高密度なヒトミトコンドリア近接相互作用ネットワーク

2023年6月3日 10:14

https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(20)30412-5?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS1550413120304125%3Fshowall%3Dtrue#supplementaryMaterial

ハナ・アントニツカ
林振元（Zhen-Yuan Lin
アレクサンドル・ジャネール
ワーノンティーウェララパチャイ（Woranontee Weraarpachai
アンヌ＝クロード・ジングラ
エリック・A・シュウブリッジ 6
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オープンアーカイブDOI:https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.07.017
PlumX メトリクス
ハイライト

BioIDを用いた高解像度ヒトミトコンドリアタンパク質近接マップを作成した。

ベイトベイト解析により、このマップにはサブコンパートメントの解像度があることがわかった

Prey相関解析により、機能クラスターと特定モジュールを同定

OMMベイトは、接触部位と二重局在を反映した特定の相互作用を示す
概要
すべてのミトコンドリアサブコンパートメントから100個のミトコンドリアベイトを用いた近接依存ビオチン化アッセイであるBioIDを用いて、高解像度のヒトミトコンドリア近接相互作用ネットワークを作成しました。1,465個のタンパク質を同定し、15,626個のユニークな高信頼性近接相互作用を作成しました。このうち、528個のタンパク質が以前にミトコンドリアとしてアノテーションされており、Mitocarta 2.0によって定義されたミトコンドリアプロテオームのほぼ半分を占めていました。ベイト-ベイト解析では、ミトコンドリアコンパートメントが明確に分離していることが示され、すべてのベイトを通じた餌間の相関解析により、多様なミトコンドリア機能に関わる機能クラスターを特定し、未特定のタンパク質を特定のモジュールに割り当てることができました。この解析により、同じミトコンドリアタンパク質のアイソフォームを異なるミトコンドリアサブコンパートメントに割り当てることができ、いくつかのタンパク質が複数の細胞内ロケーションを持つ可能性があることが示された。外膜ベイトは、細胞質タンパク質や他のオルガネラ膜のタンパク質と特異的な近接相互作用を示し、ミトコンドリアと個々のオルガネラの間の接触部位形成を担うタンパク質の特殊性を示唆している。
グラフの概要
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キーワード
ミトコンドリアタンパク質近接マップ
バイオID近接相互作用
サブミトコンドリアオーガニゼーション
機能モジュール
オルガネラ接触部位
ミトコンドリア翻訳開始
はじめに
ミトコンドリアは、酸化的リン酸化、ヘムおよび鉄硫黄クラスター生合成、尿素サイクル、トリカルボン酸（TCA）サイクル、ベータ酸化など、多くの細胞内必須代謝経路の機構を有している。さらに、ミトコンドリアDNAにコードされたポリペプチドの翻訳システム、自然免疫システムのプラットフォームとしての役割、細胞内のカルシウムのバッファリング、アポトーシスを開始させるタンパク質の放出制御なども行っています。このような無数の機能は、生理的なシグナルや細胞の要求に応じてミトコンドリア代謝を調節するために、オルガネラ内に区分けされている。ミトコンドリアタンパク質のカタログは充実しているが(
カルボら、2016年
)、多くはまだ十分に特性化されていない、あるいは機能が全く不明である(
Floyd et al.
;
パリアリーニとラッター、2013年
)、これは、一般的な遺伝性ミトコンドリア障害の分子基盤の研究を特に制限する(
Frazierら、2019年
;
ヌンナリおよびスオマライネン、2012年
).
ヒトのミトコンドリアタンパク質の最初の目録であるMitocartaは、異なるヒト組織から分離されたミトコンドリアの質量分析によって、ちょうど10年以上前に作成されました (
Pagliarini et al.
)、その後Mitocarta 2.0に更新され、1,158個のタンパク質が含まれています(
カルボら、2016年
). このデータベースは、ミトコンドリアタンパク質の最も包括的で有効なインベントリーを表しています。Mitominer V4.0 (http://mitominer.mrc-mbu.cam.ac.uk/release-4.0/begin.do) で作成された統合ミトコンドリアタンパク質インデックス (IMPI) は、さらに468個の推定ミトコンドリアタンパク質をリストアップしているが、これらのほとんどは実験的に検証されるに至っていない。個々のミトコンドリアサブコンパートメントの組成は、ミトコンドリアマトリックスのプロテオームを決定するための近接依存性ビオチン化法で使用される人工ペルオキシダーゼであるAPEXによってもプロファイリングされている (
Rhee et al.
)、膜間空間(IMS)(
Hungら、2014年
)、およびミトコンドリア外膜(OMM) (
Hung et al.
). これらのデータセットはミトコンドリア生物学の中核をなすリソースですが、個々のタンパク質間の機能的関係やタンパク質複合体の形成に関する情報を提供するものではなく、未特定のタンパク質を生物学的プロセスに割り当てることはできません。
別のアプローチにより、ミトコンドリア内のタンパク質の組織に関する情報が追加されました。私たちのグループ(
アントニツカら、2017年
;
アントニッカとシュウブリッジ、2015年
;
ジャナーら、2016
など)、その他(
フロイドら、2016年
)は、アフィニティ精製-質量分析(AP-MS)アプローチを用いて、対象となるミトコンドリアタンパク質の相互作用タンパク質パートナーを定義しました。大規模なAP-MS研究は、タグ付けされ、過剰発現されたベイトを使用して実施されてきた(
Huttlin et al.
;
マルティら、2017
). これらのデータは一般的に可溶性タンパク質複合体の同定に非常に有用ですが、オルガネラの膜タンパク質にとって最適でない可能性のある条件下や、細胞溶解後に実施されており、必ずしもin vivoの状況を表しているとは言えません。さらに、AP-MSは、アフィニティー精製プロトコルに耐えられない一過性の弱い相互作用を同定できない可能性がある。
私たちは以前、近接依存性ビオチン化アッセイBioIDを体系的に用いて、中心体などの膜なしオルガネラの組成と構造組織の両方を明らかにしました (
グプタら、2015
)や細胞質RNA顆粒(
ユンら、2018
). BioIDは、目的のタンパク質（ベイト）に融合した変異型細菌ビオチンリガーゼBirA∗を用い、ベイトの近傍、すなわち標識半径約10nm以内にある獲物タンパク質をビオチン化する (
キムら、2014
;
Roux et al.
). 高信頼性近接相互作用」とは、内因性または偽のビオチン化を模倣するために設計された一連の陰性対照サンプルに対して、与えられたベイトで定量的に濃縮される餌の相互作用と定義される。APEXと同様に、BioIDはベイトと直接相互作用するタンパク質、生化学的に安定な複合体内で会合するタンパク質、ベイトの近傍に単に局在するタンパク質を複雑に組み合わせて検出する。そのため、1回のBioID実験では、タンパク質の複合体や構造組織を特定することはできません。しかし、私たちの以前の研究では、複数のベイトでオルガネラをプロファイリングすると、ベイト間の近接関係を再構築するために使用できるベイトの空間プロファイルが得られることが実証されました (
Gingrasら, 2019
;
ゴーら、2019
).
ここでは、すべてのミトコンドリアコンパートメントから100個のミトコンドリアベイトの近接インタラクターを照会することによって作成された、高密度なヒトミトコンドリア近接ネットワークの作成を説明します。
研究成果
ミトコンドリアマトリックスとIMS BioID環境の定義により、特定の近接相互作用の濃度をスコア化する手段が提供された。
BioIDは、オルガネラを含む構造体の組成を定義することと、目的のベイトの特定のパートナーを特定することの両方に使用されています。しかし、後者については、特定の近接した餌の環境と同時に標識することが課題となっている。実際、餌の同定は必ずしも餌の存在量に比例するわけではなく、溶媒にさらされたリジン残基（活性化ビオチンの標的となる）の数、個々の反応性、質量分析による同定のしやすさにも依存する。したがって、BioIDデータを慎重に解釈するためには、細胞内および小器官内環境の定量的な定義が不可欠である。これまでの「環境」の定義は、核に対するNLS（核局在配列）のような局在配列タグの融合によって行われてきた(
Lambertら、2015年
)やCAAXモチーフ(
Bagciら, 2020
)を用いて、RhoファミリーGTPaseの細胞膜における特異性を研究しています。マトリックス空間とIMS空間を定義するために、APEXを使用して以前に行われたのと同様に、ミトコンドリア標的配列（MTS）を使用して、BirA∗をこれらのサブコンパートメントに誘導しました (
Hungら、2014年
;
Rhee et al.
). 使用したMTSの配列に起因する潜在的なバイアスを軽減するために、我々は異なる配列を使用してこれらの実験を行うことを目指した。
BirA∗タグ付きMTSベイトを293 Flp-In T-REx細胞に安定的に組み込み、STAR Methodsで定義したように、局在化（図S1A）、発現レベル、ビオチン化誘導を検証した。この原稿のすべての実験について、各ベイトは、少なくとも2つの生物学的複製でBioIDによって分析され、データは、SAINTexpressを用いた一連の陰性対照分析に対して分析された(
テオら、2014
). ベイズ型偽発見率（FDR）閾値を1％に固定した（詳細についてはSTAR Methodsを参照）。BirA∗タグ付きMTSベイトのペアワイズピアソン相関は、0.89～0.98の間でした。
ミトコンドリアマトリックス環境の特徴を明らかにするため、BirA∗を最も一般的に使用されている3つのミトコンドリアマトリックス標的配列に融合させた。2つはシトクロムc酸化酵素サブユニット、COX4I1（MTS-COX4）およびCOX8A（MTS-COX8）由来、1つはオルニチンカルバモイル転移酵素（OTC、MTS-OTC）から。異なるMTS配列は、トポロジー（両親媒性αヘリックス）が同じである一方、その長さにはかなりのばらつきがあり、アミノ酸配列のレベルではほとんど保存されていない。これらのMTS配列（「Matrix-BirA∗」と呼ばれる）を共同解析した結果、信頼度の高い餌を267個回収し（図1A；表S1およびS2）、3つの餌の間で70％（187個）の重複があった。予想通り、Mitocarta 2.0またはGene Ontology Cellular Compartment（GOCC）と比較して、Matrix-BirA∗は以前にミトコンドリアとして注釈されたタンパク質が豊富でした（249匹/93%; 図S1B）。これは、MTS-APEX（以下、MTS-APEX）と同様であった。
Rheeら、2013年
)では、検出された495の餌の94%がミトコンドリアとしてアノテーションされ、そのうち233はMatrix-BirA∗と共通でした。また、Matrix-BirA∗の餌生物142個にはミトコンドリア以下のアノテーションがあり、ミトコンドリアマトリックスタンパク質が99%濃縮されていた（図S1B）。ベイトのペア間の全体的なペアワイズ比較は高く（平均R2 = 0.76、範囲は0.62～0.95）、これら3つの異なるMTSがほぼ同じローカル環境をサンプリングしていることを示していますが（下記参照）、それぞれのベイトが優先的にラベリングを誘導することに注目しました（図1BとS1C）。注目すべきは、MTS-OTCはMTS-COX8と比較して、TCAサイクル（GO:0006099）のタンパク質を濃縮したことです（図1B）。このことは、マトリックスのMTS配列が特異的な局在シグナルを含む可能性を示唆していますが、複数のターゲティング配列を使用することで、より多くのタンパク質をサンプリングすることができ、平均Matrix-BirA∗がマトリックス環境をより確実に反映していることが示唆されました。
図1BioIDによるミトコンドリアマトリクスとIMSの "環境 "の定義
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マトリックス-BirA∗プロテオームがマトリックスベイトの特異的な近接相互作用因子を同定する上で有用かどうかを検証するため、いくつかのよく知られたベイト、すなわちLRPPRC、ACAD9、MTRF1Lに対するベイトの濃縮度をスコア化するために解析しました。簡単に説明すると、これらのベイトのそれぞれについて、上記の条件を用いてBioIDを二重に実行し、SAINTexpressでスコアリングしたところ、218から251個のタンパク質からなる高信頼性の近接相互作用のリストが得られ（表S2）、そのうち、タンパク質複合体のメンバーや直接相互作用の既知のメンバーは必ずしもリストの上位には含まれなかった。次に、これらの既知の相互作用因子がマトリックス "環境 "に対して特異的に濃縮されているかどうかを評価するために、マトリックス-BirA∗に対する各相互作用因子の存在量の変化倍率濃縮を実施した。図1Cに示すように、これは実際にそうであった：ミトコンドリア翻訳終結因子であるMTRF1Lは、ミトコンドリア翻訳因子の採用に関与する部位であるL7/L12 stalkに存在する2つのミトコンドリアリボソーム蛋白質であるMRPL53とMRPL10を特異的に濃縮しました (
ブラウンら、2014年
). ND2モジュールの組み立てを担うMCIA複合体の一部であるミトコンドリア複合体I組み立て因子であるACAD9の近接相互作用因子 (
フォルモサら、2018
)は、この複合体の他の2つのタンパク質(NDUFAF1およびESCIT)、ならびにND2タンパク質自体およびND2の翻訳に関与することが最近示されたCOA1に対して濃縮されていた(
Wangら、2020年
). 最後に、LRPPRCは、安定した複合体を形成することが知られているSLIRPを非常に強く濃縮していた (
Sasarmanら, 2010
)を形成し、ミトコンドリアmRNAの安定化とポリアデニレーションに必要であることが知られている(
中條ら, 2012
;
Ruzzenente et al.
). ポリアデニル化は、LRPPRCのもう一つの近接相互作用因子であるMTPAP（ミトコンドリアポリ（A）ポリメラーゼ）によって行われます。さらに、3つのベイトとも、付加的なタンパク質の強い濃縮を示しました。例えば、以下のようなものです： MTRF1LはMCIA複合体タンパク質（NDUFAF1、ACAD9、ECSIT）を濃縮し、ACAD9は3つのピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（PDK1、PDK2、PDK3）を濃縮し、LRPPRCはミトコンドリアRNA顆粒、より具体的には我々が以前報告したプデュウリジンシンターゼモジュール（MTERF3、TRUB2、RPUSD3、RPUSD4、RCC1L、NGRN；
アントニッカら、2017年
). これらの、これまで記述されていない関連性はすべて、探求すべき興味深い研究の方向性を示唆しています。
IMS環境は、2つのIMSタンパク質からの「bipartite presequence」を用いて特徴づけられました： OPA1（MTS-OPA1）とアポトーシス誘導因子AIFM1（MTS-AIFM1）です。IMS-BirA∗ベイトは120の近接相互作用因子を同定し、そのうち112（93％）はMitocarta 2.0またはGOCCによってミトコンドリアタンパク質としてアノテーションされていた（図S1D）。これらの餌は、IMSタンパク質に高濃縮（97％）され、IMS-APEX（以下、IMS-APEX）と同様であった。
Hungら、2014年
)が、IMS-BirA∗で同定されたタンパク質のうち、IMS-APEXと共通するのはわずか50（42％）でした。2つのIMSベイト間で検出された餌は定量的に相関していましたが（R2 = 0.91）、半数近くの餌が1つのベイトと高信頼性の近接相互作用としてスコアされました（図S1EおよびS1F）。これは、プレ配列の切断前にビオチン化された結果、未処理の膜結合中間体が蓄積された結果、あるいはミトコンドリア内膜（IMM）またはIMSの特定の場所へのターゲティングが反映された可能性があります。例えば、MTS-AIFM1は、ミトコンドリアへのタンパク質ターゲティングに関与する餌を優先的に標識した（GO:0006626、図S1F）。これらのタンパク質の1つであるCHCHD4は、全長AIFM1と直接相互作用することが以前に報告されている(
Hangenら、2015年
;
ラインハルトら、2020年
). IMSコンパートメントは、OPA1とMICOS複合体によって形成された狭いクリステーネックに制約されたクリステー内空間と、OMMとIMMの間の内腔からなり、マトリックス環境とは異なる原理で構成されています。
マトリックスプロテオームと同様に、IMS-BirA∗プロテオームが特定の近接相互作用因子を同定するのに有用かどうかを、事前に何らかの特徴づけがなされているタンパク質、すなわちSLC25A12とDIABLOの濃縮度をスコアリングして検証した（図1D；表S2）。SLC25A12は、ミトコンドリアのアスパラギン酸/グルタミン酸キャリアをコードし、IMSに約300アミノ酸長のN-末端ドメインを含む(
