合成微生物群集の完全要因構成
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合成微生物群集の完全要因構成
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.05.03.592148v1.full
View ORCID ProfileJuan Diaz-Colunga, View ORCID ProfilePablo Catalan, Magdalena San Roman, Andrea Arrabal, View ORCID ProfileAlvaro Sanchez
doi: https://doi.org/10.1101/2024.05.03.592148
この論文はプレプリントであり、査読の認証を受けていません。
00810088
要旨全文情報/履歴メトリクスプレビューPDF
要旨
微生物相互作用の複雑さを解明し、最適な微生物コンソーシアムを見つけるためには、コンビナトリアルな完全種集合を構築することがしばしば必要である。現在のところ、これは骨の折れる手間のかかる液体処理手順か、あるいは最先端のマイクロ流体デバイスの使用によって達成されている。ここでは、基本的な実験装置で実施可能な、微生物株のライブラリーのあらゆる可能な組み合わせを組み立てるための、シンプルで迅速、低コストで非常に利用しやすい液体操作の方法論を紹介する。この方法論の有用性を実証するために、緑膿菌8株のライブラリーから、コンビナトリアルで完全なコンソーシアムのセットを構築し、バイオマス生産性のコミュニティ-機能ランドスケープを経験的に測定し、最も収率の高いコミュニティを同定し、その最適な機能をもたらす相互作用を解明する。この簡便で安価な方法論により、コンビナトリアルで完全な微生物コンソーシアムを構築することが、すべての研究室にとって容易になるであろう。
はじめに
微生物コンソーシアムは、バイオテクノロジーにおいてますます重要な役割を果たしている。微生物コンソーシアムには、代謝能力の向上、分業化、生態学的・進化的安定性の向上など、単培養に比べて大きな潜在的利点がある。1 合成微生物群集は、汚染物質の分解、2 バイオ燃料、3,4 ビタミン、5,6 フラボノイドなどの高価値分子の生産、7,8 病原体の侵入防止など、多様な目的のために設計されている。9
バイオテクノロジーにおける微生物コンソーシアムの可能性を完全に実現するためには、その最適化のためのツールを開発しなければならない。候補菌株のライブラリーがあるとして、目的の機能を最大限に発揮させたい場合、どのコンソーシアムを形成すべきなのだろうか？10 この問題に取り組む一つの方法は、純粋に経験的なもので、あらゆる可能性のある集合体を形成し、単純にその中から最良のものを選択する完全要因計画に従うことである。11-15 候補ライブラリーのサイズが小さい場合（10種以下）でも、この戦略のコンビナトリアルな性質が、可能性のあるすべての群集の集合を骨の折れる面倒なものにし、完全要因計画の規模と再現性を制限している。m種のすべての可能な組み合わせを形成するために必要な、ユニークな液体処理イベントの数は、m2m-1としてスケーリングされる。したがって、手動ですべての組み合わせを作ることは、消耗が激しく、時間がかかり、人為的ミスが起こりやすい。このような作業には長い時間がかかるため、汚染のリスクが高く、再現性に制約がある。このような理由からか、微生物コンソーシアムの完全な階乗計画を報告している研究は非常にまれで、11,13,14,16、この分野では、代表的な種の組み合わせのサブセットのみを構築する分数階乗計画に頼ることがほとんどである。10,17-19
種のライブラリーの完全な階乗の組み合わせを形成する能力は、バイオテクノロジー以外の利点もある。生態学では、微生物間相互作用の複雑で組み合わせ的な性質16,20-25や、微生物群集の機能と動態において高次相互作用が果たす役割を調べたい場合、あらゆる可能性のある種の集合体を形成することが必要である。19,24,26-30要するに、高次の微生物相互作用の定量的理解、群集形成ネットワークの経験的マッピング、群集機能ランドスケープの定量的探索、微生物群集の形成と機能の予測モデルの開発にはすべて、複雑さを増す群集を確実に形成できることが必要なのである。15,18,30
ロボット液体ハンドラーは、微生物群集の完全なコンビナトリアルセットを組み立てる作業を容易にすることができる。11これにより、コンビナトリアル液体ハンドリングに関連する課題の一部、特にヒューマンエラーに関連する課題が軽減される一方で、他の課題も残っている：数百または数千のピペッティングイベントの実行には依然として時間がかかり、その結果、汚染を避けるために追加の装置（すなわち、HEPAフィルター）が必要となる。ロボットリキッドハンドラーもまた、高価で技術的に洗練された機器であり、日常的に利用できるものではない。群集形成のコンビナトリアルな複雑性に対処するための代替手段として、Blaineyらは、数百千の種集合体を形成することができる液滴ベースのマイクロ流体システム（kChip）を導入し、27,31その完全な要因論的構築を容易にした。kChipをはじめとする32のような微小液滴ベースのアプローチは、そのパワーと比類ないハイスループットにもかかわらず、いまだ最先端の実験手法であり、専門的な装置とトレーニングを必要とし、世界中の研究グループの大多数が利用できるものではない。
