この研究では扱われていない。
8
.
ここでわれわれは、肺への好中球の動員は増加し、貪食能も亢進しているにもかかわらず、酪酸塩が急性肺緑膿菌感染時の好中球殺菌活性を低下させることを報告する。酪酸塩は恒常性条件下でBMにおける好中球の成熟に本質的な影響を及ぼした。酪酸塩は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）酵素複合体成分の発現をダウンレギュレートすることによって、酸素依存性の活性酸素種（ROS）産生を減少させることにより、in vivoおよびex vivoでの好中球の細菌殺傷能力を特異的に低下させた。また、二次顆粒酵素の発現も制限され、その中でもラクトフェリンは好中球の発達過程で抗菌ペプチドと転写因子（TF）としての二重の役割を担っている。これらのデータを総合すると、細菌代謝産物が造血に及ぼす影響についての理解が深まり、最終的には末梢免疫応答を調整することになる。
結果
酪酸はCXCL2の発現と緑膿菌の初期クリアランスに影響する
我々は以前、肺インフルエンザ感染時の好中球に対するSCFAの間接的な抗炎症作用を、マクロファージ由来のCXCL1
8
. しかし、好中球もまたSCFAに対する受容体GPR43を発現しており、その走化性に影響を及ぼすことが報告されている9。
9
SCFAが好中球にどの程度直接的な影響を与えるかは、まだ明らかにされていない。この問題を解決するため、我々は緑膿菌を急性肺炎の感染モデルとして用いた。
10
. 感染に先立ち、マウスには繊維質の少ない餌を4週間与え、その後少なくとも2週間、SCFAである酪酸を飲料水に添加した。その後、成体マウスに1×106コロニー形成単位（CFU）の緑膿菌PAO1株を気管内投与し、急性感染を誘導した。
10
. 感染から18時間後に肺への細胞浸潤と細菌クリアランスを評価した。
酪酸塩は、感染していないマウスの気管支肺胞洗浄液（BALF）の細胞数をコントロールと比較して変化させなかったが、緑膿菌に反応して細胞浸潤を促進した（図1A）。マクロファージの数はコントロール群と感染群間で変化はなく、酪酸投与群における細胞総数の増加は好中球の動員促進によって説明された（図1B）。好中球は緑膿菌のようなグラム陰性菌に対する宿主の防御に重要である。好中球は細胞毒性が強く、感染を制御するために最初に動員される自然免疫細胞タイプだからである。好中球の動員は増加したにもかかわらず（図1B）、酪酸塩マウスは肺から細菌感染を除去する効率が低かった（図1C）ことから、外因性あるいは内因性の影響による好中球機能の変化が示唆される。
図1急性緑膿菌免疫に対する酪酸塩の影響。(A）1×106CFUの緑膿菌PAO1株接種18時間後のCtrlマウスとButマウスにおけるBALF中の細胞総数の定量。(B)PAO1感染18時間後のコントロールマウスおよび酪酸投与マウスのBALFの細胞スピンの細胞タイプの頻度と定量；(C)チャレンジ18時間後のBALF中の緑膿菌CFUの定量。(D, E) 感染後18時間のBALFにおけるサイトカインおよびケモカインの産生。(F）CtrlマウスおよびButマウスの肺AMおよびIMにおけるCXCR2のMFI。(G) in vitroでUSまたはLPSで2時間刺激したCtrlおよびBut肺マクロファージ上のCXCR2のMFI。 (H) 3時間後のCXCL2またはCCL2ケモカイン勾配に対するCtrlおよびBut好中球の遊走。結果は2回の独立した実験の平均値である。値は平均値±平均値の標準誤差で表した；n = 6-14。統計的有意性は、(A-E, G, H)では一元配置分散分析で、(F)ではStudentのt検定（不対、両側検定）で決定した。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001。AM＝肺胞マクロファージ；BALF＝気管支肺胞洗浄液；But＝酪酸処理；CFU＝コロニー形成単位；Ctrl＝コントロール；IFN＝インターフェロン；IL＝インターロイキン；IM＝間質マクロファージ；LPS＝リポ多糖；MFI＝平均蛍光強度；PAO1＝緑膿菌1株；TNF＝腫瘍壊死因子；US＝非刺激。
大きな画像を見る
高解像度画像のダウンロード
次に、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキン6（IL-6）、インターフェロンγ（IFNγ）などのサイトカインの発現を評価した。これらのサイトカインは、TLR4（LPS）およびTLR5（フラジェリン）刺激後に肺上皮細胞から分泌され、免疫細胞を活性化して感染部位にリクルートする。
10
,
11
. これらの炎症性サイトカインは、微生物チャレンジ後、早ければ3時間以内にBALFで検出される。
12
. さらに、SCFAは好中球に直接作用し、試験管内でTNFαと一酸化窒素（NO）を阻害することが報告されている5 。
5
. 感染後18時間のTNFα、IL-6、IFNγのレベルは、対照マウスと酪酸投与マウスで同等であったことから、酪酸は感染中の気道における炎症性サイトカイン産生を抑制しなかったことが示唆される（図1D）。肺胞マクロファージもまたIL-1βを分泌し、上皮細胞によって感知されると、CXCL1としても知られるケラチノサイト化学誘引物質やCXCL2としても知られるマクロファージ炎症性タンパク質2（MIP-2）などの好中球化学誘引物質を産生し、好中球の動員をさらに増幅させる11。
11
. CXCL1やCXCL10、CCL5を含む他のケモカインレベルは変化しなかったが、CXCL2は酪酸投与マウスのBALFで有意に増加しており（図1E）、CXCL2を介した好中球の化学誘引が示唆される。
CXCL2はLPSに応答してTLR4発現マクロファージから放出されるので
13
肺マクロファージにおけるこのケモカインの産生を評価した。その結果、酪酸処理した肺胞マクロファージ（AM）と間質マクロファージでは、ベースラインでのCXCL2発現が高いことが観察された（図1F）。LPSによるin vitro刺激ではこのサイトカインのレベルはそれ以上上昇しなかったが、酪酸処理肺マクロファージにおけるCXCL2発現の上昇は維持された（図1G）。酪酸投与マウスの好中球がCXCL2に対する反応性が亢進しているかどうかを評価するために、骨髄由来の好中球を用いてケモカイン勾配に向けたトランスウェル遊走試験を行った。CCL2は走化性を促進しなかったが、CXCL2は酪酸投与マウスの好中球の遊走をコントロールと比較して有意に促進した（図1H）。好中球の走化性は、SCFAレセプターであるGpr43とGpr109aの発現に変化がなかったことから、これらのレセプターによって誘導されることはなかった（補足図1A）。
まとめると、酪酸塩投与は緑膿菌感染時に気道の細胞性を亢進させ、肺への好中球走化性を促進する肺マクロファージによるCXCL2の発現を増加させた。
酪酸塩はホメオスタシス中のBMにおける好中球の成熟に直接影響する。
BMは造血幹細胞維持の主要な免疫部位であり、循環系に配備される準備の整った免疫細胞リザーバーを保有している。細菌成分（TLRリガンド）のような腸内微生物からのシグナルは、骨髄造血を維持するだけでなく、リステリア菌（Listeria monocytogenes）を含む全身性細菌感染の制御においても重要な役割を果たしている。
14
. 我々は以前、SCFAのような細菌代謝産物が、気道の炎症時に骨髄造血にも影響を及ぼす可能性があることを示した。炎症の状況に応じて、SCFAは造血の異なる側面を促進する。ハウスダストマイト（HDM）によるアレルギー性炎症では、SCFAはMDPと共通樹状細胞前駆細胞（CDP）の増殖を促進する。
15
インフルエンザ感染症においては、SCFAはMDPの発達を促進し、免疫病理の亢進を抑制する。
8
.
