SARS-CoV-2 RBDブースターワクチン接種の延長は、マウスの体液性および細胞性免疫寛容を誘発する

記事|25巻12号105479、2022年12月22日号
SARS-CoV-2 RBDブースターワクチン接種の延長は、マウスの体液性および細胞性免疫寛容を誘発する
高峰霞 4
Rui-Xin Wu 4
沈美鶯
Qian Chen
王 旺
金愛駿（ジン・アイシュン）5
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脚注を表示するオープンアクセス公開日:2022年11月02日DOI:https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105479
PlumX メトリクス

ハイライト

長期間の免疫により、血清中和活性が損なわれた

長期間の免疫により、胚中心形成が抑制された。

長期免疫により、CD8+T細胞の活性化が抑制された。
まとめ
中和エスケープ変異を有するSARS-CoV-2亜型の出現が相次ぐ中、ワクチンブースターの反復投与が検討されているが、その予防効果や副作用はほとんど不明である。我々は、Balb/cマウスを用い、RBD（receptor binding domain）ワクチンブースターによる長期接種と従来の免疫戦略による免疫応答を比較検討した。また、CD4+およびCD8+T細胞の活性化を著しく阻害し、これらのT細胞におけるPD-1およびLAG-3の発現を増加させた。メカニズム的には、RBDブースターの長期接種が、適応免疫寛容を促進することにより、保護免疫記憶を覆すことが確認されました。この結果は、SARS-CoV-2ワクチンのブースターを継続的に使用することの潜在的なリスクを示し、世界的なCOVID-19ワクチン接種強化戦略に直接的な示唆を与えるものである。

図解要約
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対象分野
免疫反応
微生物学
細胞生物学
はじめに
COVID-19の防御戦略において、ワクチンは中心的な役割を担っている。世界保健機関（WHO）が緊急承認したCOVID-19ワクチンの大半は、SARS-CoV-2スパイクタンパクの受容体結合ドメイン（RBD）を最低限含んでいる。これらのワクチンの従来コースは、SARS-CoV-2に対して高度な効果を示すが、その中和効力は、頻繁に出現する変異型によって絶えず挑戦されてきた（Chakrabartiら、2022；Thiruvengadamら、2022；Zhouら、2021）。2021年後半以降、SARS-CoV-2オミクロン変種が世界的な優勢を追い越し、疫学研究により、相当レベルのワクチン突破感染と再感染が確認されている（Atmarら、2022年；Wallsら、2022年）。これらの問題に遭遇し、基本ワクチン接種終了後の成人に対するブースターワクチン接種の使用が許可されました（Tanne, 2022）。蓄積されたエビデンスは、最初のワクチンブースターの使用が安全かつ有効であり、オミクロン変種に対する有効性が向上した高い中和抗体価を産生できることを示した（Cerqueira-Silvaら、2022；Elliottら、2022）。しかし、1回のブースター接種後の血清防御能は時間とともに低下することが示され、これにより免疫者は再び新たに出現したSARS-CoV-2亜種による継続的なリスクにさらされやすくなった。このため、2回目のブースターワクチンの投与、あるいはブースターを用いた定期的なワクチン接種が注目されたが、これに関する情報はほとんどなかった。COVID-19予防の実践的な分野において，追加ブースターワクチン使用の推奨条件，強化注射の推奨回数，ブースターワクチンの継続投与による潜在的な副作用など，関連する疑問に適切に対処するためには，さらなる情報が必要であった．
皮下または筋肉内注射後、ワクチンの可溶性抗原は活性化B細胞に提示されて胚中心を形成し、さらに抗原特異抗体を分泌する形質細胞や記憶細胞に分化する（Ledererら、2022；Young and Brink、2021）。一方、ワクチン上の加工されたT細胞エピトープは、MHC-I分子によってT細胞表面受容体（TCR）に提示され、T細胞を活性化し、エフェクターT細胞に分化して、毒性分子を産生する保護細胞性免疫を発揮できる（Fahrner et al, 2022; Naranbhai et al, 2022）。ブースターワクチンによる継続的な免疫に伴う大きな懸念の1つは、同じ刺激に対する系統的な免疫の反応ウィンドウが相対的に制限されることである。外来抗原刺激が免疫寛容を誘導することが報告されており、これは、抗原特異的抗体の産生およびエフェクターT細胞の活性化の不能または低効率として現われる（Linら、1998；Rizzutoら、2022）（Hanら、2013）。現在のところ、RBDワクチンブースターの長期投与が防御免疫を再確立できるのか、あるいは免疫寛容を誘発しやすいのかは不明である。
ここでは、Balb/cマウスモデルを用いて、RBD組み換えタンパク質を用いたブースターワクチンの長期コースに対する免疫応答を縦断的および横断的に評価した。その結果、従来の免疫コースでは、持続的なレベルの中和抗体を刺激し、抗原特異的なCD4+およびCD8+T細胞反応性を促進できることがわかった。しかし、ワクチン接種を継続すると、顕著な適応免疫寛容の形成が促進され、抗原特異的抗体およびT細胞反応の著しい低下、免疫記憶の喪失、免疫抑制微小環境の形成により、従来のコースで確立した免疫反応が著しく損なわれることが明らかとなった。この結果は、SARS-CoV-2ワクチン接種のブースターコースの延長に伴う潜在的なリスクを示し、ホモロジーブースターワクチンの戦略的使用に直ちに影響を与えるものであった。
結果
延長免疫は、マウスにおけるRBD特異的抗体産生を促進しなかった
ワクチンブースターが有益な効果をもたらすかどうかを調べるため、6週齢の雌性Balb/cマウスに、高純度SARS-CoV-2 RBD組み換えタンパク質を4回免疫する従来の戦略(Conventional group)に続いて、RBDワクチンを追加投与しました(Extended group)（図1A )。以前報告したように (Gao et al., 2021) 、RBD特異的IgG抗体のレベルは、2-3週間の投与間隔で用量依存的に増加することが分かりました (図1B)。具体的には、4回目の免疫で安定したレベルの抗体産生が確認され、その後6週間にわたって維持された（図1B）。しかし、その後の免疫によってRBD特異的IgG抗体の力価は徐々に低下し、RBDブースターワクチンの2回目の注射後に有意差が検出された（図1Bおよび1C）。血清中のIgGサブクラス分布はTh1またはTh2（Tヘルパー細胞、Th）に偏った免疫を示すため、RBDワクチンによって誘導されたIgGサブクラス抗体反応を解析しました。ELISAの結果、免疫したマウスの血清中にはRBD特異的IgG1とIgG2aの両方が検出された。IgG1抗体価はIgG2a抗体価より有意に高く、RBDワクチンは血清IgG1抗体を優先的に増強することによりTh2様応答を誘導することが示されました（図1Dおよび1E）。また、複数回のブースターを接種したマウスのIgG1抗体価は、ブースターを接種していないマウスと比較して有意に低い値を示しました。これらの結果から、RBDワクチンはTh2型が優位なRBD特異的抗体産生を促すことができるのに対し、RBDブースターワクチンの添加はマウスのRBD特異的抗体産生を増強しないことが示唆されました。
