GH136をコードする遺伝子（perB）がビフィズス菌の腸内コロニー形成と持続性に関与している PRL2010

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応用微生物学インターナショナル
微生物バイオテクノロジーEarly View e14406
研究論文
オープンアクセス
GH136をコードする遺伝子（perB）がビフィズス菌の腸内コロニー形成と持続性に関与している PRL2010

https://ami-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1751-7915.14406

Sonia Mirjam Rizzo, Laura Maria Vergna, Giulia Alessandri, Ciaran Lee, Federico Fontana, Gabriele Andrea Lugli, Luca Carnevali, Massimiliano G. Bianchi, Margherita Barbetti, Giuseppe Taurino, Andrea Sgoifo, Ovidio Bussolati, Francesca Turroni, Douwe van Sinderen, Marco Ventura
初出：2024年1月25日
https://doi.org/10.1111/1751-7915.14406
Sonia Mirjam RizzoとLaura Maria Vergnaは、この仕事に同等に貢献した。
概要
セクション

要旨
ビフィズス菌は、ヒトを含む哺乳類の腸内に通常生息する常在微生物である。ビフィズス菌は垂直感染する可能性があるため、一般的に出生後初日からヒトの腸内に定着し、成人期や老年期まで存続する可能性がある。ビフィズス菌がヒトの腸内環境に留まる能力は、上皮細胞への接着に関与する遺伝子や複合糖質分解酵素をコードする遺伝子に起因すると考えられてきた。最近、perB遺伝子がコードするGH136ファミリーに属する推定ムチン分解グリコシルヒドロラーゼが、特定のビフィズス菌株の腸内持続性に関与していることが示唆された。本研究では、この遺伝子の機能をより明確にするため、比較ゲノム解析を行い、ビフィドバクテリウム・ビフィダム株やビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム株など、ヒトの腸内に生息することが知られているわずか8種のビフィズス菌、あるいはヒト以外の霊長類にperBホモログが存在することを明らかにした。perBプロトタイプとしてB. bifidum PRL2010とその同種のperB挿入変異体を用いて、ネズミモデルのコロニー形成アッセイに加えて、ムチンを介した増殖とヒト腸管細胞への接着を行った。これらの結果から、perBを不活性化すると、B. bifidum PRL2010がムチン上で増殖し、ムチンに付着する能力が低下すること、またげっ歯類の腸管ニッチで持続する能力が低下することが示された。これらの結果は、perB遺伝子がヒト腸内におけるB. bifidum PRL2010の持続性に関与する遺伝的決定因子のひとつであるという考えを裏付けるものである。

はじめに
ここ数十年、ビフィズス菌属は、特に生後間もない時期にヒトの腸内に優勢に共生する微生物として認識されるだけでなく、宿主に様々な健康促進効果をもたらすとされる微生物であることから、その特性を明らかにすることに科学的関心が集まっている（Alessandri et al, 2021; Bottacini et al, 2017; Hidalgo-Cantabrana et al, 2017）。このような背景から、ヒト腸内におけるビフィズス菌の存在が宿主の免疫系の発達をサポートし、腸管バリアーの完全性を促進し、腸管eubiosisの維持に寄与し、病原体の増殖を制限し、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病の発症を予防することを強調する、説得力のある科学的証拠が蓄積されてきた（Duranti et al、 2016; Fujimura et al., 2016; Longhi et al., 2020; Luck et al., 2020; Milani, Duranti, et al., 2017; Milani, Mangifesta, et al., 2017; Shang et al., 2022）。同時に、ビフィズス菌はビタミン、ポリフェノール、短鎖脂肪酸などの生理活性代謝産物を産生し、腸管上皮宿主細胞の両方に有益な作用をもたらす可能性があり、他の腸内常在菌の増殖や存在量にも影響を及ぼす可能性がある（Bottaciniら、2014；Bunesovaら、2018；Khromovaら、2022）。

ビフィズス菌は垂直感染するため、ヒトの腸の最初のコロニー形成者の一人であり、出生後すぐに健康促進効果を発揮すると考えられている（Duranti et al., 2017; Henrick et al., 2021; Kumar et al., 2020; Milani, Duranti, et al.） 実際、生後数カ月の間、ヒトの腸管内ではビフィズス菌の相対存在量と有病率が最も高いことが記録されている（Milani, Duranti, et al.） しかし、腸内細菌叢が「乳児型」から「成人型」の腸内微生物生態系へと進化する際にそのレベルが低下するにもかかわらず、ビフィズス菌は比較的安定した状態を保ち、高齢になるまで長期にわたって存続する（Alessandri et al.）

ビフィズス菌属のメンバーが生涯を通じて宿主に持続する能力は、特定のゲノム形質に起因すると考えられる。実際、ビフィズス菌ゲノムには、外多糖類、テイコ酸、絨毛などの特定の細胞外構造の産生に関与する遺伝子が含まれており、これらは宿主や他の常在微生物との相互作用を促進することにより、ヒト腸内でのビフィズス菌の持続性に寄与している（Alessandriら、2021年；Fanningら、2012年；Milani, Duranti, et al.、2017年；Milani, Mangifesta, et al.、2017年；Turroniら、2013年）。これと並行して、ビフィズス菌は糖質代謝に必要な大規模な酵素群をコードする一連の遺伝子を有しており、ビフィズス菌が競争の激しいヒトの腸内環境にコロニー形成し、おそらく宿主の一生を通じて持続するための選択的優位性を提供している（Arzamasov & Osterman, 2022; Turroni et al.） この文脈では、ビフィズス菌は複雑な食事由来の糖質を分解できるだけでなく、ヒトミルクオリゴ糖（HMO）やムチンを含む宿主に関連する複合糖鎖にもアクセスできる可能性がある（Arzamasov & Osterman, 2022; Egan et al, 2014; Nishiyama et al, 2020; Sakanaka et al, 2019）。特に、HMOとムチンを分解する能力は、限られた数の腸内微生物に限られているため、この特徴は、ヒト腸内におけるビフィズス菌のコロニー形成と持続性を確保する上で極めて重要な利点であると提唱されている（Alessandriら、2021；Katohら、2017；Turroniら、2010、2011）。実際、ビフィドバクテリウム・ビフィダムやビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムなど、ムチン代謝の遺伝的レパートリーを持つビフィズス菌株は、そのような遺伝的に予測される能力を持たない株に比べて、ヒト腸内で高い回復力と長期間のコロニー形成を示すことが実証されている（Katoh et al.） 具体的には、B. bifidum株とB. longum subsp. longum株のより効率的な持続性は、ムチンの分解を促進すると提唱されているグリコシルヒドロラーゼファミリー136（GH136）に属する酵素をコードする遺伝子であるperBに起因していた（Tarracchini et al.）