緑膿菌感染によって肺への好中球の動員（図1B）が増加したことから、酪酸が好中球の直接の前駆細胞である顆粒球単球前駆細胞（GMP）およびその前駆細胞である共通骨髄系前駆細胞（CMP）の増殖と分化能に影響を及ぼすかどうかを検討した
16
. 恒常的な条件下では、CMPとGMPの割合と総細胞数は変化しなかった（図2A）。酪酸塩は、GMPが「前好中球」（proNeu、preNeu）と呼ばれる非常に増殖性の高い細胞プールに移行する好中球成熟の初期段階には影響を与えなかった（図2B、補足図1b）。
17
. しかし、我々は酪酸塩が好中球を宿主とする細胞の非増殖性未熟好中球と成熟好中球への分化を阻害することを見出した（図2B）。
18
. 酪酸塩を投与すると、ホメオスタシス下のBMでは、未熟好中球の割合が高く、成熟好中球の割合が低く、未熟好中球細胞数が高く維持された（図2B）ことから、終末好中球の成熟に対する選択的作用が示唆される。急性微生物感染症は、緊急顆粒球形成と呼ばれる骨髄系前駆細胞の標的化された膨張と動員を誘発することがある3。
3
. 緑膿菌チャレンジから18時間後、酪酸塩は骨髄造血（CMP）と顆粒球造血（GMP）を促進しなかった（データは示さず）。しかし、BMにおける好中球成熟の恒常性セットポイントは、緑膿菌チャレンジに反応して、酪酸マウスの未成熟好中球の急速な展開をもたらし、その結果、未成熟好中球の割合と細胞数が減少した（図2C）。さらに、両方の成熟状態の好中球の肺への浸潤の増加が観察されたことから、BMにおける好中球成熟の恒常性設定点は気道においても明らかであった（図2D）。
図2酪酸はホメオスタシス中のBMにおける好中球成熟に影響する。(A）CtrlマウスとButマウスのBMにおけるCMPとGMPの相対表示と定量。(B）CtrlマウスとButマウスのBMにおけるproNeu、preNeu、immNeu、matNeuの頻度と定量。18時間後のBMおよび18時間後のBALFにおけるimmNeuおよびmatNeuの相対表示と定量（C）。Eは、300uMの酪酸とG-CSFで18時間培養したFACS選別コントロールpreNeusのimmNeuとmatNeuへの成熟。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した；（A-D）では各群n = 9-12、（E）では各群n = 5。統計的有意性は、(A-D)ではStudentのt検定（非対、両側検定）、(E)では一元配置分散分析で求めた。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001、*** p ≤ 0.0001。BALF = 気管支肺胞洗浄液; BM = 骨髄; But = 酪酸塩処理; CMP = 共通骨髄前駆細胞; Ctrl = コントロール; G-CSF = 顆粒球コロニー刺激因子; GMPs = 顆粒球単球前駆細胞; immNeu = 未熟好中球; matNeu = 成熟好中球; PAO1 = P. aeruginosa strain 1; P. aeruginosa strain 2; PAO1 = P. aeruginosa strain 1; PBS = リン酸緩衝生理食塩水; pi = 感染後; preNeu = 前好中球; proNeu = 前好中球。
大きな画像を見る
高解像度画像のダウンロード
酪酸塩が終末好中球の成熟に直接的な影響を及ぼすかどうかを評価するために、コントロールマウスの好中球前駆体（preNeu）をFACSで選別し、in vitroでの増殖能を評価した。preNeusは、刺激なしでも酪酸存在下でも、未熟な表現型を持つ好中球に主に成熟した（図2E）。顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）存在下では、好中球を宿主とする前駆細胞は主に成熟好中球へと発達した。しかしながら、G-CSFで刺激したコントロールの前駆細胞の分化は、酪酸塩の存在下では、我々のin vivoでの観察（図2B）と同様に、未熟な好中球の割合が高く、成熟した好中球の割合と細胞数が少なくなるように調節された（図2E）。
まとめると、酪酸塩は定常状態の骨髄造血と顆粒球形成を促進しなかったが、BM中の未熟好中球プールの増加によって反映される後期好中球の成熟を特異的に変化させた。ホメオスタシスにおける好中球の成熟がこのように末期にシフトしているにもかかわらず、顆粒球の両ステージは蓄積し、細菌感染に応答して肺にリクルートされた。全体として、酪酸塩投与は、コントロールと比較して、気道への未熟好中球のリクルートを増強する結果となり、これは定常状態におけるBM環境を反映していた。
酪酸塩は恒常的な条件下で、BMの未熟好中球と成熟好中球の転写ランドスケープに影響を与える。
恒常性条件下での好中球成熟のシフトを考慮し、コントロールと酪酸BMから未熟好中球と成熟好中球をCXCR2発現に基づいてFACS選別した。未熟な好中球はCXCR2-であるが、成熟した好中球はこのケモカインレセプターをアップレギュレートしている。
19
,
20
.
RNA配列決定が行われ、主成分分析によりコントロールマウスと酪酸投与マウスのBM好中球の間に明瞭なシグネチャーがあることが明らかになった（データは示さず）。差次的遺伝子発現解析（図3A）とそれに続くパスウェイ解析（Reactome）により、酪酸未熟好中球では好中球脱顆粒に関わるパスウェイ（Camp、Creg1、Orm1、CD68、Cxcr2、Sell、Cmtm6、Mmp8、Sirpb1b）および顆粒球形成の転写制御（Cebpb、H2bc4）がコントロールと比較して低下していることが示された。成熟したBM好中球の遺伝子発現解析では、定常状態（FDR0.1）においてコントロールマウスと酪酸投与マウスの間で発現に差のある遺伝子はわずかであった（Fig.