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図1延長免疫では、マウスのRBD特異的抗体産生は増強されなかった
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延長免疫による血清中和抗体反応の低下
次に、免疫したマウス血清から得られたこれらのRBD特異的IgG抗体の中和能を測定しました。競合ELISA法の結果、RBDを免疫したマウスの血清はhACE2に対して競合的な効力を示すことがわかった（図S1A）。両群の血清は高濃度でRBDに対して100%に近い競合結合を示すことができましたが、免疫コースの延長により、従来のワクチン接種群と比較して高希釈倍率での抑制効果が有意に減少しました（図S1A）。さらに、RBDを免疫したマウス血清のSARS-CoV-2およびその新しく出現した変異型疑似ウイルスに対する中和抗体活性を評価した。疑似ウイルス中和実験の結果からわかるように、両免疫群の血清は中和効率を示すことが確認された（図2A-2C , S1B, S1C）。デルタとオミクロンに対する幾何平均力価は、野生型疑似ウイルスと比較して、2.5倍から4倍の範囲で減少していることがわかった（図2A〜2C）。なお、延長群のマウス血清は、3種類の疑似ウイルスすべてに対して、各試験に対応するIC50の低下によって示されるように、中和能の著しい低下が見られた（図2A〜2C）。以上の結果から、RBD組み換えタンパク質を免疫することで、Balb/cマウスのSARS-CoV-2およびその亜種に対する中和抗体反応が得られるが、これはワクチンブースターの長期投与により深刻な影響を受ける可能性があることが示唆された。
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図2免疫延長による血清中和抗体反応の低下
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延長免疫によりRBD特異的メモリーB細胞の産生が抑制された
延長投与による中和抗体影響の潜在的メカニズムを探るため、各群の最終注射から1週間後の免疫マウスの血液中の総リンパ球を用いてフローサイトメトリー解析を行いました。その結果、CD19-CD138+形質細胞の割合が両群で有意に上昇し、免疫期間の延長により顕著な減少が観察された（図3A ）。また、最終免疫後7日目のメモリーBの割合を、マウスの脾臓サンプルを用いたフローサイトメトリー解析により測定した。その結果、CD19+ CD27+ B細胞の集団は、2回の免疫群ともPBS対照群に比べ有意に増大していたが、延長群からは従来の接種試料に比べメモリーB細胞の割合の著しい減少が検出された（図3B）。メモリーB細胞は、TLR受容体アゴニストR848とIL-2による共刺激でプラズマ細胞への分化を誘導することができる。メモリーB細胞から分泌された抗体は、それぞれELISPOTおよびELISAアッセイによって検出された。ELISPOTおよびELISAアッセイの結果から、従来の免疫および延長免疫の両方がRBD特異的メモリーB細胞の産生を効率的に誘導し、後者が有意に低いレベルであることが示された（図3C、3DおよびS1D）。B細胞の増殖と分化はIL-4とIL-5によって促進されるため、免疫したマウスの血清中のこれらのサイトカインのレベルもELISA法で分析した。その結果、RBD組換えタンパク質はIL-4とIL-5の産生を著しく増加させることができたが、IL-4またはIL-5のいずれかの血清レベルは、延長接種によって比較的に低くなった（図3Eおよび3F）。以上のことから、RBDブースターワクチンの追加接種は、RBD特異的体液性免疫の喪失を招き、免疫寛容を促進する可能性があることが実証された。
図サムネイルgr3
図3延長免疫によるRBD特異的メモリーB細胞産生の抑制
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延長免疫による胚中心形成の抑制
抗原曝露後、活性化された抗原特異的B細胞は、それまで活性化していたT細胞の一部をTfh細胞へと分化誘導し、この細胞はケモカイン受容体CXCR5を高度に発現してリンパ濾胞へと引き込まれ、胚中心形成と機能に重要な役割を果たす。さらに、胚中心形成に関連して、GC B細胞が抗原刺激後にメモリーB細胞および宿主に有効な長期液性免疫を与える形質細胞に分化する効率を評価するために、検討を行った。マウス脾臓サンプルのフローサイトメトリー解析により、通常免疫群ではCD19+ GL7+ Fas+ B細胞の割合が有意に増加した（図4A ）。予想通り、生殖細胞中心反応は延長免疫によって消失し、PBS対照とほぼ同じレベルまで低下した（図4A）。並行して、胚中心B細胞マーカーであるPNAの発現を免疫蛍光染色で検出した。その結果、マウスの脾臓の陽性染色B細胞は、従来のワクチン接種を受けた動物のものとは対照的に、延長群では著しく減少しており、ブースターワクチンの2回接種によってGCの形成が損なわれていることが確認された。(図4B)。我々はまた、免疫マウスの脾臓におけるCD4+ CXCR5+ PD-1+ Tfh細胞の割合を分析し、従来のグループからの有意に上昇したTfh集団とは対照的に、延長免疫によってこれらのTfh細胞の集団がPBSコントロールからのものと同レベルまで減少することを見出した(図4C)。これらの結果から、通常の免疫後にRBDブースターワクチンを接種しても、マウス脾臓の胚中心反応を誘導・上昇させることはできないことが確認され、複数回のブースターは免疫反応ではなく、寛容を誘導する可能性があることが示唆された。
図1.図2.図3.図4.図4
図4免疫の延長による胚中心形成の抑制
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延長免疫によりCD4+T細胞免疫応答の活性化が抑制された
延長免疫による体液性免疫の不利が観察されたので、2つのワクチンコースに対する細胞性免疫応答に違いがあるかどうかを調べることに移った。CD4+T細胞の活性化は、対応するマーカーのフローサイトメトリー分析によって解析された。両方の免疫コースは、CD69+またはCD137+T細胞の割合を著しく増加させることができたが、延長ワクチン接種は脾臓CD4+T細胞の活性化において40％以上の減少を引き起こした（図5Aおよび5B ）。CD4+T細胞中のT細胞サブセットの詳細な研究は、延長グループのCD4+T細胞中のエフェクターメモリーT細胞（Tem）およびセントラルメモリーT細胞（Tcm）の割合が、ナイーブT細胞（Tn）集団の比較的増加とともに、通常グループからのそれと比較して急激に減少していることを明らかにした。特に、CD4+ Te細胞の頻度が拡張群で有意に上昇することが観察された。(図5CおよびS2A)。