これらの観察に基づき、本研究の目的は、ムチンの分解と腸内持続性の増強におけるPerBの関与を調査し、検証することであった。比較ゲノム調査を行った結果、perB相同体の存在は、霊長類の腸管に由来するわずか8種のビフィズス菌が保有する特異的な遺伝形質であることが明らかになった。さらに、in vitroおよびin vivoの実験から、perBがムチンの分解に関与し、腸内環境におけるビフィズス菌細胞の持続性を高めることが確認された。

結果と考察
ビフィズス菌属におけるperBホモログの有病率の評価
以前の研究で、グリコシルヒドロラーゼ（GH）、すなわちGH136をコードすると予測されるperB（for Persistence of Bifidobacteria）（Yamadaら、2017）が、ヒトの生涯にわたるビフィズス菌の腸内持続性に関与する重要な遺伝的決定因子であることが同定されていた（Tarracchiniら、2023）。当初B. longum subsp. longum株で同定されたLnbXと命名されたよく似た酵素は、細胞外ラクト-N-ビオシダーゼとして働くことが示されていた（Gotoh et al.） lnbXの転写は、N-アセチルグルコサミン含有宿主糖鎖の利用に関与する全ての遺伝子の転写を制御するグローバル制御因子NagRによって共同制御されている（Arzamasovら、2022）。しかしながら、宿主由来の糖鎖利用におけるperB/lnbXの役割にもかかわらず、乳児の腸内細菌叢によく見られるビフィズス菌種、すなわちB. bifidum、Bifidobacterium breve、B. longum subsp. longum、Bifidobacterium pseudocatenulatumであり、ビフィズス菌ゲノムにおけるperB/lnbXの非ユビキタス性が強調された（Tarracchini et al、 2023). 調べたすべてのB. bifidum株とある種のB. longum subsp. longum株はperBホモログを持つことが示されたが、B. breveとB. pseudocatenulatumゲノムのどれにもこの配列のホモログは含まれていなかったようである（Tarracchini et al.） これらの結果に基づいて、ビフィズス菌属の現在認識されている全種におけるperBの存在をさらに調べるために、B. longum subsp. longumおよびB. bifidumで以前に同定されたperBホモログから推定されたアミノ酸配列を含むカスタムデータベース（Tarracchini et al. 平均ヌクレオチド同一性（ANI）が99%以上のゲノムは、遺伝子の冗長性を減らすためにBlastP解析から除外され、合計877の非冗長ビフィズス菌ゲノムを含むカスタムデータベースが生成された（表S1）。興味深いことに、これら877ゲノムのうち、perB相同遺伝子を保持していたのは、27の異なるビフィズス菌（亜）種を網羅する201ゲノムのみであった（図1および表S2）。しかしながら、perBと配列相同性を持つ全遺伝子について、タンパク質ドメインのチェックとアミノ酸長の一致を詳細に検討した結果、8種のビフィズス菌のゲノムのみがperBと相同性を持つことが明らかになった、 Bifidobacterium aerophilum、B. bifidum、Bifidobacterium colobi、Bifidobacterium imperatoris、Bifidobacterium leontopitheci、Bifidobacterium saguini、Bifidobacterium samiriiの8種のビフィズス菌ゲノムと、B. longum subsp. longum株（表S1およびS2）は、FIVARドメインに対応するGH136触媒領域（Tarracchini et al、 2023）と完全長のperBホモログをゲノムに包含していた。逆に、perBホモログを持つ他の全てのゲノムは、複数のRibドメインをコードするBifidobacterium jacchiのperBホモログを除いて、FIVARドメインやperB遺伝子で同定された他のドメイン、すなわち分泌シグナルペプチド、様々なβヘリックスやRibドメイン（Tarracchini et al. perB遺伝子はムチンの分解に関与すると予測されるが、これはビフィズス菌属のB. bifidum種に特有の代謝機能であり、特定のB. longum亜種、B. longum亜種infantis、B. breve株は、ムチンの分解に特化した完全な遺伝子アーセナルを欠いているにもかかわらず、交差摂食事象によるムチン成分の細胞外放出を利用できる（Alessandri et al、 2021; Egan et al., 2016; Katoh et al., 2017, 2020）。さらに、少数の他の腸内細菌もムチンを分解することができる。すなわち、Akkermansia muciniphila、Ruminococcus gnavus、Ruminococcus torques、Phocaeicola vulgatus、およびBacteroides caccae、Bacteroides fragilis、Bacteroides thetaiotaomicronを含むBacteroides属の特定のメンバーである。このような細菌は、ノイラミニダーゼ/シアリダーゼ(GH33)、フコシダーゼ(GH29およびGH95)、エキソおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(GH84およびGH85)などのムチン関連糖鎖の分解をコードする様々な遺伝子を必要とする、 β-ガラクトシダーゼ（GH2、GH20、GH42）、α-N-アセチルグルコサミニダーゼ（GH89）、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（GH101、GH129）、スルファターゼ、GlcNAcリン酸脱アセチル化酵素（Hayase et al. , 2022; Kimら、2021、2023; Tailfordら、2015）。興味深いことに、ビフィズス菌の分類群に相当する上記の種は、ヒトまたはヒト以外の霊長類の糞便からのみ分離された（Bottaciniら、2017；Durantiら、2019、2020；Endoら、2012；Lugliら、2018、2021；Micheliniら、2016；Modestoら、2019）。これらの結果は、ヒトまたはヒト以外の霊長類の腸内ニッチにコロニー形成するように適応したビフィズス菌の種が、関連する競合的な腸内環境におけるコロニー形成と持続性をサポートするために、perBを特異的に獲得または進化させたことを示唆している。

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図1
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図2
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さらに、B. longum subsp. longumにおけるlnbX遺伝子の発現には、シャペロン分子LnbYが必要であることが証明されていることから（Sakurama et al. 興味深いことに、B. aerophilum、B. imperatoris、B. saguiniのみがゲノム中にlnbY相同体を示した（表S3）。このことから、このシャペロンをコードする遺伝子は、perBを含むすべてのビフィズス菌ゲノムで保存されているわけではなく、perBの発現と活性化は異なる制御を受けている可能性が示唆された。