Thangaratnarajah et al.
)、そのパラログであるSLC25A13を濃縮し、これと共免疫沈降することが示された(
ハットリンら、2017
). 我々の解析では、リフォールダーゼCLPBとの相互作用が示唆されているIMSタンパク質であるHAX1とも会合する可能性が示唆されている (
Wortmannら、2015年
). DIABLOは、IMSタンパク質を含む "bipartite presequence "で、アポトーシスのシグナルに反応して放出され、アポトーシス阻害タンパク質XIAPやBIRC6に結合してアポトーシスを活性化する (
Du et al.
)、これらはいずれもDIABLOの近接相互作用因子として見出された。DIABLOの近接相互作用因子として特に濃縮されたのは、足場タンパク質のSPFHファミリーの3つのメンバー（PHB、STOML2、PHB2）であった。PHBは、アポトーシスを制御するためにXIAPと同様にDIABLOを免疫沈降させることが以前に示された(
Xuら、2016年
)、XL-MSの検討ではDIABLOとPHB2が直接架橋していることが示された(
小柴・小迫, 2019
). マトリックスベイトの特異性濃縮の分析と同様に、IMSベイト（またはIMSに面したIMMベイト）の特異性の分析により、IMS-BirA∗スコアのIMS "環境 "の定量評価としての有用性が明らかになりました。
これらの解析は、BioID実験の解釈に役立つMatrix-BirA∗およびIMS-BirA∗リソースの有用性を示し、個々のベイトに対する特定の近接相互作用の特定が、メカニズム研究のための候補タンパク質のリストの編集と絞り込みにいかに役立つかを示す実例となっています。Matrix-BirA∗とIMS-BirA∗の両方のスコアは、Table S2で容易に入手できます。
BioIDによるミトコンドリアの包括的な探索
次に、ミトコンドリアのサブコンパートメントごとに複数のベイトでBioIDをプロファイリングすることで、ミトコンドリアドメイン内のタンパク質の空間構成についてさらなる解明ができるかを検討しました。そのために、ヒトミトコンドリアプロテオーム（Mitocarta 2.0に基づく）の約10％をベイトとして選択しました（図2A）。ベイトの選択には、主に2つの基準を用いました。まず、OMM、IMS、IMSとマトリックスの両方に面したIMM、マトリックス空間など、すべてのサブミトコンドリアコンパートメントを調査したいと考えました（図2B）。第二に、発見されていないかもしれない、または理解が不十分なミトコンドリア生物学の新しい側面を照らす可能性が最も高いと考えられるベイトを選択し、そのため、酸化的リン酸化複合体のよく特徴付けられた構造サブユニットをベイトとして選択しませんでした（e.g.．
Zhu et al., 2016
;
Zong et al., 2018（ゾングら、2018
).
図 2A BioID によるミトコンドリアの包括的な探索
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この区画には、ヌクレオイド、ミトコンドリアリボソーム、翻訳装置の他のコンポーネント、ミトコンドリアRNA顆粒など、最も多くの部分構造が含まれていると考えられるため（図2B）、我々が選んだベイトのセットは、マトリックスを標的とすると予測されるもの（n = 57）に重点を置いています。我々は、可溶性のIMSタンパク質2種（CLPBとHAX1）と、BirA∗タグをIMSに向けたIMMのタンパク質数種を用いて、IMS空間を探索することができた。OMMタンパク質については、タグの位置は文献から推測するか、両端のタグ付けをテストした。最終的に、9つのOMMタンパク質がN末端、4つのC末端にタグ付けされ、6つのタンパク質がN末端とC末端の両方にタグ付けされた。ミトコンドリアプロテオームのアイソフォームに関するデータはほとんどなく、ミトコンドリア生物学のこの側面の探求を始めるために、4つの遺伝子について2つの異なるアイソフォームをプロファイリングした（表S3）。
ベイトは上記のようにプロファイリングし、共焦点顕微鏡の画像をhttp://prohits-web.lunenfeld.ca に示した。同じベイトの2つの生物学的複製物間の一対比較は、平均R2 = 0.92（範囲0.60-0.99）であった。1,465個の高信頼性餌と15,626個のユニークな近接相互作用が検出された（図2A；表S4）。これらのうち、528個のタンパク質（12,670個のユニークな高信頼性近接相互作用を生成）は、Mitocarta 2.0によってミトコンドリアと注釈され（ここおよび論文全体では「Mitocarta interactors/preys」と呼ぶ）、これはMitocarta 2.0 が定義するミトコンドリアのプロテオームの46％に相当する。ベイトごとに検出されたプリーの総数は、個々のベイトの発現レベルと中程度の相関しかなかった（r = 0.4915, p < 0.0001）（図S2A）。
予想通り、マトリックスベイトは主にミトコンドリアの餌を検出し（図2BおよびS2A）、OMMベイトはMitocartaでミトコンドリアとして注釈されていないタンパク質（「非Mitocarta餌」）を大量に検出しました。OMMを標的としない3つのベイト、すなわちIMSのHAX1、マトリックスタンパク質のGRSF1およびCHCHD1のみが、かなりの数の非ミトカルタの餌を同定し、それらが複数の区画を標的にしている可能性を示唆した。GRSF1には2つのアイソフォームがある：ミトコンドリアマトリックスGRSF1は、mtDNAの軽鎖から転写されたGリッチRNAと結合する(
Antonickaら, 2013
と、一部の細胞に存在し、イムノブロットで検出でき、単離したミトコンドリアのプロテアーゼ保護アッセイで消失する別の短いアイソフォームがある (
Jourdainら, 2013
未発表データ)。後者は、下流のインフレームATGから翻訳される可能性があり、我々のデータは、このアイソフォームが核小体に局在し、BirA＊タグ付きベイトが大きな細胞質リボソームサブユニット成分をビオチン化することを示唆した（図S2B）。CHCHD1はミトコンドリアのリボソームのサブユニットであり、ミトコンドリア以外での役割は不明である。また、多くの核小体タンパク質だけでなく、核膜のタンパク質も回収することが示されている（図S2B）。HAX1はミトコンドリア内外で機能することが示されており、少なくとも6種類のアイソフォームを発現することが示唆されている (
リーズら, 2008
)、今回のデータは、このタンパク質について予測される複数の局在と一致する。
BioID解析の結果、ミトコンドリアとして以前にアノテーションされた528個のタンパク質と、Mitocarta 2.0ではアノテーションされていない937個のタンパク質が近接相互作用物質として同定されました（図2A）。このうち、70種類以上のベイトに対して近接相互作用物質として同定された17種類のMitocartaの餌（図2C）は、マトリックスまたはマトリックスに面したIMMのいずれかにあるタンパク質で、すべてマトリックスの "環境 "にも含まれる。非ミトカルタの相互作用因子の大部分（95％）は10個未満のベイトで検出され（図2C）、非ミトカルタの餌の54％は1回だけ検出され（図2D）、残りの50個の非ミトカルタの餌は10個以上のベイトで検出されていました。これらをHuman Protein Atlas（HPA）の細胞局在データと比較し、私たちのヒト細胞の近接性マップ(
Go et al., 2019
). 少なくとも15個のタンパク質が、少なくとも1つのリソースによってミトコンドリアに局在することが示されるか示唆されました（図2C）。さらに、CDK5RAP1、MIGA1、MTFR2、MYO19、USP30、VPS13A、およびexonuclease 3′-5′ domain containing 2 (EXD2) に焦点を当てた研究では、これらのタンパク質がミトコンドリアに局在するかテザーになることが示されました (
Bingolら、2014年
;
Kumarら, 2018
;
Lu et al., 2019（ルーら、2019
;
キンテーロら、2009
;
シュネールら、2016
;
ヤマモトら、2019
;
チャン（Zhang）ら、2016
;
ヘンセンら、2018
;
シルバら、2018
). この分析は、これらのタンパク質の少なくとも一部がMitocarta 2.0のアノテーションから欠落している可能性を示唆しており、新規ミトコンドリアタンパク質の検出における我々のデータセットの価値を示しています。
興味深いことに、84個のMitocartaの餌（16%）は、単一の餌に対して高信頼性の近接相互作用因子としてスコアされた（図2D；表S5）。これらのほとんどは、スコアされたベイトでも比較的低い存在量であったが、これらの近接相互作用因子の中には、より注目すべきものがあった。PMPCAは、ベイトとして、ミトコンドリア処理ペプチダーゼ複合体におけるその結合パートナーであるPMPCBを強くかつ特異的に濃縮した（図2D）(
Saavedra-Alanis et al.
). もう一つの例は、ミトコンドリアマトリックスへのCa2+輸入を担う複合体を形成するMCU (mitochondrial calcium uniporter) とMCUBの近接した相互作用である (
Raffaello et al.
)であることがわかった（図2D）。ACAD9とSLC25A12の特異性プロット（図S2C）には、図1Cと1Dに示したものと同じ特異的相互作用因子に加え、単一の近接した相互作用因子が示されている。
全体として、我々のグローバル解析は、ミトコンドリアのすべてのコンパートメントとサブコンパートメントを代表するベイトとの近接相互作用の豊富で高信頼性のデータセットを提供し、オルガネラ自体およびオルガネラと他の細胞コンパートメントの間の機能関係を探索するために利用することができます。
ベイトの自己組織化により、異なるマトリックスクラスターが明らかになる
データをグローバルに分析するために、Jaccard類似度係数を用いてデータセット内のすべてのベイトのプロファイルの類似性を比較し、その後、階層的クラスタリングを行いました。同じ空間にいることが予測されるベイトほど、Jaccard距離のスコアが低くなっています（図3）。OMMベイトは、マトリックスベイトと1枚、あるいは2枚の膜で隔てられており（タグが細胞質に向いている場合）、マトリックスベイトとは明らかに異なる餌をプロファイルしている。IMMベイトは、一般的にマトリックスベイトとクラスター化しているが、BirA∗タグの向きに基づいて容易に分離することができた。MTCH1とMTCH2を除き、N末端とC末端で別々にタグ付けされたほとんどのベイトが同じクラスターに出現した。同様に、ベイトとして使用したアイソフォームは、TSFM-iso1と-iso2を除いて、同じマトリックスコンパートメントに2つの異なるクラスターを形成していました。
図3ベイトの自己組織化によって明らかになったマトリックスクラスター
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興味深いことに、この比較的粗い類似性尺度でも、異なるサブコンパートメントで見つかったマトリックスベイトが異なるクラスターを形成し、そのGOCC用語でアノテーションされました（図3）。ミトコンドリアマトリックスサブクラスターのベイトは高い類似性を示し（Jaccard距離スコア<0.17）、主に酵素、プロテアーゼ、ミトコンドリアの翻訳と異なる機能を持つ酸化的リン酸化複合体の組み立てに関連するタンパク質が含まれていました。リボ核タンパク質顆粒クラスターには、GRSF1、FASTKD2、DDX28、DHX30が含まれており、これらのタンパク質は、我々が以前に共免疫沈降することを示した (
Antonickaら、2013年
)、ミトコンドリアRNA顆粒の分子マーカーであるタンパク質である。ミトコンドリアRNA顆粒はミトリボソーム生合成のハブでもあり、このプロセスに関与するいくつかのタンパク質はミトコンドリアリボソームクラスターにクラスター化していた（MTERFD1、NGRN、WBSCR16 [RCC1L], RPUSD4, and METTL15）。これは、ピアソン相関分析（図S3A-S3D）によりさらに確認されたように、このアプローチがコンパートメントおよびサブコンパートメントの空間分解能を持つことを示すものです。また、一般的に、タグ付けやベイトの発現が内因性レベルを超えることによる大きな影響は見られないことから、Jaccard解析を検証し、データセットの予測的価値を実証しています。
餌生物中心の解析で機能的モジュールを特定
互いに近接する餌タンパク質は、このデータセットのすべてのベイトにおいて、ラベルの相関パターンを持つはずです。ProHits-vizを使用したデータセットのピアソン相関分析(
ナイトら、2017
)を用いて、OMM(図4B)、IMS/IMM(図4Cおよび4D)、またはマトリックスサブコンパートメント（図4E）のいずれかに属するタンパク質の明確なクラスターを形成する657の餌を特定した（図4A)。OMMクラスター（図4B）には、異なる生物学的プロセスに関与するタンパク質の4つの小さなクラスターが含まれており、GO用語で注釈されている：オルガネラ組織、核および小胞体膜ネットワーク、タンパク質局在化の確立、ストレスに対する細胞応答。オルガネラ組織」クラスター（図S4A）には、さらにミトコンドリアの融合または分裂に関与するOMMタンパク質の明確なクラスターが表示された（図S4B）。OMMタンパク質の他の2つのクラスターも検出された：いくつかの細胞区画に属すると注釈されたタンパク質（図5A；下記詳細参照）およびストレスへの応答に関与するタンパク質（図S4C）。
図4Prey-Prey相関分析
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図5ミトコンドリアと他のオルガネラの相互作用
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IMMタンパク質の2つのクラスターが同定され（図4A）、それぞれIMMとIMSのタンパク質（図4C；IMM/IMS）、マトリックスに面したIMMタンパク質（図4D）が含まれていた。IMM/IMS（図4C）サブコンパートメントは、より小さな機能モジュールを含み、クリステー組織、呼吸電子輸送鎖、酸化還元プロセス、およびIMMを横断する分子（カルシウムなど）の輸送に関与するタンパク質を包含していた（図S4D）。IMMクラスター対面マトリックス（図4D）の解析では、チトクロームc酸化酵素複合体（COX）のサブユニットの相関性の高いクラスターが示された。
マトリックス内の個々のクラスターは図4Eに示されており、マトリックスで発生することが知られている主要な代謝プロセスを包含している。特に、ミトコンドリアRNA顆粒に局在するタンパク質の3つのクラスター（図4F-4H）を見て、その機能的関連性によって区別することができる：擬似ウリジル化（図4F）、mtLSUアセンブリ（図4G）、RNA処理（図4H）；しかし、3つのRNA顆粒モジュールはすべてミトコンドリアのリボソームのタンパク質と高い相関がある。RNA顆粒内のまだ機能が未定義のタンパク質であるRCC1L（WBSCR16）は、プソイドウリジン合成酵素モジュールとクラスター化し（図4F）、実際にはいくつかの既知のプソイドウリジン合成酵素成分を回収した(
アントニッカら、2017年
)を特異性プロットで確認した(図S4E)。NME6、アフィニティ濃縮質量分析によってRCC1Lと相互作用することが以前に示された機能未知のジヌクレオチドキナーゼであり (
フロイドら、2016
)、本研究ではRCC1Lの最も特異的な近接相互作用因子として同定された。
いくつかの対角線外のクラスターも我々のマップで検出され（図4IおよびS4F）、例えばミトコンドリア内の局在、または高分子複合体内などの理由で、主に二つの多様なグループに属するタンパク質が、その標識プロファイルに類似性を持つことを示した。例えば、マトリックスサブコンパートメントでは、複合体IのQモジュールの構成要素（NDUFA5、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS7、およびNDUFS8）(
ゲレロ・カスティーヨら、2017年
)は、Qモジュール組み立て因子(NDUFAF2、NDUFAF3、NDUFAF4)と明確に相関している(図4I)。これらのデータは、プリープリー解析が、タンパク質を異なる空間的または機能的ネットワークに割り当てるだけでなく、そのようなモジュール間の推定される関連性を検出するのにも適していることを示している。
OMMベイトによる他のオルガネラとの特異的な相互作用の確認
細胞質に面したミトコンドリアOMMベイトでは、ミトコンドリアの餌だけでなく、他の細胞区画に属する近接した相互作用因子（中央値42個のミトコンドリア以外の餌；図2B）も検出された。タンパク質局在のクラスター確立（図4B）のいくつかの餌は、複数の細胞区画に割り当てられた（図5A）。これは、それらがオルガネラ間の接触部位やオルガネラ間の輸送に関与しているか、異なるアイソフォームが異なる区画に局在していることを示唆する。