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図5延長免疫によるCD4+T細胞免疫応答の活性化抑制
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さらに、最終免疫後7日目のマウス脾臓細胞内のCD4+T細胞における排菌マーカーの発現を評価した。フローサイトメトリーの結果、PD-1- LAG-3- CD4+T細胞の割合は、従来のワクチン接種と比較して延長免疫では著しく減少したが、後者のグループはPBSコントロールグループと明らかな差を示さなかった（図5DおよびS2B）。さらに、我々は、従来のワクチン接種またはPBS対照と比較して、延長免疫がPD-1+ CD4+T細胞のパーセンテージを有意に誘導することを見出した（図5DおよびS2B）。PD-1- LAG-3 CD4++T 細胞については、すべてのグループ間で明らかな変動は検出されなかった（図5DおよびS2B）。さらに、PD-1とLAG-3の両方の表面発現の増強は、延長免疫群におけるCD4+T細胞の増加Te割合に直接比例することが確認された（図S2CとS2D）。これらのデータは、従来の免疫化コースへの追加のワクチンブースターがCD4+T細胞の消耗を促進し得ることを示唆した。延長免疫に伴う細胞性免疫の低下における制御性T細胞（Treg）集団の関与を調べるために、最後の免疫の1週間後に、マウスの脾臓細胞におけるTreg細胞の割合を測定した。フローサイトメトリー分析の結果、通常群およびPBS対照群と比較して、延長接種群ではCD4+ CD25+ foxp-3+ Treg細胞の割合がより高く検出された（図5E）。さらに、主にTreg細胞によって分泌されるIL-10の血清レベルを検査した。ELISAの結果、延長ワクチン接種群の検体では他の2群より多量のIL-10が検出され、Treg細胞の割合が増加したことと一致した（図5F）。これらのデータは、Treg細胞がRBDワクチンによる延長免疫に対する免疫寛容に重要な役割を果たす可能性を示唆した。
延長免疫によるCD8+T細胞介在性免疫応答の抑制
CD8+T細胞に対するワクチンブースターの影響を調べるために、我々は最後の免疫の1週間後にエフェクターサイトカインの分泌レベルを調査した。IL-2、IFN-γ、TNF-αの血清濃度は、両方の免疫コースで有意に増加し、CD8+T細胞の機能的活性化を示した（図6A-6C ）。しかし、延長接種では、3つのサイトカインすべての分泌が従来の免疫よりも大幅に減少した（図6A-6C）。これらの観察がCD8+T細胞のSARS-CoV-2 RBD特異的反応の結果であることを確認するために、最近HLA-A＊24：02 CD8+T細胞エピトープとして同定された9アミノ酸領域（P45）に相当する配列を含む短いペプチドをマウスCD8+T細胞によって交差認識できるようにした (25)。免疫したマウスから分離した脾臓細胞をP45ペプチドで24時間刺激した後、T細胞の活性化について調べた。フローサイトメトリー解析は、P45がCD8＋T細胞におけるCD69及びCD137の両方の発現プロファイルを増強することを示したが、延長群からの脾臓細胞は、従来のワクチン接種群からの脾臓細胞よりも両方の活性化マーカーの発現レベルが著しく低いことを示した（図6D、6E、S3A、及びS3B）。
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図6延長免疫によるCD8+T細胞介在性免疫応答の抑制
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次に、異なる免疫コースに関連するCD8+T細胞のサブタイプについて検討した。PBS群と比較して、延長群ではTemの割合が著しく減少し、Te亜集団の著しい増加とともに、TnおよびTcmの割合にはほとんど変化が見られなかった（図6FおよびS3C）。特に、延長接種群のマウスからは、従来群に比べてTem集団が50％以上減少し、他のCD8+T細胞サブタイプの割合に明らかな差は認められなかった（図6F）。
抗原刺激を繰り返すとCD8+T細胞の疲弊が誘導されることが報告されている。そこで、2回の免疫コース間で疲弊マーカー量に差があるかどうかを検証した。その結果、マウス脾臓細胞からのCD8+T細胞上のPD-1およびLAG-3の細胞表面発現は、従来群またはPBS対照のいずれかと比較して、延長接種群で明らかに高かった（図6GおよびS3D）。これに伴い、延長接種群におけるPD-1- LAG-3- CD8+T細胞の割合は、他の群に比べ有意に少なかった（図6G）。さらに、CD8+T細胞のTeサブセットにおけるPD-1およびLAG-3の発現を解析したところ、免疫延長を行ったサンプルのCD8+T細胞のTeサブセットにおいて最も高いレベルのLAG-3の発現が認められた（図S3Eおよび図S3F）。これらのデータは、RBDブースターワクチンの継続的な投与が、消耗の増加に伴うCD8+T細胞の活性化の減少につながる可能性を示していた。全体として、我々の発見は、相同ワクチンブースターの長期免疫コースによる適応免疫寛容の潜在的なリスクを証明し、保護目的の複数のブースターワクチンの適用には注意が必要であることを示唆している。
考察
現在、COVID-19に対するワクチン接種が世界的に進められているが、新たに出現したSARS-CoV-2亜種に対する持続的な防御が常に問われている。追加ブースターワクチンの接種により、防御免疫反応を再刺激できることが臨床的に証明されている（Chengら、2022年；Gruellら、2022年）。このようなワクチンによる免疫反応の再確立がブースターの継続適用によって繰り返されるかどうかは疑問視されているが、現時点ではほとんど不明である。ここでは、Balb/cマウスモデルを用いて、従来の免疫コースでRBDワクチンブースターを繰り返し接種した場合と、延長接種戦略で接種した場合の効果を比較検討しました。その結果、通常接種で確立した体液性免疫と細胞性免疫による防御効果は、延長接種コースではともに大きく損なわれていることがわかりました。具体的には、延長接種により血清中のRBD特異的抗体の量と中和効果が完全に損なわれただけでなく、長期液性記憶も短縮された。これは、脾臓胚中心BおよびTfh細胞数の減少とともに、胚中心反応における免疫寛容と関連している。さらに、延長免疫によってCD4+およびCD8+T細胞の機能的応答が減少し、メモリーT細胞の集団が抑制され、Te亜型細胞におけるPD-1およびLAG-3の発現がアップレギュレートされることが実証された。また、Treg細胞の割合が増加し、IL-10産生の有意な上昇を伴っていることが観察された。これらの結果から、RBDブースターワクチンの反復投与は、従来のワクチン接種コースで確立された免疫反応に悪影響を及ぼし、適応免疫寛容を促進する可能性があることが明らかにされました。