さらに、perBがビフィズス菌属の一部のメンバーだけの遺伝的特徴であるかどうかを評価するために、ビフィズス菌を除外して、NCBI（National Center for Biotechnology Information）に含まれるすべての細菌ゲノムに対応する推定アミノ酸配列に対してBlastP解析を行った。興味深いことに、この解析によりビフィズス菌以外の細菌種にもperBホモログが存在することが明らかになった（表S4）。しかしながら、そのようなperBホモログ蛋白質の推論された蛋白質配列に存在する蛋白質ドメインを評価したところ、ビフィズス菌科のうちGardnerella vaginalisを除いたごく一部のみが、同定された全てのPerBドメインを共有しており、他の菌種で見つかった推定PerBホモログは機能ドメインを欠いているか、フィブロネクチンタイプIIIドメインを持っていることが示された（表S4）。フィブロネクチンタイプIIIドメインがヒト腸管上皮細胞への接着と相互作用に関与していると仮定すると（Alessandri et al.、2023）、これらの結果は、特定のビフィズス菌種／菌株に代表されるビフィズス菌科の特定のメンバーだけがperB遺伝子を持ち、perBがヒト腸内環境にコロニー形成して持続するための選択的・競争的優位性を与えていることを示唆している。

perB不活性化がB. bifidum PRL2010のムチン上での増殖およびムチンへの接着能力に及ぼす影響
ヒト腸管細胞にB. longum PRL2022を暴露したところ、コントロールと比較してperB遺伝子のアップレギュレーションが認められたという最近の研究のトランスクリプトーム結果に基づき（Tarracchini et al. ビフィズス菌株の腸内持続性の増強にperBが関与していることを検証するために、B. bifidumのプロトタイプ、すなわちB. bifidum PRL2010のムチン上で増殖し、ムチンに付着してネズミモデルの腸内環境で持続する能力を、同種のB. bifidum PRL2010perB変異体のそれと比較した。

ビフィズス菌、特にB. bifidumは細胞壁の組成や厚さ、制限修飾（R/M）系の作用により形質転換に難渋することが報告されているため（Sakaguchi, et al., 2012, O'Connell Motherway et al. まず、B. bifidum PRL2010のR/M認識部位をメチロームシークエンシング（Pacbio）とREBASEによるメチル化部位予測に基づいて同定した。メチローム解析は、菌株のエンドヌクレアーゼが認識する配列モチーフを同定するために行った。このエンドヌクレアーゼは、そのようなモチーフを含む外来性DNAが非メチル化であれば切断し、形質転換の効率を低下させる。PacBioシーケンスデータの解析により、2つのタイプI（CGAYNNNNNGGT、CAAYNNNNNCTC）と1つのタイプII（CTGCAG）のR/M認識モチーフが同定され、REBASEに基づくバイオインフォマティクス予測により、異なるタイプII部位（GTCGAC、GGCGCC、GCSGC、GAATTC）の存在が強調され、B. bifidum PRL2010のメチロームが明らかになった。その後、これらの認識モチーフが存在する場合は、目的のプラスミドであるpNZ003とpFREM30から除去し、株の形質転換効率を高めた（O'Callaghan et al.） pNZ44 (McGrath et al., 2001)の誘導体である最初のプラスミドを用いて、10E+06 CFU (colony-forming unit)/μgのpNZ003 DNAの効率に達するまで形質転換プロトコルを最適化した。最適化は、以前の研究（Serafini, et al., 2012）に基づき、エレクトロポレーション電圧や、株の増殖、形質転換、プレーティングに使用する増殖/洗浄/回収培地など、様々な重要な形質転換パラメーターを評価することで達成された。最適化の後、プラスミドpFREM28（Hoedtら、2021）の誘導体である統合ベクターpFREM30を採用し、B. bifidum PRL2010のperBを標的として破壊し、B. bifidum perB::pFREM30 を生成することに成功した。

次に、B. bifidum perB::pFREM30 がムチンを利用する能力について試験した。この目的のために、ムチンを唯一の炭素源として2つのin vitro増殖アッセイを行った。まず、B. bifidum PRL2010野生型（wt）とB. bifidum perB::pFREM30を、ラクトース無添加のmMRSと0.5%のムチンを添加したmMRSで増殖させ、変異株とwt株の間の増殖性能の違いの可能性を評価した（対照としてmMRS＋ラクトースを使用）。さらに、クロラムフェニコール の存在が、perB::pFREM30 のムチン上での増殖能に影響するかどうかを 評価するため、変異株をこの抗生物質の存在下と非存在下の両方で培養した。その後、mMRS寒天培地にプレーティングして各菌株の増殖を経時的（0、5、10、24、36、48時間）にモニターし、並行して生存率アッセイとフローサイトメトリーによる総細菌数を測定した（図3A,Bおよび図S2A）。

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図3
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興味深いことに、ムチンを添加した培地でもmMRSでも、抗生物質の存在下でも非存在下でも変異株を増殖させた場合、統計的に有意な差は認められなかった（ボンフェローニポストホック検定p値＞0.05）。従って、クロラムフェニコールの存在は変異株の増殖性能に影響しないようであったので、統合プラスミドの選択圧を維持するために、その後の増殖とムチンへの接着に関する実験はすべて、抗生物質の存在下で変異株を増殖させて行った。

さらに、プレーティング法で得られたムチン増殖アッセイデータを深く洞察した結果、5、10、24時間のタイムポイントでは、B. bifidum PRL2010 wtとperB::pFREM30の間に有意差は見られなかった（Bonferroni Post Hoc test p-value >0.05）（図3A）。逆に、36 時間および 48 時間の時点では、ムチンを唯一の炭素源として生育する B. bifidum PRL2010 wt において、有意に高い CFU 値が観察された（それぞれ 2.08E+08 CFU/mL ± 1.83E+07 および 1.19E+08 ± 5.74E+07）。 74E+07）、変異体（それぞれ5.69E+06 CFU/mL ± 1.79E+06、4.42E+06 ± 3.39E+06）と比較した（Bonferroni Post Hoc p-value<0.001、p-value = 0.008、それぞれ36時間、48時間）。したがって、変異株の増殖能力はwt株と比較して初期には同等であったにもかかわらず、おそらく両菌株に存在するムチン分解に関与する他の遺伝的決定因子（Eganら、2014；Turroniら、2010、2011）および／または部分精製ムチン中の汚染糖質の存在に起因している。これらのデータは、perB遺伝子の存在が、36時間および48時間におけるムチン上でのB. bifidum PRL2010 wt株の増殖／生存を促進し、支持していることを示唆している。