この論文では、基本的な実験器具しか必要とせず、大多数の研究室が容易に実施できる、微生物コンソーシアムと接種菌の全因数設計のための、シンプルで迅速、かつ安価で、非常に利用しやすいリキッドハンドリング手法について述べる。標準的なマルチチャンネルピペットを使えば、一人のユーザーが最大10種の可能な組み合わせを1時間以内に手動で組み立てることができる。より高次元のデザインも可能であり、唯一の制限は必要なプラスチック器具だけである。特定の条件（培養液の量、バクテリアの密度など）に対する詳細なプロトコルを提供するだけでなく、ユーザーのニーズに合わせてプロトコルを調整するためのRスクリプトも提供している。このアプローチの有用性を説明するために、8株の緑膿菌からなるモデル微生物コンソーシアムの、コンビナトリアルで完全な群集機能ランドスケープを経験的に特徴付けるために、このアプローチを適用した。全てのコンソーシアムの完全な吸収スペクトルを特徴付け、モデル関数として、それらの総バイオマスを決定した。すべての菌株の組み合わせの完全な階乗アセンブリを可能にする我々のプロトコルの実装により、群集の多様性と機能の関係を定量的に決定し、最適な菌株の組み合わせを同定し、コンソーシアムのすべてのメンバー間のすべてのペアワイズ相互作用と高次相互作用を特徴付けることができることを示す。私たちは、この方法論によって、因子的に構築された微生物コンソーシアムの文献数が急速に拡大することを期待している。
方法論
以下では、我々のプロトコルの背後にある理由を詳しく説明する。このロジックの実用的な実装に興味のある読者は、Supplementary Methodsの "Full protocol description "のセクションを参照されたい。ここでは、8つの微生物分離株からなるライブラリーからなる特定の例から、すべてのコンソーシアムをアセンブルするためのステップバイステップのガイドを提供する。さらに、異なる種数やピペッティング量に対して同様のステップバイステップガイドを作成するために使用できるRスクリプトも提供しています。
アセンブリープロトコルの論理
本手法の数学的基礎は、各微生物コンソーシアムを固有の2進数で識別することにある。m種のセットに対して、任意のコンソーシアム（一般的にcと呼ぶ）を次のように表すことができる。
埋め込み画像
ここでxk = 0, 1は、コンソーシアムにおける種kの不在（0）または存在（1）を表す（図1A）。例えば、m＝6種の場合、種1、2、3のみが存在するコンソーシアムは000111と表される。
図1.
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図1.
組み立てプロトコルの論理。
(A）m種の集合（この図ではm＝8）を考え、それらで形成されうる2m個のコンソーシアムのそれぞれを2進数c＝xmxm-1- - - x2x1（xk＝1、0はそれぞれ種kの存在／非存在を表す；式1参照）で識別する。(B）我々のプロトコールは、96ウェルプレートの最初のカラムに、種1から種3の23＝8の組み合わせのそれぞれを組み立てることができるという考えに基づいている。これらのコンソーシアムを反復的に複製し、そこに種4から種mを加えれば、最終的には本文で説明したように、2m個の種の組み合わせがすべて得られることになる。(C）m種のそれぞれが、示されたウェルに存在する（式2参照）。(D）プロトコールで使用した96ウェルプレート内の2m個のコンソーシアムの位置。
2進数は、数学において組合せ-スタンス-を表す自然な方法であり、実際、2つのセットの間の対応は、組合せ論においてしばしば使用される埋め込み画像である。m種の場合。同じ数は、長さmの2進文字列にn個の1（等価的にはn個の0）が含まれる数を数える。
さて、この表記法の最も重要な点は、2つの不連続なコンソーシアムをマージすることが単純な足し算になることである。コンソーシアム110000とコンソーシアム000011を結合すると、結果として生じるコンソーシアムは2進数110011で表され、これは最初のコンソーシアムの2進数表現の和である：110000 + 000011 = 110011。ただし、この操作は不連続なコンソーシアムに対してのみ有効である。コンソーシアム100001とコンソーシアム000001を組み合わせると、再び最初のコンソーシアム100001になるはずである（今のところ、潜在的な種の存在量／密度の違いは無視しているが、この問題については本文で後述する）。しかし、2つの2進表現を加算すると100010となり、これは適切なコンソーシアムを表していない（2進加算では01 + 01 = 10であることを思い出してほしい）。後述するように、我々のプロトコルは、この加算特性を広範に利用することで、リキッドハンドリングイベントの数を最小化するが、それは不連続なコンソーシアムに対してのみである。
我々が利用する第二の特性は、96ウェルプレートが8列あり、2の累乗（23＝8）であることである。これにより、3種セット（例えば、種1、2、3）のすべての組み合わせをプレートの1列に形成することができる。最初のウェルに空のコンソーシアム（000）、次に001、010、011、100、101、110、111と続く。
次に、これら8つのコンソーシアムを複製し、96ウェルプレートの2番目のカラムにピペッティングし、マルチチャンネルピペットを用いて、この2番目のカラムのすべてのウェルに種4（1000）をピペッティングする（図1B）。この操作は、コンソーシアム1000（種4単独）を、開始する8つのコンソーシアムのそれぞれと二元的に加えることと等価であり、その結果、種1から種4までで組み立てることができる全24＝16のコンソーシアムが得られる： 最初の列には、先に説明したように、0000、0001、0010、0011、0100、0101、0110、0111（10進数0から7）があり、2番目の列には、1000、1001、1010、1011、1100、1101、1110、1111（10進数8から15、図1B）がある。次に、これらの16のコンソーシアムをそれぞれ複製し、プレートの1列目と2列目を、それぞれ3列目と4列目にピペッティングする。次に、複製した各コンソシアに種5（10000）を加えると、種1から種5までの25＝32の組み合わせが生成される（図1B）。
以下では、このロジックが実際にどのように最も効率的に実装できるかを説明するが、読者がより多くの種を持つコンソーシアムについてこのアルゴリズムを一般化する方法をすでに直感できることを望む。例えば、m = 7の場合、27 = 128の潜在的なコンソーシアムを形成することができる。ここでは使用しないが、このアルゴリズムは384ウェルプレートでも一般化できる。この場合、最初の列を使用して、種1から種4で構成されるすべてのコンソーシ アムを組み立て、それ以降のすべての種について上記のように進める。