私たちの最近の研究では、RBDワクチンの3回投与コースは、Balb/cマウスモデルで4ヶ月間、体液性および細胞性の両方の免疫保護を得ることに成功しました（Gaoら、2021年）。本研究では、その後の同じワクチンの4回目の投与により、RBD特異的中和抗体の産生を引き続き刺激し、その血清レベルは少なくとも6週間持続することを見いだしました。これらの知見は、SARS-CoV-2変異体に対するファイザー社製ワクチンの4回目の投与による中和効果の報告と一致した（Tanne, 2022）。しかしながら、同様に増強された、あるいは少なくとも持続的な免疫応答を誘導することを試みて、同じワクチンブースターを追加投与したところ、全体的な免疫応答の明らかな減少が観察された。RBD特異的抗体価およびSARS-CoV-2疑似ウイルスに対する血清中和能はともに深刻な影響を受け、Delta変異体およびOmicron変異体を含む最も最近出現したSARS-CoV-2変異体に対するIC50が2倍以上減少した。このことは、RBDブースターワクチンの反復投与が、機能的な体液性免疫ではなく、体液性免疫寛容を積極的に促進する可能性を示唆しています。最近の独立した報告でも、ヒトの不活化SARS-CoV-2ワクチンの追加ブースターが、すでに防御効果の低下が観察されている時期に投与された場合、RBD特異的抗体の力価が著しく低下するという同様の観察がなされている（Perez-Thenら、2022年）。このことから、野生型SARS-CoV-2 RBDをターゲットとして開発されたブースターワクチンでは、投与量または免疫コースが免疫寛容の悪影響を受ける重要な要因である可能性が示唆された。そのため，長期接種の前に血清中の抗体濃度をモニターすることが重要である．
本研究で証明された相同ブースターの反復投与による免疫寛容は，SARS-CoV-2ブースターワクチン接種の延長計画を最適化する際に注意すべきことを示唆している．同種プライムワクチンの連続投与の代わりに、異種ブースターの選択への途中切り替えは、オミクロン変異体に対する観察されたエネルギーに改善の可能性を提供するかもしれない（Reynoldsら、2022年）。このようなワクチン接種戦略は、特に小児に対するSARS-CoV-2ワクチン接種において新たな課題となっている抗体刷り込みまたはオリジナル抗原性罪（OAS）と呼ばれる血清現象に起因する、さもなければ満足できない免疫応答を利用することができる（Lavinder and Ippolito, 2022）。異種ブースターと遭遇すると、OASが支配する免疫記憶反応は、野生型株のエピトープを認識する抗体を持つ既存のB細胞クローンの優先的な活性化から、より速く、より強い中和保護を生成する可能性がある。このことは、提示された新しいエピトープに対して別の一次あるいは二次反応を引き起こす新しいナイーブB細胞の適切な動員を誘導する異種抗原の十分な時間と蓄積の機会の窓を提供するかもしれない。このような変異体特異的な免疫適応が、進化する防御の必要性に対する耐久性や有効性を高めると推測するのは妥当なことである。このような枠組みの中で、テーラーメイドmRNAワクチンは、野生型ウイルスを用いて開発された従来のワクチンによる有効な体液性および細胞性免疫の損失を回避するための良い選択となる可能性があります。OASのメカニズムがヒトとマウスで異なることを考えると、SARS-CoV-2に対する耐久性のある防御のためにワクチンブースターの適用を戦略的に最適化するために、さらなる研究が必要であることは間違いない。
本研究では、SARS-CoV-2に対する体液性免疫寛容のメカニズムを解明するために、RBD特異的な抗体産生に関わるメカニズムを解析した。その結果、B細胞の成熟と活性化に必要な素因子とアシストT細胞の数が、従来の免疫コースに比べて著しく減少していることが確認された。Tfh細胞の不足は、従来のB細胞の機能分化を妨げ、血清IL-4の減少はB細胞の活性化を阻害している可能性がある。これらの仮説は、延長免疫群のマウスの胚中心で検出された活性B細胞数が、従来のワクチン接種を受けた動物に比べ有意に少なかったという事実によって支持された。特に、延長免疫群ではメモリーB細胞の割合が著しく減少し、B細胞免疫寛容の兆候も認められたことから、ブースターショットによる反復接種が、慢性ウイルス感染時のような反復抗原曝露による体液性免疫寛容と同様のメカニズムを共有していることが明らかとなった（Han et al, 2013）。
体液性免疫反応に加えて、細胞性免疫寛容もRBDブースターワクチン接種の長期コースで観察されました。RBDワクチン4回接種後の細胞性免疫応答の持続とは対照的に、延長群の血清では抗原特異的メモリーT細胞の活性化が限定的で、IL-2およびIFN-γの分泌が著しく減少していることが確認されました。HBVウイルスの慢性感染により、抗原特異的CD8+T細胞からの活性免疫応答が部分的または完全に誘導されないこと、PD-1、Tim-3、CTLA-4などの阻害受容体の表面発現が有意に増加することとして示される抗原特異的細胞性免疫寛容が生じることが報告されています。同様に、RBDブースターワクチンの長期投与は、PD-1およびLAG-3のレベルを明白に増加させ、メモリーCD8+T細胞の著しい減少を伴うことを見出した（Hanら、2013）。これは特に重要であり、メモリーCD8+T細胞応答は、集団中和エスケープ変異で体液性免疫に大きく挑戦した、新たに出現したSARS-CoV-2変種に対する有効な応答に対して優勢な役割を果たすことが示されている（タルクら、2022；ナランバイら、2022；スワドリングら、2022）。したがって、同じブースターワクチンによる過剰刺激またはワクチン接種後の再感染は、従来のワクチンコースによって確立された細胞性免疫応答を著しく妨げ、これは、挑戦された体液性免疫応答とともに、レシピエントの疾患期間の延長および／または症状の悪化につながる可能性がある。
さらに、過剰なワクチン接種は、免疫寛容の重要な促進因子でもある免疫抑制の微小環境を生成する可能性がある。我々は、CD25+Foxp3+CD4+Treg細胞の割合と免疫抑制サイトカインIL-10のレベルが、RBDワクチンブースターワクチンの延長後にアップレギュレートされることを証明した。これは、抗原刺激時のB細胞の活性化・分化の低下、抗原提示細胞（APC）の機能阻害、結果としてCD8+T細胞の活性化が低下していると考えられる（Damo and Joshi, 2019; Field et al, 2020; Turner et al, 2020）。実際、我々は、延長ブースター投与の用量で体液性および細胞性免疫寛容の両方を観察し、これは、過剰接種が従来のSARS-CoV-2免疫化によって確立された免疫防御効果に重大な影響を与え、おそらく新しいCOVID-19患者または再感染者の疾患重症度を高めるかもしれないと推測して安全であった。