4
. それにもかかわらず、影響を受けた主要な経路は、インターロイキンシグナル伝達（Ccl3、Ccl4、Cxcl2）、抗菌ペプチド、好中球脱顆粒（Camp、Elane、Ltf、Prg2）であった。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、酪酸投与動物の全好中球はカテリシジン（Camp）、ラクトフェリン（Ltf）だけでなく、好中球顆粒タンパク質（Ngp）のような他の好中球顆粒二次酵素の転写レベルが有意に低いことを確認した（図3C）。さらに、免疫ブロッティングにより、酪酸処理した好中球全体ではLTFタンパク質レベルが低いことが明らかになった（図3D）。興味深いことに、ラクトフェリンは二次顆粒タンパク質であるだけでなく、好中球の発生初期に活性を示すTFでもある
21
. 細胞内ラクトフェリンの量が減少しているにもかかわらず、酪酸投与マウスの好中球では、この形成前の二次顆粒の脱顆粒は影響を受けていなかった。対照マウスと酪酸投与マウスのBALF中の細胞外ラクトフェリンレベルは同程度であったことから、肺の好中球細胞数の増加を考慮すると、この酵素の利用可能性が低下していることが示唆される（Fig.）
図3酪酸は恒常性条件下で好中球の転写様式を変化させる。C、CtrlマウスとButマウスの好中球全体から得られたCamp、Ngp、Ltfの遺伝子発現（fold change）； D、感染していない生体外好中球の免疫ブロットと、β-アクチン負荷Ctrlに対して正規化したLTFバンドの定量；E、感染後18時間のCtrlマウスとButマウスの気管支肺胞洗浄液中のLTFのサイトカイン発現。結果は（C、E）については2回の独立した実験の平均値、（D）については2回の独立した実験のデータの代表値である。値は平均値±平均値の標準誤差で表した；(C, E)では各群n = 5-7。免疫ブロッティングでは、1群あたりn = 3-4匹のマウスをプールした。統計的有意性は、(C, D)ではStudentのt検定（非対、両側検定）、(E)では一元配置分散分析で決定した。** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001。But = 酪酸処理; Camp = カテリシジン; Ctrl = コントロール; Ltf = ラクトフェリン; mRNA = メッセンジャーRNA; Ngp = 好中球顆粒タンパク質; PAO1 = 緑膿菌1株; PBS = リン酸緩衝生理食塩水。
大きな画像を見る
高解像度画像をダウンロード
これらのデータを総合すると、酪酸はBMの恒常性条件下で好中球の転写ランドスケープの個別の側面を調節することが示唆される。それによって、末梢における好中球の応答は、成熟期に二次顆粒にあらかじめ貯蔵されている酵素の産生と利用可能性を特異的に変化させることによって調整される可能性がある。
酪酸塩は殺菌活性を低下させるが、貪食は亢進させる
定常状態の未熟好中球と成熟好中球のRNA配列決定から、酪酸投与動物の好中球では脱顆粒、ひいてはエフェクター機能が調節不全であることが示唆された（図3Aと3B）。緑膿菌感染後、好中球のBALFおよび肺への動員は亢進していたにもかかわらず（図1A）、酪酸塩投与マウスでは対照マウスに比べて細菌量が高いままであった（図1C）ことから、エフェクター機能の阻害が示唆された。このことを調べるために、コントロールマウスと酪酸投与マウスから分離した生体外好中球を緑膿菌と共培養し、その殺菌力を評価するin vitro殺傷アッセイを行った。酪酸投与マウスの生体外好中球は、生存菌数が多いことからわかるように、コントロールと比較して殺傷能力が低かった（図4A）。好中球は病原体を排除するために、貪食、あるいはミエロペルオキシダーゼ（MPO）とエラスターゼを含むアズロフィリック顆粒を細胞外腔やファゴライソソームに速やかに放出するなど、多様なエフェクター機能を用いている。
4
,
22
. 酪酸マウスではコントロールに比べ好中球浸潤が多いにもかかわらず（図1C）、MPOとエラスターゼの脱顆粒にBALFでの差は認められなかった（図4B）。従って、酪酸エステル処理マウスの好中球が細胞外腔に脱顆粒するアズロフィル酵素の量が細胞当たりでより少ないことは否定できない（図4B）。貪食とそれに続く細胞内死滅の両方による病原体の除去も好中球の重要な機能である。SCFAは好中球の貪食能力を低下させ、A. actinomycetemcomitansの封じ込めを阻害することが報告されている23。
23
. 対照的に、我々は酪酸投与マウスの生体外BM好中球が、蛍光標識した免疫グロブリン(Ig)Gビーズを貪食することで測定したところ、コントロールに比べて貪食能が高いことを見いだした。貪食能の増加は成熟した好中球に特異的で、未熟な貪食細胞では変化がなかった（図4C）。
図4酪酸は細菌のクリアランス能力を低下させるが、貪食は促進する。(A）in vitroでの殺傷能力を評価するために、Ctrlまたは酪酸好中球と2時間共培養した後の緑膿菌の定量。(B）未感染マウスあるいは緑膿菌にチャレンジしたCtrlマウスとButマウスのBALFにおけるミエロペルオキシダーゼとエラスターゼの発現。(C) 2時間培養後の全好中球、未熟骨髄好中球および成熟骨髄好中球によるPE標識免疫グロブリンGビーズの貪食能。結果は2回の独立した実験の平均値である。値は平均値±平均値の標準誤差で表した。統計解析は、(A)ではStudentのt検定（不対、両側検定）、(B, C)では一元配置分散分析で行った。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001。BALF = 気管支肺胞洗浄液; But = 酪酸塩処理; Ctrl = コントロール; immNeu = 未熟好中球; matNeu = 成熟好中球; mRNA = メッセンジャーRNA; PAO1 = 緑膿菌1株; PE = フィコエリトリン; PBS = リン酸緩衝生理食塩水。
大きな画像を見る
高解像度画像のダウンロード
全体として、in vivoでの酪酸への曝露は、BM好中球を「プライミング」し、貪食能を増強した。とはいえ、細胞内病原体の効果的な除去には、貪食に続くさらなる抗菌機構が必要である。これらのデータは、in vitroおよびin vivoでの細菌排除の減少の原因として、他のエフェクター機構が影響を受けていることを示している。
酪酸は好中球における活性酸素を介した細菌クリアランスを阻害する
貪食後、NADPHオキシダーゼ2（NOX2）によるファゴリソソームでの活性酸素の生成は、細胞内病原体を制御し排除する強力なメカニズムである。酪酸はNADPH活性とROS産生を増強し、マクロファージにおける抗細菌活性を高めることが示された
21
. 酪酸塩が好中球の呼吸バーストに影響を及ぼすかどうかを評価するために、我々は、酸化により緑色の蛍光を発する非蛍光性活性酸素インジケーターであるジヒドロローダミン123（DHR123）を用いて、ex vivoのBM好中球の細胞内活性酸素産生を測定した。コントロールマウスと酪酸投与マウスの非刺激好中球における活性酸素含量は同等であった（図5A）。しかし、生体外でのPMA（Phorbol 12-Myristate 13-Actetate）刺激後、酪酸処理好中球はコントロール好中球よりも細胞内活性酸素の産生が少なかった。活性酸素産生の減少は成熟好中球に限らず、未成熟細胞でも観察された（図5A）。同様に、精製したBM好中球を緑膿菌と共培養すると、酪酸塩処理した好中球はコントロールと比較して酸化バーストの減少を示した（図5B）。
図5酪酸は好中球の活性酸素を介した細菌クリアランスを阻害する。A、PBSまたは20 nM PMAで45分間処理した後のROS測定として、CtrlマウスまたはButマウスのBM好中球全体、未成熟および成熟好中球におけるDHR 123のMFI発現の倍数増加； B、緑膿菌と2時間共培養した後のCtrlおよびButマウスのBM好中球におけるDHR123のMFI；C、BM好中球のNox2、Cyba、Ncf1、Ncf4の遺伝子発現；D、感染していないex vivo好中球のウェスタンブロットと、ローディングコントロールに対して正規化したNOX2バンドの定量。結果は2回の独立した実験の平均値（A-C）、または2回の独立した実験のデータの代表値（D）である。数値は平均値±平均値の標準誤差で表し、(A, B)では各群n = 7-10、(C)では各群n = 6。免疫ブロッティングでは、1群あたりn = 3-4匹のマウスをプールした。統計解析は、(A)では一元配置分散分析、(B-D)ではStudent's t test（非対、両側検定）を用いて行った。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001、*** p ≤ 0.0001。BM = 骨髄、But = 酪酸塩処理、Ctrl = コントロール、DHR = ジヒドロローダミン、immNeu = 未熟好中球、matNeu = 成熟好中球、MFI = 平均蛍光強度、mRNA = メッセンジャーRNA、ROS = 活性酸素種、PAO1 = 緑膿菌1株、PE = フィコエリトリン、PMA = ホルボール12-ミリスチン酸13-アクテート、PBS = リン酸緩衝生理食塩水。