OMMベイトがどのオルガネラと相互作用しているかを調べるために、各OMMベイトについて、同定されたすべての非ミトカルタの餌のGO用語の濃縮分析を行った。最も特異的なサブクラス用語をさらなる解析とクラスタリングに使用した（表S6；図5B）。SLC25A46、PTPN1（ERにも存在することが知られている）、FKBP8、RMDN3、およびRHOT2は、主にERから、または核膜もしくはゴルジ体に関連する近接餌料を検出する。これは、RMDN3がVAPBとの相互作用によってミトコンドリアとERを結びつけることを示すデータと一致する(
De Vos et al.
)、SLC25A46がERとミトコンドリア間の効率的な脂質移動に必要であるというデータ(
ジャナーら、2016年
). 逆に、MTCH1、MARCH5、MAVS、OCIAD1はペルオキシソームから餌を検出した。MAVSはミトコンドリアとペルオキシソームの両方に局在し、抗ウイルス自然免疫のシグナル伝達プラットフォームとして機能する (
Dixitら, 2010
). これらの例は、今回の相関解析を裏付けるものであり、いくつかのOMMタンパク質が二重／多重に局在しているか、あるいはミトコンドリアと他のオルガネラの間に形成される接触部位が、関係するオルガネラに特異的であることを示唆しています。さらに機能解析を進めることで、これらの接触部位が細胞代謝の制御において果たすさまざまな役割について、何らかの知見が得られるはずである。
293 Flp-In T-REx細胞における個々のベイトの免疫蛍光分析から、いくつかのベイトはそれ自体、複数の細胞区画に局在することが示唆された（図S5A）。そこで、FKBP8とOCIAD1という2つのベイトを選び、検出された餌が濃縮されている小胞体とペルオキシソームにもそれぞれ局在するかどうかを検討した。ヒト線維芽細胞およびHeLa細胞の内因性FKBP8およびOCIAD1に対する抗体と、ミトコンドリア、ER、ペルオキシソームのマーカーを用いて、FKBP8がミトコンドリアとERの周辺に局在することを示すことができた（図5C、S5B、S5C、およびS5E）。OCIAD1は主にミトコンドリアに局在していたが、免疫検出可能なOCIAD1の一部はペルオキシソームマーカーABCD3と共局在し（図5D、S5B、S5D）、ERマーカーは存在しなかった（図S5F）ことから、BioIDの結果と一致した。重要なことは、別の研究において、複数のペルオキシソームベイト（ABCD5、PXMP2、PEX3、PEX14）を用いたBioID実験により、OCIAD1が高い信頼度で餌になることが確認されたことです。例えば、ABCD5（80）とPXMP2（60）で検出されたOCIAD1スペクトルの平均数は、ミトコンドリアタンパク質AKAP1（95）とSFXN1（49）のそれと同様であった (
Go et al., 2019
). さらに、293 Flp-In T-REx細胞における細胞内分画実験により、ミクロソーム画分におけるFKBP8の存在が示され、OCIAD1がペルオキシソームマーカーに陽性の画分に存在することが示された（図S5G）。
以上のことから、個々のミトコンドリアOMMタンパク質が細胞タンパク質のユニークなサブセットと相互作用することが示され、他のオルガネラと接触部位を形成するミトコンドリア上のタンパク質のアイデンティティを決定するためにBioIDが使用できることが確認されました。ERの餌を主に認識する5つの餌（SLC25A46、PTPN1、FKBP8、RMND3、RHOT2）は、それぞれ182-230個の餌を同定したが、そのうち72個は共通で（表S6）、ERとミトコンドリアの接触部位に濃縮されているかもしれないタンパク質を表していた。これら72のプリーの半分以上は、1つ以上の最近の研究で報告されたER-ミトコンドリア接触タンパク質と重なっていた(
Cho et al., 2020
;
Hung et al.
;
Kwak et al.
を参照）（図S5H; 表S6）。残りの32個のタンパク質は、BioIDミトコンドリア-ER孤児と名付け、さらなる機能検証のための貴重な候補の供給源となります。
EXD2アイソフォームのミトコンドリアにおけるサブコンパートメント局在性
ベイト-ベイトクラスター解析（図3）では、ミトコンドリアマトリックスとOMMのベイトが明確に分かれていることが示されたが、驚くべきことに、OMMベイトの一つであるEXD2（exonuclease 3′-5′ domain containing 2）はマトリックスベイト、主にミトコンドリアのリボソームの構造サブユニットと一部相関を示した（図6Aおよび6C ）。我々は、EXD2が異なるミトコンドリアサブコンパートメントに二重に局在しているのではないか、と考えた。EXD2 は以前、OMM に局在することが報告された (
Hensen et al., 2018
;
パークら、2019
)、ミトコンドリア翻訳を制御するミトコンドリアマトリックス(
シルバら, 2018
)、二本鎖切断の切除に関与することが示唆された核(
ブロデリックら、2016年
;
Nieminuszczyら、2019年
). 2つのEXD2アイソフォームは、代替スプライシングによって生じると予測され、最初の125アミノ酸を欠くアイソフォーム2が生成される（図6B）。また、下流のメチオニンM126が翻訳開始のために使用される場合、同一のタンパク質が生じ、そのような代替翻訳開始は、（タグ付きベイトがスプライシングされないため）我々のBioIDデータを説明できる。いくつかのEXD2アイソフォーム（または翻訳後処理による生成物）の存在は、ステルスsiRNAを用いて細胞内のEXD2をノックダウンすることで確認した（図S6A）。EXD2アイソフォーム1のM126からの代替翻訳開始がマトリックスベイトの近接標識の原因となりうるかどうかを調べるため、126位のメチオニンをアラニンに置換し、3つのBirA∗タグ付き構築物を作成した：野生型アイソフォーム1（iso1）、M126A変異体を有するアイソフォーム1（M126A）、野生型アイソフォーム2（iso2）。3つのタンパク質はすべてミトコンドリアに局在した（図6BおよびS6B）。プロテイナーゼKプロテクションアッセイにより、iso1とM126AはOMMに局在し、isoform2はミトコンドリアの内部に局在することが確認された（図6B）。iso1とM126Aは、iso2には存在しない、アミノ酸7と25の間に予測される膜貫通ドメインを含んでおり、iso1とM126Aはともに膜貫通タンパク質であり、iso2は主に可溶性であることが確認された（図S6C）。
図6EXD2-BirA∗アイソフォームのサブコンパートメント局在の決定
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BioID解析（図6C；表S7）により、iso1とM126AはOMMに局在し、iso2はマトリックスに局在していることが確認されました。19個のタンパク質がiso1とiso2に共通し、すべてIMMまたはマトリックス由来であったが、これらのタンパク質について検出されたスペクトルカウントは、iso1ではiso2よりも一般的に4〜8倍低く（図S6D）、下流のATGからの翻訳は、完全長アイソフォームの翻訳よりもはるかに効率が低いことが示された。M126Aコンストラクトはマトリックスプリを同定せず、M126位置の代替開始部位がiso1によるマトリックスプリの同定に実際に関与しているという我々の予測を検証した。M126Aによるマトリックスタンパク質との相互作用の消失は、ベイトの発現量の減少によるものではなかった（図6B）。iso1およびM126Aベイトは、同数の高信頼性プリーを検出し（iso1では88プリー、M126Aでは86プリー）、検出プリーの60％は両方のベイトに共通していた（図6C）。BirA∗タグが細胞質に面しているため、これら2つのベイトに共通する餌は、ほとんどがOMMの餌か異なる細胞区画（ペルオキシソーム膜、細胞質キナーゼ、細胞質ストレス顆粒）に割り当てられた。しかし核餌は検出されず、EXD2がミトコンドリアのみに局在することが確認された。IMMの餌は、AFG3L2とNDUFS3の2つだけが3つの餌に共通していたが（スペクトル数は少ないものの、ネガティブコントロールでも確認されることがあった）、iso1とM126Aによる検出スペクトル数はiso2よりも10倍少なかった（表S7）。EXD2 BioIDの結果は、BioIDを使用して、個々のベイトの局在と検出する近接パートナーに明確な違いを見ることができるという点で、我々の分析とデータセットの強みを補強しています。
ミトコンドリアリボソーム近接ネットワークとリボソームアセンブリ
検出された餌の、フォールドチェンジを存在量の尺度として用いた餌-餌相関分析では、ミトコンドリアマトリックス内に個々のクラスターを形成する78個のミトコンドリアリボソームタンパクが検出されました（図7AおよびS7）。相関行列をCytoscapeで表示すると、ミトコンドリアリボソームタンパク質とその相関相手のネットワークが現れ（図7B）、小型リボソームサブユニット（mtSSU）のタンパク質間の密接な関係が容易に観察された。大リボソームサブユニット（mtLSU）のタンパク質は、餌と餌の相関分析に基づき、大きく分けて3つのクラスターを形成した（図7AおよびS7）。ヒトミトコンドリアリボソームの低温電子顕微鏡構造（PDB 3J9M、mtLSUのみ表示）上にこれらのタンパク質のクラスターを表示したところ、構造内の位置はmtLSUのモジュラーアセンブリの可能性と一致することがわかりました。クラスターL3（図7BおよびS7B）は、MRPL11/MRPL54とMALSU1との間に密接な相関を示し、以前にミトコンドリア大型リボソームサブユニットの組み立て因子であることが示されている(
Fungら, 2013
;
Rorbach et al.
)、MRPL11/MRPL54のリボソームへの付加にMALSU1が関与している可能性を示唆しています。また、リボソームの組み立てに関与する他のいくつかの因子もクラスターで同定された（RPUSD4、GTPBP10、DDX28、およびGRSF1）。この解析で同定されなかった唯一のmtLSUタンパク質はMRPL36で、私たちや他の公開されているBioID解析では餌として検出されなかった。最近、パルスチェイスSILACを用いたミトリボソームアセンブリの低分解能モデルが提案された (
ボーゲンハーゲンら、2018
)、タンパク質をmtLSUアセンブリの初期、中間、後期タンパク質に分類した。mtLSU-cluster1には初期と中間のタンパク質が、mtLSU-cluster2には初期と後期のタンパク質が、mtLSU-cluster3には後期のタンパク質が含まれており、我々のデータは示唆されたモデルとよく一致しています。
図7ミトコンドリアリボソーム相互作用ネットワーク
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mtSSUタンパク質は、MRPS15とMRPS21（図7A、7B、S7A）を除いて、大部分がクラスター化していた。この2つは、mtSSUの後期組み立てパートナーとして以前に報告されている (
ボーゲンハーゲンら、2018
). mtSSUの3つのタンパク質（MRPS12、MRPS37、MRPS38）は、この分析では同定されなかった。MRPS37（CHCHD1）とMRPS38（AURKAIP1）は、私たちや他の公開されたBioID分析では、餌として検出されませんでした。興味深いことに、mRNA解読部位の近傍のmtSSUの間期側に存在するタンパク質であるMRPS12は、ミトコンドリア開始因子MTIF2の特異的相互作用因子としてBioID解析で検出された（相関行列に含めるためには、この解析では餌を検出するベイトが最低2つは必要だったため、餌-餌相関図には存在していなかった）。また、MRPS12を餌として使用した場合、MRPS12とMTIF2の相互作用が検出された。MTIF2は、イニシエーターtRNAのmtSSUへの結合を促進する(
LiaoとSpremulli, 1991
). これらのデータから、MRPS12はMTIF2をイニシエーターtRNAやミトコンドリアmRNAとともにリボソームの活性部位に運び、翻訳を開始させる役割を担っている可能性が示唆された。今回のデータは、哺乳類ミトコンドリアにおける翻訳開始のメカニズムに迫るものであり、その制御についてはまだ十分に解明されていないことが明らかになった。
考察
本論文では、ミトコンドリア近接相互作用ネットワークの作成について説明し、BioIDデータを応用したいくつかの例を紹介した。サブオルガネル環境（マトリックス、IMS）を定義することで、個々のベイトに対する特定の近接相互作用因子を調査することができ、潜在的な洞察を得ることができました。例えば、ミトコンドリア翻訳終結因子MTRF1Lは、ミトリボソームの2つのサブユニット（MRPL10、MRPL53）とミトリボソームの組み立てに関わるGTPase（GTPBP10）だけでなく、3つの複合体Iの組み立て因子にも濃縮されていました（図1C）。複合体Iの組み立て因子の一つであるACAD9は、同じモジュールの他の組み立て因子と濃縮されており、興味深いことに、PDH（ピルビン酸脱水素酵素）をリン酸化して不活性化し、ピルビン酸がTCAサイクルに入るのを遅らせるキナーゼであるPDK（ピルビン酸脱水素酵素）のサブユニット3つが存在していました。これらのデータは、ミトコンドリアの翻訳、酸化的リン酸化システムの第一複合体の組み立て、TCAサイクルの活性を制御することによるNADHの生成の制御の間に密接な機能的結合があることを示唆しており、さらなる機能検証が必要な仮説である。
ベイトベイト解析により、ミトコンドリア内のサブコンパートメントにタンパク質複合体や機能性タンパク質モジュールを割り当てる解像度があることが示されました。この解析では、OMM、マトリックス、IMMのコンパートメントを非常に明確に分離し、マトリックス空間ではミトコンドリア翻訳、ミトリボソームアセンブリ、RNA顆粒に関連するサブコンパートメントのクラスタリングを示しました。ベイトベイト解析では、RNA顆粒の主要なタンパク質成分であるGRSF1、DDX28、DHX30、FASTKD2がクラスター化され、UV架橋後の内在性GRSF1の免疫沈降によって同定された(
アントニッカとシュウブリッジ、2015年
)、一方、NGRN、RCC1L、FASTKD5、MTERFD1、RPUSD4など顆粒でも同定された他のタンパク質はミトコンドリアのリボソームとクラスター化し、RNA顆粒は当初考えられていたよりも構造化されている可能性を示唆しており、このアイデアはBioIDとXL-MSを組み合わせて検証することが可能です。
全100種類のベイトによって同定された獲物を総合的に解析した結果、新規のミトコンドリアタンパク質をいくつか同定することができました（そのうちのいくつかは、この研究の進行中に確認されました）。また、免疫蛍光分析では容易に可視化できない、明らかに複数の細胞内位置を持つIMSとマトリックス中のタンパク質もいくつか同定した。RNA結合タンパク質であるGRSF1は、免疫蛍光法ではミトコンドリアだけに見えるが、核小体を含む他の区画に明確な近接相互作用因子を示している。このような二重または複数の細胞内局在は、下流のATG開始部位が交互に、または複数のタンパク質アイソフォームが交互に存在することによって生じる可能性がある。オルガネラ内での二重標的のもう一つの例は、EXD2の近接インタラクトームの解析から明らかになったものである。このタンパク質は、エキソクレアーゼとエンドヌクレアーゼの両方のドメインを持ち、以前は核、OMM、マトリックスに局在することが提案されていたが、それぞれ異なる機能帰属がなされていた。今回のデータから、EXD2-iso1-BirA∗は主にOMMタンパク質であるが、一部はマトリックスに局在し、下流のATG開始部位から翻訳されるアイソフォームである可能性が高いことが明らかになった。EXD2の正確な機能については、さらなる研究が必要である。
今回のデータで特に有益なのは、餌と餌のクラスタリングである。この相関分析は、同じ経路やモジュールに関与する餌のクラスタリングを予測し、ミトコンドリアの分裂と融合、呼吸鎖複合体の組み立て、ヌクレオイド、RNA顆粒などに関与するタンパク質でこれを検証した。GOタームを用いて、特定の生物学的プロセスに関与することが知られているタンパク質のクラスターを同定したが、これらのクラスターには、詳細な機能解析によって生物学的機能を調べることができる未特定のタンパク質が含まれていることが多い。特異性プロットは、擬似ウリディレーションモジュール（図S4E）および他のいくつかのタンパク質（図2DおよびS2C）で示したように、特定のモジュールと会合する新規タンパク質を特定するのに役立ちます。これらのデータは、ミトコンドリアの代謝や形態に関連する、十分に解明されていない多くのタンパク質の役割に関するメカニズム的な仮説を生み出すための豊富な情報源となるものである。
ミトコンドリアリボソームの構造サブユニットのうち、餌として選んだものはごくわずかですが、ほぼすべてを餌として同定し、これらをリボソームの低温電子顕微鏡構造上にマッピングし、餌-餌解析において、その組み立てモデルと一致する形でクラスター化することを顕著に示しました。また、このクラスターから、既知のリボソーム組み立て因子や、このプロセスにも関与している可能性のある未知のタンパク質が多数同定された。MRPS36タンパク質は、低温電子顕微鏡解析でヒトミトコンドリアリボソームのサブユニットとして検出されなかったが(
アメンツら、2015年
)、むしろα-ケトグルタル酸複合体の一部であることが示されている(
ホイベリンら、2014年
)、α-ケトグルタル酸複合体のE1成分であるOGDHと解析でクラスター化し、既発表の結果を検証した。