RBDサブユニットワクチンは、不活化ワクチンやmRNAワクチンを完全に代替することはできませんが、特に抗原の運搬方法において、RBDサブユニットワクチンは、不活化ワクチンやmRNAワクチンを代替することができます。The New England Journal of Medicineに掲載された最近の報告では、健康な若い医療従事者の4回目のmRNAワクチン接種は、わずかな効果しか示さないことが実証された（Regev-Yochayら、2022年）。野生型SARS-CoV-2配列に基づく他のCOVID-19ワクチンによる延長ワクチン接種が免疫寛容を誘導するかどうか、さらなる調査が必要である。
要約すると、我々は、balb/cマウスモデルにおいて、RBDブースターワクチンによる延長免疫の包括的効果を特徴づけた。その結果、ワクチン反応確立後の反復投与は、抗原特異的反応性をさらに向上させない可能性があること、それどころか、系統的寛容を引き起こし、現行のSARS-CoV-2亜種に対する有効な体液性および細胞性免疫反応を生じさせなくなる可能性があることが明らかとなった。本研究は、COVID-19の予防のためにタイムリーな情報を提供するものである。また、血清抗体価およびT細胞機能を適切に評価することなくワクチン増強剤を使用することに警鐘を鳴らすものである。
本研究の限界
本研究では、霊長類ではなく、げっ歯類の動物モデルを使用しました。マウスとヒトの間の免疫反応性の実際の動態は十分に理解されていないが、Balb/cマウスモデルは、SARS-CoV-2感染に対する反応においてヒトと深い類似性を有することが示されている（Halfmannら、2022年）。したがって、延長ブースターワクチン接種に関連して観察される適応免疫寛容は、特に相同ワクチンのレシピエントにとって重要な参考値を提示する可能性がある。我々の発表した研究では、免疫マウス血清中の抗体価が、最後のワクチン注射の3〜4週間後に低下し始めたことが報告されている（Gaoら、2021年）。したがって、本研究におけるブースターの3週間の間隔は、若干短かった。本研究のもう一つの限界は、ワクチン接種者に見られるような免疫応答が衰える遅い時期にワクチンを投与するのではなく、日常的な時間間隔でワクチンを投与する延長コースの試験を行ったことである。この結果は、通常のSARS-CoV-2エンハンサー・ワクチンに関連する潜在的な副作用を明らかにし、適応寛容によって大きく影響されうるワクチン接種時の体系的な免疫状態の複雑さを浮き彫りにしました。我々の発見を裏付けるように、38人のワクチン接種者コホートにおける最近の独立した研究では、免疫反応が低下した時点で不活化SARS-CoV-2ウイルスの2回目のブースターを投与した場合、同様の液性免疫の減少が見られた（Wangら、2022年）。脾臓CD8+T細胞活性化の変化に関する直接的な証拠はないものの、P45ペプチドで刺激した脾臓由来CD8+T細胞で観察されたCD137およびCD69発現の減少、ならびにエフェクター分子IL-2、IFN-γおよびTNF-αの血清レベルの減少は、RBDサブユニット・ワクチンの長期免疫化がP45特異的CD8+細胞性免疫の活性化を損なったことを裏付けるものだった。これらの結果から、大規模集団におけるSARS-CoV-2ブースターワクチン接種の反復には注意が必要であることが示唆された。
STAR★Methods
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
APC 抗マウス CD19 BioLegend Cat#152409; AB_2629838
PE 抗マウス CD138 BioLegend Cat#142503; AB_10915989
FITC 抗マウス/ラット/ヒト CD27 BioLegend Cat#124207; AB_1236463
PE/シアニン7 抗マウス CD4 BioLegend Cat#100421; AB_312706
APC/シアニン7 抗マウス CD185 (CXCR5) BioLegend Cat#145525; AB_2566798
PE 抗マウス CD279 (PD-1) BioLegend Cat#135205; AB_1877232
FITC 抗マウス/ヒト GL7 抗原 BioLegend Cat#144603; AB_2561696
PerCP/Cyanine5.5抗マウスCD95 (Fas) BioLegend Cat#152609; AB_2632904
Alexa Fluor® 647 抗マウス/ヒト CD45R/B220 抗体 BioLegend Cat#103229; AB_492875
Alexa Fluor 700 抗マウス CD3 BioLegend Cat#100216; AB_493697
PE 抗マウス CD8a BioLegend Cat#162303; AB_2894434
Brilliant Violet 605™ 抗マウス CD69 BioLegend Cat#104529;AB_11203710
APC 抗マウス CD137 BioLegend Cat#106109; AB_2564296
APC 抗マウス CD279 BioLegend Cat#109111; AB_10613470
PE 抗マウス CD223 BioLegend Cat#125208; AB_2133343
Brilliant Violet 605™ anti-mouse/human CD44 BioLegend Cat#103047; AB_2562451
Brilliant Violet 421™ anti-mouse CD62L BioLegend Cat#104435; AB_10900082
Alexa Fluor® 488 抗マウス FOXP3 BioLegend Cat#136803; AB_10946412
HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG H&L secondary antibody Abcam Cat#ab6789; AB_955439
HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG1 H&L Bethyl Cat#A90-105P; AB_67150
HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2a H&L Bethyl Cat#A90-107P; AB_67155
Goat anti-mouse IgG-ALP MabTech Cat#3310-4; AB_2890180
細菌・ウイルス株
SARS-COV-2-S GenBank QVE75681.1
SARS-CoV-2-SB.1.617.2 GenBank EPI_ISL_4299998
SARS-COV-2-SOmicron GenBank EPI_ISL_7263803
生体試料
RBD組換えタンパク質 研究室で保管 N/A
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
RBD-his タンパク質 Sinobiological Cat#40592-V05H
RBD-mfc タンパク質 Sinobiological Cat#40592-V05H