さらに、ムチンを唯一の炭素源として増殖したB. bifidum PRL2010 wt株とperB::pFREM30株をプレーティングして得られたデータは、フローサイトメトリーによる生存率アッセイと総細菌数を組み合わせて得られた生存細胞数を正規化したものを分析することでさらに確認された。実際、変異株はwt株と比較して、5時間後の総生細胞数がそれぞれ1.71E+07および1.13E+07と、わずかではあるが有意に高い増殖性能を示したものの、10時間を除く他のすべての時点では、B. bifidum PRL2010 wt株は変異株と比較して有意に高い生菌数を記録した（図S2）。これらの観察結果は、perBがムチン存在下でのB. bifidum PRL2010の増殖性能の向上に一役買っているという考えを支持するものである。

したがって、ムチンのような複雑な炭水化物にアクセスする能力は、少数の腸内微生物の担い手、特にビフィズス菌種に限られており、高レベルの栄養素獲得競争が起こる腸内環境での生存とコロニー形成の成功にとって極めて重要な特徴であると考えられていることから（Alessandriら、2021；Paone and Cani、2020）、これらの結果は、perBがヒト腸内におけるB. bifidum PRL2010のコロニー形成に役割を果たしているという仮説を支持するものである。

さらに、B. bifidum PRL2010がムチンのアンカーを介してヒト腸内での持続性を促進する際のperB遺伝子の影響を裏付けるために、B. bifidum PRL2010のwtおよびperB::pFREM30のヒトムチン分泌HT29-MTX細胞への接着能を評価した。興味深いことに、B. bifidum PRL2010 wt（接着指数146,499±577）と比較して、B. bifidum perB::pFREM30（接着指数62,001±260）では、HT29-MTXに対する接着指数（細菌の平均細胞数/100*HT29-MTX細胞数として計算）の統計学的に有意な減少（スチューデントのt検定p値<0.001）が観察された（図3C,D）。これらの結果は、perB遺伝子の不活性化がperB::pFREM30のムチンを利用する能力に影響を与えるだけでなく、ヒト腸管細胞への接着能力も低下させることを示している。

げっ歯類モデルを用いた腸管コロニー形成におけるperBの関与の評価
機能的なperB遺伝子が腸管コロニー形成の成功と競争環境下での持続性に寄与するかどうかを評価するため、B. bifidum PRL2010 wt株とB. bifidum perB::pFREM30 の腸管コロニー形成能力をげっ歯類モデルで試験した。まず、B. bifidum PRL2010 perB::pFREM30 を作製するために使用した統合 pFREM30 プラスミドの安定性を評価した。この目的のため、B. bifidum PRL2010 perB::pFREM30 を 5 μg/mL クロラムフェニコール存在下または非存在下で増殖させ、合計 2 週間毎日継代培養した。さらに、副培養の2日ごとに、細胞を抗生物質の有無にかかわらずmMRSプレートにスポットし、48時間培養後、コロニーPCRによって統合プラスミドの存在を確認した。この分析により、抗生物質の選択がない場合の統合プラスミドの経時的安定性が確認されただけでなく、両試験条件におけるコロニー形成単位（CFU）数が評価期間中安定したまま（10E+08 CFU/mL）であったことも確認された。プラスミドの安定性が確認された後、マウスモデルを用いたin vivo試験が行われた。後者は2群の動物で構成され、一方は約10E+09細胞/mlのB. bifidum PRL2010 perB::pFREM30 を1日1mL接種し（グループ1）、もう一方は同量のB. bifidum PRL2010 wtを接種した（グループ2）（図4A）。本研究に参加した動物の糞便サンプル中のB. bifidum PRL2010の存在量をqPCRを用いて評価した（図4B）。興味深いことに、qPCRから収集したデータを解析した結果、野生型と比較してB. bifidum perB::pFREM30のゲノムコピー数（GCN）のわずかな増加が観察されたとしても、菌株投与1週間目（T1）後の2群間でB. bifidum PRL2010の存在量に有意差は認められなかった（マン・ホイットニー検定p値＝0.694）。対照的に、B. bifidum perB::pFREM30 (7.11E+03 GCN/g ± 8.34E+03)と比較して、菌株投与2週間後(T2)にB. bifidum PRL2010 wt (7.23E+04 GCN/g ± 1.52E+05)のGCNの統計学的に有意な増加(Mann-Whitney検定 p値 <0.01)が観察された(図4B)。これらのデータから、両菌株の腸内環境へのコロニー形成能は初期には同程度であったにもかかわらず、長期間の介入期間中、野生型株はB. bifidum perB::pFREM30 と比較して、より効率的な腸内コロニー形成と高い持続性を示し、ネズミの糞便サンプル中の平均負荷量は10倍高かったことが示唆された。この知見は、洗浄期間（T3）後、野生型株がB. bifidum perB::pFREM30 （wt株およびperB::pFREM30株について、それぞれ7.56E+03±5.31E+03 GCN/gおよび4.41E+03±3.01E+03 GCN/g）よりも有意に高い存在量（Mann-Whitney検定p値＜0.05）を示したという観察結果によってさらに確認された（図4B）。さらに、我々は以前に、perBがヒトの腸管内で生涯を通じてビフィズス菌が持続することに関与していることを示したが、この遺伝子は男性と比較して女性ではビフィズス菌の効率的なコロニー形成に寄与しているようであることも示した（Tarracchiniら、2023）。そこで、B. bifidum PRL2010 wt株とperB::pFREM30株の雌雄ラットの腸内コロニー形成能の違いについても検討した。いずれの株についても、T1 および T2 において雌雄間で B. bifidum GCN に統計学的有意差は認められなかった（Bonferroni post hoc p-value >0.05）（図 S2）。bifidum PRL2010 wt（平均 GCN/g：5.98E+04）を投与した雌性群では、T2 において平均 B. bifidum GCN/g のわずかな増加が観察された（図 S2）ことから、ヒト宿主で以前に観察されたように、投与 2 週間後、perB の存在が雌性宿主における B. bifidum PRL2010 のコロニー形成能に有利な役割を果たす可能性が示唆された（Tarracchini et al、 2023). 検出限界は95％であった（NTCのCtに基づく）。一方、T3 においては、wt 株および perB::pFREM30 株のいずれにおいても、雄ラットの糞便検体では雌ラットに比べて B. bifidum の平均 GCN/g が有意に高い値を示した（Bonferroni post-hoc p-value >0.05）（図 S2）。これらの一見相反する結果は、ヒトとげっ歯類の間で腸管粘液組成に違いがあること（Hugenholtz & de Vos, 2018; Robinson et al.