プレートの配置
今説明した論理に従えば、96ウェルプレートの2、4、6、8...列のすべてのウェルに、種4が存在することに気づくのは簡単である。次に、種5はカラムの交互のペアに存在する： 3、4、7、8、11、12... 種6は、4つのカラムの交互の組に存在する： 5、6、7、8、13、14、15、16...（図1C）。ここで13列から24列と呼んでいるものは、実際には2枚目の96ウェルプレートの1列目から12列目、25列目から36列目は3枚目の96ウェルプレート、といった具合である。同様の理由で、種1から種3は、それぞれ1、2、4行（列の代わりに）の交互のセットに存在することになる（図1C）。まとめると、種kは以下の場所に存在することになる：
に存在する：
埋め込み画像
便利なことに、この配置により、コンソーシアムはプレート内で上から下へ、左から右へと順番に配置されることになる：最初の列は10進数0（00000）から7（00111）の2進数表現に対応するコンソーシアムを含み、2番目の列は10進数8（01000）から15（01111）に対応し、3番目の列は10進数16（10000）から23（10111）に対応する。
コンソーシアム間の種密度の均一化
先ほど見たように、マルチチャンネルピペットを使って、m個の種をそれぞれ対応する位置（式2）に、縦方向（種1から種3まで）または横方向（種4から種mまで）にピペッティングするだけで、m個の種のすべての組み合わせを形成することが可能である。しかし、一つ重要な注意点があります。各生物種の単培養液を等量ピペットで分注すると、ウェル間で分注量がばらつくことになります。例として、各モノカルチャーをv0容積ずつピペッティングすると、96ウェルプレートのウェルD01（コンソーシアム011がある）では2v0容積になりますが、ウェルH01（コンソーシアム111がある）では3v0容積になります。種1は、これらの例の両方のコンソーシ アムに、同じ総個体数で存在するが、2/3のファクターで異なる個体数密度で存在する。
しばしば、各生物種の密度をコンソーシアム間で一貫させたい場合がある。これを達成するために、容積の違いを補正するために、各ウェルに追加の液体（滅菌水、増殖培地、生理食塩水バッファーなど）をピペットで注入することができる。この密度均一化ステップの前では、ウェル内の最大体積はmv0であり、これはm種の全菌種を含むコンソーシアムに相当する。これは当然、個々の種が最低の個体密度で存在するコンソーシアムにも対応する。他のすべてのコンソーシアム（例えば、コンソーシアムc）では、この最小個体密度に到達するために追加する必要があるバッファーの体積（vB（c）とする）は、次式で与えられる。
埋め込み画像
ここで、H（c）はコンソーシアムcの2進数表現のハミング重みを表す。2進数のハミング重みとは、その表現における1の数であり、例えば、H（0000）＝0、H（0010）＝1、H（1111）＝4などである。したがって、H (c)は単にコンソーシアムcに存在する種の数を数える。
実際には、ウェルごとに手動でバッファー をピペッティングする必要はない。プレートの便利な配置により、このプロセスを合理化することができる。以下では、iとjをプレートの行と列のインデックスとして使用する（それぞれ上から下へ、左から右へ）。例えば、ウェルC02（コンソーシ アム1010を含む）はi=3、j=2に対応する。注意点として、j = 13から24は2枚目の96ウェルプレートの1列目から12列目に対応し、j = 25から36は3枚目のプレートに対応する、などと考える。
バッファーのピペッティングを効率化するためには、位置インデックスiとjでH（c）の式を見つけるのが便利であろう。さて、プレート内のコンソーシアムの特殊な配置により、コンソーシアムcの2進表現を2つに分けることができる。第一に、cの右端3ビットは、それが位置する行によって決定される。例えば、7行目にあるすべてのコンソーシ アムは、それが現れる列とは無関係に、常に110で終わる二進表現を持つ。一般に、cの右端の3桁はB（i - 1）に等しく、iはコンソーシ アムcのある行のインデックスで、I - 1の二進表現である。同様に、cの左端m - 3ビットは列にのみ依存し、次のようになる：列jを取り、右端の3桁を無視する。例えば、m = 8の場合、列4の全コンソ ーシアの2進表現は00011x3x2x1である-最後の3ビッ トは特定のウェルによって0または1になるが、最初の5ビッ トは列の全ウェルに共通である。したがって、あるコンソーシアムのハミング・ウェイトを計算するには、行のハミング・ウェイトと列のハミング・ウェイトを合計すればよい：
埋め込み画像
式4を使って、式3を位置インデックスiとjで書き直すことができます。
埋め込み画像
この方程式の項をもっとコンパクトな形に並べることもできるが、式5をそのまま使えば、非常に効率的な方法でバッファーのピペッティングを行うことができる： まず、液体バッファーを列ごとにピペッティングします（容量v0 [m - 3 - H (B (j -1))] をj列の各ウェルにピペッティングします）。さらに、Supplementary Methodsで詳しく説明するように、種1から3で形成された開始コンソシアムの密度を均一化すれば、行ごとのバッファーのピペッティングをバイパスすることができる（「m = 8種のための完全なプロトコルの説明」のセクション）。
結果
概念実証：着色剤の組み合わせの構築
この方法の最初のデモンストレーションとして、またその実現可能性と精度を確立するために、市販の食品着色料とテンペラを用いて、8色からなる256通りの組み合わせを構築した。これらの着色料を水で希釈し、380 nmから780 nmの範囲で、すべての最大吸光度が同等になるようにした。各色はこの範囲で異なる吸光度スペクトルを示す（図2A）。
図2.