ACE2-his タンパク質 Sinobiological Cat#10108-H08H
重要なコマーシャルアッセイ
LIVE/DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kit Invitrogen Cat#L34976
マウスおよびラットサイトカインアッセイキット Bio-RAD Cat#10014905
実験モデル 細胞株
HOK 293T ATCC N/A
293F 細胞 ATCC N/A
実験モデル 生物／系統
Balb/c マウス；雌 重慶医科大学実験動物センター N/A
ソフトウェアおよびアルゴリズム
グラフパッドプリズム8 グラフパッドプリズム8 N/A
Flow jo バージョン 10.5.2. Flow jo バージョン10.5.2. N/A
その他
6 ウェル細胞培養プレート サーモフィッシャー社製 Cat#140675
コーニング セルバインドサーフェス 100mm カルチャーディッシュ コーニング Cat#3296
Bio-plex マウスサイトカイン検出キット Bio-rad Cat#M60000007A
ELISPOT プレート Thermo Fisher 社製 Cat#AB2384B
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リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬のリクエストは、リードコンタクトのA.-S.J. ( aishunjin@cqmu.edu.cn ) にお願いします。
材料の入手方法
すべての試薬および材料は、材料提供契約を締結した後に、リクエストに応じて提供されます。
実験モデルおよび被験者の詳細
細胞株
HEK 293Tおよび293F細胞はAmericanType Culture Collection (ATCC)から入手した。Daudi細胞およびACE2-HEK 293T細胞は当研究室に保管されていた。HEK 293T細胞およびHACE2-293T細胞は、10%牛胎児血清（Gibco, USA）、100 mg/mL Streptomycin および100 U/mL Penicillinを添加したDulbecco modified Eagle medium (GibcoTM, USA) で、37℃、5 %で培養させた。Daudi細胞は、10%ウシ胎児血清（GibcoTM、USA）、100 mg/mLストレプトマイシン、100 U/mLペニシリンを添加したDMEM培地で、37℃、5%CO2で培養した。
プラスミド

pWPXL, pMD2.G, pSPAX2 は重慶医科大学免疫学研究センターへ寄託した。

pMD2.GベクターのEcoR I制限サイトを合成し、炭素末端に19個のアミノ酸を欠失したSARS-COV-Sにクローン化した。

N. Landauが構築したpWPXLルシフェラーゼレポーターベクター（pWPXL-luciferase）は、武漢大学（中国・武漢）のChiguo Cai教授から提供されたものである。

VSV-Gを発現するプラスミドpMD2.Gは、清華大学（中国・北京）のDing Xue教授から提供されたものである。

ヒト ACE2 の発現プラスミドは、GeneCopoeia (Guangzhou, China) より入手した。
RBD タンパク質の生産と精製
Ersi1919-514 aa を哺乳類発現ベクター pcDNA 3.4 にクローニングし、マウス IgG シグナルペプチド、AviTag、6×His タグ の上流に位置する野生型 SARS-CoV-2 RBD タンパク質（残基 334-526 ）を発現させた。SARS-CoV-2 RBD組換えタンパク質は、293F細胞（ATCC）で7日間発現させた後、HisTrapカラム（GEヘルスケア）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
マウス系統
本研究で使用したBalb/cマウスは、重慶医科大学動物研究センターに寄託されたものである。マウスは個々に換気されたケージに無作為にグループ分けされ、12：12の光サイクル、30-70％の湿度で維持され、スルファトリム含有水と標準的なチャウ食を与えた。
方法詳細
施設認可
本研究に記載されたすべての動物実験は、重慶医科大学のInstitutional Animal Care and Use and Committee (CQMU202104)による審査と承認を受けている。
マウス免疫戦略
50μgのRBD組換えタンパク質（Sinobiological：#40592-V05H）を100μLのPBSに溶解し、フロイント完全アジュバント（Sigma：#9007-81-2）またはフロイント不完全アジュバント（Sigma：#F5506-10ML）中に1.2：1の割合で配合しました。従来群では4回の皮下免疫（0、2、4、6週目）を実施した。延長群では6回（0、2、4、6、9、12週目）皮下接種を行った。各免疫後10日目に尾静脈血を採取し、直ちに抗体分析に使用した。
血清 ELISA
免疫したマウス血清中のRBD特異的IgG、IgG1およびIgG2a抗体価をELISA法により検出した。384ウェルプレートに20μLのRBDタンパク質（Sinobiological: #40592-V05H, 3μg/mL）を添加し、4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ブロッキングバッファー（5％BSA＋0.05％Tween20）で37℃、1時間ブロッキングし、10倍連続希釈の20μL試験マウス血清と37℃、30分インキュベートした。反応したマウス血清は、HRP標識Goat Anti-Mouse IgG H&L二次抗体（Abcam: #ab6789, 1: 10000）、HRP標識Goat Anti-Mouse IgG1 H&L (Bethyl: #A90-105P, 1: 10000) およびHRP標識Goat Anti-Mouse IgG2a H&L (Bethyl: #A90-107P, 1: 10000) それぞれで検出しました。
IgG ELISPOT
マウス脾臓細胞をR848 (Sigma: #SML0196-10MG, 2 μg/mL) とマウスIL-2 (PeproTech: #212-12-20UG, 100U/mL) で6日間刺激し、メモリーB細胞をプラズマ細胞へ分化誘導させた。IgG ELISPOTアッセイは、報告されているように、かつ若干の修正を加えて行った（Gaoら、2021年）。滅菌水を含む35％アルコールを使用して、ELISPOTプレート（Millipore：#0038401-5）を1分未満で活性化し、液体を廃棄した。50 μL RBD (Sinobiological: #40592-V05H,10 mg/mL) を4℃で一晩プレートに添加した。その後、プレートに5×105/wellのplenocytesを播種し、RBD protein (Sinobiological: #40592-V05H,10 mg/mL)で36時間刺激した。陰性対照として等モル量の培地による刺激を行った。その後、プレートをGoat anti-mouse IgG-ALP (MabTech: #3310-4, 1:1000) で現像した。IgGスポットはBCIP/NBT plus substrate (MabTech: #3650-10, 50μL)で展開し、AID ELISPOT Reader (AID, Germany)で定量化した。RBD特異的な陽性反応を定量化するために、結果は各マウスの脾臓細胞5×105個あたりのRBD特異的IgGスポット数として表した。IgGスポット＝（RBD刺激ウェル＃1-非刺激ウェル＃1）＋（RBD刺激ウェル＃2-非刺激ウェル＃2）／2。
