重症患者における微生物-免疫メタシステムのディスバイオシスと院内感染との関連性

発行：2023年3月9日
重症患者における微生物-免疫メタシステムのディスバイオシスと院内感染との関連性

https://www.nature.com/articles/s41591-023-02243-5

Dysbiosis of a microbiota–immune metasystem in critical illness is associated with nosocomial infections - Nature Medicine

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集中治療室の重症患者は、腸内細菌叢が大きく変化し、そのメカニズムが不明なまま院内感染のリスクや有害な転帰と関連付けられる。豊富なマウスデータと限られたヒトデータから、腸内細菌叢は全身の免疫恒常性の維持に寄与し、腸内細菌の異常は感染症に対する免疫防御の欠陥につながる可能性があることが示唆されています。ここでは、直腸スワブの糞便微生物叢動態の統合システムレベル解析と、重症患者の前向き縦断コホート研究における全身性免疫・炎症反応のシングルセルプロファイリングを用いて、腸内細菌叢と全身性免疫が統合メタシステムとして機能し、腸内細菌の異常が宿主防御機能の低下や院内感染頻度の上昇と関連していることを明らかにした。直腸スワブの16s rRNA遺伝子配列決定とマスサイトメトリーによる血液の単一細胞プロファイリングにより、急性重症時の微生物叢と免疫ダイナミクスは高度に相互関連し、腸内細菌科細菌の濃縮、ミエロイド細胞応答の調節障害、全身性炎症の増幅が支配的で、宿主防御の適応的メカニズムへの影響は小さいことが明らかになりました。腸内細菌科細菌の濃縮は、機能低下や未熟な好中球を含む自然界の抗菌エフェクター応答の障害と結びついており、様々な細菌および真菌病原体による感染リスクの上昇と関連していた。これらの結果から、腸内細菌叢と全身性免疫応答が相互に関連するメタシステムの異常が、重症患者における宿主防御機能の低下と院内感染への感受性を引き起こす可能性が示唆されました。
主な内容
集中治療室（ICU）で生命維持のための治療を必要とする重症患者は、非常に高い確率で院内感染（20～50％）を起こし、死亡リスクを著しく上昇させる要因となっている1,2。重症患者における重症感染症への感受性は、自然免疫と適応免疫の広範な障害と宿主防御機構の崩壊、および医療機器（血管内カテーテル、気管内チューブ、膀胱カテーテル）による物理的障壁の突破と関連しています3,4,5,6. また、ICUにおける院内感染は、健常者ではほとんど侵襲を受けない病原体によって引き起こされることが多く、宿主の防御機能が著しく低下した状態と一致しています1。しかし、重症患者における免疫機能障害を誘発・進展させるメカニズムは十分に理解されていません。
マウスとヒトの両方から得られた証拠から、腸内だけでなく、腸外、全身的な区画における免疫恒常性の維持と宿主防御において、腸内細菌が重要な役割を果たすことが明らかになっている7,8,9. 重症患者は腸内細菌叢の深刻なディスバイオシスを抱えており10,11,12,13,14、ICUやその他の入院患者に見られるこのディスバイオシスは、不明なメカニズムによる感染症を含む有害な転帰のリスク上昇と関連しています11,14,15,16. 病原微生物のコロニー形成や過剰増殖は、腸内環境の異常と感染症を結びつける直接的なメカニズムとして、血流への移行につながる可能性がある15,17,18。しかし、ICU患者における複数の身体部位にわたる感染率の高さには、通常の腸内病原体以外の多様な病原体による、さらなるメカニズムの寄与も考えられる1。特に、腸内細菌叢の変化は、免疫系との病的なクロストークを通じて宿主を感染症に罹患しやすくし、宿主の防御機能を低下させる可能性があります。
本研究では、重症患者における院内感染への感受性は、病的な微生物と免疫の相互作用によって引き起こされるという仮説を検証した。この仮説では、腸内細菌叢の異常が全身性免疫と宿主防御の障害を誘発する。51名の重症成人における腸内細菌叢動態と全身性免疫機能の統合システムレベル解析を用いて、腸内細菌叢と全身性免疫応答は統合された微生物-免疫メタシステムとして機能し、腸内細菌叢における腸内細菌科細菌の濃縮の進行によって特徴づけられるディスバイオシスにより、自然免疫とホストディフェンスが制御不能になり、細菌性および真菌性の院内感染への感受性が上昇すると提案します。
研究成果
重症患者における病的な腸内細菌叢の動態と院内感染の関連性
カルガリーの内科、外科、外傷、神経系のICUに入院中の重症成人51名を対象に、糞便微生物叢、全身の細胞性免疫、炎症反応の前向き縦断統合マルチオミクス解析を実施しました（表1）。成人であり、新たにICUに入室し、治療にあたる専門医の判断により、少なくとも72時間、継続的な機械換気と集中治療が必要と予想される患者を登録した。微生物叢の生態や全身の免疫機能の既知の交絡因子を避けるため、ICU入室の48時間以上前に入院していた患者（今回の入院中または過去3ヶ月のいずれかの時期）、入院前の3ヶ月間に全身性抗生物質を投与された患者は除外しました、 免疫不全（先天性または後天性）、炎症性腸疾患または消化管（GI）悪性腫瘍、不連続なGI管、入院時に72時間以上の生存が期待できない瀕死の患者（方法と補足表1に詳細が記載されています）である。
表1 試験参加者の人口統計学的、臨床的および治療上の特徴
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ICU 入室時、および ICU 入室 3 日目と 7 日目に、16s rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンスを用いて糞便細菌組成を連続的に分析した（図 1a）。サンプル採取の正確なタイミングが必要であり、重症患者における排便のタイミングが予測できないため、ICU患者の腸内細菌叢に関する複数の研究において以前に説明したように、直腸スワブを利用した11,19,20,21．入院時から、重症患者は健康なボランティアと比較して、分類学的多様性、豊かさの減少、コミュニティβ多様性の著しい変化など、腸内細菌異常症の証拠を保持していた（図1a-d）。重症患者の最初の1週間にわたる微生物叢の連続分析では、生物多様性、分類学的豊かさ、組成のシフトが進行していた（図1a-d、拡張データ図1、補足表2および3）。これまでの報告10,11,12と同様に、重症患者における糞便微生物群集のシフトは、常在嫌気性発酵菌（RuminococcaceaeaおよびLachnospiraceae）の喪失と病原性細菌（EnterococcaceaeおよびEnterobacteriaceae）分類群の出現によって特徴付けられた（図1a、Extended Data Fig.1と補足表2および3）。観察された微生物叢の違いがICUと健常者のコホート間の年齢の中央値の違いによるものではないことを確認するために、我々はICU患者コホート22と同様の年齢中央値（62歳、範囲42-80）、性別、民族分布を持つ健常者のボランティアから直腸スワブの16s rRNA遺伝子アンプリコン配列のデータセットを一般に入手した。ここでも、ICUの微生物叢は、有意に異なるβ多様性、減少したα多様性、および腸内細菌科の差分存在量と相対存在量の増加を示した（補足図1）。Permutational multivariate analysis of variance（PERMANOVA）分析では、生物学的性別とサンプリング前の抗生物質治療期間のみが重症化1週目の微生物叢組成と有意に関連していたのに対し、年齢、民族、併存疾患の負担（Charlson index）、 病気の重症度（sequential organ failure assessment（SOFA）スコア）、微生物叢採取前の入院期間、入院診断（亜急性疾患（敗血症）と外傷、神経損傷、心停止などの超急性疾患の両方）は微生物叢組成と関連しなかった（拡張データ表1および補足図）。2). 本研究のすべての重症患者は経腸栄養で治療され、ストレス投与によるグルココルチコイド療法を受けた患者はおらず、入院中にプロトンポンプ阻害剤療法を受けた患者は1人であった。これらのデータを総合すると、糞便細菌叢のディスバイオシスはICU入室時に確立され、重症の急性期に動的かつ進行性の変化を示すことが実証された。
図1：重症患者における腸内細菌科の濃縮が進行する腸内細菌異常症は、院内感染と関連している。