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図2.
合成着色料の組み合わせの完全要因構成。
(A)8種類の合成着色料を考え、それぞれ380-780 nmの範囲で異なる吸光度スペクトルを示す。(B）例として、着色料1、3、8（10000101）の組み合わせについて、経験的に測定された吸光度スペクトル（黒の実線）を示す。黒の破線は、加法期待値、すなわち3つの構成着色料のスペクトル（着色破線）の和を表す。(C) 10000101の組み合わせ例（左）および2色以上のすべての混合物（右）についての、経験的スペクトルと加法的期待値（式6参照）との間の相対的偏差。相対誤差は、真の吸光度が0.1 A.U.以上の場合のみ計算した。
我々のプロトコルをテストするために合成着色料を使用することには、様々な利点がある。第一に、色の違いは肉眼ではっきり見えるので、各着色剤の位置を簡単に追跡できる。第二に、これらの着色料は互いに相互作用しないか、あるいは非常に弱い相互作用しかしないと予想される。つまり、どのような着色剤の組み合わせでも、吸光度スペクトルは、各着色剤の個々のスペクトルの合計と一致することが合理的に期待できる。したがって、経験的スペクトルとこの相加的期待値（図2B）との間の偏差の大きさは、プロトコルのピペッティングエラーの上限を推定するために使用することができる。この偏差を調べることで、プロトコルの精度を推定することができる。
m=8、v0=25μL（これらのパラメータに関する詳細なステップバイステップのプロトコルは、補足ファイル protocol 8species 25uL.txtに記載されている）と設定し、上述のプロトコールに従って、256色の組み合わせをすべて組み立てた。各組み合わせの吸光度スペクトルは、MultiSkan SkyHighプレートリーダー（Thermo Scientific）を用いて定量した。このプロトコールの実施には、96ウェルプレート3枚、ファルコンチューブ8本、8チャンネルピペット、12チャンネルピペットが必要であった。プロトコール全体を完了するのに要した時間は、実験者1人で1時間未満であった。図S1は、プロトコールの6つの異なるステップにおける3つの96ウェルプレートを示している。
図2Bは、着色剤混合物の例（10000101）の吸光度スペクトルを示し、3つの構成着色剤（1、3、8）が相互作用しないという加法的予想と比較している。我々は、プロトコルのピペッティングエラーを、すべての波長（図2B）における経験的スペクトルと加法的期待値との間の相対的偏差（δと表記）として推定しました：
埋め込み画像
ここで、Absλ（c）を着色剤混合物cの波長λ（380～780nm）における吸光度、Embedded Image（c）を加法期待値（すなわち、各構成着色剤の吸光度の合計）とする。
図2Cに、すべての波長における例の混合物10000101の相対偏差の分布（左）と、すべての波長におけるすべての混合物に対応する分布（右）を示す。図S2は、すべての波長におけるすべての混合物の絶対偏差の埋め込み画像です（絶対偏差の中央値は0.025 A.U.程度）。相対偏差は概して小さいことがわかった（図2C：平均約5.8%、中央値約4.9%）。また、これらの偏差の大きさは、混合物中の着色剤の数によって増加しないことがわかった（図S3）。このことは、私たちのプロトコルの精度が、混合物を組み立てるセットのサイズによって損なわれないことを示唆している。また、偏差はすべての波長でほぼ同じ大きさであった（図S4）。
合成細菌コンソーシアムの完全階乗設計
最適な微生物コンソーシアムを見つけ、微生物相互作用の複雑さを定量的に研究するための、我々のプロトコルの応用の可能性を説明するために、我々は以前の実験から得られた8つの緑膿菌株のコレクションを採用した。33-35液体LB培地で増殖させたこれらの各菌株の単培養株は、吸光度スペクトルに違いを示した（図3A）。合成着色料とは異なり、細菌株は、制限的な資源をめぐる競争や、異なる種の個体数の変化につながる可能性のある促進など、さまざまな潜在的メカニズムを通じて相互に作用し合うことが予想される。15,19
図3.
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図3.
細菌分離株の共培養の組み合わせ。
(A）以前の実験から得られた緑膿菌8株を考える。33-35 ここでは、これら8株の単培養株の吸光度スペクトルを示す。実線と斜線部分は、3つの独立した生物学的複製における平均値と標準偏差を表す。(B)我々のプロトコールに従って、様々な菌株の組み合わせ（この例では、2、3、8株で形成されるコンソーシアム、10000110と表す）を組み立てた。各コンソシアムを1:400の倍率で新鮮な培地に希釈し、40時間再成長させた後、培養液の吸光度スペクトルを測定した。黒実線：コンソーシアム10000110の経験的スペクトル（3つの独立した生物学的複製の平均値。） 黒破線：3株が相互作用しなかった場合の相加的期待値。色の破線：3つの構成株の単培養スペクトル。
まず、50mLのコニカルファルコンチューブに入れた15mLのLB培地にコロニー1個を懸濁し、各菌株を別々に培養した。株は攪拌せず、37℃で24時間、増殖させた。その後、単培養株を完全にホモジナイズし、前述と同じプロトコールに従って、全 256 株の組み合わせを組み立てるために使用した（詳細な手順は、補足的方法、セクション「m = 8 種のための完全なプロトコールの説明」に記載されている）。リン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）は、プロトコールに示されているように、容量／密度の調整に使用した。プロトコール終了後（実験者一人で1時間弱かかった）、各コンソシアムを96ウェルプレートで新鮮なLB培地に接種した（0.5μLの接種液を200μLの培地に接種し、希釈倍率を1:400とした；プロトコールの設計上、これは各菌株の単培養液を新鮮な培地に0.5μL/8=0.0625μL接種するのと同じであることに注意）。サンプルを37℃で40時間静置した後、各サンプルの吸光度スペクトルを、前回と同じプレートリーダーで定量した。
図3Bは、40時間培養後のコンソーシアムの吸光度スペクトルである。われわれの推論と一致し、このスペクトルは相加的な期待値（各単 独培養のスペクトルの合計）から大きく乖離しており、菌株間の相互作用が顕著に影響 していることを示している。図4は、メンバーが2人以上いるすべてのコンソーシ アムのスペクトルを示しており、相加的期待値からの乖離は同様に大きい。
図4.