OMMベイトの餌生物-餌生物の分析で予想外だったのは、近接した相互作用の特殊性であろう。OMMベイトで検出された非ミトカルタの餌を教師なしクラスタリングすると、OMMタンパク質が明確に分離し、あるものは小胞体や関連する内膜と相互作用し、あるものはペルオキシソームマーカーと明確に濃縮することが示された。また、ミトコンドリアとERのテザーとして機能することが提案されているMFN2など(
de Brito and Scorrano, 2008)のように、ミトコンドリアとERのテザーとして働くことが提案されているものもある。
このことは、ミトコンドリア-ERテザーとしての役割をさらに検討する必要があることを示唆している。また、2つのOMMタンパク質のER（FKBP8）またはペルオキシソーム（OCIAD1）への二重局在を検証することができた。
オルガネラの接触部位は、脂質やカルシウムの移動、特にミトコンドリアとERの間の移動に重要なプラットフォームであるため、その領域は非常に重要な研究領域となっている (
Csordásら、2018年
). 我々のデータは、ミトコンドリアとオルガネラの接触部位は、実際には、ERやペルオキシソームとの接触の特定の性質に依存するユニークなプロテオームで特定の細胞機能に絶妙に調整されている可能性を示唆しています。BioIDは、生理的な課題や、オルガネラの繋留や代謝物の交換に関与するタンパク質をコードする遺伝子の変異に応答して、接触部位の近接インタラクトームの変化をプロファイルするために利用できる可能性があります。我々が同定した32のBioIDミトコンドリア-ERオルファンのうち（図S5H）、オートファゴソーム成熟に関与しているSMCR8-C9orf72-WDR41複合体の3メンバーがいる（図S5H）。
Yangら、2016年
)、選択的オートファジー(
セリエら、2016年
)、オートファジーの正と負の両方の制御(
Jungら、2017年
;
ウゴリーノら、2016
)、ERとミトコンドリアの付着部位でのオートファゴソームの形成と一致する(
ガロファロら、2016年
;
Hailey et al.
;
浜崎ら、2013
).
また、ミトコンドリア・ERの孤児として、cAMP依存性プロテインキナーゼ複合体（PKA）の制御サブユニットであるPRKAR2AおよびPRKAR2Bが同定されました。OMMには、PKAをリクルートするための足場となるAキナーゼアンカリングタンパク質AKAP1からなるcAMP/PKAシグナルのマイクロドメインが存在する(
Felicielloら, 2005
;
レフキンミアティスとザッコロ、2014年
). PKA活性は、いくつかのミトコンドリアプロセスを制御している(
オウルド・アメルとヘベール＝シャトラン、2018年
)、特に興味深いのはミトコンドリアの分裂と融合(
フリッポとストラック、2017
). ミトコンドリア分裂は、ミトコンドリアとERの接触部位で、そのアダプターMFFによるGTPase DNM1Lのリクルートが必要である (
オセラメら、2016年
). 我々の解析では、AKAP1、DNM1L、MFFもミトコンドリア-ER接触タンパク質として濃縮されたことが確認され（表S6）、これらはすべて、接触部位のタンパク質をプロファイリングした少なくとも一つの他の研究でも見られた(
Choら、2020年
;
Hung et al.
;
Kwak et al.
).
すべてのデータが読者に公開されているため、我々のデータセットは膨大な情報源を提供し、直接的に（データセットにあれば、目的のタンパク質の近接相互作用因子を見つけるために）、あるいは間接的に（読者のデータを我々のデータセットと比較するために）使用することができます。
研究の限界
餌は、ビオチン化できる溶媒に露出したリジン残基がある場合にのみ同定できる。したがって、餌によっては善意の近接相互作用因子を検出できない可能性がある。ストレプトアビジンビーズに捕獲された餌は、質量分析により同定されます。トリプシン消化によって、既知のタンパク質に同定され、一意に割り当てられるペプチドが放出されない場合、いくつかの餌が見逃される可能性がある。最後に、BirA∗タグを付けた餌がミトコンドリアに局在することを証明するために注意した一方で、場合によってはタグがタンパク質の正常な機能を阻害し、近接相互作用体の性質や程度に影響を与える可能性がある。しかし、この最後の問題は、本研究でプロファイリングされた多数のベイトによって軽減されます。
STAR★メソッド
主要リソース一覧
REAGENTSOURCEIDENTIFIERAntibodiesanti TOMM20Santa CruzCat# SC-11415; RRID: AB_2207533anti FLAGSigmaCat# F3165; RRID: AB_25952; Cat# F1804; RRID： AB_262044anti FKBP8SigmaCat#HPA045177; RRID: AB_2679244anti PDHAbcamCat# ab110333; RRID: AB_10862029anti OCIAD1SigmaCat# HPA044803; RRID： AB_10961287anti ABCD3 (IF)SigmaCat# SAB4200181; RRID: AB_10639362anti cytochrome c, CYTCBD BiosciencesCat# 556432; RRID: AB_396416anti SLC25A46ProteintechCat# 12277-1-AP; RRID: AB_2239384Anti VAPBProteintechCat# 14477-1-AP; RRID： AB_2288297anti calnexin, CANX (western blot)Cell Signaling TechnologyCat# 2679; RRID: AB_2228381anti calnexin, CANX (IF)BioLegendCat# #699402 ; RRID: AB_2728520anti PDIBD BiosciencesCat# 610946; RRID: AB_398259anti ABCD3 (western blot)AbcamCat# ab3421; RRID： AB_2219901anti α-tubulinCell Signaling TechnologyCat# #2125 ; RRID: AB_2619646anti GAPDHAbcamCat# ab9485; RRID: AB_307275anti MFN1Cell Signaling TechnologyCat# 14739; RRID： AB_2744531i RMDN3ProteintechCat# 20641-1-AP; RRID: AB_10695187anti YME1L1ProteintechCat# 11510-1-AP; RRID: AB_2217459anti SCO1in house
リアリーら, 2004
抗LRPPRC（ハウス
Sasarman et al.
anti GRSF1SigmaCat# HPA036985; RRID: AB_10672785anti EXD2SigmaCat# HPA005848; RRID: AB_1078768anti LONP1ProteintechCat# 15440-1-AP; RRID: AB_2137152anti SDHAAbcamCat# ab14715; RRID： AB_301433anti MT-CO2a gift by Nancy KennawayN/AGoat Anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-adsorbed Antibody, Alexa Fluor 488 ConjugatedMolecular ProbesCat# A-11029; RRID： AB_138404Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Molecular ProbesCat# A-11037; RRID: AB_2534095Goat Anti-Mouse IgG2a Antibody, Alexa Fluor 647 ConjugatedMolecular ProbesCat# A-21241; RRID： AB_141698Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, Alexa Fluor 594 ConjugatedMolecular ProbesCat# A-11012; RRID: AB_141359Goat Anti-Mouse IgG1 Antibody, Alexa Fluor 488 ConjugatedMolecular ProbesCat# A-21121; RRID： AB_141514Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) antibodyJackson Immuno Research LabsCat# 115-035-146；RRID： AB_2307392Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) antibodyAntibodyJackson Immuno Research LabsCat# 111-035-003; RRID: AB_2313567Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 ConjugatedMolecular ProbesCat# A-21206; RRID： AB_141708Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Polyclonal Antibody, Alexa Fluor 647 ConjugatedMolecular ProbesCat# A-31571; RRID: AB_162542anti BiotinJackson Immuno Research LabsCat# 200-002-211; RRID： AB_2339006化学物質、ペプチド、と組換えタンパク質Proteinase KQiagenCat# 19133LumiGLOCell Signaling TechnologyCat# 7003SOPTI-MEM mediaGibcoCat# 31985070Lipofectamin 2000InvitrogenCat# 11668019Lipofectamin RNAiMAXInvitrogenCat# 13778150DAPISigmaCat#32670マウントメディアDAKOCat# S3023 Streptavidin-separose beadsGEC セファロースビーズGECat# GE17-5113-01TrypsinSigma-AldrichCat# T6567Tetracycline hydrochlorideSigmaCat# T7660BiotinSigmaCat# B4639Hygromycin BWisentCat# 450- 141-XLPuromycinWisentCat# 450-162-XLChloroquineSigmaCat#C6628PolybreneAldrichCat#10768Protease Inhibitor CocktailSigmaCat#P8340PercollGEヘルスケアCat# 17-0891- 01重要な市販アッセイGateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogenCat# 11789020Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogenCat# 11791020QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis KitStratageneCat# 210518Deposited Data解析済みデータ本調査http． //prohits-web. lunenfeld.caミトカルタ2.0
カルボら、2016年
該当なし統合ミトコンドリア・プロテイン・インデックス（IMPI)
スミスおよびロビンソン、2016年
http://www.mrc-mbu.cam.ac.uk/impiGene オントロジー、GOエンリッチメント解析
トーマスら、2003
http://www.pantherdb.orgIMS APEXプロテオミクスデータ
フンら、2014
N/AMatrix APEXプロテオミクスデータ
Rhee et al., 2013
N/ARaw and analyzed datathis studyMassIVE: MSV000085154Subcellular location data version 18.1The Human Protein AtlasHPAExperimental Models：細胞ラインコントロールヒト線維芽細胞Montreal Children Hospital cellbankN/AFlp-In T-REx 293InvitrogenCat# R78007HeLaSigmaCat# 93021013Phoenixa gift from Garry P．NolanN/AOオリゴヌクレオチド使用したプライマーとクローン本研究表S3EXD2 siRNADharmaconCat# L-020899-02-0005組換えDNApDEST-pcDNA5-BirA＊-FLAG C-ターミンハウス
Couzensら、2013年
pDEST-pcDNA5-BirA∗-FLAG-GFPinハウス
Couzensら、2013年
pOG44InvitrogenCat# V600520mCherry-ER-3AddgeneCat# 55041Gateway pDONR221InvitrogenCat# 12536017pDEST-pcDNA5-BirA∗-FLAG N-termin home
クーゼンスら、2013
pBabe-gtw-rfAinハウス
アントニッカら、2006
ソフトウェアとアルゴリズムProHits-viz解析
ナイトら、2017
https://prohits-viz.lunenfeld.caCytoscape
シャノンら、2003
https://cytoscape.orgFiji
シンデリンら、2012
N/APDBビューア
Guex and Peitsch, 1997
http://www.expasy.org/spdbv/TMHMM 膜貫通予測ソフトウェア
Krogh et al., 2001
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/Prism 8GraphPadhttps://www.graphpad.comVenny 2.1Vennyhttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmlBioVennBioVennhttp://www.biovenn.nl；
Hulsen et al., 2008
新しいタブで表を開く
リソースの有無
リードの連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報およびリクエストは、リードコンタクトであるEric A. Shoubridge (eric.shoubridge@mcgill.ca)までお願いします。
試薬の入手方法
この研究で生成されたすべての試薬は、制限なく要求に応じてリードコンタクトから入手可能である。
データおよびコードの利用可能性
すべての提示されたデータは、本文および補足資料で利用可能です。
また、データはProHits (http://prohits-web.lunenfeld.ca)に寄託され、個々のベイトとその検出された餌の情報を見ることができる。
生ファイルと関連するピークリスト、結果ファイルからなるデータセットは、ProteomeXchange (http://proteomexchange.org, アクセッション番号 PXD018196) および MassIVE (http://massive.ucsd.edu, アクセッション番号 MSV000085154) に寄託されています。追加ファイルには、サンプルの説明、ペプチド/タンパク質のエビデンス、データセットの完全なSAINTexpress出力、およびデータセット構成と投稿に関連する実験手順を説明する「README」ファイルが含まれています。
実験モデルおよび被験者の詳細
哺乳類細胞培養
Flp-In T-REx 293細胞（Invitrogen）、Phoenixパッケージング細胞株（Garry P. Nolanの親切な贈り物）、HeLa細胞（Sigma）およびコントロールヒト線維芽細胞（Montreal Children Hospital Cell bank）は、10％ウシ胎児血清、500単位／mlペニシリンおよび500μg／mlストレプトマイシン補充高糖質DMEM（Wisent）で37℃、5％CO2培養器において培養した。細胞株は、マイコプラズマ汚染について定期的に検査した。免疫蛍光分析のために、細胞は24ウェルプレートの12mmラウンドカバースリップ（厚さNo.1、Fisherbrand）上で培養した。
Flp-In T-REx 293安定化細胞株の作製