a, 細菌ファミリーの相対量による分類学的構成 b, PERMANOVAによる3次元主座標解析（Bray-Curtis非類似距離、属レベル） c, Shannon指数 d, 1日目の重症患者（n = 51）および3日目と7日目にICUにとどまった生存者（n = 44）より得た直腸スワブにおけるChao1指数、健康ボランティア（n = 15）と比べて。ドットは個々の患者を表し、中央の線は中央値を、ボックスは四分位範囲（IQR）を、ひげは範囲を示す。両側クラスカル・ウォリス検定（健常者対ICU日）で分析し、混合線形回帰モデルによる日間の反復測定の一対比較とポストホックTukeyの検定で分析した。e、健常ボランティアとICU患者の微生物叢組成のMOFAは、上位10分類学的因子（ファミリー）と、説明された微生物叢の分散に対する相対的寄与（因子重み）を示す。 f、ICU入院1、3、7日目の腸内細菌科相対存在量を健常対照と比較して示す。ドットは個々の患者を表し、中心線は中央値、ボックスはIQR、ウィスカーは範囲を示す、解析はcとdに準じる。 g, 腸内細菌科相対量とシャノン指数との相関、スピアマン相関検定を用いて解析。h, ICU入室1～3日目のシャノン多様性の変化に対する、最も豊富な15種類の細菌ファミリーとその重要性のペナルティ付きリッジ回帰. 1 by ANCOM-II differential abundance）（i）およびICU3日目の最も豊富な15菌種の相関行列（j）。 k, 進行性の腸内細菌科細菌の濃縮（n = 18）または濃縮なし（n = 26）患者間の縦断的微生物相安定指数。l-n、ログランク検定による30日間の院内感染フリー生存率（l）、両側フィッシャーの正確検定による任意の病原体または腸内細菌科病原体による院内感染のオッズ比（m）、院内感染で確認された病原体（n）（28人の患者のn＝30感染）。P値はbに示す通り；*P < 0.05、**P < 0.01。
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マルチオミクス因子分析（MOFA）23を用いて、重症患者と健康なボランティアの間のマイクロバイオーム組成の分散は、入院時およびICUでの最初の1週間のすべての時点において、圧倒的に腸内細菌科のメンバーで説明されることがわかった（図1eおよび拡張データ図2a.） プロテオバクテリア、特に腸内細菌科の増加は、入院患者や重症患者を対象とした過去の研究で一貫して観察されている11,12,13,14,20,24. 重症患者の直腸スワブサンプルにおける腸内細菌科の相対存在量の中央値は、健常対照者と比較して約10倍であったが、個々の患者の変動はICU入室後1週間にわたって動的であった（図1f）。腸内細菌科の存在量は、総微生物相の豊かさおよび多様性と逆相関しており（図1gおよび拡張データ図2b）、罰則付きリッジ回帰分析により、腸内細菌科はICU患者の微生物相の多様性の経時変化と最も関連性の高い科であることが判明した（図1h）。腸内細菌科の相対量の増加は、RuminococcaceaeやLachnospiraceaeなどの嫌気性発酵菌の早期減少と一致した（拡張データ図1b、c）。コミュニティネットワークの可視化と細菌科間のスピアマン相関分析では、個々の時点における腸内細菌科とRuminococcaceae、Lachnospiraceae、Bifidobacteriaceaeなどの嫌気性発酵菌の間に有意な対相関は認められなかった（拡張データ図2c-eおよび補足表4-7）。一方、ICU入室1日目から3日目までの腸内細菌科相対存在量の変化を罰則付きリッジ回帰で縦断的に解析したところ、腸内細菌科の動態に最も重要な科としてLachnospiraceaeとBifidobacteriaceaeが挙げられた（拡張データ図2f）このことは、腸内細菌の拡大に対するコロニー形成抵抗性の役割として知られている25と合致する。
ICU入室後1週間における腸内細菌科細菌の時間的変化をさらに調べたところ、連続サンプリングを行った患者の41％が、連続サンプリング時点間で腸内細菌科細菌の相対存在量が2倍以上に増加していることが判明した（以下、腸内細菌科細菌の進行性濃縮と呼ぶ）（1～3日目は18人中14人、3～7日目は18人中4人。注目すべきは、単変量および多変量回帰分析の両方で、進行性腸内細菌科濃縮症の発症は、年齢、性別、併存疾患、入院診断、抗生物質治療（微生物叢サンプリング前のスペクトルまたは期間）、微生物叢サンプリング前の入院期間または病気の重症度に依存しないことがわかったことである（Extended Data Table 2）。腸内細菌科の濃縮の進行は、他の病原体の拡大とは関連せず、代わりに細菌群全体の安定性の低下と関連していた（図1-k）。さらに、qPCRによる総糞便細菌密度および総腸内細菌量（総菌密度に腸内細菌科の相対存在量を乗じた値、既報20,26）の定量化により、腸内細菌科濃縮が進行した患者では、総菌密度および総腸内細菌量がともに進行性の増加を示し、他の分類群の縮小ではなく、腸内細菌の拡大により、濃縮が媒介されていることを示した（拡張データ図2h、i）。これらの結果から、急性重症患者における微生物相の障害は、腸内細菌科の濃縮が支配的であり、動的かつ進行性であることが明らかになった。
微生物相の異常は、入院患者や重症患者における院内感染などの有害な転帰に関連している11,14,16,20,24,27. これと一致して、入院時の微生物叢のシャノン多様性が低い（<3.59、最大選択順位統計で決定したカットオフ）患者は、入院時のシャノン多様性が高い（>3.59）患者と比較して、院内感染または死亡のリスクが有意に高いことが分かった（拡張データ図3a、b）。微生物叢の異常と院内感染なしの生存との間のこの関係が、特定の分類群（量または時間的動態のいずれか）と関連しているかどうかを調べるために、我々は、健康な対照と比較してICU患者で異なる豊富さを示した細菌科（Enterobacteriaceae、RuminococcaceaeおよびLachnospiraceae；Extended Data Fig.1）に焦点を当てた。入院時のこれらの科の相対的な存在量は、院内感染のない生存期間と関連しなかった（Extended Data Fig.） 一方、時点間で腸内細菌科の相対量が増加した患者は、腸内細菌科が減少した患者と比較して、感染または死亡のリスクが有意に高かったが、RuminococcaceaeまたはLachnospiraceaeの動態については関連が認められなかった（拡張データ図3f～h）。さらに、腸内細菌科の相対量が時点間で2倍以上増加した患者（これを腸内細菌科の濃縮が進行したと定義する）は、腸内細菌科の濃縮が進行していない患者と比較して、院内感染または死亡の複合リスク、および院内感染のオッズが有意に高いことがわかった（図1l、m）。腸内細菌科のメンバーは、院内感染の一般的な原因病原体であり、これまでの研究で、腸の過剰増殖と転流・拡散を介した感染との直接的な関連性が示唆されています11,15,17,24。臨床微生物学的データにより、この重症患者コホートの院内感染症の27%で腸内細菌科細菌が同定された（表2）。しかし、糞便微生物叢における腸内細菌科細菌の濃縮の進行と、腸内細菌科細菌による感染の確率（OR 0.97, 95% CI 0.2-4.7 ）には有意な関連は認められなかった。この分析は、本研究における腸内細菌科細菌の感染数が比較的少ないためパワー不足と考えられる（図1m）。その代わり、院内感染で同定された病原菌は多様であり、糞便中の腸内細菌科細菌が濃縮されている者と濃縮されていない者との間に差はなかった（図1nおよび表2）。したがって、微生物叢の異常と腸内細菌科細菌の濃縮の進行は、細菌および真菌の病原体のスペクトルによって引き起こされる院内感染症のリスク上昇と関連しており、グローバルに宿主防御が損なわれた状態を示唆するものであった。
表2 試験参加者の院内感染症
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重症患者における微生物-免疫系メタシステムのディスバイオシス