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図4.
合成微生物コンソーシアムの全要因設計。
緑膿菌8株からなるライブラリーを用いて形成可能なすべてのコンソーシアム（2株以上）の吸光度スペクトルを示す。図3Bと同様に、黒い実線と斜線部分は3つの生物学的複製を通した共培養スペクトルの平均と標準偏差を表し、破線は個々の単培養スペクトルを表し、黒い破線はこれらの個々のスペクトルの合計を表す。
すべての可能な集合体を構築したので、生物種間の相互作用を系統的に調査することができ、それらがどのように異なる群集レベルの特性や機能をもたらすかを調べることができる。例として、培養における総バイオマスの指標である600nmの吸光度（Abs600）に注目する。その結果、群集バイオマスと群集の豊かさ（菌株数）の間には非単調な関係が認められ、そのピークは3株であった（図5A）。われわれのプロトコールは、このような多様性と機能の間の広範な関係を特徴づけるだけでなく、特定の高性能コンソーシアムを同定することも可能にする（図5B）。われわれの実験では、バイオマス量が最も高いコンソーシアムには3株しか含まれていない（コンソーシアム00001101、1株、3株、4株を含む）。図5Cは、我々の実験に参加した256の全コンソーシアムの組成と機能（バイオマス）の間の完全なマップ（すなわち、群集構造-機能ランドスケープ15,16,19,22）を表している。
図5.
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図5.
微生物コンソーシアムの完全階乗設計により、微生物の相互作用が解明できる。
コンソーシアムのバイオマスの代用として、波長600 nmでの吸光度に注目した。(A）コンソーシアム機能（Abs600として定量化したバイオマス）とコンソーシアム内の菌株数。ドットとエラーバーは、同じ株数の全コンソーシアムにおける平均と標準偏差を表す。(B)全28の組み合わせの中で、バイオマスが最も高い上位3つのコンソーシアム。(C)我々のプロトコルを用いてアセンブルしたコンソーシアムの機能（バイオマス。ノードは異なるコンソーシアムに対応し、エッジは特定の1株の存在で異なるコンソーシアムを結んでいる。(D）バックグラウンドのコンソーシアム（この例では、バックグラウンドはコンソーシアム11001000に対応する）に、菌株1、菌株2、およびその両方を含めた場合の効果を詳細に示す。赤：菌株1の機能的効果は、バックグラウンドのコンソシアムと、その菌株を組み込んだ結果のコンソシアムとの間の機能の差として定量化されている。緑：この特定のバックグラウンドにおける株1と株2の機能的相互作用は、本文で説明したように、両株を含むコンソーシアムの機能に関する相加的期待値（破線）と経験値との差として定量化されている。(E）全体として最もバイオマスの高いコンソーシアム（00001101）を構成する3株に対応する機能的ランドスケープの詳細。挿入図：この3菌株コンソーシアム内の機能的相互作用。順序1はモノカルチャー機能に対応する。順序2は、この図のパネルDで定義されているように、種ごとのペアワイズ相互作用に対応する。次数3はこれらの菌株間の3次相互作用に対応し、相加的相互作用と2次相互作用からのヌル期待値に対するトリオの経験的機能の偏差として定義される。19,2919,29（F）実験に使用した8系統の機能的効果の分布で、それぞれが含まれる可能性のある128のバックグランドすべてにわたっている。(G)両方が含まれる可能性のあるすべてのバックグラウンドにおける、すべての系統の対間の機能的相互作用の分布。(H)異なる次数の相互作用による機能分散の割合（次数1は各系統の相加効果に対応）。分率は補足的方法で説明したように計算した。30 破線は累積和。(I)我々は最近、ある菌株の機能的効果は、単純な線形回帰によって、背景のコンソーシアムの機能から予測できることが多いことを示した。10 今回の実験に用いた8つの緑膿菌株では、線形回帰がこれらの機能的効果とバックグラウン ドコンソーシアムの機能とを見事に結びつけている。
この種のデータから、関心のある群集レベルの機能（この場合は総バイオマス）に対する菌株の相互作用の符号と大きさを容易に定量化することができる。図5Dでは、あるコンソシアム（ここでは生態系バックグラウン ドと呼ぶ）に株1を入れるとバイオマスが増加し、株2を入れた場合も同様であ ることを示している。 ここでは、ある株を入れた場合と入れない場合の2つのコンソシアム間の 機能の差を、その生態系バックグランドにおけるその株の機能効果と呼ぶ。10 もし2つの系統が相互作用しなければ、同じ生態学的背景の中に両系統を含めると、両系統の個々の機能効果の合計に等しい機能変化が生じると予想される（図5D参照、破線はこの相加的な予想を表す）。経験的な機能が相加的な期待値から外れる場合、2つの系統はその特定の生態学的背景で機能的相互作用（図5Dでは↪Ll_3F と表記）を起こす。10,19
この定義に従えば、我々のシステムにおける緑膿菌8株すべての相互作用構造を解剖することができる。例として、図5Eに、菌株1、3、4のみで形成されうるすべてのコンソーシアム、すなわちバイオマス収量が最大となるトリオに対応する群集機能ランドスケープを示す（図5B-Cを参照すると、コンソーシアム00001101によって最大のAbs600が達成されていることがわかる）。このコンソーシ アム内では一対の相互作用は負であるが、3 株は正の 3 次機能的相互作用を行い（図 5E の挿入図を参照）、トリオの機能を回復させた。この観察結果は、特に高性能のコンソーシアムにおいて（しかしそれだけではない）、コミュニティレベルの機能の出現を支配するメカニズムに関して、ハイポシフィズムを調査し、生成するための完全要因計画の可能性を強調している。