Flp-In T-REx 293細胞を、2mlの培地中、6ウェルプレートに1ウェルあたり250,000細胞で播種した。翌日、200 ng pDEST-pcDNA5-ProteinX-BirA∗-FLAG、および2μgのpOG44を250μlの1x Opti-MEM (Invitrogen)中で5μlのLipofectamine 2000 reagentと混合してLipofectamine 2000 (Invitrogen) で細胞をトランスフェクトした。Opti-MEM/Lipofectamine溶液をOpti-MEM/プラスミド溶液に加え、細胞に添加する20分前にインキュベートした（抗生物質を含まない培地中）。トランスフェクションの4時間後に培地を交換した。翌日、トランスフェクションした細胞を10cmプレートに継代し、翌日、ハイグロマイシン（Wisent）を最終濃度200μg/mlで増殖培地に添加することにより選択した。この選択培地は、はっきりと見えるコロニーが存在するまで、2-3日ごとに交換した。1つの構築物につき最大6つのコロニーを摘出し、検証のために拡大した。まず共焦点顕微鏡でミトコンドリアへの局在を検証し、続いてイムノブロットでベイトコンストラクトの発現レベルとビオチン化レベルを評価した（下記参照）。
mCherry-ER過剰発現細胞株の作製
pBabe-mCherry-ERのレトロウイルス過剰発現により、mCherry-ERマーカーを安定的に過剰発現するコントロールヒト線維芽細胞株を作製した。pBabe-mCherry-ERプラスミドをHBS／Ca3（PO4）2法（ https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/publications/publications.html ）を用いてPhoenix包装細胞株に一過性トランスフェクションした。トランスフェクションの前日にPhoenix細胞を6cmプレートに約40-50%コンフルエントで播種した。トランスフェクション当日、新鮮な培地3 mlを細胞に加え、トランスフェクションの5分前に培地に25 μMクロロキンを加えた。3 μgのssDNAを補充したpBabe-mCherry-ERプラスミド（2 μg）を最終容量0.439 mlに希釈して、2M CaCl2 61μlをDNA混合物に加えた。一定の激しいバブリング下で、0.5 mlの2x HEPES緩衝生理食塩水（2xHBS、pH 7.0）をDNA/CaCl2溶液に添加した。その後、HSB/DNA混合液をPhoenix細胞に滴下添加した。翌日、Phoenix細胞を培地交換により無毒化し、生成したウイルスを翌24時間分回収した。Phoenix細胞から回収したウイルス含有培地を0.45μMシリンジフィルターでろ過し、ポリブレンを終濃度4μg/mlになるように添加し、70%コンフルエントのコントロールヒト線維芽細胞の6cmプレートに1ml添加した。翌日、線維芽細胞を10cmプレートに継代し、2μg/mlのピューロマイシンの添加により選択した。
メソッドの詳細
ベイトの選択とクローニング
ミトコンドリアベイトは、すべてのサブミトコンドリアコンパートメントを代表するように選択され、確認されたミトコンドリアタンパク質と予測されたミトコンドリアタンパク質の両方を選択しました。BirA∗タグを持つIMSに適切に局在する可溶性IMSベイトを見つけることは困難でした。多くのIMSタンパク質は、C末端にCX9Cモチーフを持ち、Mia40（CHCHD4）経路を介した輸入に必須である (
Chacinskaら, 2004
)であるため、C 末端へのタグ付けができない（N 末端も MTS が存在するため使用できない）。しかし、我々は2つの可溶性IMSタンパク質（CLPBとHAX1）を使用した。
マトリックス、IMS、およびほとんどの IMM ベイトは、N 末端がミトコンドリア標的化に不可欠であるため、すべて C 末端でタグ付けした。1つのIMMタンパク質（SLC25A12）はN末端でタグ付けされ、1つのIMMタンパク質（SLC25A51）は両末端でタグ付けされた。OMMタンパク質については、タグの位置は文献から推測するか、膜貫通予測プログラムTMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）を用いたタンパク質構造プロファイリングに基づくか、両端へのタグ付けをテストした。最終的に、9つのOMMタンパク質がN末端、4つのC末端にタグ付けされ、6つのタンパク質がN末端とC末端の両方にタグ付けされました。全体として、93種類のタンパク質がプロファイリングされ、その中には2つの異なるアイソフォームを持つ4種類のタンパク質が含まれていた。全てのコンストラクトとBirA∗-FLAGタグの位置は表S3に示す通りである。
すべての構築物は、適切なpDEST-pcDNA5-BirA∗-FLAG構築物（インフレームN末端またはC末端のBirA∗-FLAG融合タンパク質を作るため）へのゲートウェークローニングを用いて生成した。選択したエントリーゲートウェイクローンは、DNASU、AddgeneまたはLunenfeld-Tanenbaum Research Institute (LTRI) Open Freezer（カナダ、トロント）から入手した。エントリークローンが市販されていない場合は、ヒトcDNAから目的のORFをPCR増幅し、その後pDONR-221（Invitrogen）にサブクローニングすることでエントリークローンを作成した。EXD2-M126A変異体は、Quick Change Lightning kit（Stratagene）を用いてpDEST-EXD2-iso1-BirA∗-FLAG構築物を部位特異的変異誘発することにより作成した。
ミトコンドリアマトリックスとIMSのタンパク質環境を調べるために、MTSをターゲットとしたBirA∗コンストラクトを作成した。MTS-COX8（N 末端 29 アミノ酸）、MTS-AIFM1（N 末端 120 アミノ酸）、MTS-OPA1（N 末端 208 アミノ酸）はヒト cDNA から PCR で増幅し、ゲートウェークローニングを用いて pDEST-pcDNA5-BirA∗-FLAG-C-ter にクローニングした。MTS-COX4（N末端22アミノ酸）およびMTS-OTC（N末端32アミノ酸）については、全配列とBsrGIオーバーハングを包含するPCRプライマーを一緒にアニールし、その後BsrGI消化pDEST-pcDNA5-BirA＊-FLAG-C-terにライゲートした。
すべての個々の構築物のクローニングに使用したクローンおよびプライマーを、表S3に示す。すべての最終プラスミドは、サンガー配列決定によって検証された。
pBabe-mCherry-ERクローニング
mCherry-ER融合タンパク質をmCherry-ER-3プラスミド（Addgene）からPCRで増幅し、Gateway修飾pBABE（in house）にクローニングした。配列はサンガーシークエンスで確認した。
免疫蛍光法（Immunofluorescence
安定なFlp-In T-REx 293発現クローンを選択するために、構築物の局在および発現レベルは、抗FLAG抗体（Sigma）を用いた免疫蛍光により評価した。カバースリップ上で増殖した細胞に、1μg/mlのテトラサイクリン（Sigma）を24時間添加することにより、構築物の発現を誘導したか否かを調べた。翌日、PBS中の4％ホルムアルデヒドを用いて、37℃で20分間、細胞を固定した。カバースリップをPBSで3回洗浄し、細胞をPBS中の0.05% Tritonで室温で15分間可溶化した。3回のPBS洗浄後、カバースリップを5％BSAを含むPBSで10分間ブロックし、一次抗体（抗FLAG 1：4000および抗TOMM20 1：2000）と室温で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、アレクサ結合二次抗体（1：2000）およびDAPI（1：2000）と室温で30分間インキュベートした。カバースリップをPBSで洗浄し（3回）、マウントし、UPLANSAPO 100x/1.40 Oil対物レンズ（オリンパス）とAndor Neo sCMOSカメラを使用して、横河CSU-X共焦点スキャンユニットと接続したオリンパスIX83顕微鏡で細胞を画像化した。画像はFijiで処理した(
Schindelinら、2012年
). クローンの選択には、ミトコンドリア局在が優勢であることと、非誘導細胞における構築物の発現が最小であることが必要であった。1つのコンストラクトにつき1つのクローンを選択し、BioID解析に使用した。各ベイトの代表的な免疫蛍光画像は、http://prohits-web.lunenfeld.ca/GIPR/index.php?m_num=m1&DataSets_Sel=0 に掲載されています。
選択したタンパク質の局在を確認するために、コントロールのヒト線維芽細胞またはHeLa細胞を使用した。免疫細胞化学は、細胞可溶化を除き、0.1％Tritonを使用し、上記のように実施した。ミトコンドリアを可視化するために抗PDH（1：1000）または抗シトクロムc（1：1000）抗体を用い、ペルオキシソームマーカーとしてABCD3（1：1000）を用い、mCherry-ER（ER-赤）を安定して過剰発現させた細胞または抗CANX（1：1000）抗体によりERを可視化した。適切なAlexaコンジュゲート二次抗体（1:2000）を使用し、上記のように細胞を撮像した。
BioIDサンプルの調製
選択したFlp-In T-REx 293クローンとBioIDコントロール細胞（Flp-In T-REx 293細胞単独またはBirA∗-FLAG-GFPを過剰発現するFlp-In T-REx 293）を必要数の150mmプレートにスケールアップした（1つはフリーバック、6は処理と収穫のため）。細胞は、1μg/mlテトラサイクリン（Sigma）を用いたタンパク質発現の誘導、およびタンパク質標識のための50μMビオチンによる培地補給の前に70％のコンフルエントに成長した。細胞を24時間後に以下のように収穫した：細胞培地をデカントし；細胞を150mmプレートあたり5mlのPBSで2回洗浄し、そして5mlのPBS中で掻き取ることにより収穫した。3×150mmプレートからの細胞を800rpmで3分間ペレット化し、PBSを吸引し、ペレットを-80℃のフリーザーに移した。BioIDコントロール細胞を含む各サンプルの小部分（2％）を、抗FLAG抗体および抗ビオチン抗体を用いたSDS-PAGE/ウェスタンブロッティングによるベイト発現の誘導およびビオチン化について試験するために確保した。
細胞ペレット（3×150mmプレートに対応）を、RIPAバッファー（50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.1% SDS, Sigma protease inhibitors 1:500, and 0.5% Sodium deoxycholate）で4℃で1：10（ペレットの重量g：溶解バッファの容量ml）ニュートルで1時間インキュベートした。インキュベーション後、1μlのベンゾナーゼ（250U）を各サンプルに加え、溶解物を65％の振幅で氷上で超音波処理（3×10秒バースト、間に2秒の休憩）した。次に、これらのライセートを4℃で20,817gで30分間遠心分離した。遠心分離後の上清を新しい15mlファルコンチューブに移し、あらかじめ洗浄したストレプトアビジン-セファロースビーズ（GE）の30μlベッドボリュームを各サンプルに添加した。ストレプトアビジン-セファロースビーズを1mlのRIPAバッファー（プロテアーゼ阻害剤とデオキシコール酸ナトリウムを除く）で3回予備洗浄し、ビーズは400gで1分間洗浄の間にペレット化した。アフィニティ精製は、4℃、ニュートレーターで3時間行った。精製後、ビーズをペレット化し（400g、1分）、上清を除去し、ビーズを1mlのRIPAバッファー（プロテアーゼ阻害剤およびデオキシコール酸ナトリウムを除いた）中の1.5ml微量遠心分離管に移した。次に、ビーズを上下にピペッティングして洗浄し（洗浄ステップごとに4回）、最初に追加の1 ml RIPAバッファ（プロテアーゼ阻害剤およびデオキシコール酸ナトリウムを除く）で、次にTAP溶解バッファ（50 mM HEPES-KOH pH 8.0）で2回洗浄した。ビーズは遠心分離（400g、1分）によりペレット化し、洗浄ステップの間に上清を吸引した。最後の洗浄後、残留する50mM重炭酸アンモニウムをすべてピペッティングし、ビーズ上でタンパク質を消化した。
アフィニティ精製後、すべての洗浄バッファーを除去した後、ストレプトアビジン-セファロースビーズを、1μgのトリプシン（Sigma-Aldrich）を含む50mM重炭酸アンモニウムpH8の200μlに再懸濁しました。次に、サンプルを回転ディスク上で攪拌しながら37℃で一晩インキュベートした。翌日、さらに0.5μgのトリプシンを各サンプルに加え（10μlの50mM重炭酸アンモニウムpH8中）、サンプルを回転ディスク上で混合しながら37℃でさらに2時間インキュベートした。その後、ビーズを400gで2分間ペレット化し、上清を新しい1.5ml微量遠心チューブに移した。ビーズを150μlの50mM重炭酸アンモニウムpH8で2回すすぎ（ビーズを400gでペレット化、その間2分間）、これらのすすぎを元の上清と合わせました。次に、プールした上清を16,100gで10分間遠心分離し、上清の大部分（すべてのビーズを取り除くためにマイナス30μl）を新しい1.5mlマイクロフューズチューブに移した。これらのサンプルを、遠心分離エバポレーターで乾燥させた。
マススペックのデータ取得
3×150mmプレートからアフィニティー精製した消化物を12μlの5%ギ酸に再懸濁し、16,100gで1分間遠心分離した後、5μlをオートサンプラーで自作HPLCカラム（0. 75μmID、350μmOD、スプレーチップはレーザープーラーで作成）に10〜12cmのC18逆相材料（ZorbaxSB、3.5μmまたはReproSil-Pur 120 C18-AQ 3μm）をロードした。カラムは、ナノエレクトロスプレーイオン源（Proxeon、Thermo Fisher Scientific）を備えたLTQ-Orbitrap Velos（Thermo Fisher Scientific）をNanoLC-Ultra 2D plus HPLC system（Eksigent, Dublin, USA）にインライン接続し、設置しました。Xcalibur 2.0下のLTQ-Orbitrap VelosまたはElite装置をデータ依存モードで操作し、MSと最大10回の後続MS/MS取得を自動的に切り替えた。バッファAは99.9% H2O、0.1%ギ酸、バッファBは99.9%アセトニトリル、0.1%ギ酸です。HPLCグラジエントプログラムは、125分かけてアセトニトリルグラジエントを供給しました。最初の20分間は、2%Bで400μl/minの流速であったが、その後流速を200μl/minに下げ、95.5分まで溶媒Bの分率を35%まで直線的に増加させた。その後、溶媒Bを5分かけて80%まで増加させ、107分までそのレベルに維持した。その後、移動相はランの終了（125分）まで2％のBに減少した。
プロティナーゼKアッセイ
EXD2-iso1-BirA∗-FLAG, EXD2-iso2-BirA∗-FLAG または EXD2-M126A-BirA∗-FLAG を安定して発現する Flp-In T-REx 293細胞を3x15cmプレート上で培養し、1μg/mlテトラサイクリンの添加により24時間構築物を発現誘導した。細胞をPBSで2回洗浄し、氷冷したPBSで掻き出し、800rpmで3分間ペレット化した。細胞ペレットを800μlのMIBバッファー（220mMマンニトール、68mMスクロース、10mM HEPES pH 7.4, 80mM KCl, 0.5mM EGTA, 2mM 酢酸マグネシウム）に再懸濁し、テフロン-ガラスホモジナイザーで約15ストロークして2100rpmで均質化した。ホモジナイズした細胞を600gで5分間2回回転させ、核と壊れていない細胞を除去した。ミトコンドリアを10000g、10分間の遠心分離によりペレット化し、MIBバッファーで2回洗浄した。20μgのミトコンドリア（MIBバッファー中の最終濃度1mg/ml）を未処理のまま、または50μg/mlのプロテイナーゼK単独または1% Triton-X100との組み合わせで氷上で30分間処理した。プロテイナーゼK処理後、2μlの40mMフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）をすべてのサンプルに加え、サンプルを氷上で20分間インキュベートした。プロテアーゼ阻害後、Laemmliローディングバッファーを加え、サンプルを5分間煮沸した後、SDS-PAGEで分離した。
アルカリ炭酸塩抽出
EXD2-iso1-BirA∗-FLAG, EXD2-iso2-BirA∗-FLAG, EXD2-M126A-BirA∗-FLAG を安定発現させた Flp-In T-REx 293 細胞から、上記のプロテイナーゼKアッセイと同様にミトコンドリアを作製した。50μgのミトコンドリアを100μlの100mM炭酸ナトリウムバッファー（pH11.5）に懸濁し、氷上で30分間、10分ごとにピペッティングで穏やかに混合しながらインキュベートした。炭酸アルカリ処理したミトコンドリア50μlをインプットとして脇に置き（氷上に保管）、50μlをTLA100ローター（Beckman Coulter）で4℃、100000g、30分遠心分離した。ペレットを氷冷した炭酸ナトリウムバッファーで穏やかに洗浄し、20μlの1x Laemmliローディングバッファーに再懸濁した。上清とインプットをTCA（トリクロロ酢酸）によりさらに沈殿させた。50μlのサンプルに100%(w/v)のTCAを8.8μl加え、サンプルを-80℃で一晩保存した。TCA沈殿したタンパク質を20,000g、4℃で20分間遠心分離し、500μlの氷冷アセトンで2回洗浄し、風乾させた。最終TCA沈殿を20μlの1x Laemmliローディングバッファーに再懸濁した。
細胞内分画