大きな画像を見る
高解像度画像のダウンロード
NADPHオキシダーゼは、主触媒ドメインNOX2とCYBA、もう一つのファゴソーム膜サブユニット、その他の細胞質成分（NCF1、NCF2、NCF4）からなる多タンパク質複合体である。活性化後、NADPH複合体はファゴソーム膜に集まり、スーパーオキシドアニオンラジカル(O2.-)を生成し、ファゴソーム内腔で殺菌力の高い過酸化水素(H2O2)に変換される。その結果、酪酸投与マウスの非刺激好中球では、Nox2、さらにCyba、Ncf1、Ncf4の遺伝子発現がコントロールと比較して有意に減少していた（図5C）。さらに、免疫ブロッティングにより、NOX2タンパク質レベルも恒常性条件下で酪酸マウスの好中球で減少していることが示された（図5D）。
まとめると、酪酸好中球の殺微生物性の欠損は、活性化後の細胞内活性酸素の変換に必要な酸素依存性NADPHオキシダーゼ複合体成分の発現低下による内在性酸化バースト能の低下の結果であった。
考察
我々は以前、腸-骨髄-肺の軸が関与するアレルギー性肺炎およびウイルス性肺炎に対するSCFAの抗炎症効果を報告した。多様な前駆細胞が存在する骨髄は、SCFAによって調節され、末梢の免疫応答を形成する中心的な部位として浮上した。BMの造血、特に骨髄造血に対するSCFAの影響は、非常に文脈依存的である。
8
HDM誘発喘息では成熟度の低いDCが誘導された。
15
を誘導し、肺の炎症を抑制している。
ここで我々は、好中球の終末分化を調節し、好中球の転写様式を変化させることによって、恒常性と炎症における好中球の反応性のセットポイントを確立する上で、酪酸が果たす役割を明らかにした。我々は、酪酸塩処理により好中球のNADPH依存性活性酸素産生能が低下し、おそらく免疫病理学的損傷を防ぐことができることを見出したが、しかしこれはin vivoおよびin vitroでの殺菌機能を犠牲にしていた。
先行研究では、SCFAによる前駆細胞の表現型変化は炎症時にのみ明らかになったが、これはおそらく、前駆細胞の機能的軌道を設定する、まだ未解明の分子シグネチャーによるものであろう。これまでの観察と同様に、酪酸投与動物では、恒常性条件下でのBM造血と骨髄造血に変化は見られなかった（データは示していない）。しかしながら、酪酸投与マウスは、コントロールと比較して、定常状態でのBMにおいて、成熟好中球と比較して未熟好中球の優先的蓄積を示した。増殖前好中球（preNeu）から未成熟好中球、そして完全に機能的な成熟好中球へと直線的に発達することを支持する証拠が増えつつあるが、それは機能的変化を伴うTFsの高度に協調的な発現によって規定される。
17
. それゆえ、好中球の異なる発生段階において、異なるTFsのセットが活性を示すことが報告されている24。
24
. ある種の初期好中球C/EBP TFは、C/EBPα
25
C/EBPεおよびC/EBPδはLTFのような二次顆粒
26
. 一次顆粒は主にGMPの段階であらかじめ形成され、二次顆粒はpreNeuおよび未成熟好中球の段階で発現する
17
. 我々のRNAシークエンシングと免疫ブロッティングの結果から、酪酸塩を投与した動物の無刺激好中球ではラクトフェリンの発現が減少していることが明らかになった。このことは、酪酸塩が未熟な発育段階付近でこれらの前形成顆粒の生成を阻害し、この変化が成熟段階でも維持されていることを示唆している。さらに、CampやNgpのような他の二次（特異的）顆粒の遺伝子発現も酪酸によって影響を受けた。
ラクトフェリン(Ltf)は二次顆粒に含まれる鉄結合性糖タンパク質で、鉄を隔離することにより微生物感染に対する防御に機能し、細菌から増殖に不可欠な栄養素を奪う。
27
. しかし、ラクトフェリンは核局在化シグナルを持つことから、よく知られたTFとして二重の役割を担っている28。
28
. ラクトフェリンの遺伝子発現は、特に好中球の発生初期に顕著である。
24
. 酪酸塩マウスにおけるラクトフェリン発現の減少は、我々のモデルにおける未熟好中球と成熟好中球の間の成熟シフトを説明しうることから、好中球が完全に成熟するためには、一定レベルのラクトフェリンが初期発生段階で維持される必要があることが示唆される。この発見はまた、細菌代謝産物のような末梢シグナルがBMにおける定常状態の好中球発生を指示し、その細胞運命、機能、および末梢応答を決定する可能性を示唆している。好中球は、KRAS誘発肺腺癌の実験的マウスモデルで観察されたように、腫瘍の成長を促進するようにリプログラミングされることがある。
29
. 対照的に、これらの顆粒球は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）アゴニスト存在下で、脳損傷を軽減するために免疫抑制性表現型（N2好中球）を採用することが示された30。
30
. それにもかかわらず、Ltf発現が低いにもかかわらず、完全な成熟に達することができた酪酸好中球は、好中球エフェクター機能の全領域を持たず、おそらく好中球の活性化を減弱させる呼吸バーストの「欠陥」を示した。同様に、ラクトフェリン欠損マウスは、好中球の初期発生、遊走、貪食、顆粒放出、抗菌反応は正常であるが、PMAで処理した成熟好中球の呼吸バーストには障害がある31。
31
. ここで我々は、酪酸が主要な触媒ドメインであるNox2だけでなく、他のNADPH複合体構成成分であるCyba、Ncf1、Ncf4の発現をダウンレギュレートすることにより、活性酸素産生を制御していることを見出した。同様に、酪酸はNADPHオキシダーゼのサブユニットp22phox（Cyba）の発現を低下させることにより、マウス関節炎の発症を抑制し、その結果、内皮細胞における酸化ストレスを減少させることに関連している32。
32
. 以前の研究では、ラット好中球のp47phox（Ncf1）のリン酸化をin vitroで酪酸で前処理することにより減少させることが示唆されている33。
33
. しかし、これはSchulthessらの所見とは対照的である。Schulthessらは、酪酸塩処理したマクロファージがPMA刺激やサルモネラ菌感染後に細胞内活性酸素をより多く産生することを見いだした21。
21
. とはいえ、これらの矛盾した所見は、SCFA濃度や細胞の活性化など、プロトコルの違いによるものかもしれない。殺菌活性の低下に対して、好中球の動員および貪食能の亢進は、感染を制御するための代償機構である可能性があり、さらなる研究が必要である。
まとめると、好中球は自然免疫系の重要なエフェクター細胞であり、酸化的エフェクターシステムと非酸化的エフェクターシステムを併用して、微生物の挑戦に対して即座に宿主防御を行う。ここで我々は、酪酸塩が炎症に先立つNADPH依存性の活性酸素産生を抑制することにより、酸化的作用を調節することを見出した。さらに酪酸は、好中球の発生過程で転写活性化因子としても働くラクトフェリンなどの二次（特異的）顆粒酵素の発現を標的とすることで、非酸化的防御機構を部分的に制御した。ある種のTFの連続的発現は高度に制御されており、好中球の発達段階ごとにエフェクター機能の秩序だったアップレギュレーションを伴っている。
24
BMでの初期発生過程における微生物成分やその副産物の影響は、完全に成熟した好中球のエフェクター機能の配列に永続的な影響を及ぼす可能性がある。我々の知見は、好中球が短命であるにもかかわらず、BMにおけるこれらの顆粒球のトランスクリプトームおよび機能的シグネチャーを変化させることが、嚢胞性線維症（CF）のような慢性疾患において、肺機能の低下を加速させる好中球を介した免疫病理に関連する可能性があることを示唆している34。
34
,
35
. 好中球集団内の不均一性や活性化状態による好中球の調節異常は、CFや全身性エリテマトーデス（SLE）などの病態に関与している。
18
,
34
,
36
. このような慢性的で素因のある状態において、好中球の過剰な反応を抑制することで、SCFAは免疫系の "健康的な "セットポイントを確立し、免疫病理学的な誇張がなくても感染症をコントロールできるように機能するのかもしれない。
前述の好中球に対する成熟から活性までの作用は、酪酸塩に特異的なものではなく、酢酸塩やプロピオン酸塩でも部分的に再現された。酪酸とは対照的に、これら2つのSCFAはBMにおける未熟好中球と成熟好中球の割合を変化させなかった。しかし、これらのSCFAは酪酸と同様に好中球の貪食能を増強し、活性酸素産生を減少させた（補足図2A-C）。
食餌性SCFA補給は、ウイルス性呼吸器感染症やアレルギー性気道炎症において治療的可能性がある一方
8
,
15