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図4
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全体として、これらの結果は、perBがB. bifidum PRL2010の宿主コロニー形成をサポートし、腸内環境における同菌株の持続性を高めていることを示唆している。

結論
以前に同定されたムチン分解グリコシルヒドロラーゼPerBがビフィズス菌の腸内持続性に寄与していることを調べるため、まず現在認められている全てのビフィズス菌種におけるperBホモログの分布を調べたところ、GH136触媒ドメインに相当するFIVARドメインをコードする完全長のperBホモログをゲノム中に持つビフィズス菌は8種のみであることが明らかになった。これらの8菌種は、ヒトまたはヒト以外の霊長類の腸内環境に典型的にコロニー形成するビフィズス菌分類群に対応しており、これらのビフィズス菌種のみが、関連する競合的な腸内環境におけるコロニー形成と持続性をサポートするために、perBを特異的に獲得または進化させたことを示唆している。

この考え方は、ヒトのムチン産生細胞を用いたin vitro実験によって確認された。この実験では、ゲノムにperB遺伝子を持つ菌株、すなわちB. bifidum PRL2010と、その同種のperB陰性変異体が関与しており、ムチン上での増殖とムチンへの接着を促進する上でこの遺伝子の役割が強調されている。さらに、ネズミを用いたin vivo実験では、perBの不活性化によってB. bifidum PRL2010細胞が腸内環境にとどまる能力が低下し、その結果、野生株と比較してコロニー形成能力が低下することが明らかになった。したがって、我々の結果は、ヒト腸内環境におけるビフィズス菌のコロニー形成と持続性に関与するビフィズス菌の遺伝的決定因子がこれまでに特徴づけられてきたことに加え、perBもこれらの特異的機能に関与していることを示唆している（Alessandriら、2019、2021；Turroniら、2022）。とはいえ、PerBがムチン分解に関与していること、また以前に報告されたようにこの酵素はムチンだけでなくHMOも分解するようであることから（Sakurama et al.） 本研究の限界は、B. bifidum PRL2010の腸内コロニー形成におけるperBの関与を評価するためにマウスモデルを用いたことであるが、この遺伝子はヒトまたはヒト以外の霊長類の腸内に通常コロニーを形成するビフィズス菌種にのみ存在する。しかし、in vitroで得られた変異体を投与できないin vivo試験を避けるため、マウスモデルはヒトに関連する研究のためのゴールドスタンダードなモデル生物であり、現在もそうである。さらに、ビフィズス菌全体におけるGH136の役割を確認するためには、他のB. bifidum株やperB遺伝子を持つ他のビフィズス菌種に本研究で用いたプロトコールを適用することが必要であろう。

実験手順
ビフィズス菌ゲノム配列
2023年7月にNCBI公開データベースから、現在特徴づけられているすべてのビフィズス菌種を網羅する公開ゲノム（完全ゲノム配列およびドラフトゲノム配列）を検索した。重複ゲノム（ANI値＞99％）は遺伝的冗長性を避けるために除去され、最終的に813のビフィズス菌ゲノム配列からなるデータセットが得られた。

ビフィズス菌種におけるperBホモログの存在
公開されている各ビフィズス菌ゲノムの推定プロテオームについて、カスタム参照データベースとの配列類似性に基づいてperB相同体の有無をスクリーニングした。後者は、B. bifidumおよびB. longum subsp. longum株で過去に同定されたすべてのPerBタンパク質配列を考慮して得られた。後者は、B. bifidum株およびB. longum subsp. longum株で過去に同定されたperB遺伝子の4つの非冗長タンパク質配列（配列類似度<90%）から構成される（Tarracchini et al.） その後、すべての冗長配列（配列類似度90％以上）を除去した結果、4つ（B. bifidum株由来3つ、B. longum subsp. longum株由来1つ）の非冗長perBタンパク質配列からなるカスタムデータベースができ、これらの種におけるこの遺伝子の遺伝的変異性を網羅した。BlastP解析はDIAMONDソフトウェア（Buchfink et al.） さらに、Pfam v34.0（https://pfam.xfam.org/）、InterPro 86.0（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）、HMMER（http://hmmer.org/）を用いてタンパク質ドメインを同定した。公開されている各ビフィズス菌ゲノムの推定プロテオームも、lnbXおよびlnbY相同体の存在についてスクリーニングした。

菌株、プラスミド、培養条件
プラスミドpNZ003はpNZ44プラスミド（McGrathら、2001）の誘導体であり、プラスミドpFREM30はpFREM28（Hoedtら、2021）の誘導体であり、遺伝子破壊による変異誘発のためにperBを標的にするために使用される自殺ベクターである。これら2つのプラスミドとその誘導体の構築について以下に記述する。Escherichia coli EC101 (Law et al., 1995)を、前述のプラスミドの増殖のための宿主株として用い、最終濃度25μg/mLのクロラムフェニコールを添加したLB培地（Luria Bertani, Scharlab, Spain）中、37℃で培養した。B. bifidum PRL2010は、嫌気チャンバー（Davidson and Hardy; Belfast; United Kingdom）内で、0.05%システイン-HClと2%ラクトース（mMRS）を添加したグルコース無添加の修正デ・マン-ロゴサ-シャルペ（MRS）培地で、37℃、ブロスでは24時間、寒天培地では48時間培養した。ビフィズス菌形質転換体または変異体の培養には、mMRS培地に5μg/mLのクロラムフェニコールを添加した。本研究で使用したB. bifidum PRL2010株は、母乳栄養児の糞便サンプルから分離したビフィズス菌株である（Turroni et al.）

B. bifidum PRL2010株のメチローム予測
特定のプラスミド上に存在し、B. bifidum PRL2010がコードする内在性R/M系が標的とする制限および修飾（R/M）部位を除去するため、REBASEデータベース（http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html）を用いてB. bifidum PRL2010ゲノムを評価し、Pacific Biosciences（PacBio）シーケンシングプラットフォームを用いてゲノムの塩基配列を決定することにより、B. bifidum PRL2010のメチロームを予測した。PacBioシーケンスでは、B. bifidum PRL2010を0.05%システイン塩酸添加MRSブロスで600nmの光学密度（OD600）が約0.6になるまで培養した。収穫したPRL2010細胞からGenElute Bacterial Genomic DNAキットを用いてゲノムDNAを抽出し、PacBio Sequel IテクノロジーとSMRTセル（Macrogenサービス）を用いて塩基配列を決定した。PacBioシーケンスリードを処理し、B. bifidum PRL2010の配列にマッピングした。パルス間持続時間は前述の方法で測定した (Murray et al., 2012)。メチル化位置を同定するために、PacBio SMRTPortal解析プラットフォームを採用し、インシリコ動力学リファレンスとt検定ベースの動力学スコアによる修飾塩基位置の検出を行った。