Flp-In T-REx 293細胞（4x15cmディッシュ）をPBSで洗浄し、単離バッファー（220mMマンニトール、70mMスクロース、5mM HEPES/KOH pH 7.4, 1mM EDTA, 1x complete protease inhibitor）中に再懸濁しました。細胞懸濁液は、テフロンガラス製の回転式ホモジナイザーを用いて1000rpmで約15回ストロークし、その後、差動遠心分離を行うことでホモジナイズした。このホモジネートを600g、5分、4℃で2回遠心分離し、残骸と核を除去した後、得られた上清を8000g、10分、4℃で遠心分離して粗ミトコンドリア画分を得た。得られた上清をまず8 000gで遠心分離して残存する粗ミトコンドリアを除去した後、100 000g、4℃で30分間遠心分離して細胞質画分（上清）と軽膜・ミクロソーム画分（ペレット）に分離した。さらにミトコンドリアを精製するために、粗ミトコンドリアを分離バッファーに懸濁し、40％（2mL）-19％（4mL）-12％（4mL）のパーコール勾配（42 000g、30分、4℃）上の密度勾配遠心分離によって精製した。分離用緩衝液で1：5に希釈した3つのフラクションを集め、分離用緩衝液で3回洗浄した（20 000g、10分間、4℃）。各フラクションのタンパク質濃度を測定し、各フラクションから5μgのタンパク質をSDS-PAGE分析に使用した。
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット
すべてのBioIDサンプル、Proteinase Kアッセイサンプル、アルカリカーボネートサンプル、コントロールおよびsiRNA処理細胞を、10% Laemmli SDS-PAGE電気泳動で分離した。ゲルをニトロセルロース膜（PALL）に転写し、その後、0.1% Tween 20を含む5%スキムミルクトリス緩衝生理食塩液中で、指示した一次抗体および二次抗体とインキュベートした。
siRNA処理
コントロールのヒト線維芽細胞は、6ウェルプレートでリバース・トランスフェクション手順を用いて、製造者の指示に従って2.5μlのLipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）を用いて12nM EXD2 siRNA（Dharmacon）でトランスフェクションされた。処理は3日目に繰り返し、6日目にSDS-PAGE用に細胞を採取した。
定量化および統計解析
BioIDのためのMSデータ解析
すべてのThermo RAWファイルは、私たちのローカル相互作用プロテオミクスLIMSであるProHits(
リューら、2016
)に保存した。mzXMLファイルは、ProteoWizard() を使用してThermo RAWファイルから生成した。
Adusumilli and Mallick、2017年
)コンバータを使用し、ProHits内に実装した(-filter "peakPicking true2" --filter "msLevel2")。検索したデータベースは、RefSeqタンパク質データベース（バージョン57）のヒトおよびアデノウイルスの補完物に、Max Planck Institute（http://141.61.102.106:8080/share.cgi?ssid=0f2gfuB ）およびGlobal Proteome Machine（GPM; http://www.thegpm.org/crap/index.html ）からの「共通汚染物質」および共通配列タグを補足した。配列データベースは、順配列と逆配列からなり、合計72,226配列が検索された。検索エンジンはMascotとCometで、トリプシン特異性と2つのミス切断部位を許容した。メチオニン酸化とアスパラギン/グルタミン脱アミド化は可変修飾として設定された。フラグメントの質量公差は0.6 Da、プリカーサーの質量ウィンドウは±12 ppmでした。得られたCometとMascotの検索結果は、個別にPeptideProphet(
Keller et al.
)で個別に処理し、ProteinProphetで最初に記述されたパーシモンルールを用いてペプチドをタンパク質に組み立てた(
Nesvizhskii et al.
)、最終的にiProphet(
Shteynberg et al.
Trans-Proteomic Pipeline (TPP; Linux version, v0.0 Development trunk rev 0, Build 201303061711)を用いてタンパク質を出力しました。） TPPのオプションは以下の通りです。Velos Orbitrapファイルの場合、一般オプションは -p0.05 -x20 -PPM - d "DECOY"、iProphetオプションはpPRIME、PeptideProphetオプションはpPAEdです。iProphetのタンパク質確率が最小0.05のタンパク質はすべてProHitsのrelationalモジュールにパースされました。なお、SAINTでの解析では、iProphetタンパク質確率≧0.95のタンパク質のみが考慮されました。これは、タンパク質レベルのFDRが約0.5%であると推定されることに対応します。また、最低2個のペプチドイオンが検出されることが条件となりました。
SAINT分析
SAINT (Significance Analysis of INTeractome) は、実験で同定された各餌生物について、スペクトルカウント（半教師付きクラスタリング、多数の陰性コントロールランを使用）を用いて真の相互作用の確率を計算します。SAINTexpress(サイントエクスプレス)
テオら、2014
)解析は、バージョンexp3.6.1を使用して実施した。3つのSAINTexpress分析を行った：（1）SAINT＃3963：すべてのミトコンドリアベイトならびにEXT2-iso2およびEXT2-M126Aを含み、分析はベイトあたり2生物学的複製で実行した；（2）SAINT＃3962．(2) SAINT #3962 : MTS-OPA1を含み、ベイトあたり2つの生物学的複製で分析を行った。(3) SAINT #3961 : MTS-COX8, MTS-COX4, MTS-OTC, MTS-AIFM1を含み、ベイトあたり6-8生物学的複製で6複製に圧縮して分析を実施した。3つのSAINT分析のベイトタンパク質サンプルは、48のネガティブコントロールランと一緒に分析されました。これは、トランスフェクトされていないFlp-In T-REx 293細胞からの24の精製（内因的にビオチン化したタンパク質をモニターするため）とBirA＊-FLAG-GFP（プロミス的にビオチン化するタンパク質検出用）発現細胞から24精製からなり、スコアリングの厳格さを増すために、以前に記述したように24に圧縮しました (
Mellacheruvuら、2013年
). 1%のBayesian false discovery rate (BFDR)を閾値として、信頼度の高い近接相互作用因子を選択した。
下流の解析のために、3つのSAINTファイルを結合/分離して4つのデータセットを作成した：表S4：コア100ミトコンドリアベイトを含む、表S1：MTS-BirA∗データを2セットで含む： Matrix-BirA∗（MTS-COX8、MTS-COX4、MTS-OTCのデータ）およびIMS-BirA∗（MTS-OPA1、MTS-AIFM1のデータ）、表S7：EXT2-ISO1（この餌については表S4と同じデータ）、EXT2-ISO2、EXT2-M126Aに関するデータを含む。すべての非ヒトタンパク質コンタミは、SAINTファイルから削除されました。DHX30-DHX30およびMETTL17-METTL17のベイト-プレー間相互作用も手動で削除した。NCBIに登録されなくなった項目も手動で削除されました。3つのエントリーが新しいNCBIアノテーションに基づいて更新された。すなわち、LOC100507855がAK4、LOC101060541がRBM8A、LOC101060751がMRC1。表S1、S4、S7は、SAINT分析全体と、削除された餌、または以前のmass-spec実行時の汚染による異常なスコアの結果、スコアを調整した餌のリストです。
ProHits-Web
SAINT #3963データセットは、http://prohits-web.lunenfeld.ca/GIPR/index.php?m_num=m1&DataSets_Sel=0、インタラクティブな検索が可能です（「A high-density human mitochondrial proximity network」）。
各ベイトページには代表的な免疫蛍光画像（左上）が含まれている：ベイトの発現は、抗FLAG抗体（緑）、ミトコンドリアマーカーTOMM20（赤）、DAPI（青）で可視化されている。右上画像は、「トップ25」（スペクトル／長さネットワーク）におけるベイトの最初の近傍（緑色）のサイトスケープ表現。
解析に使用したデータベース
Mitocarta 2.0 (
カルボら、2016
)は、Mitocarta 2.0データベースの公開以降、20種類のタンパク質が遺伝子名を更新したことを考慮し、検出された餌をミトコンドリアまたは非ミトコンドリアとしてアノテーションするために使用した（括弧内にMitocarta 2.0の名前）： RCC1L（WBSCR16）、SDHAF3（ACN9）、MRM3（RNMTL1）、MRPL58（ICT1）、TWNK（C10orf2）、GATB（PET112）、TOMM70（TOMM70A）およびミトコンドリアATP合成酵素13サブユニット。ヒトの遺伝子アノテーションは、2019/04/17にGene Ontology（GO）からダウンロードした（GOバージョン日付2019/02/02）。Human Protein Atlas (HPA) subcellular localization dataは、https://www.proteinatlas.org/about/download、Human Protein Atlas version 18.1に基づいて、2019/06/06にダウンロードされたものです。
ProHits-vizを用いたデータ解析および可視化
表S1、S4、S7に示したSAINTファイルをProHits-vizの入力ファイルとして使用した(
ナイトら、2017
)解析の入力ファイルとして、以下に示すモジュールとパラメータを使用した。
ベイト・ベイト・ヒートマップ（図3用）
表S4のSAINT出力ファイルをProHits-vizのDot plot generatorモジュールにアップロードし、距離メトリックをJaccardに設定した以外はデフォルト設定で使用しました。Jaccard距離は1 - J(A,B)と定義され、J(A,B)はJaccard指数で、2つの集合（A、B）間の重なりとして定義され、J(A,B)=|A∩B｜A∪B｜�（�、�）=|�∩｜�∪�｜として計算されています。デンドログラムはモジュール内で自動的に作成され、OMMと使用した他のすべてのベイトの間に高いレベルの分離を示した。他のベイトはさらに、IMMとRNA顆粒ベイトを含むクラスタと、ミトコンドリアマトリックスとミトコンドリアリボソームを含むクラスタの2つの主要なクラスタに分かれています。この軸を中心に木の枝の構成が中立的に見えるので、デフォルトの表現から枝を手動で反転させました。最終図では、ミトコンドリア区画のラベリングとGO用語のアノテーションは、ProHits-vizの外で手動で行った。
ベイト対ベイトの比較
SAINTの各出力ファイルは、ProHits-vizのBait-Bait Comparisonモジュールに個別にアップロードされました。基準（x軸）と二次（y軸）ベイトが選択され、「対」出力タイプが選択されました。プライマリフィルタとセカンダリフィルタの値はどちらもBFDR≦1%（0.01）に設定されました。コントロール間のスペクトルカウントの減算と総存在値への正規化を行い、データはlog2変換された。これらの図において、端の円の色は、比較した両方のベイトにおける指示された餌のBFDRにマッピングされる。黒丸は、両方のベイトでBFDR≦1%の閾値に達したことを示し、半円は、一方のベイトでこの閾値に達したことを示している。ペアワイズ相関係数は、2つの条件の変換されていないスペクトルカウント行列から計算されました。なお、SAINTではベイト-ベイト間の相互作用を除去しているため、ベイト-ベイト間の比較において、ベイトが餌として検出された場合は色分けしています。選択した餌の色分けとラベル付けは、ProHits-vizの外で手動で行った。
特異性プロット
表S4のSAINT出力ファイルをProHits-vizのPrey Specificityモジュールにアップロードし、Fold Enrichment分析を実施した。コントロール全体のスペクトルカウントの減算が行われた。各Preyのスペクトルカウントは、Prey Sequence Lengthに対して正規化した。図はProHits-vizの外で手動で注釈を付け、色分けした。
相関分析
表S4のSAINT出力ファイルをProHits-vizのCorrelation Analysisモジュールにアップロードした。アバンダンス測定は、図4、5、S4ではAvgSpectraに、図7、S7ではFoldChangeに設定されました。スコアフィルター値はBFDR≦1%(0.01)に設定した。Abundance cutoffは5スペクトル、minimum bait requirementは2、コントロールのカウントの減算を実施した。ユークリッド法によるピアソン相関を用い、「完全」クラスタリングとした。GOタームエンリッチメントの計算は、ProHits-vizで直接、ダイナミックビューアを用いたボックス領域の分離を通して行い、タームエンリッチメントの計算はg:Profiler (
Reimandら、2016年
)を用いて、すべてのデフォルトオプションを使用した。GO用語のアノテーションは、その後、ProHits-vizの外で手動で行われた。いくつかのパネルは、ダイナミックビューアからズームインされた。
ヒートマップ作成（図5Bの場合）
表S6（TabA）をProHits-vizのDot plot generatorモジュールにアップロードし、デフォルト設定で使用し、二次フィルターを0.01に設定した。得られたドットプロットは、ダイナミックビューアの「表示オプション」でヒートマップとして可視化された。デンドログラムは、モジュール内で自動的に作成された。表S6（TabA）については、OMMベイトによって検出されたすべての非ミトカルタの餌をPANTHERにアップロードし、GOタームCellular Compartment分析を実施した。すべてのGOタームはBFDR≦1%で同定された。最も特異的なサブクラス用語とそのFold濃縮スコアは、さらなる解析に使用された。得られた図は、ProHits-vizの外で手動で色分けとラベル付けを行った。
Cytoscapeによるデータ解析と可視化
Cytoscape 3.7.2 (
Shannonら, 2003
)を使用した。図7のネットワークの生成には、餌食-被食解析の相関行列データを使用した。ネットワークには0.7以上の相関関係のみを考慮し、少なくとも1つのミトコンドリア・リボソームタンパク質を持つエッジのみを取り込んだ。レイアウトはデフォルトが選択された。エッジは相関スコアに基づき色分けされた。ノードサイズは各ノードの接続性の度合いを示し、ノードにリンクされたエッジの数として定義される。レイアウトはPDFとしてエクスポートし、手動で調整した：mtSSUタンパク質はターコイズブルーとライトブルーで表示し、mtLSUタンパク質はダークブルー、グリーン、ピンクで表示した。ミトコンドリアリボソームの一部ではないその他の相互作用因子はグレーで表示した。
ProHits-web.lunenfeld.caのベイトネットワーク画像の生成には、各ベイトの上位25個の近接相互作用因子に限定したベイト-プレー近接ネットワーク（下記詳細参照）を使用しました。個々のネットワークについて、まず対象となるベイトに接続するすべてのエッジと、これらのエッジに接続するすべてのノードを選択した。yFiles Organic Layoutを選択し、長さ正規化スペクトル数（NormSpec）をエッジの重みとして使用した。NormSpecでエッジ幅を連続的にマッピングし、方向性のあるネットワークを作成した（餌→餌の関係を表示）。ノードの大きさは、「トップ25」ネットワークにおける指示タンパク質の検出頻度を示す。データセットでベイトとして使用されたタンパク質は、紫色で表示されている。Mitocarta 2.0におけるタンパク質の存在は、ノードの周囲に黒枠で表示されている。ノードは、視認性を高め、特定の近接相互作用を強調するために、このレイアウトから手動で再配置された。レイアウトはPDFとしてエクスポートされ、手動で調整され、最終的に.pngファイルに変換され、http://prohits-web.lunenfeld.ca/GIPR/index.php?m_num=m1&DataSets_Sel=0 にアップロードされた。
「上位25名のインタラクター
各ベイトの上位25の相互作用する餌を、長さで正規化したスペクトルカウント（NormSpectra）から決定した。
餌の長さ正規化スペクトル数（NormSpectra）の計算
餌xと餌yについて、NormSpectraは、まず餌xでの存在量からコントロールで見つかった餌の平均スペクトルカウントを引き、次に餌xの全餌の長さの中央値を掛け、その長さで割って算出する：
NormSpectrax,y=(AvgSpectrax,y-AvgSpectraControls,y)∗Len~gthPreyLengthy�� =(��-�� )