しかし、細菌性肺疾患や好中球性肺疾患に対するSCFAの潜在的影響については、さらなる研究が必要である。
材料と方法
マウス
4週齢のC57BL/6雌性マウスをWEHI（オーストラリア、メルボルン）から購入し、オーストラリア、メルボルンのMonash University, Alfred Research Allianceの特定の病原体フリー施設下で飼育した。マウスには、SCFA補充前および実験期間中、低繊維食（Speciality Feeds diet SF09-28）を4週間与えた。マウスには、緑膿菌感染前および実験期間中の2週間、最終濃度300 mMの酪酸ナトリウム（Sigma-Aldrich, St.Louis MO）、酢酸ナトリウム（Sigma-Aldrich, St.Louis MO）またはプロピオン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich, St.Louis MO）を飲水として与えた。飼料はオーストラリアのSpeciality Feeds社から購入した。すべての動物実験は、オーストラリア、メルボルンのAlfred Research Alliance Animal Ethics Committeeの動物保護ガイドラインに従って承認され、実施された。
緑膿菌感染
緑膿菌PAO1株（ATCBAA47、ATCC）をトリプティックソイブロス（TSB、BD Biosciences）でOD600が0.5になるまで培養した。細菌をペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、PBSに再懸濁した。細菌接種量はOD600から推定し、寒天平板上に連続希釈液をプレーティングしてCFUを測定することで確認した。10～12週齢のマウスをケタミン（100 mg/kg）とキシラジン（10 mg/kg）の混合液で麻酔し、気管内に1 × 10
6
CFUを30μlの滅菌PBSで気管内感染させた。感染から 18 時間後にマウスを犠牲にし、気管支肺胞洗浄（BAL）を実施した。総CFUは、連続希釈とTSA寒天培地へのプレーティングにより定量した。総CFUはBALFのCFU/mlに換算した。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーにより、BM および肺における様々な細胞型の表現型決定と特徴付けを行った。肺マウス組織は、コラゲナーゼIV（BioConcept, Worthington, Lakewood, NY）を用いて、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中、37℃で45分間消化した。その後、サンプルを70μm細胞ストレーナーで濾過し、DMEM10％FCSで洗浄した。BM細胞は、25ゲージの針とシリンジを用いてPBS 10%FCSでマウスの大腿骨を洗浄し、70μmのセルストレーナーで濾過することにより単離した。細胞を数え、フローサイトメトリー用に染色した。BMの前駆細胞集団と好中球集団を区別するために、細胞をリネージカクテル、CD115（BD Biosciences、クローン2B8）、SiglecF（BD Biosciences、クローン2B8）、CD117 BUV117（BD Biosciences、クローン2B8）、Sca1 APCFire（Biolegend、クローンD7）、FcgR biot（Miltenyi、クローン93）、CD34 BV421（Biolegend、クローンSA376A4）、CD11b BV510（BDバイオサイエンス、クローンM1/70）、Ly6G Pecy5（eBioscience、クローン1A8-Ly6g）、CXCR2 Pecy7（Miltenyi、クローンREA942）およびストレプトアビジンBUV395（BDバイオサイエンス）。肺およびBALF中の好中球は、CD45-biot（Miltenyi, clone 30-F11）、CD11c APCCy7（Biolegend, clone N418）、SigF AF647（BD Biosciences、クローンE50）、CD11b PB（Biolegend、クローンM1/70）、Ly6G Pecy5（eBioscience、クローン1A8-Ly6g）、CXCR2 Pecy7（Miltenyi、クローンREA942）およびストレプトアビジンBV786（BD Biosciences）。細胞内染色のために、細胞を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、次いで0.1％サポニンで透過処理した。細胞は、CXCL2に対する抗体（Invitrogen、クローン40605）に続いて抗ラットIgG2b FITC（Biolegend、クローンRTK4530）で染色した。すべての細胞をFortessa（BD Biosciences）で取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star, Ashland, OR）を用いて解析を行った。
RNA配列決定
大腿骨をDMEM10％FCSでフラッシュすることによりBM細胞を採取し、未熟（lin- CD117lo/int Sca1- Ly6G+ CD11b+ CXCR2-）および成熟（lin- CD117lo/int Sca1- Ly6G+ CD11b+ CXCR2+）好中球を前述のように染色し、フローサイトメトリーにより選別した。選別後直ちに、細胞を遠心分離によりペレット化し、Quick-RNA MiniPrep kit（Zymo Research）を用いてRNAを製造元に従って単離した。RNA量はQubit（Invitrogen）で測定し、RNAの質はFragment Analyzerで評価した。ライブラリー調製のために、まずClontech Smart-seq v4 ultra low kitを用いて全RNAを増幅した後、NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illuminaで調製した。得られたライブラリーは、Illumina NovaSeqプラットフォーム（PE150）を用いて、サンプルあたり20Mリードの深度でシーケンスした。生のfastqファイルはRNASik v1.5.0を用いて処理した。
37
を用いて処理した。アライメントは、STAR v2.5.2bを用いて、Musculus GRCm38参照ゲノムと関連する遺伝子モデルGTFに対して行った。
38
を用いて、Degustにインポートする前にリードカウントを定量化した。
in vitro緑膿菌殺傷アッセイ
BMをRPMI10% FCS 1% Pen/Strepで洗浄し、好中球をメーカー（Miltenyi）に従ってネガティブ分離した。5×105 個の好中球を、HBSS 10%FCS中、緑膿菌に10の感染多重度で感染させた。好中球を細菌と一緒にチューブ内で端から端まで回転させながら（6rpm）、37℃で120分間インキュベートした。細菌CFUはH20 pH11で連続希釈し、37℃の寒天プレート上で増殖させた。死滅した緑膿菌の割合は、好中球存在下で増殖したCFU数を好中球非存在下で増殖したCFU数で割ることにより算出した。
酸化バーストアッセイ（活性酸素アッセイ）
1×106個のBM細胞をRPMI中で1ug/mlのジヒドロローダミン123（DHR）（サーモフィッシャー社製）とインキュベートし、20nM PMA（シグマアルドリッチ社製）と300uM酪酸ナトリウム（シグマアルドリッチ社製）で37℃で45分間刺激した。細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメトリーで染色し、好中球サブセットの蛍光強度を測定した。
貪食アッセイ
1×106個のBM細胞を、1:100希釈のIgG-PEビーズ（Cayman Chemical）と37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメトリー用に染色して解析した。
トランスウェルアッセイ
BMをRPMI10% FCS 1% Pen/Strepで洗浄し、好中球をメーカー（Miltenyi）に従ってネガティブに分離した。細胞はRPMI10% FCS 1% Pen/Strep 25 ng/ml GM-CSF (PeproTech)中で37℃5% CO2で培養した。5×105個の好中球を3μm孔の12ウェルインサートに播種した。CXCL2またはCCL2を含む培地を一番下のウェルに添加した。37℃、5% CO2で3時間培養後、移行した細胞を数えた。
in vitro肺マクロファージアッセイ