この特定のコンソーシアムだけでなく、図5Fでは、私たちのライブラリーに含まれる全8株の機能効果の分布を、それらが含まれる可能性のある128の生態学的背景すべてにわたって示している。緑膿菌8株すべての機能的効果は、符号と大きさに大きなばらつきを示 しており、このことは、ある株の群集バイオマス全体への寄与が、生態系背景における 追加的な群集メンバーの有無に大きく依存していることを示している。このことは、この系において菌株間相互作用が重要な役割を果たしていることを示している。
図5Gでは、i株とj株のすべてのペア間の機能的相互作用（ϵijと表記）の大きさを、両者が含まれる可能性のあるすべての生態系背景にわたって表している。これらの一対の相互作用は、バックグラウンドによって大きく異なることがわかった。一対の相互作用が追加的な群集メンバーの有無に敏感であることは、高次生態学的相互作用（HOI）の特徴として解釈できる。19,36,37この定義によれば、HOIは我々の特定の実験系に存在する（図5Gに示す一対の相互作用項?ijのばらつきで証明される）。しかし、群集バイオマスの分散のほとんどは、低次の相互作用で説明できる（図5H、一対の相互作用と高次の相互作用に起因する機能分散の割合は、別の場所で説明されているように計算された。） このことは、微生物群集機能の他のデータセットでも示されている。30
私たちは最近、一対および高次の微生物間相互作用の効果を集計すると、多くの場合、統計的なパターンが出現することを明らかにした。10 ある菌株の機能的効果と背景となる生物群集の機能との間の関係 は、遺伝学で一般的に報告されているグローバル・エピスタシスのパタ ーンを反映した単純な線形モデルでとらえられることが多い。この現象は、今回解析した緑膿菌の特定の菌株群（図5I、R2平均0.54）でも観察され、それぞれの菌株は、その機能効果とバックグラウンドの機能との間に異なる関係を示している。このような強いグローバルなエピスタシスパターンは、ランダムなコミュニティ機能ランドスケープのヌル予想から逸脱していることがわかった（図S6）。
これらの解析結果を総合すると、微生物群集の完全な要因構成によって、最適な群集を同定し、一対や高次の相互作用がどのように群集レベルの特性や機能を形成しているのかを解明できる可能性があることがわかる。われわれの知る限り、今回報告した実験は、菌株のライブラリーからあらゆる可能性のある組み合わせを集めた数少ないデータセットのひとつである。この実験が1複製あたり1時間未満で行われたという事実は、我々の設計が、文献における経験的群集機能ランドスケープの数を劇的に拡大する可能性を持っていることを感じさせる。
考察
我々は、マルチチャンネルピペットや96ウェルプレートなどの基本的な実験器具を用いて、与えられた生物種のすべての可能な組み合わせを組み立てるための、迅速でシンプルかつ安価なプロトコルを紹介した。われわれのプロトコールは、8つの生物種のプールから256の可能なコンソーシアムすべてを1時間以内に一人で構築することを可能にし、さらに多様性の高いライブラリーへと容易に拡張することができる。ロボット・リキッドハンドラーのような特別な装置を使わなくても、このプロトコールは、10-12種までの全コミュニティーを効率的に作製することを可能にする。
ロボットリキッドハンドラーを備えている研究室では、このプロトコルはより大きなライブラリーに対応するように簡単に拡張でき、主な制限は使用するプラスチック器具の量である。我々のアセンブリープロトコルの根底にある理論的根拠は、各研究室の特定のニーズに応じた柔軟な実施を可能にする（例えば、384ウェルプレート用に一般化するのは簡単である）。また、8つの合成着色剤から256色の組み合わせをすべて作成することで示したように、我々の実装には、ピペッティングエラーを最小限に抑え、コンソーシアムのサイズに依存しないという利点もある。自動化と他のグループのニーズへの適応を容易にするために、我々は、任意の数の生物種とピペッティング量に対する包括的なステップバイステップのプロトコルの生成を容易にする付属のRスクリプトを提供する。
緑膿菌8株のコレクションから可能な限りのコミュニティを生成し、それらの間のペアワイズおよび高次の機能的相互作用の強さを定量化することで、合成微生物生態学におけるこのプロトコルの有用性を実証した。この実験は、微生物コンソーシアムの完全な要因設計によって、生態学的群集機能ランドスケープの完全な特徴付けがいかに可能になるかを示すものであり、群集レベルの機能（今回研究したようなバイオマス生産性などに限定されない）の出現に関する貴重な洞察を提供するものである。コロニーの散布から群集機能の測定まで、実験の最初から最後まで、一人の実験担当者が1週間もかからずに完了させることができた。
当初は微生物種の組み合わせを作るために設計されたが、我々のプロトコルは微生物以外のあらゆる可溶性（または少なくとも均質に分布する）化合物の組み合わせを作るために容易に適用できる。例えば、一組の資源から可能な限りの培地組成、抗生物質、毒素、あるいはバクテリオファージなどの可能な限りの組合せ、さらにはそれらの混合組合せを生成するために用いることができる。したがって、我々の方法論は、微生物学、生態学、進化学、バイオテクノロジーなどの多様な分野にわたって、広範な応用と有用性が見いだされると期待している。
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
補足方法
m = 8種のプロトコルの説明
このセクションでは、m = 8種のライブラリーから全てのコンソーシアムをアセンブルするためのプロトコルを詳細に説明する。より大きな（あるいはより小さな）ライブラリーサイズに対してプロトコルを一般化することは簡単であることが、読者に理解されることを期待する。また、カスタマイズ可能なパラメータ（例えば、異なるmの値）を持つ完全なステップバイステップのプロトコルを生成するRスクリプトも提供する。
初期考察