プラスミド操作と構築
プラスミドpNZ003は、その前身であるpNZ44（McGrath et al., 2001）に存在する3つの異なるR/M部位を、表1に示すプライマーを用いたPCRで除去して得た。プライマーpNEW_002、pNEW_003、pNEW_001、およびpNEW_004を用い、Q5ポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いてpNZ44プラスミドを増幅した。精製（GeneJet Gel Extraction Kit-Thermo Fisher Scientific）後、得られたアンプリコンをApaLIおよびEsp3I（New England Biolabs）で消化し、ライゲーション（T4 DNAリガーゼ、New England Biolabs）し、化学的にコンピテントな細胞（Hanahanら、1991）のための修正プロトコルを用いて調製した大腸菌EC101の形質転換に使用した。形質転換体を25μg/mLクロラムフェニコール添加LBで選択し、個々の形質転換体をコロニーPCRで期待されるプラスミドの存在についてスクリーニングした。プラスミドpFREM30は、クロラムフェニコール遺伝子（CmR）をプライマーCLMC_207およびCLMC_208で、pFREM28（Hoedtら、2021）のバックボーンをプライマーCLMC_009およびCLMC_010で増幅することにより得た。DNA断片精製（GeneJet Gel Extraction Kit, Thermo Fisher Scientific）の後、生成したアンプリコンを用いて、IIS型酵素SapI（New England Biolabs）を利用したゴールデンゲートクローニング法（Engler & Marillonnet, 2014）を用いてプラスミドpFREM30を得た。反応産物を、化学的にコンピテントな細胞のプロトコールに従って、大腸菌EC101に導入した。その後、25μg/mLのクロラムフェニコール添加LBで増殖させたコロニーをコロニーPCRでスクリーニングし、予想される組換えプラスミドpFREM30の存在を確認した。

表1. 使用したすべてのプライマーのリスト。
ターゲットプライマー プライマー配列5′-3′。
pNZ003 PNEW_001 AACAATGTGCACGACGCGATTATGCGACGCGTGCATGCGGGTACCACTAGTTC
pnew_002 cgcgtcgtgcacattgttagatctggagctgtaataaaaaccttctc
PNEW_003 GATCGACGTCTCAGCTGCTAGTAGAATGCAAGAAG
PNEW_004 GATCGACGCTCAGCAACCGAGATTGAAAAACC
pFREM30 CLMC_009 GATCGCTTCTCCACCAAAACCGAAATCCAC
CLMC_010 GATCGCTCTTACCAAACCGAAATCCAC
CLMC_207 GATCGCTCTTCCGGATTAAAAGCCAGTCCATAGCCTGAC
CLMC_208 GATCGCTCTTCTATGAACTTTAATAAAATGATTAGACAATGAGAG
PFREM30 MCST
ATATCGCTGTACCGGTACGAAGCTTACGCGTAGAGCTATAGG

atatcgccgtgctcgagt

PFREM30 MCSB
ATATTCTAGACTCGAGCACGCGATCCATGACGTCTACGCGTAAG

cttcgtgcaccccgggtac

コロニーPCRスクリーニング
LMV_015

LMV_016

CLMC_022

cgcagcagcggtcgctatg

GAAGTTGAGTACGCTGTAGC

gccaacgttttcgccaacg

perB遺伝子
LMV_011

LMV_012

TATTGGTGCACGGCGTCAAGG

ggtatgtctagaccgccgttggccatgtgc

qPCR
BBPR_0282_FW

BBPR_0282_RV

gcgaacaatgatggcaccta

gtcgaacacgacgatgt

プラスミドpFREM30-perBを構築するために、Q5ポリメラーゼとプライマーLMV_011およびLMV_012を用い、染色体B. bifidum PRL2010 DNA（GenElute Bacterial Genomic DNA kit, Sigma, Germany）からPCRによって標的遺伝子の内部領域を増幅した。プラスミドDNAは、GeneJET Plasmid Maxiprep Kit（Thermo Fisher Scientific, USA）を用いて大腸菌から単離した。アンプリコンとプラスミドをApaLIとXbaIで消化し、ライゲーションし、既報のように大腸菌EC101に導入した(Hanahan et al., 1991)。形質転換体を選択するために、操作した細胞を25μg/mLクロラムフェニコール添加LB上にプレーティングし、コロニーをコロニーPCRによって期待されるプラスミド構築物の存在についてスクリーニングした。

DNAエレクトロポレーション用ビフィズス菌細胞の調製
一晩培養したPRL2010を、7%(v/w)のスクロースを添加した新鮮なmMRSブロス（sMRS）に接種し、指数関数増殖期、すなわちOD600が0.5～0.6になるまで37℃で培養した。その後のプロトコールは、細胞を氷上で冷蔵保存して行った。具体的には、遠心分離（4500g、10分間、4℃）により細胞を回収し、氷冷したクエン酸-スクロース緩衝液（0.5Mスクロース、pH5.8）で2回洗浄し、エレクトロポレーション前に同じ緩衝液250μLに再懸濁した。

エレクトロポレーションとPRL2010変異体の選択
クエン酸-スクロース緩衝液（pH5.8）に懸濁した濃縮細菌細胞100μLを、電極間距離0.2cmの予冷済み使い捨てエレクトロポレーションキュベット（Cell project社、英国ケント）中でプラスミド1.5μgと混合した。200Ωの抵抗、25μFの容量、2.5kVの電圧を、Gene Pulser装置（BioRad, UK）を用いて印加した。細胞エレクトロポレーション後、バクテリアを950μLのsMRSに懸濁し、嫌気キャビネット内で37℃、3時間インキュベートした。この後、細胞を5μg/mLのクロラムフェニコール添加sMRS寒天培地にプレーティングし、37℃で48時間嫌気培養した。遺伝子標的領域外の染色体遺伝子にアニールするプライマーLMV_015とLMV_016、および(統合)pFREM30プラスミドにアニールするプライマーCLMC_02を用いたコロニーPCRによって、変異体の可能性をスクリーニングした。予想されるアンプリコンのサイズは、それぞれ約2000bpと800bpである。得られたアンプリコンは、予想される相同組換えを介した統合イベント後に予想される塩基配列をさらに確認するために、塩基配列決定（Sanger）に送られた。すべてのプライマー配列を表1に示す。