次に、各患者の血流中の細胞性免疫および炎症ランドスケープのシステムレベル解析を行い、重症患者における微生物叢の傷害は全身性免疫の障害と連動しているという仮説を検証した。マスサイトメトリーを用いた循環免疫ランドスケープの高次元シングルセル解析により、重症患者における自然免疫と適応免疫の深い変化が、入院後1週間にわたってダイナミックに変化することが明らかになった（図2a、bおよびExtended Data Fig.4）。これまでの報告3,4,28と同様に、急性重症患者における細胞性免疫応答は、好中球の早期かつ持続的な増加と、TおよびBリンパ球、ナチュラルキラー（NK）細胞の枯渇によって支配されていた（Extended Data Fig.4）。FlowSOMを用いた単一細胞データのクラスタリングにより、重症患者における好中球の増加は、主に未熟な好中球（CD16lo/intCD11blo/int、クラスタN1、 N2およびN8）、最近特徴付けられた機能不全CD123+好中球（クラスターN4）29に似た集団を含み、成熟（CD16hiCD11bhi、クラスターN3、N5およびN7）および老化（CXCR4+CD62Llo、クラスターN6）好中球集団の減少が見られる（図2a、拡張データ図5a、補足表8）。2a, Extended Data Fig. 5a and Supplementary Table 8）。さらに、単球の調節障害（HLA-DRを発現する古典的および中間的単球クラスターCM3、CM4、IM1、IM2の早期かつ持続的な枯渇、非古典的単球クラスターNC2、NC3の拡大）、HLA-DR+樹状細胞（クラスターDC3）の喪失、活性化インターフェロン-γ+NK細胞（クラスターNK2）などの多系統自然免疫異常が見られた（ExtendedData Figure 5b-d および補足 Table 8）．適応免疫コンパートメントでは、重症患者においてグローバルなTおよびB細胞のリンパ球減少が優勢であり、残りのT細胞プールは、PD-1+ CD4+およびCD8+ T細胞クラスター（CD4-2、CD4-3およびCD8-6）および制御T（Treg）細胞クラスター（ CD4+CD25+FoxP3+, CD4-4）に富む（Extended Data Fig.6a,b および補足表 8）．循環する炎症性メディエーターの定量化により、サイトカインストーム症候群30に特徴的な炎症性（インターロイキン（IL）-6、腫瘍壊死因子-α、IL-8、C反応性タンパク質、血清アミロイドA）と抗炎症性（IL-10、IL-4）応答の急性かつ動的上昇（図2c、d、補足図3、4）が明らかにされました。これらのデータを総合すると、重症患者におけるダイナミックな細胞性免疫・炎症反応は、初期の自然免疫調節障害と全身性炎症、それに続く進行性の自然免疫・適応免疫機能障害を特徴としている。
図2：重症患者における動的な微生物-免疫メタシステム異常。
a-d, 血液中の細胞性免疫ランドスケープ（a,b）および血漿中の炎症メディエーター（c,d）を、それぞれマスサイトメトリーおよび多重電気化学発光アッセイにより、入院1日目に採取した重症患者（n = 51）（n = 49）および3日目と7日目に再びICUで過ごした生存者（n = 43）と健康ボランティア（n = 15）の血液サンプルと比較して定量化しました。単一細胞マスサイトメトリーデータのFlowSOMクラスタリング（方法）（a）および健康なボランティアとICU患者の間の単一細胞免疫ランドスケープのt-SNE次元削減（b）によって特定されたすべての免疫細胞集団（%CD45+として示す）の存在度。血漿中の炎症性メディエーターの濃度（pg ml-1）（c）およびICU患者の1、3、7日目の各メディエーター濃度の健常ボランティアと比較したlog2倍変化（FC）（d）。CRP、C反応性タンパク質、TNF、腫瘍壊死因子、IFN、インターフェロン、SAA、血清アミロイドA。 e,f, 微生物の構成との間の有意なスピアマン相関（偽発見率（FDR）調整後のP＜0.1）を描いた和算表。 1）各時点における健常ボランティアおよびICU患者の微生物叢組成、免疫細胞ランドスケープ、全身性炎症メディエーター間の相関（e）およびメタシステム区画間の有意なスピアマン相関の数（FDR調整P < 0.1）の定量化（f）。g,h、ICU入室1週目における、最も豊富な15種類の微生物群（相対量）と血液中の免疫細胞クラスター（g）および血漿中の炎症メディエーター（h）間の個々のスピアマンの相関係数のヒートマップ（h）。i,j、糞便中腸内細菌科濃縮が進行した患者（n = 18人）および進行していない患者（n = 26人）におけるICU入室後7日間にわたる単一細胞免疫ランドスケープ（i）および全身性炎症メディエーター（j）のNMDS順序付けを示した。統計的比較は、反復測定を考慮したPERMANOVA（補足表15および16はフルモデルの結果を示す）を用いて行い、各ポイントは個々の患者の時間ポイントを表す。 t-SNE、t-distributed stochastic neighbor embedding。
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急性重症患者における微生物叢の損傷と全身性免疫異常の時間的ダイナミクスが重なることから、微生物叢と免疫のダイナミクスがメタシステムレベルの連結性を示すかどうかを検討しました。Chordダイアグラム解析を用いて、微生物分類群と免疫構成要素間の接続性を可視化したところ、健康なボランティアで観察された接続性と比較して、入院時のICU患者ではより多くの有意な相互作用が観察された（図2e、f）。微生物と免疫の結合性の増強は重症の初期段階から持続し、入院3日目と7日目にも上昇したままでした（図2e,f）。この微生物-免疫結合の急増が微生物叢の特定の分類学的変化と関連しているかどうかを確認するために、最も豊富な15種類の細菌ファミリーのそれぞれと個々の免疫細胞サブセット（図2gおよび補足表9-11）および炎症メディエーター（図2hおよび補足表12-14）の間のスピアマン相関係数を定量化しました。階層的解析（デンドログラムで示す）により、腸内細菌科と細胞性および炎症性メディエーターの両方との関連は、他のすべての微生物科と比較してユニークであることがわかった（図2g、h）。腸内細菌科の相対的な存在量と自然免疫反応の間に強い相関が見られ、腸内細菌科の増加は、未熟な好中球（クラスターN1、N2、N4）および古典的単球（クラスターCM5、CM6）の高レベルと相関し、成熟好中球（クラスターN3）の減少を示した（図2g）。さらに、腸内細菌科細菌の増加は、原型的な全身性炎症メディエーター（IL-8、IL-15、腫瘍壊死因子-α、MIP-1α、IL-10）と正の相関があったが、急性期反応物質のC反応性タンパク質と血清アミロイドAとは相関が見られなかった（図2gおよび補足図5a-d）。重症化してから1週間の時系列分析では、腸内細菌と炎症性および自然免疫のランドスケープとの相関の大きさに変化が見られた（補足図5e、f、6、補足表9-14）。
これらの観察と一致して、非計量的多次元尺度法（NMDS）を用いて単一細胞免疫ランドスケープの次元削減を行ったところ、年齢、性別、入院診断、民族、病気の重症度など免疫細胞構成に関連する患者の共変数を制御しても、腸内細菌科細菌の濃縮（ICU入院1週目に腸内細菌科細菌の相対存在量が2倍以上）が進行した患者は、濃縮が進まない患者と比べて有意差をもって細胞免疫反応を示した（図2i）（補足 表 15）。一方、腸内細菌科細菌の濃縮が進行した患者とそうでない患者の間で、循環炎症性メディエーターランドスケープに有意差は認められず（図2j）、入院時の炎症性メディエーターランドスケープとその後の腸内細菌科細菌の濃縮発症の間に関連も認められなかった（拡張データ図7）。これらのデータを総合すると、急性重症時の微生物叢と細胞性免疫の動態が統合されたメタシステムとして機能していることが示され、腸内細菌科細菌の濃縮がメタシステム全体のディスバイオシスのドライバーとなる可能性があることが判明した。
メタシステム・ディスバイオシスは自然免疫防御の崩壊につながる
次に、腸内細菌科に関連したメタシステム異常が、細菌や真菌の院内感染リスクの上昇に寄与すると考えられる特定の免疫防御プログラムの欠陥によって特徴づけられるかどうかを調べた。次元削減分析により、腸内細菌科細菌の濃縮が進行した患者の適応免疫細胞コンパートメントは、そうでない患者と有意な差はないことが判明した（図3a）。単一のナイーブB細胞集団（クラスターB2）を除けば、腸内細菌科細菌の濃縮が進行した患者では、重症の最初の週にリンパ球反応にほとんど影響がなかった（図3a、b）。これとは対照的に、糞便微生物叢に腸内細菌が濃縮されている患者では、濃縮されていない患者と比較して、自然免疫細胞ランドスケープが大きく異なっていた（図3c、d）。個々の自然免疫細胞クラスターを分析すると、この違いは主に好中球クラスターの大きなシフトによって特徴付けられ、単球、樹状細胞、自然リンパ球への影響はより限られていた（図3d、e）。
図3：重症患者における腸内細菌科細菌のディスバイオシスと好中球の宿主防御機能障害。
a-d、糞便微生物叢に腸内細菌科細菌の濃縮が進行したICU患者（n = 18）またはそうでない患者（n = 26）の血液中のマスサイトメトリーデータのクラスタリングによって特定した、適応免疫細胞集団（T細胞とB細胞）および自然免疫細胞集団（すべての好中球、単球、樹状細胞と自然リンパ系細胞集団）のNMDS順序（a、c）および存在量の比較（b、d）（a、b）。ドットはICU入室の最初の7日間にわたる個々の患者の時間点を示し、反復測定を考慮したPERMANOVAによる統計解析を行っている（a、c）。e,好中球（左）とその他の自然免疫細胞（右；単球、樹状細胞、NK細胞クラスターを示す）のt-SNEプロット。ヒートマップのオーバーレイは、糞便微生物叢に腸内細菌科細菌の濃縮が進行したICU患者（n = 18）としなかった患者（n = 26）における各細胞群の存在量のlog2FCを示す。f, Spearmanの順位相関検定を用いて分析した、入院1週目のICU患者における糞便腸内細菌科相対量と成熟（左）および未熟（右）好中球量（全好中球の割合として示す）の間の相関。ドットは個々の患者サンプルを示し、回帰（線）および95％信頼区間（斜線部）を示す。 g、腸内細菌科細菌の濃縮がある（n = 18）またはない（n = 26）ICU患者の血液中の好中球クラスターの比較（グループ間のクラスター存在量の対数2倍差として示す）。腸内細菌科細菌の濃縮状態（a-e,g）の独立した寄与を明らかにするため、解析では、免疫細胞組成と独立に関連する臨床共変数をコントロールした（補足表15）。 i,j, 腸内細菌科細菌の濃縮がある患者（n = 18）またはない（n = 26）におけるICU3日目のプラズマNETマーカー（i）細胞フリーDNAおよび（j）MPO-DNA複合体の定量化。ドットは個々の患者を表し、中央線は中央値を、ボックスはIQRを、ウィスカーは範囲を示す；統計比較は、両側Mann-Whitney U-testを使用して行った。P値を示す。