Matrix-BirA∗ スコアの算出について
3つのミトコンドリアMatrix-BirA∗ベイトで同定された高信頼度餌生物267個（BFDR≦1%）のそれぞれの餌生物長正規化スペクトル数を、各Matrix-BirA∗ベイトが検出した全スペクトル数で正規化（Norm2Spectra count）しました：ベイトxと餌食yについて
Norm2Spectrax,y=NormSpectrax,yTotalSpectrax��2��、�＝��、��。

Matrix-BirA∗ スコアは、3つの Matrix-BirA∗ ベイトで識別した獲物の3つの Norm2Spectra カウントの平均、2つのベイトで識別した獲物の2つの Norm2Spectra カウントの平均として算出し、1つのベイトのみで獲物を検出した場合のNorm2Spectraカウントと等しくなるようにしています。図1Cでは、Matrix-BirA∗スコアのlog2を示し、3つのグループ（3つのMatrix-BirA∗ベイトすべてによって識別された獲物（濃い茶）、2つのベイト（中茶）、1つのベイトのみ（薄茶）に分けています。ソート順は、3つのMTSベイトすべてに見られる最も豊富なタンパク質、次に2つのベイトに見られるタンパク質、次に1つのMTSのみに見られるタンパク質に基づきます。
IMS-BirA∗スコアの算出方法
2つのミトコンドリアIMS-BirA∗ベイトで同定された120の高確率餌（BFDR≦1%）のそれぞれの餌の長さ正規化スペクトルカウントを、それぞれのIMS-BirA∗ベイトが検出した全スペクトルに対して正規化しました（Norm2Spectra count）。ベイトxと餌食yについて
Norm2Spectrax,y=NormSpectrax,yTotalSpectrax��2��、�＝��、��。