免疫蛍光法
最終免疫後7日目に免疫マウスの脾臓を分離し、Optimal Cutting Temperature (O.C.T) compound (SAKURA: #4583) に包埋した。この組織を液体窒素で凍結した後、クリオスタットで切片化（7 um）した。冷アセトンで固定し、PBS中5％FBSで室温（RT）1時間ブロッキング後、切片をBiotinylated PNA (VECTOR: #FL-1071-5, 1: 100) で4℃で一晩インキュベートした。二次抗体としてDyLight 488 Streptavidin (BioLegend: #405218, 1: 100) を1時間、Alexa Fluor647-conjugated anti-mouse CD45R (BioLegend: #103226,1: 150) を1時間、RTで使用した。染色後、切片をPannoramic SCAN装置（3DHISTECH、ハンガリー）下でスキャンした。
フローサイトメトリー解析
免疫マウスの血液または脾臓からのリンパ球を、最後の免疫後7日目に採取し、フローサイトメトリーにより分析した。死細胞は生存率色素染色により除外し、付着細胞はSSC/AおよびSSC/Hゲーティング分析により除外した。細胞はBD LSRFortessa™ Flow Cytometry（BD Biosciences, USA）により解析された。データの取得と解析はFlow jo version 10.5.2によって行われた。生菌染色にはLIVE/DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kit (Invitrogen: #L34976) を使用した。表面染色のために、脾臓細胞は以下の抗体で染色した。APC抗マウスCD19（Clone：1D3／CD19、Biolegend）、PE抗マウスCD138（Syndecan-1）（Clone：281-2、Biolegend）、FITC抗マウス／ラット／ヒトCD27（Clone：LG.3A10、Biolegend）、PE抗マウスCD279（PD-1）（Clone：29F.1 A1、Biolegend）、PE/Cyanine7 anti-mouse CD4（Clone: GK1.5、Biolegend）、APC/Cyanine7 anti-mouse CD185 (CXCR5) (Clone: L138D7, Biolegend) はTfh細胞解析に、FITC anti-mouse/human GL7 Antigen (Clone: GL7, Biolegend), perCP/cyanine5. 5 anti-mouse CD95 (Fas), (Clone: SA367H8, Biolegend), and Alexa Fluor® 647 anti-mouse/human CD45R/B220(Clone: RA3-6B2, BD Pharmingen™) mAb for GC B cell analysis. Alexa Fluor 700 anti-mouse CD3 (Clone: 17A2, Biolegend), PE anti-mouse CD8a (Clone: 53-6.7, Biolegend), Brilliant Violet 605™ anti-mouse CD69 (Clone: H1.2F3, Biolegend), APC anti-mouse CD137 (Clone: H1. 2F3, Biolegend). 2F3、Biolegend）、APC anti-mouse CD279（Clone：RMP1-30, Biolegend）、PE anti-mouse CD223（Clone：C9B7W, Biolegend）、Brilliant Violet 605™ anti-mouse/human CD44（Clone：IM7, Biolegend）、Brilliant Violet 421™ anti-mouse CD62L（Clone：MEL-14, Biolegend）. 細胞内染色には、Alexa Fluor® 488 anti-mouse FOXP3 (Clone: MF-14, Biolegend)を使用する。
脾臓細胞を回収し、Staining Buffer で1×洗浄する。上清を吸引し、細胞表面抗原に特異的な蛍光標識抗体を最適な濃度で含む 100 μL の Staining Buffer にペレットを再懸濁する。暗所で20分間インキュベートし、次にStaining Bufferで1回洗浄する。Fixation/Permeabilization solution（BD: #554714）を500μL添加し、細胞を固定・透過させ、暗所にて20分間インキュベートする。上清を吸引し、細胞内染色に最適な濃度の蛍光色素標識抗サイトカイン抗体を含む 100 μL BD Perm/Wash™ buffer にペレットを再懸濁する。暗黒下、常温で 30 分間染色する。2mL BD Perm/Wash™ buffer を加えて細胞を洗浄する。5分間、500×gでスピンさせ、上清を吸引する。細胞ペレットを500μLのPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーで解析する。
SARS-CoV-2疑似ウィルスの作製と滴定検出
SARS-CoV-2のスパイク（S）タンパク質を発現するpVSVGは、VSV-G疑似型ΔG-ルシフェラーゼプラスミドを使用するように構築された。SARS-CoV-2のSタンパク質、B.1.617.2およびOmicron（BA.1）のいずれかをコードするものを作製した。Lenti-X293T細胞を70％コンフルエントに成長させてから、VSV-G疑似型ΔGルシフェラーゼの混合プラスミド、pWPXLおよびpSPAX2でトランスフェクションした。これらの細胞は、37℃、5％CO2で一晩培養した。接種した細胞に、5％牛胎児血清（Gbico，USA）および100IU／mLのペニシリン（beyotimem，China）および100μg／mLのストレプトマイシン（beyotimem，China）を添加したDMEM（Gbico，USA）を加え、48時間一晩培養を行った。上清を採取し、0.45μmのフィルターでろ過した後、300gで7分間遠心分離して上清を回収し、アリコートして-80℃で保存した。擬似ウイルスの力価は、Lenti-X qRT-PCR Titration Kit (Takara, Japan) を用いて、製造者の指示に従って検出した。