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マウスモデルを用いた先行研究では、循環好中球の顆粒球形成、成熟および老化の制御を通じて、好中球を介した宿主防御を指示する腸内細菌叢の重要な役割が報告されている31,32,33,34。ICU患者では、腸内細菌科細菌の相対量と未成熟好中球（CD16lo/intCD11blo/intクラスターN1、N2、N4、N8）の増加および成熟好中球（CD16hiCD11bhiクラスターN3、N5、N7、N9）の減少の間に強い相関が認められた（図3f）。循環好中球の総数が同程度であるにもかかわらず、糞便中の腸内細菌科細菌の濃縮が進行したICU患者では、未熟クラスター（N1、N2、N4）の早期かつ持続的な増加など、好中球の分布に時間の経過とともに顕著な変化が見られた（図3g）。微生物-免疫メタシステム異常とその後の院内感染リスクとの間の時間的な方向性と一致して、我々はまた、院内感染を発症した患者とそうでない患者の間の免疫ランドスケープを比較し、未熟な好中球の拡大など自然免疫細胞ランドスケープの違いが感染症の発症に先行することを再び発見した（Extended Data Fig. 8）。最近の研究で、ヒトの未熟な好中球集団は、好中球細胞外トラップ（NET）の産生障害など、病原体殺傷機構の機能低下を示すことが明らかになった35。腸内細菌科細菌の濃縮が進行している患者（およびそれに伴う未熟な好中球の拡大）では、血漿中の循環NETマーカー（無細胞DNAとミエロペルオキシダーゼ（MPO）-DNA複合体の両方）の量が濃縮していない患者と比較して減少していた（図3h、i）。これらの結果から、腸内細菌科細菌の濃縮が進行すると、院内感染に対する感受性が高まり、好中球の反応に異常が生じ、機能低下することが明らかになった。
考察
我々は、急性重症患者における腸内細菌叢と全身性免疫応答は、動的なメタシステムとして機能的に統合されていることを明らかにした。重症患者におけるこのメタシステムのディスバイオシスは、腸内細菌叢の進行性拡大、自然免疫の調節不全、細菌性および真菌性の院内感染の発生率の上昇と関連している。
マウスモデルから、腸内細菌が全身免疫の様々なメカニズムを制御していること、無菌マウスや抗生物質調整マウスでは、様々な細菌、真菌、ウイルス感染に対する防御機能が低下していることが示されている33,34,36,37,38,39. 重症のヒトでは、腸内細菌叢の異常は自然免疫の調節障害と主に連動し、適応免疫のランドスケープにはあまり影響を与えないことが観察された。特に、重症の初期段階における微生物叢の変化に対する好中球の優勢な反応は、適応免疫応答の時間経過がより長引くのに比べて、好中球の回転が速く、急性機能可塑性の能力が高いことを反映しているのかもしれない。これまでの研究で、一部の患者で持続する広範なリンパ球のアポトーシスと機能的消耗が記録され、臓器機能不全と日和見院内感染の継続に寄与していることから3,6、腸内細菌異常が病気の後期に適応免疫調節障害を引き起こす可能性がある。メタシステム異常が自然免疫と適応免疫の長期的な刷り込みに与える影響についてはまだ解明されていませんが、入院患者を対象とした過去のレトロスペクティブ研究では、腸内異常が数ヶ月（またはそれ以上）続く感染症や敗血症の再発リスクの上昇と関連している可能性が示唆されています40。
腸内細菌は、好中球の成熟、老化、エフェクター機能の調節、骨髄での顆粒球形成の調節を通じて、全身の好中球の恒常性に関与している31、32、33、34．マウスでは、腸内細菌の異常や無菌状態は、骨髄造血の抑制、好中球の成熟障害、抗菌エフェクター機能の欠陥につながる31,32,33,41. これと一致するように、腸内環境の悪化と腸内細菌科細菌の濃縮が進行した患者では、好中球の反応に大きな変化が見られ、NETの減少を含む未熟で機能低下した好中球の反応が顕著であることが確認された。このように、自然宿主防御の中核となるプログラムが関与する微生物-免疫メタシステム・ディスバイオシスのメカニズムは、複数の臓器にわたる多様な細菌および真菌病原体による全身感染症のリスク上昇と整合的である。
重症患者における微生物叢異常の原因となる生態学的圧力は、宿主の内因的要因（年齢、合併症、腸管運動、粘膜血流、pHなどの生理的変化）に加え、重症患者に固有の宿主外因子（栄養摂取量の変化、抗生物質を含む薬剤、侵襲的器具、ICU環境）を含む多因子性であると考えられる。特に、腸内細菌科のような病原性細菌は、ICU入室時から群集組成の異常、多様性、拡大が見られることが、我々や他の研究者によって明らかにされている10,11,20。特に、この現象はICU入室前の亜急性疾患（敗血症など）だけでなく、より急性の疾患（外傷、神経損傷、心停止）の患者でも観察され、ICU入室前の入院や抗生物質の投与を制限した厳しい除外基準にもかかわらず存在した。ICUへの入室後、我々は、腸内細菌科の拡大と嫌気性発酵菌の減少を特徴とする重症急性期における微生物相の漸進的かつ動的な変化を観察し、嫌気性発酵菌が腸内細菌科に対するコロニー形成抵抗性に関係している証拠と一致した42。注目すべきは、急性重症時に観察された複数の菌種の変化のうち、進行性の腸内細菌科の濃縮（RuminococcaceaeやLachnospiraceaeなどの嫌気性発酵菌の減少ではない）だけが、宿主防御機能の低下および院内感染リスクと関連していたことである。これは、重症時に腸内細菌科が微生物-免疫メタシステムに独自の影響を及ぼすことを示唆している。ICU患者を対象とした最近の研究では、抗嫌気性抗生物質投与時の腸内細菌科の拡大が、院内感染のリスク上昇と関連していることが判明した20。これらの知見から、抗生物質などの介入は、腸内嫌気性菌を介したコロニー形成抵抗性の抑制と腸内細菌科細菌の拡大を通じて、微生物-免疫メタシステム異常の悪循環を伝播する可能性がある。また、腸内腸内細菌科細菌の拡大は、院内感染リスクのあるICU以外の入院患者集団でも観察されていることから、今回の知見は重症患者以外にも影響を与える可能性がある。
最後に、我々の知見は、ICUにおける感染症の予防と治療にとって重要な治療的意味を持つ可能性がある。院内感染は、死亡率、入院期間の延長、資源利用など、重症患者における有害な転帰の主要因であり続けている1,2,43. 微生物叢異常と院内感染との関連性から、重症患者を対象とした微生物叢改善療法の臨床試験が行われていますが、微生物叢異常と感染症を結びつけるメカニズムの理解が不十分であるため、プロバイオティクスや消化管除染などの非標的なアプローチでは、効果がわずかであるか無視できる程度であり、またこの脆弱な患者集団に害を及ぼす可能性もあります47、48、49。我々の発見は、重症患者における病的な微生物相の変化が、免疫機能不全の誘発を介して宿主を感染症にかかりやすくすることを明らかにし、ICUにおける微生物相治療薬は、微生物相-免疫メタシステム異常のドライバーを修正することを目標とすべきことを示唆しています。我々は、腸内腸内細菌科の拡大を重症患者におけるメタシステム異常のマーカーとして同定した。したがって、腸内腸内細菌科コロニー形成50の精密編集は、全身性免疫防御を強化することによって感染症と有害転帰を減らす戦略であると考えられる。
本研究には、単一施設でのデザイン、限られたサンプルサイズ、重症患者（多様な併存疾患や治療を含む）の固有の異質性など、多くの限界がある。前向きかつ縦断的な解析により、微生物-免疫系メタシステム異常とその後の院内感染との間に時間的な方向性を持つ注目すべき関連性を特定することができたが、因果関係を決定的に示すことはできなかった。さらに、重症患者において侵襲的な組織生検や内視鏡による近位消化管のサンプリングを行うことの安全性や倫理的配慮から、全身免疫の調査は血流に限定し、微生物叢の解析は直腸区画に限定している。さらに、16s配列解析とマスサイトメトリー解析により、微生物叢の形成不全と免疫細胞の不均一性を不完全ではあるが詳細に解明することができる。したがって、免疫解析の拡大と微生物叢の詳細な配列決定を用いた今後の研究により、好中球やその他の抗菌エフェクター細胞、腸や他の部位（肺、口腔咽頭、皮膚、あるいはICU環境）の微生物変化が関与する免疫機能不全のメカニズムがさらに明らかになり、重症患者のメタシステムディスバイオシスやホストディフェンスの低下に寄与する可能性があります。