IMS-BirA∗スコアは、2つのIMS-BirA∗ベイトで識別した獲物の2つのNorm2Spectraカウントの平均として計算するか、1つのベイトのみで獲物を検出した場合は、1つのベイトのNorm2Spectraカウントと等しくなるようにしました。図1Dでは、IMS-BirA∗スコアのlog2を示し、2つのベイトによって識別された餌（赤）と1つのベイトのみによって識別された餌（薄赤）の2つのグループに分けています。
ミトコンドリア "環境 "の特異性解析
Matrix-BirA∗とIMS-BirA∗によって検出された高信頼度の餌を、ミトコンドリアマトリックスAPEXの既発表データセットと比較しました (
Rheeら、2013年
)および膜間空間APEX(
Hung et al.
). マトリックスおよびIMSプロテオームのミトコンドリア特異性を計算するために、まず、獲物がMitocarta 2.0に従ってミトコンドリアタンパク質としてアノテーションされているかどうかを判断しました(
カルボら、2016
)またはGene Ontology (GO)データベースに従って、ミトコンドリアタンパク質としてアノテーションされているかどうかを判定した。その後、以前にミトコンドリアアノテーションを受けた餌の数を、検出された餌の総数で割りました。マトリックス特異性および「IMS露出」は、MTS-APEXおよびIMS-APEXに記載されているように計算しました：マトリックス-BirA∗およびMTS-APEXは、サブミトコンドリア局在を有する424のタンパク質を含むデータセットと比較しました(
Rheeら、2013年
). IMS-BirA∗とIMS-APEXは、サブミトコンドリア局在の579個のタンパク質を含むデータセットと比較しました (
Hung et al.
). IMS-BirA∗で検出された68種類の餌とMatrix-BirA∗で検出された142種類の餌について、それぞれサブミトコンドリアアノテーションが利用可能であった。OMM、IMS、またはIMMタンパク質としてアノテーションされたことがあるタンパク質は、「IMS露出タンパク質」とみなされました。
ミトコンドリアリボソームのタンパク質の可視化
ヒトミトコンドリアリボソームの低温電子顕微鏡構造（PDB：3J9M；
アメンツら、2015
)をSwiss-PDBViewerに読み込み、大ミトコンドリアリボソームサブユニット、または小ミトコンドリアリボソームサブユニットを個別に表示しました。構造はSolid 3Dでレンダリングされた。個々のRNA分子はグレーで色分けされた。タンパク質はリボンで表示され、餌食相関分析で同定された個々のクラスターに基づいて色分けされた。
その他の解析
その他の統計解析とデータプロットは、Microsoft ExcelとPrism 8 (GraphPad)を用いて実施した。ベン図は、Venny 2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) または面積比例型ベン図ソフトウェアBiovenn (
Hulsen et al., 2008
).
謝辞
Kathleen Daigneaultには、このプロジェクトの技術的な作業（BioIDコンストラクトと細胞株の大半の生成）を、Shoubridge labのメンバーには、有益な議論を提供していただいた。本研究は、United Mitochondrial Disease Foundation（米国）およびCanadian Institutes of Health Research（MT-15460）からE.A.S.への助成金、M.J.A.はCIHR Healthy Brains Healthy Lives initiativeからの研究助成を受けて行われたものである。A.-C.G.は、カナダ保健研究所（CIHR）財団助成金（FDN 143301）の支援を受けている。プロテオミクス作業は、Canada Foundation for Innovation funding、オンタリオ州政府、Genome CanadaおよびOntario Genomics (OGI-097, OGI-139)の支援を受けたLunenfeld-Tanenbaum Research InstituteのNetwork Biology Collaborative Centreで行われました。A.-C.G.は、機能的プロテオミクスのカナダ研究椅子である。
著者貢献
H.A.、E.A.S.、A.-C.G.はプロジェクトを構想した。H.A.、E.A.S.、A.-C.G.は論文を執筆した。H.A.は、すべてのBioIDサンプルの調製を監修した。Z.-Y.L.は、アフィニティ精製と質量分析計の取得を行った。H.A.、A.J.、M.J.A.、W.W.はウェスタンブロットと免疫蛍光研究を行い、データを分析した。H.A.とA.-C.G.は、データ解析を行った。E.A.S.とA.-C.G.はプロジェクトの監督を行った。
利害関係の宣言
著者らは競合する利害関係を宣言しない。
補足情報
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資料S1. 図S1〜S7
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表S1. 図1に関連するマトリックスとIMS「環境」のBioID近接インターアクトーム
SAINTexpress タスク ID 3962 および 3961。関連ファイルは、MassIVE submission MSV000085154 および PXD018196 に記載されています。表A マトリックスMTS-BirA∗データセット。
BaitはMTS-「遺伝子名」（カラムA）、prey（カラムB）はNCBIタンパク質アクセッション番号、PreyGene（カラムC）はNCBI遺伝子通りの記号、各preyのスペクトルカウント（カラムD、「I」区切り；カラムEはスペクトルカウントの合計；カラムFはスペクトルカウントの平均）、実施した複製回数（カラムG）、全てのネガティブコントロールにわたるpreyのスペクトルカウント（カラムH）、複製をまたぐ平均確率（アッブジー・AvgP．カラムI）、最大確率（カラムJ）、SAINTスコア（タンパク質-タンパク質相互作用の確率、カラムK）、フォールドチェンジ（精製におけるカウントをコントロールにおけるカウントで割ったものに0による除算を防ぐための小さな因子を加えたもの、カラムL）、ベイズFDR（カラムM）、餌の配列長（カラムN）はSAINTexpress出力から各餌-餌関係に対してリストアップした。
(1)「DECOY」配列（SAINTexpressで削除）、(2)すべての非ヒトタンパク質汚染物質（タブCにリストアップ）です。
タブB IMS MTS-BirA∗データセット
個々の列は、タブAと同じです。
1）"DECOY "配列（SAINTexpressで削除）、（2）すべての非ヒトタンパク質コンタミ（タブCに記載）、（3）SAINTが見逃したベイトベイト相互作用：MTS-AIFM1からのAIFM1 なお、以下の項目もこの原稿に関連する最終高信頼リストから手動で削除されている。
タブC：削除された非ヒト汚染物質のリスト。
個々の列はTab Aと同じである。 Tab D. NCBIに存在しない削除されたエントリーのリスト。
個々の列は、Tab Aと同じです。
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表S2. 図1Cと1Dに関連するマトリックスまたはIMSの「環境」上でのベイト-プレイの濃縮度。
表A：検出された餌のマトリックス-BirA∗スコア（マトリックス "環境"）。
3つのマトリックスMTS-BirA∗ベイトのうち少なくとも1つに対して有意な近接相互作用因子として検出された267の餌生物（A列）：濃い茶色は、3つのマトリックスMTS-BirA∗ベイトすべてに対して有意と検出された餌生物、中茶色は、二つのマトリックスMTS-BirA∗ベイトに対して有意として検出された餌生物、薄茶色は、一つのマトリックスMTS-BirA∗ベイトのみに対して有意として検出された餌生物の例です。
MTS-OTC（B列）： MTS-OTC（カラムB）：MTS-OTC-BirA∗で検出された全スペクトルに対する各餌の餌長正規化スペクトル数、MTS-COX8（カラムC）：MTS-COX8-BirA∗で検出された全スペクトルに対する各餌の餌長正規化スペクトル数、MTS-COX4（カラムD）．MTS-COX4（カラムD）：MTS-COX4-BirA∗で検出された全スペクトルに正規化した各餌生物の長さ正規化スペクトル数；Matrix-BirA∗ Score（カラムE）．B～D列で算出したスペクトル数の「平均値」（「平均値」の算出方法はこちらを参照）。
表B：検出された餌生物のIMS-BirA∗スコア（IMS "環境"）。
2つのIMS MTS-BirA∗ベイトのうち少なくとも1つに対して有意な近接インタラクターとして検出された120の餌生物（A列）：赤は両方のIMS MTS-BirA∗ベイトに対して有意な餌生物、オレンジは一方のIMS MTS-BirA∗ベイトのみに対して有意な餌生物として検出。
MTS-AIFM1（B列）： MTS-AIFM1（カラムB）：MTS-AIFM1-BirA∗で検出された全スペクトルに対して正規化した各餌の餌長正規化スペクトル数、MTS-OPA1（カラムC）：MTS-OPA1-BirA∗で検出された全スペクトルに対して正規化した各餌の餌長正規化スペクトル数、IMS-BirA∗スコア（カラムD）．B-C列で算出したスペクトル数の「平均」（「平均」の算出方法はこちらを参照）。
表C LRPPRCの有意な近接相互作用因子として検出された全ての餌の濃縮スコア（餌として）。Baitはベイト遺伝子名（A列）、prey（B列）はNCBIタンパク質アクセッション番号、PreyGene（C列）はNCBI遺伝子ごとの記号、NormSpec（D列）、各preyの長さ正規化スペクトルカウントをベイトとしてLRPPRCについて検出した総スペクトルに対して正規化； N/Aは、どのMatrix-BirA∗ベイトにおいても有意な餌として検出されなかった餌である。
表D：ACAD9（ベイト）の有意な近接相互作用因子として検出されたすべての餌の濃縮スコア。
個々の列は、表Cと同じである。
タブE. MTFR1L（ベイト）の有意な近接相互作用因子として検出されたすべての餌の濃縮度スコア（ベイト）。
個々のカラムは、タブCと同じである。
表F. DIABLO（ベイト）の有意な近接相互作用因子として検出されたすべての餌の濃縮スコア。
Baitはベイト遺伝子名（A列）、prey（B列）はNCBIタンパク質アクセッション番号、PreyGene（C列）はNCBI遺伝子ごとの記号、NormSpec（D列）、各preyのprey長正規化スペクトルカウントをベイトとしてのDIABLOについて検出した全スペクトルに対して正規化； N/Aは、IMS-BirA∗のどのベイトにおいても有意な餌として検出されなかった餌。
表G：SLC25A12（ベイト）の有意な近接相互作用因子として検出されたすべての餌の濃縮度スコア（ベイト）。個々の列は、タブFと同じ。
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表S3. 図2およびSTAR Methodsに関連する、研究で使用したベイトのリストとベイト-BirA∗ クローニング戦略
タブ A. ベイトの説明表。
Bait Nameには、遺伝子名、必要に応じてアイソフォーム、タグローカライズ（N-またはC-terminal、カラムA）を記載。Bait geneはNCBI Entrez Gene（B列）。C列（BirA∗タグ（N/C））は、各ベイトのタグ局在、N末端/C末端を示す。UniProtIDはD列、UniProtエントリ名はE列、タンパク質名はF列、長さはアミノ酸数（G列）、質量はダルトン単位（H列）、細胞内局在はUniProtアノテーションに基づく（I列）、遺伝子名はスペースで区切って代替遺伝子名（J列）。他のミトコンドリアデータベース（Mitocarta 2.0, IMPI, GO）におけるベイトの存在をカラムK-Mに示している。
表B bait-BirA∗のクローニングに使用したクローンとプライマーのリスト。
ベイト名には遺伝子名、必要に応じてアイソフォーム、タグの局在（N末端またはC末端、A欄）を記載。B列（BirA∗タグ[N/C]）には、各ベイトのタグ局在（N末端/C末端）を示す。UniProtID、C列、クローン番号、D列、クローン供給元、E列、トロント、はLTRIオープンフリーザーから入手した構築物を示す、PCRプライマー（FおよびG列）、個々の遺伝子の増幅に使用したPCRプライマー、クローニング戦略、H列。
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表S4. 図2、3、4、5、6、7に関連するミトコンドリアネットワークの高信頼性BioID近接インターアクトーム
SAINTexpressタスクID 3963。関連ファイルはMassIVE submission MSV000085154 and PXD018196に掲載されています。Tab A. Baitはベイト遺伝子名、アイソフォーム、BirA∗-FLAGタグの向き（NまたはC；A列）、Prey（B列）はNCBIタンパク質アクセッション番号、PreyGene（C列）はNCBI遺伝子通りの記号、各Preyのスペクトル数（D列、「I」デリミターで区切る；カラムE、スペクトルカウントの合計；カラムF、スペクトルカウントの平均）、実施した複製数（カラムG）、すべてのネガティブコントロールにわたる餌食のスペクトルカウント（カラムH）、複製にわたる確率の平均（AvgP；カラムI）、最大確率（カラムJ）、SAINTスコア（タンパク質-タンパク質相互作用の確率、カラムK）、フォールドチェンジ（精製におけるカウントをコントロールにおけるカウントで割ったものに0による除算を防ぐための小さな因子を加えたもの、カラムL）、ベイズFDR（カラムM）、餌の配列長（カラムN）はSAINTexpress出力から各餌-餌関係に対してリストアップした。
(1)「DECOY」配列（SAINTexpressで削除）、(2)すべての非ヒトタンパク質汚染物質（タブBに記載）、(3)以前のサンプルおよびSAINTが見逃した餌-餌相互作用からの質量仕様汚染物質（情報はタブCに記載）、次の項目もこの原稿に関連する最終的な高信頼性リストから手動で削除したことに注意してください。
表B：除去された非ヒト汚染物質のリスト
個々の列は、表Aと同じです。
表 C. 以前のマススペックの汚染により、除去された、またはスコアが調整された餌のリスト。
SAINTが見逃した2つの餌-餌の相互作用もリストアップしています。サンプル番号：ProHitsのサンプル番号（A列）、ベイト：ベイト遺伝子名、アイソフォーム、BirA∗-FLAGタグの向き（NまたはC、B列）、プレイのコンタミ：NCBI遺伝子による記号（C列）、実行したアクションはD列に示す。
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表S5. 図2に関連する、ミトコンドリアベイトとその同定された餌の間のユニークな相互作用のリスト
このリストで同定された餌は、BFDR≦1％で単一のミトコンドリアベイトと相互作用することが判明している。ベイトはベイト遺伝子名、アイソフォーム、BirA∗-FLAGタグの向き（NまたはC；A列）を示し、プライ（B列）はNCBIタンパク質アクセッション番号、PreyGene（C列）はNCBI遺伝子通りの記号、各プライのスペクトルカウント（D列、「I」区切り；カラムE、スペクトルカウントの合計；カラムF、スペクトルカウントの平均）、実施した複製数（カラムG）、すべてのネガティブコントロールにわたる餌食のスペクトルカウント（カラムH）、複製にわたる確率の平均（AvgP；カラムI）、最大確率（カラムJ）、SAINTスコア（タンパク質-タンパク質相互作用の確率、カラムK）、フォールドチェンジ（精製におけるカウントをコントロールにおけるカウントで割ったものに0による除算を防ぐための小さな因子を加えたもの；カラムL）およびベイズFDR（カラムM）、プレイの配列長はアミノ酸数を表す（カラムN）、平均Ctrl counts（カラムO）はネガティブコントロールにより検出された平均スペクトルカウント（カラムHの平均）、プレイの長さで正規化したスペクトルカウント（カラムP）。Q列は、餌と餌の相互作用が無限特異性を示すかどうかを示し、他の餌によって餌のスペクトルが検出されなかったことを意味する（Y, yes; N, no）。
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表S6. 図5に関連する、OMMタンパク質によって検出された非ミトカルタの餌の分析
表A. 同定されたGO用語のリスト：OMMベイトによって検出されたすべての非ミトカルタの餌の細胞区画。ベイトはベイト遺伝子名、アイソフォーム、BirA∗-FLAGタグの向き（NまたはC；A列）；PANTHER（2019-02-02公開のGOオントロジーデータベース、B列）に基づくGO用語細胞区画、PANTHERでの倍率濃縮スコア（C列）に基づいて各GO用語へ付与しました。最も特異的なサブクラス用語が示されている。すべてのGOタームはBFDR≦1%で同定された。
表B. 図S5Hの生成に使用したミトコンドリア-ER接触部位タンパク質に分類されるタンパク質のリスト。BioID（Mito-ER）タンパク質は、5つのOMMベイト（SLC25A46、PTPN1、FKBP8、RMDN3、およびRHOT2）のクラスターに共通する72のプリーを表す。ミトコンドリア-ER接触部位タンパク質の既発表プロテオミクスデータセットのリストを比較に使用した（Cho et al., 2020; Hung et al., 2017; Kwak et al.）
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表S7. 図6に関連するEXD2アイソフォームのBioID近接インターアクトーム
SAINTexpressタスクID 3963。関連ファイルはMassIVE submission MSV000085154 and PXD018196に掲載されています。
タブ A. Baitはベイト遺伝子名とアイソフォーム（column A）、prey（column B）はNCBIタンパク質アクセッション番号、PreyGene（column C）はNCBI遺伝子通りの記号、各preyのスペクトル数（column D、「I」デリミターで区切る；カラムE、スペクトルカウントの合計；カラムF、スペクトルカウントの平均）、実施した複製数（カラムG）、すべてのネガティブコントロールにわたる餌食のスペクトルカウント（カラムH）、複製にわたる確率の平均（AvgP；カラムI）、最大確率（カラムJ）、SAINTスコア（タンパク質-タンパク質相互作用の確率、カラムK）、フォールドチェンジ（精製におけるカウントをコントロールにおけるカウントで割ったものに0による除算を防ぐための小さな因子を加えたもの、カラムL）、ベイズFDR（カラムM）、餌の配列長（カラムN）はSAINTexpress出力から各餌-餌関係に対してリストされています。
なお、本原稿に関連する最終的な高信頼性リストから以下のエントリも手動で削除した：(1)「DECOY」配列（SAINTexpress中に削除）；(2)すべての非ヒトタンパク質コンタミナント（タブBに記載）；(3) EXD2_iso1 サンプルラン#9416の以前のサンプルランからのマススペクトロメーターコンタミ（CLUH）も削除された。
タブC. NCBIに存在しない削除されたエントリーのリスト。個々の列は、タブAと同じである。
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パブコメ
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掲載されました： 2020年9月1日発行
受理されました： 2020年7月28日
改訂版で受理された： 2020年6月24日
受理された： 2020年4月20日
識別情報
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.07.017
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要旨
図1BioIDによるミトコンドリアマトリクスとIMSの "環境 "の定義
図2BioIDによるミトコンドリアの包括的な探索
図3ベイトの自己組織化により明らかになったマトリックスクラスター
図4餌と餌の相関分析
図5ミトコンドリアと他のオルガネラの相互作用
図6EXD2-BirA∗アイソフォームのサブコンパートメント局在の決定
図7ミトコンドリア・リボソーム相互作用ネットワーク
リンク記事
ミトコンドリア遺伝子発現とOXPHOS生合成の分子的連関性
Singhら
モレキュラーセル2020年9月1日号
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高密度なヒトミトコンドリア近接相互作用ネットワーク

脚注を表示するオープンアーカイブDOI:https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.07.017PlumX メトリクスハイライト

BioIDを用いた高解像度ヒトミトコンドリアタンパク質近接マップを作成した。

ベイトベイト解析により、このマップにはサブコンパートメントの解像度があることがわかった

Prey相関解析により、機能クラスターと特定モジュールを同定

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オープンアーカイブDOI:https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.07.017
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