DMEM中、コラゲナーゼIV（BioConcept, Worthington, Lakewood, NY）を用いて、穏やかに攪拌しながら37℃で45分間、肺組織を消化した。その後、サンプルを70μm細胞ストレーナーで濾過し、DMEM10%FCSで洗浄した。細胞をDMEM10% FCS 1% P/Sに再懸濁し、非組織処理プレートで37℃、5% CO2で培養した。翌日、上清を除去し、マクロファージを5mM EDTAでウェルから剥離した。1×105個のマクロファージを96ウェルプレートにプレーティングし、20ng/mlのLPSで37℃5% CO2で2時間刺激した。インキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメトリー用に染色し、分析した。
好中球前駆体アッセイ
コントロールマウスの好中球前駆細胞（preNeus）をBM細胞からFACS選別した。3×104個のpreNeusを96ウェルプレートに播種し、300 uM酪酸（Sigma）と10 ng/ml G-CSF（Peprotech）で37℃5% CO2で16時間刺激した。培養後、細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメトリーで染色し、未熟好中球と成熟好中球への成熟を分析した。
ELISA法
TNFa、IFNg、IL-6（Thermo Fisher Scientific）およびCXCL2（R&D）のタンパク質レベルは、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によって測定した。LEGENDplexパネルを用いて、BALF中のCXCL1、CXCL10およびCCL5（BioLegend）タンパク質をフローサイトメトリーで定量した。感染後18時間のマウスのBALF中の好中球活性を、ミエロペルオキシダーゼ（R&D）、エラスターゼ（R&D）、およびラクトフェリンELISAキット（St John's Laboratory）を用いて、製造者の指示に従って定量した。
イムノブロット
好中球はMACS（130-097-658、Miltenyi）を用いてBMから製造者の指示に従って精製し、溶解し、タンパク質抽出物をBCA（Thermo Fisher Scientific）で定量した。細胞全ライセートをSDS-PAGE（Thermo Fisher Scientific）で行い、続いてメチルセルロース膜（Thermo Fisher Scientific）に転写した。タンパク質は、ラクトフェリン（PA5-95513、Thermo Fisher Scientific）、NOX2（ab129068、Abcam）、β-アクチン（4967S、Cell Signaling）に対する一次抗体、およびHRP標識二次抗体を用いて検出した。
定量的PCR
RNAはTRIzol（Life Technologies）を用いてMACSで精製した好中球から単離した。相補的DNA合成は、FIREScript相補的DNA逆転写酵素（Solis BioDyne）を用いて行った。定量的PCRはPowerUp SYBR Green（Life Technologies社製）を用い、QuantStudio 6（Life Technologies社製）で行った。Ltf、Camp、Ngp、Ccl3、Ccl4、Nox2、Cyba、Ncf1、Ncf2、Ncf4、Gapdh、およびPolr2aの相対的mRNA発現は、以下のプライマーセットを用いた定量的RT-PCRによって評価した： Ltfフォワード5'-CCGCTCAGTTGTGTCAAGAA-3'およびリバース5'-AGACTTCAGCTGCCACAGGT-3'；Campフォワード5'-CGAGCTGTGGATGACTTCAA-3'およびリバース5'-CTCCTTCACTCGGAACCTCA-3'；Ngpフォワード5'-CCACTCCGCCTTCTAGTCAG-3'およびリバース5'-TCCAGGAAGTCGCAGTCTTT-3'； Nox2フォワード5'-CCCTTTGGTACAGCCAGTGAAGAT-3'およびリバース5'-CAATCCCGGCTCCCACTAACATCA-3'；Cybaフォワード5'-CCCTCCACTTCCTGTTGTC-3'およびリバース5'-CCCTCACTCGGCTTCTTT-3'； Ncf1フォワード5'-GATGAAGACAAAGCGAGGTT-3'およびリバース5'-CAGATACATGATGGGAAATAG-3'；Ncf4フォワード5'-GCTTCACCAGCCACTTTGTT-3'およびリバース5'-AGGGCTGTTCTTGCTCTCTG-3'； Gapdhフォワード5'-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3'およびリバース5'-CGGCCATCACGCCACAGTTT-3'；Polr2aフォワード5'-GAGTCCAGAACGAGTGCATGA-3'およびリバース5'-ACAGGCAACTGACAATC-3'。
統計解析
GraphPad Prism 9を用いて、Studentのt検定（不対、両側検定）または一元配置分散分析を行い、治療群間の有意水準を算出した。グラフと図の凡例には、試験群間の有意水準を注釈した。p値＜0.05を有意とした。
著者貢献
A.D.とB.J.M.が研究を計画した。A.D.とC.B.が実験を行った。A.D.、C.B.、C.P.はデータを解析した。A.D.、C.B.、C.P.、L.C.、R.F.、D.P.、B.J.M.は監督、批判的分析、討論を行った。A.D.とB.J.M.が論文を執筆した。全著者が論文の編集を行った。
利益相反宣言
B.J.M.はMucosal Immunology誌の編集委員である。他の著者に利害の対立はない。
資金提供
本研究は、嚢胞性線維症トラスト（Cystic Fibrosis Trust）[SRC 012]、オーストラリア国立保健医学研究評議会（National Health and Medical Research Council：NHMRC）（助成金番号1154344）およびビクトリア州科学・知識・イノベーション基金（Victorian Endowment for Science, Knowledge, and Innovation：VESKI）からB.J.M.へのフェローシップの助成を受けた。
付録A. 補足データ
以下は本論文の補足データである：
ダウンロード.pdf (.52 MB)
pdfファイルのヘルプ
補足データ1
参考文献
コレーア・オリヴェイラ R.
ファチ J.L.
ヴィエイラ A.
佐藤文俊
ヴィノロ M.A.
短鎖脂肪酸による免疫細胞機能の制御。
臨床。Transl. Immunol. 2016; 5: e73
論文で見る
スコープス (700)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マスロフスキー K.M.
他
腸内細菌叢と化学誘引性受容体GPR43による炎症反応の制御。
Nature. 2009; 461: 1282-1286
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マンツ M.G.
ベッチャーS.
緊急顆粒球形成。
Nat. Rev. Immunol. 2014; 14: 302-314
論文で見る
スコパス (494)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ネーメスT.
スペランディオM.
Mócsai A。
新たな治療標的としての好中球。
Nat. Drug Discov. 2020; 19: 253-275
論文で見る
スコープス (277)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ヴィノロ M.A.
他
好中球による炎症性メディエーターの産生に対する短鎖脂肪酸の抑制効果。
J. Nutr. 2011; 22: 849-855
論文で見る
スコパス(425)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ヴィノロ M.A.
ら
短鎖脂肪酸は炎症部位への好中球の遊走を刺激する。
Clin. Sci. 2009; 117: 331-338
論文で見る
スコパス (133)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ヴィノロ M.A.
ロドリゲスH.G.
ナッハバーR.T.
キューリR.
短鎖脂肪酸による炎症の制御。
栄養素。2011; 3: 858-876
論文で見る
スコープ（967）
PubMed
クロス
グーグル奨学生
トロンペットA.
et al.
食物繊維は、Ly6c-パトロール単球の造血とCD8+ T細胞の代謝を形成することにより、インフルエンザからの保護をもたらす。
Immunity. 2018; 48: 992-1005.e8
論文で見る
スコープス (345)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Sina C.
et al.