研究方法
研究デザインおよび参加者
本研究は、カルガリー大学およびアルバータ保健サービスの共同健康研究倫理委員会により承認された（REB18-1294）。書面でのインフォームドコンセントは、すべての研究参加者、または不能な病気のために同意が得られない患者の適切な代理意思決定者から取得された。登録は2019年7月23日から2021年7月20日の間に行われ、2020年3月から2021年4月のCOVID-19パンデミックにより登録に大幅な遅延と混乱が生じた。カルガリーのFoothills Medical Centerの内科、外科、神経学、外傷のICUに入院した患者は、以下の包括基準（他所44からの引用）でスクリーニングされた：成人（18歳以上）で、ICUへのインデックス入院があり、機械換気を必要とし、担当ICU専門家の判断により72時間以上の連続機械換気を必要とすると予想される者。患者は、既存の免疫不全状態（全身免疫調節療法、化学療法、HIV感染、その他の先天性または後天性免疫不全）、過去3ヶ月間にICU入院の48時間以上前に入院していた場合は除外された、 過去3ヶ月間に全身性抗菌薬治療を受けた患者、炎症性腸疾患または活動性の消化器悪性腫瘍を有する患者、不連続な消化管を残す過去の手術、妊娠、生命維持のための介入を除外した治療目標、72時間以上の生存が期待できない病的な患者。COVID-19のパンデミックの発生に伴い、研究チームはSARS-CoV-2感染を除外基準として追加したため、COVID-19の患者は本研究に含まれなかった。
直腸スワブと血液サンプルは、ICU入室日に前向きに登録した患者（n = 51）から採取し、入室後3日目（n = 45）と7日目（n = 18）にICUにとどまった生存者から再度採取しました。また、参考比較のため、健康なボランティア（n = 18）から直腸スワブと血液サンプルを採取し、コントロールとして使用しました。微生物と免疫の相互作用に関する発見ベースの研究であるため、先験的なサンプルサイズの算出を容易にする効果量の推定値は公表されていなかった。そのため、最近発表された重症患者における他のマルチオミック研究51,52,53,54,55、およびヒト微生物と免疫に関するオミックス研究56,57,58と同等のコホートサイズで登録した。各分析に含まれる患者サンプルの数は、図の説明文に記載されており、個々のサンプルの質または量が特定のアッセイに適さず、再収集できなかったまれな例により、若干の違いがあります。患者の人口統計学的データおよび臨床データは入院時に収集され、表1に表示されている。院内感染および死亡の臨床的転帰は、ICU 入室後 30 日まで記録した。院内感染とは、入院後少なくとも48時間以内に発生し、担当の専門医によって診断され、新たな抗菌薬投与に至った新規感染とし、以下の定義に基づいて研究チームの医師が独自に確認した：VAPおよびHAPの診断には、胸部X線写真に新規または進行性の放射線浸潤の存在に加え、発熱、化膿した痰、白血球数＞10×106l-1または＜3． 0 × 106 l-1であることが必要であり、VAPの全症例は、以前に説明したように44、Center for Disease Control and Prevention National Healthcare Safety Network（CDC NHSN）の症例定義であるProbableまたはDefinite VAP59に適合していた。院内BSIはBSI/中央ライン関連BSIのCDC NHSN定義に合致し、UTIはカテーテル関連尿路感染症の診断に関する米国感染症学会臨床実践ガイドライン基準に基づいて特定し、Clostridium difficile感染は新規下痢の存在とC. difficile toxinの便検査陽性に基づく60、61. 院内感染部位と臨床微生物学データを表2に示す。注目すべきは、本研究で報告されたすべての院内感染症は、ICU入室／入学後に獲得されたものと仮定し（上記の除外基準を参照）、したがって表1に記載した入院診断とは別である（特に、表1の敗血症の入院診断は、補足表1に示すようにすべて市中感染症によるものであったため院内感染によるものではない）。
16S rRNA遺伝子の増幅と塩基配列の決定
すべての実験解析はカルガリー大学で実施した。直腸スワブを採取し、滅菌チューブで-80℃に保存した。DNAは、DNeasy PowerSoil（QIAGEN）を用いて、製造者のプロトコールに従って単離した。陰性コントロールのスワブは、コントロールとして、同じように処理し、研究プロトコルを実行した。16S V4領域のPCR増幅は、サンプルバーコードと配列決定アダプターおよびPCR条件62を備えた、以前に記述したデュアルインデックスプライマーを用いて実施した。PCR産物は、Nucleomagビーズ（Macherey Nagel）を用いて、製造者の指示に従って洗浄し、サイズ選別した。個々のサンプルライブラリーは、SequalPrep Normalization Plate（Invitrogen）を用いて正規化し、その後サンプルをプールして最終ライブラリーを作製した。プールされた次世代シーケンサーライブラリーの品質管理は、Agilent Technologies 2200 TapeStationとQubit dsDNAアナライザーを用いて行われました。プールされた16S V4アンプリコンライブラリーは、Illumina MiSeqプラットフォームを使用して配列決定し、2×250bpペアエンドリードを生成した。
16Sアンプリコン配列データの処理と解析
イルミナMiSeqペアエンドリード（FASTQ）を脱多重化し、DADA2パイプラインv.1.14に従ってR v.4.1.2で処理しました。フォワードリードとリバースリードは、それぞれ230 bpと210 bp、または品質スコアQ < 2の最初の塩基に切り詰めた。曖昧な(N)ヌクレオチドを含むリード、または2つ以上のエラーを含むリードは削除されました。トリミングとフィルタリングのステップを経て1,000リード未満のサンプルは、さらなる分析から除外された。SILVA v.138.1データベースを用いたRDP Classifierにより、DADA2において固有のアンプリコン配列バリアント（ASV）の分類が行われました。ASVとサンプルデータは、Phyloseqパッケージv.1.38.0を使用して、さらなる下流解析のために結合されました。潜在的な汚染物質は、ASVの分布頻度と個々のサンプルのDNA濃度に基づいて、Decontamパッケージv.1.14.0によって識別・除去されました63。シアノバクテリア、ミトコンドリア、クロロプラストと分類されるASVは除去された。Dadkhahら22の健康なボランティア（n = 95、結腸ポリープなし）の公開データセットは、上記のように生のFastQファイルで処理しました。
マイクロバイオームα多様性メトリクスは、Microbiomeパッケージv.1.16.0を使用して計算した。コミュニティ非類似度（β-diversity）は、Bray-Curtis非類似度指標について、Vegan v.2.6のadonis関数を用いたPERMANOVAにより算出し、3次元可視化は、Bray-Curtis非類似度序列の最初の3次元をprottly package v.4.10.0でプロッティングして実施。スピアマン相関行列は、Hmiscパッケージv.4.7のrcorr関数を用いて、少なくとも10%のサンプルに存在する最も豊富な15の細菌ファミリーの間で実行し、Rのggplot2パッケージv.3.3.6を用いて可視化した。相対存在量を示す分類プロットは、ggplot2パッケージ microbiomeutilities v.1.00.16 およびPhyloseqパッケージ v.1 Rパッケージのcaret v.6.0-93を用いて、3重クロスバリデーションを10回繰り返し、特定のマイクロバイオームの結果（ICU1日目と3日目の間のシャノン多様性の変化または腸内細菌科相対存在量の変化）に対する最も豊富な15の細菌ファミリーの重要性を決定するために、ペナルティーリッジ回帰分析（glmnet Rパッケージ v.4.1-4）を使用した。群集の安定性は、ICU入室1日目と3日目のデータについてcodyn Rパッケージを用いて決定した。相対的な存在量についてANCOM-IIを用い、microbiomeMarker Rパッケージv.1.0.2を用いて、反復測定を考慮するために患者をランダム効果としてフィットさせ、存在量の差異分析を実施した。ネットワーク解析は、NetCoMi Rパッケージ64 v.1.1.0を使用して細菌ファミリーに実施し、すべてのサンプルで最も豊富な（上位四分位25%）細菌ファミリーのスピアマン相関を0.2以上示しています。データは、STORMS（Strengthening the Organization and Reporting of Microbiome Studies）ガイドラインに従って報告されています（補足表18）。