変異体の安定性
組み込まれたpFREMプラスミドの安定性を評価するために、スポットアッセイを行い、コロニーPCRによってプラスミドの存在を確認した。このアッセイのために、B. bifidum perB::pFREM30を、5μg/mLのクロラムフェニコール添加または無添加のmMRSブロスで培養した。毎日、合計14日間、培養液のアリコートを新鮮な培地で継代培養し、2日ごとに、2つの増殖条件の一晩培養液を連続希釈（1.00E-04、1.00E-05、1.00E-06）し、5μg/mLのクロラムフェニコールありまたはなしのmMRSプレートにスポットした。プレートを 37℃で 48 時間嫌気培養した後、プライマー LMV_015 と LMV_016 を用いてコロニー PCR を行った。実験は3連で行った。

ムチン増殖アッセイ
ムチン利用における相違の可能性を評価するため、B. bifidum PRL2010 野生型（wt）と B. bifidum perB::pFREM30 を mMRS で指数増殖期に達するまで一晩培養し、変異株には 5 μg/mL のクロラムフェニコールを添加した場合と添加しなかった場合を比較した。その後、菌株をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Sigma, Germany）で2回洗浄し、唯一の炭素源として0.5%ムチン（ブタの胃から-タイプIII、Sigma, Germany）を添加したmMRSとmMRSの最終容量20mLに接種し（両培地とも変異体には5μg/mLのクロラムフェニコール添加の有無にかかわらず）、OD600～0.1の最終接種量とした。細胞は生物学的に独立した3反復で増殖させた。細菌培養液のアリコートを異なる時点（0、5、10、24、36、48時間）で採取し、以下に述べるように、フローサイトメトリーを用いて生存率アッセイと総細菌数カウントを行った。各アリコートをmMRS寒天培地に平行してプレーティングした。菌の増殖は、コロニー形成単位の計数により評価した。

フローサイトメトリーによる細菌細胞密度の評価と生存率アッセイ
総細胞数については、各培養複製を生理的溶液（PBS）で10万倍に希釈した。その後、得られた細菌細胞懸濁液1mLを、1μLのSYBR®Green I（ThermoFisher Scientific, USA）（ジメチルスルホキシドで1：100希釈；Sigma, Germany）で染色し、ボルテックスし、37℃で暗所、測定前に少なくとも15分間インキュベートした（Alessandriら, 2022; Vandeputteら, 2017）。細菌細胞生存率アッセイには、LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit（ThermoFisher Scientific、米国）の蛍光色素SYTO9（3.34 mM）とヨウ化プロピジウム（PI；20 mM）を、製造元の説明書に従って使用した。具体的には、1サンプルにつき5種類の希釈細胞チューブ（各最終容量1mL）を得た。そのうちの1本を2515gで8分間遠心分離し、上清を捨て、微生物細胞ペレットを70％イソプロピルアルコールに1時間懸濁して微生物細胞膜を透過させ、細胞死を誘導した。処理した細胞を遠心分離し、PBSに再懸濁し、1.5μLのPIを加えて染色した。他の2本のチューブは2種類の色素のうち1.5μLで染色し、4本目のチューブは染色しなかった。最後に、最後のチューブをSYTO9とPIの両方で染色した。染色後すぐにサンプルをボルテックス混合し、暗所で室温で15分間インキュベートした。装置のパラメータ調整のため、単一染色サンプルとイソプロピルアルコールに暴露したサンプルをコントロールとして使用し、染色していない細胞をバックグラウンドコントロールとして使用した。

計数実験と生存率実験の両方を、青色レーザーを50mWに設定し、励起波長488nmに調整したAttune NxTフローサイトメトリー（ThermoFisher Scientific、米国）を用いて行った。マルチパラメトリー解析は、前方散乱（FSC）と側方散乱（SSC）の両散乱シグナルに対して行い、蛍光はBL1 530/30 nm光学検出器で検出した。細胞残屑は、BL1の閾値を設定することで取得解析から除外した。さらに、ゲーティングされた蛍光イベントは、前述したように、残りのバックグラウンドイベントを除外し、正確な微生物細胞数を得るために、前方横方向の密度プロットで評価された。すべてのデータはAttune NxTフローサイトメトリーソフトウェアで解析した。

B. bifidum PRL2010のHT29-MTX細胞への接着
HT29-MTX細胞へのビフィズス菌接着は、以前に記載されたプロトコール（Guglielmettiら、2008；Rizzoら、2023；Serafiniら、2013）を若干改変して評価した。簡単に説明すると、ヒト結腸癌由来ムチン分泌杯HT29-MTX細胞（ミラノ大学Antonietta Baldi教授のご厚意により提供）を、以前に記載されたように、高グルコース（4.5g/L）を添加した最小必須培地（MEM）中で培養した（Bianchi et al.） 培地は、10％ウシ胎児血清（FBS）、4mMグルタミン、100μg/mLストレプトマイシン、100U/mLペニシリン、および10mM HEPESで補充した。実験のために、HT29-MTX細胞を10cm2のペトリ皿にあらかじめ沈めておいた顕微鏡用カバーガラス上に播種した。細菌細胞を添加する前に、細胞をPBSで注意深く2回洗浄した。B. bifidum PRL2010 wt株とB. bifidum perB::pFREM30株を、1.00E+08 cells mL-1の濃度に達するまで、前述のように増殖させた。その後、2株を5000gで8分間遠心し、PBSに再懸濁し、HT29-MTX細胞とインキュベートした。37℃で1時間培養後、細胞を2 mLのPBSで2回洗浄し、結合していない細菌を除去した。次に細胞を1mLのメタノールで固定し、室温で8分間インキュベートした。最後に、細胞を1.5 mLのギムザ染色液（PBS中1:20）（Sigma Aldrich, Milan, Italy）で染色し、暗所、室温で30分間インキュベートした。2mLのPBSで2回洗浄した後、カバーグラスをペトリ皿から取り出し、スライドグラスにマウントし、Leica DM 1000位相差顕微鏡（対物レンズ：100X/1.4 oil）で観察した。無作為に選んだ20顕微鏡野の付着細菌を数え、平均した（Rizzoら、2023）。HT29-MTXに付着したままの細菌細胞の割合を求め、宿主と微生物の特異的相互作用の程度を反映させた。接着指数は、20個のランダムスポットでカウントされた細菌細胞の平均数/（HT29-MTX細胞数100）として計算される（Guglielmettiら、2008）。

倫理声明
動物を用いたすべての実験手順およびプロトコルは、動物実験に関するイタリアの法令（D.L. 04/04/2014, n. 26, authorization n° 370/2018-PR）により承認され、2010年9月22日付の欧州共同体理事会指令（2010/63/UE）に従って実施された。