Gタンパク質共役型受容体43は腸炎症時の好中球のリクルートに必須である。
J. Immunol. 2009; 183: 7514-7522
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Bragonzi A.
嚢胞性線維症病原体による急性および慢性肺感染症のマウスモデル。
Int. J. Med. Microbiol. 2010; 300: 584-593
論文で見る
スコープス (92)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Mijares L.A.
他
気道上皮MyD88はIL-1依存性経路を介して緑膿菌マウス感染の制御を回復させる。
J. Immunol. 2011; 186: 7080-7088
論文で見る
スコパス (60)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ファン・ヘッケレンA.M.
シュルヒターM.D.
シュエ W.
デイビス P.B.
嚢胞性線維症マウスにおけるムコイド緑膿菌による急性肺感染に対する反応。
Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2006; 173: 288-296
論文で見る
スコープス (70)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
デ・フィリッポ K.
ヘンダーソンR.B.
ラッシンガーM.
ホッグ N.
好中球ケモカインKCとマクロファージ炎症性タンパク質-2は、異なるTLRシグナル伝達経路を用いて組織マクロファージで新たに合成される。
J. Immunol. 2008; 180: 4308-4315
論文で見る
スコパス(221)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ホスラビ A.
et al.
腸内細菌叢は細菌感染を制御するために造血を促進する。
Cell Host Microbe. 2014; 15: 374-381
論文で見る
スコープス (415)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
トロンペットA.
et al.
食物繊維の腸内細菌叢代謝はアレルギー性気道疾患と造血に影響する。
Nat. Med. 2014; 20: 159-166
論文で見る
スコープス (1753)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
明石康
トラバーD.
宮本毅
ワイズマン I.L.
すべての骨髄系譜を生み出すクローン形成性の共通骨髄前駆細胞。
Nature. 2000; 404: 193-197
論文で見る
スコパス (1935)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
エブラールM.
et al.
骨髄好中球の発生学的解析から、拡大、輸送、エフェクター機能に特化した集団が明らかになった。
Immunity. 2018; 48: 364-379.e8
論文で見る
スコープス (313)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ン L.G.
オストゥーニ R.
イダルゴ A.
好中球の不均一性。
Nat. Rev. Immunol. 2019; 19: 255-265
論文で見る
スコープス (296)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マーティン C.
ら
CXCR2およびCXCR4を介して作用するケモカインは、骨髄からの好中球の放出および老化後のそれらの復帰を制御する。
Immunity. 2003; 19: 583-593
論文で見る
スコパス (534)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
イーシュ K.J.
グリーンバウム A.M.
ゴパラン P.K.
リンク D.C.
CXCR2とCXCR4は拮抗的にマウス骨髄からの好中球輸送を制御する。
J. Clin. Invest. 2010; 120: 2423-2431
論文で見る
スコープス (506)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シュルテスJ.
ら
短鎖脂肪酸酪酸はマクロファージに抗菌プログラムを刷り込む。
Immunity. 2019; 50: 432-445.e7
論文で見る
スコパス (459)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
オドバシックD.
キッチング A.R.
ホールズワース S.R.
好中球を介した自然免疫と適応免疫の制御：ミエロペルオキシダーゼの役割。
J. Immunol. Res. 2016; 2016: 2349817
論文で見る
スコープス (125)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
コレーア R.O.
他
細菌性短鎖脂肪酸代謝産物は、感染性細菌に対する炎症反応を調節する。
細胞。Microbiol. 2017; 19: e12720
論文で見る
スコープス（46）
クロス
グーグル奨学生
グリースハーバー・ブイヤーR.
et al.
neutrotime転写シグネチャーは、生物学的コンパートメントを超えた好中球の単一の連続体を定義する。
Nat. Commun. 2021; 12: 2856
論文で見る
スコパス (74)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
フォード A.M.
他
顆粒球系分化におけるミエロペルオキシダーゼエンハンサー結合タンパク質Pu1、C-EBPα、-β、-δの制御。
Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 10838-10843
論文で見る
PubMed
クロスレフ
グーグル奨学生
ゴンバート A.F.
他
転写因子C/EBPεおよびPU.1による好中球および好酸球二次顆粒遺伝子発現の制御。
Blood. 2003; 101: 3265-3273
論文で見る
スコパス (136)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ウォード P.P.
パス E.
Conneely O.M.
ラクトフェリンの多機能的役割：重要な概説。
Cell. Mol. 生命科学 2005; 62: 2540-2548
論文で見る
日本
PubMed
クロス
グーグル奨学生
He J.
フルマンスキー P.
ラクトフェリンのDNAへの結合における配列特異性と転写活性化。
Nature. 1995; 373: 721-724
論文で見る
スコープス (326)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
コルテス-レタモゾV.
et al.
腫瘍関連マクロファージと好中球の起源。
Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 2012; 109: 2491-2496
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
Cuartero M.I.
他
N2好中球、脳卒中後の脳炎症における新たな担い手：PPARγ作動薬ロシグリタゾンによる調節。
脳卒中。2013; 44: 3498-3508
論文で見る
スコパス (243)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ウォード P.P.
メンドーサ-メネセスM.
パークP.W.
Conneely O.M.
ラクトフェリン欠損マウスにおける好中球酸化バースト反応の刺激依存性障害。
Am. J. Pathol. 2008; 172: 1019-1029
論文で見る
スコパス (46)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
アギラーE.C.
et al.
経口酪酸は、内皮細胞におけるNADPHオキシダーゼのダウンレギュレーションが関与する機序により、アテローム性動脈硬化病変部位の酸化ストレスを軽減する。
J. Nutr. Biochem. 2016; 34: 99-105
論文で見る
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
ヴィノロ M.A.
畑中英明
ランバートゥッチ R.H.
ニューショルム P.
キュリ R.
好中球のエフェクター機構に対する短鎖脂肪酸の影響。
Cell Biochem. Funct. 2009; 27: 48-55
論文で見る
スコパス (86)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ハートルD.
et al.
嚢胞性線維症肺疾患における自然免疫。
J. 嚢胞。Fibros. 2012; 11: 363-382
論文で見る
スコープス (174)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Mésinèle J.
et al.
嚢胞性線維症の小児における緑膿菌気道感染と肺機能低下の危険因子。
J. 嚢胞。Fibros. 2022; 21: 45-51
論文で見る
スコープス (7)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Mistry P.
et al.
トランスクリプトーム、エピジェネティック、および機能的解析により、好中球の多様性が全身性エリテマトーデスの病因に関与していることが示唆された。
Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 2019; 116: 25222-25228
論文で見る
スコープス (101)
PubMed
Crossref
グーグル奨学生
ツィガノフ K.
ジェームズ・ペリーA.
ケネス・アーチャーS.
パウエル D.
RNAsik：完全で再現性の高いRNA-seq解析のためのパイプライン。
J. Open Source Softw. 2018; 3: 583
記事で見る
クロスリファレンス
グーグル・スカラー
リャオ Y.
スマイス G.K.