糞便細菌密度の定量的解析
細菌密度の測定は、以前に記載されたように、ユニバーサル16s rRNA遺伝子プライマーセット（フォワード、5′-TCCTACGGAGGCAGCAGT-3′；リバース、5′-GGACTACCAGGTATCTAATCCTGTT-3′）を用いてqPCRにより行い65、標準曲線を大腸菌Xen14株DNA（パーキンエルマー）から作成した。PCR反応は、PowerUp SYBR Greenキット（Thermo Fisher）を用いて、StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上で行った。サイクル条件は以下の通りである： 50 ℃ 2 分、95 ℃ 10 分、95 ℃ 15 秒（40 サイクル）、60 ℃ 1 分。腸内細菌科の存在量の決定は、Chanderrajら20が以前に報告したように、絶対細菌密度に16s rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスによって決定された腸内細菌科相対存在量を乗じることによって行われた。
飛行時間型マスサイトメトリー
マスサイトメトリー解析に使用した全血サンプルは、PROT1プロテオミクス安定剤（SmartTube）に1：1.4の割合で凍結保存し、-80℃で保存して、記載58のように患者サンプルのバッチ解析を可能にした。サンプルを室温で解凍し、PROT1 RBC lysis buffer（SmartTube）を用いて赤血球溶解を行い、白血球を細胞染色液（PBS with 1% BSA）で洗浄した後、カスタム金属結合抗体パネル（補足表17）で標識した。白血球を金属標識表面抗体とインキュベートした後、固定・透過処理（BD Cytofix-Cytoperm）、細胞内抗体とインキュベートし、PBS中のCell-IDイリジウムインターカレーター（Fluidigm）、0.3％サポニン、1.6％パラホルムアルデヒドを含む溶液で一晩放置した。その後、細胞をEQ Four Element Calibration Beads（Fluidigm）と混合し、Helios CyTOFIIマスサイトメーター（DVS）にて取得しました。マスサイトメトリーデータは、内部のHelios CyTOFIIビーズベースの正規化ソフトウェア（DVS）を使用して正規化した。
シングルセルマスサイトメトリーデータの処理と解析
正規化されたマスサイトメトリーデータファイルは、CytoSpillパッケージv.0.1.0を用いてRでさらに処理し、マーカー間のシグナルオーバーラップを補正した66。次に、補正されたFCSファイルをサイトバンク（Cytobank）にインポートして、CD45+単一細胞イベントおよび主要な細胞集団に関する手動ゲーティングを行った（補足表8）。その後、手動でゲーティングしたイベントをFCSファイルとしてエクスポートし、CATALYSTパッケージv.1.16.0を使用してRでさらに解析した。バッチ補正は、limmaパッケージv.3.48.3のRemoveBatchEffect関数を用いて実施した。ゲートされた細胞集団は、FlowSOM関数を用いて、CATALYSTの利用可能なすべてのマーカーの発現に基づきクラスタリングされた。極めて稀なメタクラスタ（各集団のイベントの0.5%未満）または異常なクラスタ（すべてのパネルマーカーの異常発現または3つ未満のパネルマーカーの異常発現）も除去した。t-SNE次元削減は、各サンプルからランダムに選択した1000個のイベントに対して、perplexity 80で5000回反復して行った。RのVegan metaMDS関数を用いて、免疫細胞集団の相対的存在量のNMDSを行い、研究参加者間の次元削減された細胞性免疫ランドスケープの視覚化を行った。個々の細胞集団のlog2FCを示す図（健康なボランティアとICU患者の間、または腸内細菌科細菌の濃縮の有無によるICU患者の間）は、絶対細胞数について計算し、免疫細胞組成と有意に関連する臨床共変量（補足表15）について制御し、DESeq2パッケージv. 1. .34.0.
血漿中炎症性メディエーターの定量と解析
凍結保存した血漿サンプルは、V-PLEX Human Biomarker 40-Plex kit (MesoScale Diagnostics) を用いて炎症性サイトカイン、ケモカイン、バイオマーカーの定量に使用した。無細胞DNAレベルは、Quanti-iT PicoGreenキット（Invitrogen）を用いて製造者の指示に従って定量化し、血漿中のMPO-DNA複合体の定量化は既述の通り実施した55。40プレックスの血漿炎症性バイオマーカーの差分存在量は、前述67のように、Rのlimmaパッケージv.3.48.3を用いて、対数変換した濃度値に対して実行した。腸内細菌科細菌の濃縮の有無による血漿炎症性メディエーターの違いの次元削減と可視化は、RのVeganパッケージv.2.6を用いたメディエーター濃度のNMDSで行った。腸内細菌科細菌の濃縮の有無によるICU患者の個々のメディエーターのログ2FCを示す図は、絶対濃度でlimmaパッケージv.3.48.3で計算、ggplot2を使ってプロットした。炎症性メディエーターランドスケープの構成と有意に関連する臨床共変数はなかった（補足表16）。
マルチオミクスの統合と解析
便中微生物叢、細胞性免疫組成、血中炎症性メディエーターランドスケープの統合マルチオミクス解析を行うため、前述68のようにRでMOFA v.1.4.0を使って教師なし因子解析アプローチを採用した。簡単に言うと、微生物叢の分類学的データを家族レベルに集約し、25％の有病率というカットオフ値でフィルタリングした後、カウントデータを中心対数比（clr）により変換した。単細胞マスサイトメトリーデータと炎症性メディエーター濃度は、データセット統合の前に対数変換した。得られたMOFA因子を健康なボランティアとICU患者の間で比較し、これらの集団間の変動を説明する潜在的な因子を決定した。MOFAで統合されたデータセットのモデリングは、デフォルトのパラメータを使用して行われ、モデルフィッティングにより、サンプル間の変動の最大量を説明する上位10個のMOFA因子が特定されました。次に、すべてのメタシステムデータセット（糞便微生物叢、単細胞免疫組成、全身性炎症メディエーター）からの寄与を示すMOFA因子で、分散の少なくとも5%を説明するものを、健康なボランティアとICU患者の間で比較した。各MOFA因子内において、個々の特徴の重み（微生物叢因子内の個々の微生物分類など）を、健康なボランティアとICU患者との間で比較した。
微生物叢、細胞性免疫ランドスケープ、炎症性メディエーター間の接続性は、Chord diagram分析を用いて決定した。すべての微生物分類群（10％有病率カットオフ、相対存在度、ファミリーレベル）、免疫細胞サブセット数、炎症性メディエーター濃度のペアリングについてスピアマン相関係数を計算し（P < 0.1で多重比較をFDR調整）、有意値をcirclize package v.0.15を用いて可視化しました。 最も豊富な15種類の細菌ファミリー（有病率10％カットオフ）と免疫成分（細胞数および炎症性メディエーター濃度）の間のスピアマン相関係数を描いたヒートマップを、Hmiscパッケージv.4.7のrcorr関数を使って作成し、Rのpheatmapパッケージv.1.0.12を使って可視化しました。
統計解析
微生物相のα-多様性指標（Shannon indexとChao1）、および個々の細菌ファミリーの相対存在量データを、Kruskal-Wallis検定とポストホックTukey検定を使用して、健康なボランティアとICU患者の日間で分析しました。ICU患者の入院1日目、3日目、7日目のペア測定値の解析は、RのlmerTestパッケージv.3.1.3を用いて、サンプリング時点間の反復測定と変数の脱落を考慮する線形混合効果モデルを用いて行った（これらのモデルには追加の臨床共変量は含まれていない）。微生物叢のβ多様性は、Veganパッケージv.2.6のadonis関数を用いたPERMANOVAにより、Bray-Curtis非類似度で計算し、健康なボランティアとICU患者日の間のペアワイズANOVA比較は、EcolUtilsパッケージv.0を使用して、Rで実行された。 微生物叢β多様性と患者の人口統計学的および臨床的共変数（生物学的性別、入院診断、民族性のカテゴリー変数、および年齢、併存疾患シャルソン指数、SOFAスコア、入院期間、微生物叢サンプリング前の抗生物質治療の連続変数）との関連を調べるために、多変量順列分散分析を、サンプリング時点間の反復測定を考慮して患者によって順列をブロックしたR内のVegan v.2.6 で行い、結果を拡張データ表 1 に示した。