擬似ウイルス中和アッセイ
疑似ウイルスおよびマウス血清は、上記のように作製した。50μLの連続希釈したマウス血清は、37℃で1時間、疑似ウイルス（1×109コピー／mL）とインキュベートした。これらの疑似ウイルス-血清混合物をhACE2-293T細胞との共培養に添加した。72時間後、hACE2-293T細胞のルシフェラーゼ活性をBright-Luciferase Reporter Assay System (Promega, China)により解析した。Luc活性の相対的な発光単位は、ThermoFisher LUXリーダー（ThermoFisher、米国）を用いて検出した。すべての実験は少なくとも3回行い、平均値±SEMで表した。希釈倍数の半値阻害濃度（IC50）は、GraphPad Prism 8.0のDose-response-inhibition-variable slope four-parameter logistic regressionを使用して算出した。
競合ELISA法
RBD mfc protein (Sinobiological: #40592-V05H) 20μLを384-well plate (Corning: # 3570) に最終濃度0.2μg/mLになるように4℃で一晩添加した。翌日，ブロッキングバッファー（5% BSA + 0.05% Tween 20）で1時間プレートをブロッキングした．その後、1ウェルあたり20mLのマウス血清と5倍連続希釈液をディッシュに加え、37℃で40分間インキュベートし、さらに同量の0.2 μg/mL ACE2-his protein (Sinobiological: #10108-H08H) を加えて37℃で40分インキュベートした。PBSで洗浄後、ヤギ抗マウスIgG H&L二次抗体（Abcam：#ab6789、1：10000）をプレートと共にRTで30分間インキュベートした。TMB (MabTech: #3652-F10) をプレートに添加し、1 mol/L HClで停止した後、定量的に検出した。半値阻害濃度（IC50）は、4パラメータロジスティック回帰を用いて求めた。阻害率は以下のように算出した。阻害率 = [(A-Blank)-(P-Blank)]/(A-Blank) × 100、ここでAは血清が存在しない場合のACE2-hisへのRBD結合の最大ODシグナル、Pはある希釈度での血清存在時のACE2-hisへのRBD結合のODシグナルである。
サイトカインアッセイ
マウス血清はBio-Plexサンプル希釈液（Bio-RAD, Mouse and Rat cytokines Assays kit: #10014905）で1：4に希釈したものを使用しました。希釈した（1×）ビーズを20秒間ボルテックスし、アッセイプレートの各ウェルに50μLずつ加える。100 μL Bio-Plex Wash Bufferでプレートを2回洗浄する。各ウェルに50μLのサンプル、標準品、ブランクを添加し、シェーカー上で850rpm、30分間インキュベートします。その後、100μLの洗浄液で3回洗浄し、25μLの希釈した検出用抗体を各ウェルに加え、シェーカー上で850rpm、30分間インキュベートします。洗浄後、希釈した（1×）SA-PEを各ウェルに50μLずつ加え、シェーカー上で850rpm、30分間インキュベートする。プレートを100μLの洗浄液で3回洗浄する。ビーズを125μLのアッセイバッファーに懸濁し、プレートを850rpmで30秒間振とうする。シールテープを剥がし、以下の設定によりプレートを読み取る。
定量および統計解析
データは、GraphPad Prism version 8.0 ソフトウェアを使用して統計的に分析した。数値結果は、平均標準偏差で表示した。ヒストグラム、折れ線グラフおよび個々のデータポイントの定量的データは、平均値±SEMで示した。統計解析は、両側不対価のStudent's t-testsを用いて行った。p <0.05は、統計的に有意な群間差の基準であった。
データおよびコードの利用可能性
この研究では、オリジナルのコードは生成されませんでした。この論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求に応じて主席研究員から入手可能です。この研究で作成されたすべてのデータは、公開された論文とその補足情報に含まれているか、または要求に応じて主席研究員から入手可能です。
謝辞
本研究は、重慶医科大学SARS-CoV-2ウイルス緊急研究プロジェクトの支援を受けて行われた。
著者の貢献
構想および監督、A.-S.J.、方法論、F.-X.G.、R.-X.W.、J.-J.H.、S.-Y.S.、調査、T.-T.L、 C.H., M.-Y.S., S.-M., F.-Y.L.,S.-Y.S.,Y.-N.H.,X.-J.H.., Q.C., Y-M.W., L.L., S.-L.L.; writing-original draft, F.-X.G. and R.-X.W.; funding acquisition and resources, A.-S.J.; all authors discussed and commented on the manuscript.著者全員は、原稿について議論し、コメントした。
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
インクルージョンと多様性
私たちは、包括的で多様な、そして公平な研究の実施を支持します。
補足情報
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資料S1. 図S1〜S3
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記事情報
出版年譜
掲載されました。2022年12月22日
受理されました。2022年10月28日
改訂版受理 2022年8月14日
2022年8月14日 2022年4月27日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105479

著作権
© 2022
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図
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図表の概要
図 サムネイル gr1
図1延長免疫ではRBD特異的抗体産生が促進されないマウス
図2 gr2
図2延長免疫による血清中和抗体反応の低下
図1.図2.図3.図4.図5.図
図3延長免疫によるRBD特異的メモリーB細胞産生の抑制
図1.gr4
図4延長免疫による胚中心形成の抑制
図 サムネイルgr5
図5延長免疫によるCD4+T細胞免疫応答の活性化の抑制
図 サムネイルgr6
図6延長免疫によりCD8+T細胞介在性免疫応答が抑制された例