動物飼育とin vivo実験のデザイン
in vivoげっ歯類実験には、パルマ大学で繁殖された5週齢のWistarラットの雄10匹と雌10匹を用いた。離乳後、ラットは個々にポリメチルメタクリレート製ケージに入れられ、湿度（50％±10％）と温度（22±2℃）を制御した部屋で、12時間の明暗サイクル（午前7時に点灯）に維持され、餌と水は自由に摂取できた。in vivo試験の最初の1週間は馴化期間とし て、ラットに標準的なチャウ食を与え、注射器から500 μLのスクロース溶液（2%）を経口投与し、この投与方法に適応させた（図4）。その後2週間（介入期間）、ラットを無作為に対照群（B. bifidum PRL2010 wt投与）と処理群（B. bifidum perB::pFREM30投与）に均等に分け、いずれも1日1回、特定菌株を1.00E+09個/mL経口投与した（図4）。介入期間の各日について、ビフィズス菌細胞を遠心分離により採取し、PBSで洗浄した後、ラットに経口投与するために1mLのスクロース溶液（2%）に懸濁した（10E+09細胞/mL）。

各群にメス5匹、オス5匹を含めた（Kissら、2019）。最後に、最終週はウォッシュアウト期間に相当した（図4）。

in vivo実験中、新鮮な糞便サンプルを3つの異なる時点で採取した。糞便サンプルは、ビフィズス菌株投与1週目後（T1）、投与2週目後、およびウォッシュアウト終了時（それぞれT2およびT3）に採取した（図4）。各糞便採取の1時間前にケージの砂を交換した。その後、朝に新鮮な糞便サンプルを採取し、分析まで-20℃で保存した。

DNA抽出とqPCR分析
採取したラットの糞便サンプルの0.2 gを、QIAmp DNA Stool Mini kitを用い、メーカーの説明書に従って個別にDNA抽出を行った（Qiagen, Germany）。その後、B. bifidum PRL2010特異的プライマーを用いて定量的PCR（qPCR）を行った： BBPR_0282_FWおよびBBPR_0282_RVを用いた（表1）。これらのプライマーは、in vitroおよび/またはin vivo条件下でB. bifidum PRL2010細胞を特異的に同定するために以前に設計および試験されていた(Duranti et al., 2016; Turroni et al., 2013, 2015, 2016)。qPCRは、以前に記載されたプロトコル(Milani et al., 2015)に従って、CFX96システム(BioRad, CA, USA)上でPowerUp SYBR Greenマスターミックス(Applied Biosystems, USA)を用いて行った。PCR産物はSYBR green蛍光色素を用いて検出し、以下のプロトコールに従って増幅した：95℃で2分間の1サイクル、続いて95℃で15秒間、58℃で15秒間、72℃で1分間の40サイクル。陰性コントロール（DNAなし）を各走行に含めた。標準曲線は、GenElute 細菌ゲノム DNA キット（Sigma-Aldrich）を用いて抽出した B. bifidum PRL2010 染色体 DNA を用い、CFX96 ソフトウェア（BioRad）を用いて製造者のガイドに従って作成した。

統計解析
SPSSソフトウェア（www.ibm.com/software/it/analytics/spss）を使用し、Bonferroniポストホック多重比較付きANOVA、Student's t-test、ノンパラメトリックMann-Whitney検定などの統計解析を行った。

著者貢献
Sonia Mirjam Rizzo：データキュレーション（均等）、正式分析（均等）、調査（均等）、検証（均等）、可視化（均等）、執筆-原案（均等）。ラウラ・マリア・ヴェルニャ データキュレーション（対等）、正式分析（対等）、調査（対等）、検証（対等）、視覚化（対等）、執筆-原案（対等）。ジュリア・アレッサンドリ：データキュレーション（支援）、正式分析（支援）、調査（支援）、検証（同等）、視覚化（同等）、執筆-原案（支援）。Ciaran Lee: 概念化（同等）、資金獲得（同等）、監督（同等）。フェデリコ・フォンタナ： データキュレーション（同等）、形式的解析（同等）。Gabriele Andrea Lugli: データキュレーション（均等）、正式分析（均等）。ルカ・カルネヴァリ 概念化（同等）、監督（同等）、検証（同等）、視覚化（同等）。マッシミリアーノ・G・ビアンキ： 概念化（同等）、調査（同等）、監督（同等）、検証（同等）、視覚化（同等）。マルゲリータ・バルベッティ：調査（同等）、検証（同等）、視覚化（同等）。ジュゼッペ・タウリーノ 検証（支援）；視覚化（支援）。アンドレア・スゴイフォ 構想（対等）、リソース（対等）、監督（対等）、執筆-レビューおよび編集（対等）。オヴィディオ・ブッソラーティ 構想（対等）、リソース（対等）、監督（対等）、執筆-校閲・編集（対等）。フランチェスカ・トゥローニ フランチェスカ・トゥローニ：構想（対等）、資金獲得（対等）、プロジェクト管理（対等）、リソース（対等）、監督（対等）、執筆-査読・編集（対等）。Douwe van Sinderen： コンセプト立案（同等）、資金獲得（同等）、プロジェクト管理（同等）、リソース（同等）、監督（同等）、執筆-レビューと編集（同等）。マルコ・ヴェントゥーラ コンセプト立案（対等）、プロジェクト管理（対等）、リソース（対等）、監督（対等）、執筆-レビューおよび編集（対等）。

謝辞
GenProbio srlのLaboratory of Probiogenomicsからの資金援助に感謝する。本研究の一部は、パルマ大学のハイパフォーマンス・コンピューティング（HPC）施設で行われた。D.v.S.はアイルランド政府の国家開発計画（助成金番号SFI/12/RC/2273-412 P1およびSFI/12/RC/2273-P2）を通じてアイルランド科学財団（SFI）から資金援助を受けているAPCマイクロバイオーム研究所のメンバーである。C.L.は欧州連合（EU）のHorizon 2020研究革新プログラム（Marie Skłodowska-Curie助成金契約番号883766）の助成を受けた。F.T.は、Bando 414 Ricerca Finalizzata（助成金番号GR-2018-12365988）を通じてイタリア保健省から資金提供を受けた。M.V.は、「Fondo per il Programma Nazionale di Ricerca e Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN)」、Ministero della Ricerca e dell'Università (20229LEB99)から資金提供を受けた。L.M.V.は、イタリア大学研究省の資金援助を受けている。国家復興・強靭化計画（NRRP）、Azione IV.4-Dottorati e contratti di ricerca su tematiche dell'innovazione、イタリア大学研究省は欧州連合（EU）の資金援助を受けている-NextGenerationEU、CUP番号： D91B21004630007、プロジェクト名 "微生物の生物多様性、環境の持続可能性、生態系構成員の生命への影響"

利益相反声明
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

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