腸内細菌科の濃縮が進行している患者とそうでない患者との間の免疫細胞集団の存在量および炎症性メディエーターのNMDSの統計解析は、Vegan v.2.6の多変量PERMANOVAを用いて実行した。多時点比較の反復測定を考慮するため、順列は患者ごとにブロックした。人口統計学的および臨床的共変数間の関連を調べ、免疫細胞組成および炎症メディエーターランドスケープに対するそれらの影響をコントロールするために、カテゴリー変数（生物学的性別、入院診断および民族性）および連続変数（年齢、併存疾患シャルソン指数、SOFAスコア、入院期間、微生物叢サンプリング前の抗生物質治療）の両方をモデルに含め、補足表15および16に示す。
ICU患者における腸内細菌科細菌の濃縮が進行するという結果と、微生物叢および/または免疫組成に影響を及ぼすことが知られている人口統計学的/臨床的共変数との関連を調べるために、単変量解析と多変量解析を行い、全モデル結果を拡張データ表2に示す。単変量解析は、連続変数についてはウィルコクソン順位和検定、カテゴリー変数についてはフィッシャーの正確検定により行い、多変量解析はロジスティック回帰を用いて、人口動態／臨床変数と腸内細菌科濃縮症の進行という結果との関連性を明らかにした。
30日院内感染なし生存率データは、Kaplan-Meier曲線を用いて可視化し、ログランク（Mantel-Cox）検定を用いて解析した。最大選択順位統計は、survminer R パッケージ v.0.4.9 の surv_cutpoint 関数を用いて、30 日院内感染フリー生存率に基づく患者の最大分離を識別するための微生物叢変数（腸内細菌科、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae の入場シャノン多様性、入場相対存在量、または相対存在量の 1 日から 3 日の進行性変化）に対するカットオフ値の定義に利用した．ゼロ値の除外によるバイアスを避けるため、相対存在量ゼロの値は0.00001（最低存在量値の半分）の値で置き換えた。オッズ比を算出し、両側フィッシャーの正確検定を用いて分析した。
すべての統計解析は、RまたはGraphPad Prism v.9.3.1で実施した。該当する場合、多重比較を考慮し、P値のFDR調整を実施した。
研究参加者を生物学的性別で層別化したすべての主要データの解析は、補足図7に記載されている。
報告書の要約
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
通信およびリクエストはB.M. (bamcdona@ucalgary.ca)宛にお送りください。DNA配列データセットはNCBI Sequence Read ArchiveにBioProject ID PRJNA851469で寄託され、利用可能である。その他のデータセットは、補足表に掲載されています。その他の非識別化データセットは、リクエストに応じて入手可能である。患者情報を特定する可能性のあるメタデータへのアクセスには、承認された研究倫理プロトコルが必要であり、すべての研究参加者の患者情報の管理者であるAlberta Health Servicesの承認が必要な場合がある。また、材料/データ転送契約が必要な場合がある。本研究では、Dadkhah et al.22の16s rRNA遺伝子配列の公開データセットと、DADA2形式のSILVAデータベースv.138.1（https://doi.org/10.5281/zenodo.4587955）が使用されました。
コードの利用可能性
すべての解析は、Methodsに記載されているように、一般に公開されているソフトウェアと公開されているコードを使用して行われた。本研究では、データ解析のためにカスタムコードを生成していない。
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リファレンスのダウンロード
謝辞
著者らは、研究参加者のスクリーニング、同意、登録に協力してくれたZ. Slavikova、C. Codan、O. Dmetrieva、サンプル調達に協力してくれたFoothills Medical CenterのICU看護職員に感謝する。また、マスサイトメトリーおよびイルミナシーケンスに協力してくれたK. Poon、A. IslamおよびNicole Perkins Microbial Core facilityのスタッフ、バイオインフォマティクスに協力してくれたH. Ramay、M. EstakiおよびInternational Microbiome Centerのスタッフに感謝します。最後に、本研究にご協力いただいた患者さんとご家族に感謝します。本研究の資金は、CIHR Early Career Investigator Award in Infection and Immunity（助成番号170746）、Canadian Foundation for Innovation JR Evans Leaders Fund（40697）助成、カルガリー大学 Peter Lougheed New Investigator Award、Alberta Health Services Critical Care Strategic Clinical Networkからの初期シードグラント資金により、すべて B.M. に供与された。
著者情報
著者と所属
カルガリー大学カミング医学部クリティカルケア医学科（カナダ、アルバータ州、カルガリー市
ジャレッド・シュレヒト、アマンダ・Z・ズコロト、イアン・リン・ユー、クリストファー・J・ドイグ＆ブレドン・マクドナルド
カナダ・アルバータ州カルガリー市、カルガリー大学カミング医学部、スナイダー慢性疾患研究所
ジャレッド・シュレヒト、アマンダ・Z・ズコロト、イアン・リン・ユー、クリストファー・J・ドイグ、キャシー・D・マッコイ、ブレドン・マクドナルド
カルガリー大学カミング医学部生理学・薬理学教室（カナダ、アルバータ州カルガリー市
アマンダ・Z・ズコロト＆キャシー・D・マッコイ
カルガリー大学カミング医学部地域保健科学科（カナダ、アルバータ州カルガリー市
クリストファー・J・ドイグ＆メアリー・J・ダンバー
カルガリー大学カミング医学部小児科（カナダ、アルバータ州、カルガリー市
メアリー・J・ダンバー
アルバータ小児病院研究所、カルガリー大学カミング医学部（カナダ、アルバータ州カルガリー市
メアリー・J・ダンバー
貢献度
B.M.は、本研究の構想、実験の設計、資金の確保、全体的な監督を行った。I.Y.とB.M.は、患者サンプルの収集、処理、保管を行った。J.S.、A.Z.Z.、I.Y.およびB.M.は、実験を実施した。J.S.、A.Z.Z.、M.J.D.、B.M.はデータを分析し、図を作成した。C.J.D.とM.J.D.は、試験デザインとデータ解析に貢献した。K.D.M.は、実験デザインに貢献した。J.S.とB.M.は原稿を作成した。全著者が原稿を編集した。
筆頭著者
Braedon McDonaldに対応しています。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
査読
ピアレビュー情報
Nature Medicineは、Herbert Tilgと他の匿名の査読者の方々の本作品の査読への貢献に感謝します。プライマリーハンドリングエディター アリソン・ファレル、ネイチャー・メディシン・チームとの共同作業。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 重症患者における糞便微生物叢の動態。
(a) 入院1日目に採取した重症患者（N = 51）、および3日目（N = 44）、7日目（N = 15）にICUに再入院した生存者（N = 15）における細菌群の分類学的組成（門レベル）と相対存在量の解析、および健康なボランティアコントロール（N = 15）との比較。ドットは個々の患者、中央線は中央値、ボックスはIQR、ウィスカーは範囲を示す。各時点での健常ボランティアとICU患者間の統計的比較は、クラスカル・ワリス検定を用いて行い、ICU患者日間の反復測定の一対比較は、反復測定と変数の脱落を考慮した混合線形回帰モデルとポストホックTukeyの検定を用いて行った。P値は示した通りである。(c) ICU患者と健康なボランティアの間の細菌ファミリーの存在量の差は、反復測定（サンプリング日全体）を考慮した混合モデルでANCOM-IIを使用して決定した（*p-adj<0.1）。
Extended Data 図2 ICU患者の糞便微生物叢における細菌間動態。