前回と同様に、プロトコール全体を通して最小ピペッティング量をv0と呼ぶことにします。m = 8の場合、v0 = 25 μLを選択することができます。これは標準的なピペットで簡単に扱うことができる容量で、プレートの各ウェルは、アセンブリープロトコルの終了までに合計200 μLの容量を持つことになります。以下では、プロトコルの開始時に、m＝8種の単培養で十分な量があると仮定する。用途によっては、単培養の密度を標準化することが望ましいかもしれない。典型的には、すべての培養を同じ目標光学密度まで希釈する。各生物種は2mコンソーシアムの半分に存在すること、つまり、各単培養液の最小容量は2m-1v0（mとv0の選択で3.2mL）であることを念頭に置くべきである。もちろん、余分な容量を用意しておくことをお勧めします。
ステップ1：バッファーピペッティング
必要なバッファーをカラムごとにピペッティングすることからプロトコールを開始します。これをプロトコールの最初のステップとすることで、すべての液体バッファー操作を同じピペットチップを使って行うことができ、クロスコンタミネーションのリスクがないという利点がある。8チャンネルのピペットを使って、v0 [m - 3 - H (B (j - 1))] （式5の第2項に相当することに注意）の量をカラムjのすべてのウェルにピペッ トします。8種の場合、v0 = 25 μLとすると、次のようになる：
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ステップ2：種4から種m
8チャンネルピペットを用いて、種4～mの単培養液を、対応するカラムのすべてのウェルにv0 = 25 μLずつピペットで注入する（式2および図1C参照）：
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クロスコンタミネーションを避けるため、ピペッティングごとに異なるピペットチップを使用することを推奨しますが、例えば、種4のすべてのピペッティングを同じチップセットで行っても、クロスコンタミネーションのリスクはないことに注意してください。同様に、最初に種5をすべての必要な奇数カラムに、次にすべての必要な偶数カラムに、同じチップセットでピペッティングすることができます。
ステップ3：種1から3の組み合わせ
次に、種1、種2、種3の23＝8組合せをすべて組み立てる。これらのコンソシアムをまず大きな容器、通常は15mLまたは50mLのファルコンチューブに入れることをお勧めします。次に、以下の量の種1、2、3の単培養とバッファーをそれぞれのチューブにピペットで注入する：
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最後に、1ウェルあたり3v0＝75μLの量を、T1～T8チューブからプレートのi＝1～8列にそれぞれピペットで注入する。これは、12 チャンネルのピペットを用いて簡単に行うことができる。これは、種1から種3を対応する位置に配置するだけでなく（図1C）、列ごとに必要な量のバッファーも加えることに注意する（式5の第1項参照）。また、ウェル当たり3v0 の量が各チューブからプレートの各列に加えられるので、チューブ当たり3v0 - 2m-3 = 2.4 mLの最小量が必要であることにも注意されたい。
試薬と菌株
合成着色料を用いた実験では、食品着色料（Dr. Oetker）とテンペラを混合したものを使用し、380～780 nmの範囲において、すべてが同様の最大吸光度値を示すまで水で希釈した（図2A）。
緑膿菌8株はすべてSara Hernando-Amadoの好意により提供されたもので、他の文献に記載されている。33-35 株から 8 株（本文中のラベル）は、原著論文中の変異株 pAOV、PA14、NfxB、 ParR-CAZ、mexZ、OrfN、NfxB-CAZ、MDR6-CAZ に順に対応している。我々の実験では、菌株を凍結ストックからLB寒天培地（Condalab）プレートにストリークし、各菌株のシングルコロニーをLB培地（Condalab）15 mLに懸濁した（50 mLコニカルチューブ入り、Falcon社製）。単培養株を37℃で24時間生育させた後、それを用いて、本文に記載したように28菌株の組合せをすべて組み立てた。すべての組合せを組み立てた後、96ウェルプレート（Thermo Scientific）で、サンプルを新鮮なLB培地に1:400倍希釈した（0.5μLの接種片を200μLの新鮮培地に）。プレートは透過性シール（Excel Scientific）で覆い、培養は37℃で40時間、攪拌せずに行った。インキュベーション後、プレートをMultiSkan SkyHighプレートリーダー（Thermo Scientific； ソフトウェアバージョン：SkanIt 7.0）に移し、吸光度スペクトルを得た。
生物種間の一対の機能的相互作用の定量化
微生物生態学における最近の研究10,19,29に従い、バックグラウンドのコンソーシアムBにおける2つの生物種iとjの間の一対の機能的相互作用を以下のように定義した。
埋め込み画像
ここで、B + i、B + j、B + i + jを、生態学的背景Bに種i、種j、またはその両方を含めた結果のコンソーシアムと呼ぶことにする。括弧内の項は、コンソーシアムB + i + jの機能に対する相加的期待値、つまりバックグラウンドの機能F（B）に、そのバックグラウンドにおける種iとjの2つの個別機能効果（それぞれΔFi（B）とΔFj（B）と表記）を加えたものを表す。本文で説明したように、バックグラウンドBにおける種iの機能的効果は、単純にコンソーシアムB + iとBの間の機能の差として定量化される：
埋め込み画像
したがって、式S1は次のように書ける。
埋め込み画像
本文中の図5Fは、式S3を用いて計算された、すべての潜在的背景Bにわたるすべての株iとjのペアの相互作用係数ijの値を示している。
相互作用次数による機能分散の解析