Shi W.
featureCounts：配列リードをゲノムの特徴に割り当てるための効率的な汎用プログラム。
Bioinformatics. 2014; 30: 923-930
論文で見る
ゲノム機能解析
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
オンライン公開 2023年5月11日
受理 2023年5月4日
受理：2023年5月4日 2023年4月12日
出版段階
インプレス校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.mucimm.2023.05.005
著作権
© 2023 The Author(s). Society for Mucosal Immunologyを代表してElsevier Inc.が発行。
ユーザーライセンス
クリエイティブ・コモンズ表示（CC BY 4.0）
再利用方法
サイエンスダイレクト
ScienceDirectでこの論文にアクセスする
図
図1急性緑膿菌免疫に対する酪酸の効果。(A）1×106CFUの緑膿菌PAO1株接種18時間後のCtrlマウスとButマウスにおけるBALF中の細胞総数の定量。(B)PAO1感染18時間後のコントロールマウスおよび酪酸投与マウスのBALFの細胞スピンの細胞タイプの頻度と定量；(C)チャレンジ18時間後のBALF中の緑膿菌CFUの定量。(D, E) 感染後18時間のBALFにおけるサイトカインおよびケモカインの産生。(F）CtrlマウスおよびButマウスの肺AMおよびIMにおけるCXCR2のMFI。(G) in vitroでUSまたはLPSで2時間刺激したCtrlおよびBut肺マクロファージ上のCXCR2のMFI。 (H) 3時間後のCXCL2またはCCL2ケモカイン勾配に対するCtrlおよびBut好中球の遊走。結果は2回の独立した実験の平均値である。値は平均値±平均値の標準誤差で表した；n = 6-14。統計的有意性は、(A-E, G, H)では一元配置分散分析で、(F)ではStudentのt検定（不対、両側検定）で決定した。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001。AM＝肺胞マクロファージ；BALF＝気管支肺胞洗浄液；But＝酪酸塩処理；CFU＝コロニー形成単位；Ctrl＝コントロール；IFN＝インターフェロン；IL＝インターロイキン；IM＝間質マクロファージ；LPS＝リポ多糖；MFI＝平均蛍光強度；PAO1＝緑膿菌1株；TNF＝腫瘍壊死因子；US＝非刺激。
図2酪酸はホメオスタシス中のBMにおける好中球の成熟に影響する。(A）CtrlマウスとButマウスのBMにおけるCMPとGMPの相対表示と定量。(B）CtrlマウスとButマウスのBMにおけるproNeu、preNeu、immNeu、matNeuの頻度と定量。18時間後のBMおよび18時間後のBALFにおけるimmNeuおよびmatNeuの相対表示と定量（C）。Eは、300uMの酪酸とG-CSFで18時間培養したFACS選別コントロールpreNeusのimmNeuとmatNeuへの成熟。結果は平均値±平均値の標準誤差で表した；（A-D）では各群n = 9-12、（E）では各群n = 5。統計的有意性は、(A-D)ではStudentのt検定（非対、両側検定）、(E)では一元配置分散分析で求めた。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001、*** p ≤ 0.0001。BALF = 気管支肺胞洗浄液; BM = 骨髄; But = 酪酸塩処理; CMP = 共通骨髄前駆細胞; Ctrl = コントロール; G-CSF = 顆粒球コロニー刺激因子; GMPs = 顆粒球単球前駆細胞; immNeu = 未熟好中球; matNeu = 成熟好中球; PAO1 = P. aeruginosa strain 1; P. aeruginosa strain 2; PAO1 = P. aeruginosa strain 1; PBS = リン酸緩衝生理食塩水; pi = 感染後; preNeu = プレ好中球; proNeu = プロ好中球。
図3酪酸は恒常性条件下で好中球の転写様式を変化させる。C、CtrlマウスとButマウスの全好中球から得られたCamp、Ngp、Ltfの遺伝子発現（フォルドチェンジ）； D、感染していない生体外好中球の免疫ブロットと、β-アクチン負荷Ctrlに対して正規化したLTFバンドの定量；E、感染後18時間のCtrlマウスとButマウスの気管支肺胞洗浄液中のLTFのサイトカイン発現。結果は（C、E）については2回の独立した実験の平均値、（D）については2回の独立した実験のデータの代表値である。値は平均値±平均値の標準誤差で表した；(C, E)では各群n = 5-7。免疫ブロッティングでは、1群あたりn = 3-4匹のマウスをプールした。統計的有意性は、(C, D)ではStudentのt検定（非対、両側検定）、(E)では一元配置分散分析で決定した。** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001。But = 酪酸塩処理；Camp = カテリシジン；Ctrl = コントロール；Ltf = ラクトフェリン；mRNA = メッセンジャーRNA；Ngp = 好中球顆粒タンパク質；PAO1 = 緑膿菌1株；PBS = リン酸緩衝生理食塩水。
図4酪酸は細菌のクリアランス能力を低下させるが、貪食は促進する。(A）Ctrlまたは酪酸好中球と2時間共培養した後の緑膿菌の定量を行い、in vitroでの殺傷能力を評価した。(B）未感染マウスあるいは緑膿菌にチャレンジしたCtrlマウスとButマウスのBALFにおけるミエロペルオキシダーゼとエラスターゼの発現。(C) 2時間培養後の全好中球、未熟骨髄好中球および成熟骨髄好中球によるPE標識免疫グロブリンGビーズの貪食能。結果は2回の独立した実験の平均値である。値は平均値±平均値の標準誤差で表した。統計解析は、(A)ではStudentのt検定（不対、両側検定）、(B, C)では一元配置分散分析で行った。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001。BALF = 気管支肺胞洗浄液、But = 酪酸塩処理、Ctrl = コントロール、immNeu = 未熟好中球、matNeu = 成熟好中球、mRNA = メッセンジャーRNA、PAO1 = 緑膿菌1株、PE = フィコエリトリン、PBS = リン酸緩衝生理食塩水。
図5酪酸は好中球における活性酸素を介した細菌クリアランスを阻害する。A、PBSまたは20 nM PMAで45分間処理した後のROS測定として、CtrlマウスまたはButマウスのBM好中球全体、未成熟および成熟好中球におけるDHR 123のMFI発現の倍数増加； B、緑膿菌と2時間共培養した後のCtrlおよびButマウスのBM好中球におけるDHR123のMFI；C、BM好中球のNox2、Cyba、Ncf1、Ncf4の遺伝子発現；D、感染していないex vivo好中球のウェスタンブロットと、ローディングコントロールに対して正規化したNOX2バンドの定量。結果は2回の独立した実験の平均値（A-C）、または2回の独立した実験のデータの代表値（D）である。数値は平均値±平均値の標準誤差で表し、(A, B)では各群n = 7-10、(C)では各群n = 6。免疫ブロッティングでは、1群あたりn = 3-4匹のマウスをプールした。統計解析は、(A)では一元配置分散分析、(B-D)ではStudent's t test（非対、両側検定）を用いて行った。* p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001、*** p ≤ 0.0001。BM = 骨髄、But = 酪酸塩処理、Ctrl = コントロール、DHR = ジヒドロローダミン、immNeu = 未熟好中球、matNeu = 成熟好中球、MFI = 平均蛍光強度、mRNA = メッセンジャーRNA、ROS = 活性酸素種、PAO1 = 緑膿菌1株、PE = フィコエリトリン、PMA = ホルボール12-ミリスチン酸13-アクテート、PBS = リン酸緩衝生理食塩水。
関連記事
ホーム
論文＆号外
プレス記事
最新号
号外リスト
執筆者の方へ
執筆許可
研究者アカデミー
原稿を投稿する
ジャーナル情報
ジャーナルについて
アブストラクト/索引付け
採用情報
連絡先
編集委員会
広告主情報
リプリント
新着情報
社会
SMI
その他の定期刊行物
定期刊行物の検索
製品カタログへ
このサイトのコンテンツは医療従事者向けです。
当サイトでは、サービスの提供・向上およびコンテンツのカスタマイズのためにクッキーを使用しています。クッキーの設定を更新するには、このサイトのクッキー設定をご覧ください。
Copyright © 2023 Elsevier Inc.第三者から提供された一部のコンテンツを除く。

プライバシーポリシー

利用規約

アクセシビリティ

ヘルプ＆コンタクト

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？