(a) マルチオミックスファクター分析（MOFA）を用いて、入院1日目の健常ボランティアとICU患者の微生物叢組成の説明分散を算出し、上位10分類学的要因（ファミリー）と説明分散への相対的寄与（要因重み）を示した。(b) すべてのサンプリングタイムポイントにおける、ICU患者における腸内細菌科の相対的存在量と分類学的豊かさ（Chao1）の間のスピアマン相関。ドットは個々の患者サンプル、回帰直線と95％信頼区間（斜線部）を示す。(c) 入院1日目の健康なボランティアとICU患者における最も豊富な細菌ファミリーのスピアマン相関ネットワーク（上位四分位、25％）。(d, e) すべてのサンプリングタイムポイントにおけるICU患者の腸内細菌科相対量とLachnospiraceae (D) およびRuminococcaceae (E) の相対量との間のスピアマン相関関係。ドットは患者サンプル、回帰直線と95％信頼区間（斜線部）を示す。(f) ICU患者において最も豊富な15種類の細菌科と，入院1日目から3日目までの腸内細菌科相対存在量の進行性変化に対するそれらの重要性（△Enterobacteriaceae）のペナルティーリッジ回帰 (g) 便微生物叢における腸内細菌科の濃縮が進行した患者（N = 18）またはしなかった（N = 26）におけるICU入院1，3および7日目の腸内細菌科相対存在量．(h) 直腸スワブサンプルにおける総細菌密度の進行性変化、および (i) 直腸スワブサンプルにおける腸内細菌数の絶対量（log fold changeとして示す）、便微生物叢における腸内細菌科細菌の濃縮が進行した患者（N = 17、1人の患者はqPCR用のサンプル残量が不足していた）またはしなかった（N = 26）患者。ドットは個々の患者、中央線は中央値、ボックスはIQR、ウィスカーは範囲を示し、統計解析は両側Mann-Whitney検定によるものである。P値は示した通り。
Extended Data 図3 重症患者における微生物叢の動態と院内無感染生存率。
(a) 最大選択順位統計では、入院1日目のシャノン多様性指数値が3.59である場合に、院内感染なし生存率に基づく患者の分離が最も大きいことが確認された。このカットオフ値以上のシャノン指数（>3.59）を持つ患者を「高」シャノン指数、カットオフ値以下（<3.59）を「低」シャノン指数としてグループ分けした。(b) (A)で求めたシャノン多様性が高い患者と低い患者の院内感染無症状生存率のカプランマイヤー曲線。(c-e)最大選択順位統計により、院内感染無症状生存率に基づく患者の分離が最も大きくなる（C、上）Enterobacteriaceae、（D、上）Ruminococcaceae、（E、上）LachnospiraceaeのICU入院1日目の相対存在量値を特定した。カットオフ値以上の相対存在量の患者を「高」、カットオフ値以下の患者を「低」として、それぞれの細菌ファミリーをグループ分けした。(下段）（C、下段）腸内細菌科、（D、下段）ルミノコックス科、（E、下段）ラクネスピラ科の相対存在量が高い患者から低い患者の間の院内感染フリー生存率のカプラン・マイヤー曲線。(f-h) ICU 入室 1 日目から 3 日目までの相対存在量の変化（増加 vs 減少）で層別化した患者における院内感染フリー生存率のカプランマイヤー曲線（F）腸内細菌科、（G）ルミノコックス科、（H）ラクネスピラセア科の比較。統計解析はlog-rank testを用いて行い、p値は示した通り。
Extended Data Fig. 4 重症患者における免疫細胞の動態。
全血のマスサイトメトリーにより、入院1日目に採取した重症患者（N = 51）（N=49）と、3日目（N=43）および7日目（N=15）にICUに再入室した生存者の主要免疫細胞集団の存在量を、健康ボランティア対照（N = 12）と比較して定量化した。データは、（a）好中球、（b）単球、（c）樹状細胞、（d）NK細胞、（e）Tリンパ球、（f）Bリンパ球の血中％CD45＋細胞として示されている。ドットは個々の患者、中央線は中央値、ボックスはIQR、ウィスカーは範囲を示す。各時点における健常ボランティアとICU患者の統計的比較は、クラスカル・ワリス検定を用い、ICU患者日数間の反復測定の一対比較は、反復測定と変数の脱落を考慮した混合線形回帰モデルを用い、ポストホックTukeyの検定で実施した。P値は示した通りである。
Extended Data Fig. 5 重症時の自然免疫ランドスケープ。
シングルセルマスサイトメトリーデータのFlowSOMクラスタリングにより、入院1日目に採取した重症患者（N = 51）の血液（N = 49）、および3日目（N = 43）、7日目（N = 15）にICUで再入院した生存者の血液（N = 12）と健康ボランティアコントロール（N = 12）との間で、（a）好中球、（b）単球、（c）樹状細胞、（d）NK細胞について固有のクラスタが特定されました。グラフは、ICU1日目、3日目、7日目における健常対照者とICU患者のクラスター存在量のlog2倍差を示す。ヒートマップは、マスサイトメトリーで測定した各細胞タイプの主要マーカーの平均発現量（列/マーカーでスケール）、および各細胞クラスターの総量（平均）（血液中の細胞/mL）を示す。
Extended Data 図6 重症時の適応性免疫細胞ランドスケープ。
シングルセルマスサイトメトリーデータのFlowSOMクラスタリングにより、入院1日目に採取した重症患者（N = 51）（N = 49）、および3日目（N = 43）、7日目（N = 15）にICUで過ごした生存者の血液中の（a）T細胞、（b）B細胞の固有のクラスターを、健康ボランティアコントロール（N = 12）と比較して特定した。グラフは、ICU1日目、3日目、7日目における健常対照者とICU患者のクラスター存在量のlog2倍差を示す。ヒートマップは、マスサイトメトリーで測定した各細胞タイプの主要マーカーの平均発現量（列/マーカーでスケール）、および各細胞クラスターの総量（平均）（血液中の細胞/mL）を示す。
Extended Data 図7 重症時の糞便微生物叢における腸内細菌科の濃縮と全身性炎症反応。
(a) ICU入室時の全身性炎症メディエーターのNMDS（Non-metric Multidimensional Scaling）順序付け（N=18人）、その後、進行性の腸内細菌科濃縮症を発症した患者（N=26人）または発症しなかった患者（N=26人）。統計的比較は、順列分散分析（PERMANOVA）を用いて行い、各ポイントは個々の患者の時間ポイントを表し、p値は示したとおりである。(b-d) 炎症性メディエーターの血漿レベルを、入院1日目に糞便微生物叢に腸内細菌が徐々に濃縮されたICU患者（N = 18）またはそうでない（N = 26）と、3日目と7日目にICUに再入院した生存者とで比較（log2倍差として表示）した。
Extended Data 図8 重症患者における院内感染に先行する細胞性免疫・炎症ランドスケープ。
ICU入室後1週間における(a)適応免疫細胞集団（T細胞およびB細胞）、(b)自然免疫細胞集団（すべての好中球、単球、樹状細胞）の量の非計量多次元尺度法（NMDS）順序付けを行った、 (c)その後、院内感染を発症した患者（N = 28人）と発症しなかった患者（N = 23人）における全身性炎症メディエーター。） 統計的比較は、順列多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて行い、各ポイントは個々の患者の時間ポイントを表し、p値は示したとおりである。院内感染状況との独立した関連を明らかにするため、解析は免疫細胞組成と独立した関連を持つ臨床共変数をコントロールした（補足表15）。(d, e) その後院内感染を発症した患者（N = 28人）と発症しなかった患者（N = 23人）における、入院3日目（院内感染前）のICUからの血液の単一細胞マスサイトメトリー解析の教師なしクラスタリングによって特定された（d）適応免疫細胞クラスタと（e）自然免疫細胞クラスタの存在量の差分解析．
Extended Data 表1 ICU入室1週目の臨床因子と微生物叢組成との関連についての多変量解析
フルサイズテーブル
Extended Data Table 2 糞便微生物叢に腸内細菌科の濃縮が進行している患者とそうでない患者の人口統計学的および臨床的特徴
フルサイズテーブル
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補足情報
補足表1、補足図1～7。
報告書の概要
補足表
補足表2～17
補足表18
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Schlechte, J., Zucoloto, A.Z., Yu, Il. et al. Dysbiosis of a microbiota-immune metasystem in critical illness is associated with nosocomial infections. Nat Med (2023). https://doi.org/10.1038/s41591-023-02243-5
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2022年7月5日受領
2023年1月30日受理
2023年3月09日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41591-023-02243-5
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