すでに発表されている微生物コンソーシアム30に関する最近の解析では、相互作用を定量化するために次のようなアプローチが用いられている：ある種iの存在／非存在を変数xi = 1, 0で表す代わりに、変数σi = +1, -1で表すことができる。このようにして、コンソーシアムcの機能（我々の場合、Abs600として定量化されたバイオマス）は、以下のように表すことができる。
埋め込み画像
この式において、係数αiは、種iの有無のみで異なる2つのコンソーシアム間の機能の平均差、つまり、この種が含まれる可能性のあるすべての生態学的背景にわたる種iの平均機能効果（本文で定義）を表す。30 したがって、係数iは図5Eに示した分布の平均である。次に、係数αijは、種iとjの間の平均的な一対の機能的相互作用（本文で定義した意味で、図5Dと式S3を参照）、すなわち図5Fの分布の平均に比例する。
この表現を用いると、機能分散の合計（我々の場合、28のコンソーシアムすべてにわたるAbs600の分散の合計）を次のように表すことができるという利点がある：
埋め込み画像
例えば、1次の係数によって説明される機能分散はEmbedded Imageであり、2次の項によって説明される分散はEmbedded Imageというように、k次の係数によって説明される分散はEmbedded Imageとして計算できる。これにより、本文の図5Gで表される、各次数に起因する分散の割合を計算することができます。
補足図
図S1.
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図S1.
8種類の着色剤を組み合わせた場合の、アセンブリープロトコルの各段階におけるプレートレイアウト。
図S2.
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図S2.
2色以上の着色剤からなるすべてのコンソーシアムc、および380 nmから780 nmの間のすべての波長λについて、8色の着色剤コンソーシアムのスペクトルと加算期待値との間の絶対偏差、|Abs(c) - Abs(add)(c)|。絶対誤差の中央値は約0.025 A.U.である。
図S3.
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図S3.
コンソーシアムに含まれる着色剤の数に対する、経験的スペクトルとそれぞれの加法期待値（式6）との間の相対的偏差。ここでは380-780 nmの全波長における偏差を表す。
図S4.
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図S4.
波長の関数としての経験的スペクトルとそれぞれの加算期待値（式6）との間の相対的偏差。380-780 nmの波長を10の分位数に分割した。各分位の中で、2つ以上の着色料のすべての組み合わせに対する相対的な偏差（式6）を表す。
図S5.
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図S5.
これまでの研究では、コンソーシアムcのコミュニティレベルの関数を埋め込み画像として表現してきた。30 この式では、σiは、コンソーシアム内の株iの存在または非存在に応じて、それぞれ+1または-1の値をとる（存在/非存在を代わりに1sと0sで表した本文の式1との違いに注意）。この係数αi、αijなどは、緑膿菌8株を用いた実験のように、群集組成と機能の間の完全なマッピングがわかっていれば、経験的データから正確に定量化することができる。ここでは、その実験のすべての次数における係数αの大きさを表す。上の式は、全機能分散var (F)が次のように計算できるという利点がある： 各和が次数1、2、3、・・・の項による分散に対応する。
図 S6.
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図S6.
図5Iで報告したような、ある菌株（Abs）の機能的効果と、その菌株が含まれるバックグラウンドのコンソーシアムの機能との相関は、コミュニティーの構成と機能との間のマッピングが完全にランダムである場合に現れる可能性がある。10 (A) 図5Iで観察された経験的相関がこの現象に起因するかどうかを調べるために、経験的データを100回無作為化した。これらのランダム化のそれぞれにおいて、8つの菌株の機能効果（ΔAbs）とバックグラウンドのコンソーシアムの機能とを結びつける線形モデルを当てはめた。(B)ここで、これら100回の無作為化コントロールのそれぞれで得られた線形フィット（青線）と、経験的データに対する真の最良フィット（黒線）を比較する。経験的フィットは、無作為化コントロールとは概して相容れないことがわかった。
謝辞
実験に使用した緑膿菌株を提供してくれたSara Hernando-Amadoに感謝する。A.S.とJ.D.-C.は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033の助成金PID2021-125478NAI00と "ERDF： A way of making Europe "によるものである。P.C.は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033および "ERDF: A way making Europe "による助成金PID2022-142185NB-C21およびPID2022-142185NB-C22の支援を受けた： A way of making Europe "の助成を受けた。A.S.は欧州連合（ERC, ECOPROSPECTOR, 101088469）からの資金提供を受けた。しかしながら、表明された見解および意見は、あくまでも著者個人のものであり、必ずしも欧州連合（EU）または欧州研究会議（ERC）の見解を反映するものではない。欧州連合および助成機関は、それらに責任を負うことはできない。
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