アッカーマンシア・ムシニフィラは、食物乳化剤が微生物叢と宿主の代謝に及ぼす悪影響を抑制する

2023年4月14日 09:55

腸内細菌叢（ちょうないさいきんそう
オリジナル研究
アッカーマンシア・ムシニフィラは、食物乳化剤が微生物叢と宿主の代謝に及ぼす悪影響を抑制する

https://gut.bmj.com/content/72/5/906

ノエミー・ダニエル1、
http://orcid.org/0000-0002-6338-7578Andrew T Gewirtz2、
http://orcid.org/0000-0002-4285-769XBenoit Chassaing1
Dr Benoit Chassaing, Team "Mucosal microbiota in chronic inflammatory diseases", INSERM U1016, CNRS UMR 8104, Université Paris Cité, Paris, France; benoit.chassaing@inserm.fr 宛にご連絡ください。
要旨
背景乳化剤であるカルボキシメチルセルロース（CMC）やポリソルベート80（P80）を含む一部の非吸収性食品添加物は、腸内細菌叢に悪影響を与え、細菌叢の侵食、慢性低級腸炎、ひいては代謝異常の促進につながるという証拠が蓄積されています。乳化剤の摂取による腸内細菌叢への悪影響には、健康に関連する粘液強化細菌であるAkkermansia muciniphilaの枯渇が含まれます。
目的乳化剤の有害な影響から保護する手段として、外因性A. muciniphilaの投与の可能性をマウスで調査する。
結果 A. muciniphilaを毎日経口投与することで、CMCおよびP80の摂取による過食、体重増加、血糖値異常などの表現型が抑制された。また、A. muciniphilaの投与は、低グレードの腸内炎症が誘発するCMCとP80を打ち消すことができた。さらに、A. muciniphilaの補給は、低悪性度慢性炎症と代謝異常を引き起こすと考えられている腸内細菌叢へのCMCとP80の近接影響を防止した。具体的には、A. muciniphilaは、CMCとP80によって誘発される腸内細菌叢の種構成の変化と侵入を防いだのです。さらに、CMCとP80が大腸のトランスクリプトームを変化させたのに対し、A. muciniphilaがこれらの変化をほぼ防いだことも報告されたのは注目に値する。
結論 A. muciniphilaの日常的な投与は、乳化剤が微生物叢と宿主の両方に及ぼす有害な影響から保護します。これらの結果は、プロバイオティクスとしてA. muciniphilaを使用することで、慢性炎症性疾患を促進する可能性のある現代の幅広いストレスの中で、腸と代謝の健康を維持できるという考えを支持するものである。
データ提供について
データは合理的な要求があれば入手可能です。未処理のシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveにアクセッション番号PRJEB57855で寄託されています。
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-326835
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きちじょう
これまでの知見では、一般的に使用されている食事用乳化剤が腸内細菌叢を変化させ、慢性腸炎や代謝異常を促進することが報告されています。
乳化剤が引き起こす有害な結果において、微生物叢の侵食は中心的なステップである。
Akkermansia muciniphilaは、腸のバリアを強化し、代謝異常を防ぐことができる次世代の有益なプロバイオティクスである。
この研究により追加されたもの
A. muciniphilaの摂取により、乳化剤の摂取によって引き起こされる代謝異常が防止される。
A. muciniphilaは、カルボキシメチルセルロースとポリソルベート80によって誘発される腸内細菌叢の種構成の変化と侵入を防止する。
食用乳化剤は大腸のトランスクリプトームを変化させるが、A. muciniphilaはこれらの変化をほぼ防ぐ。
この研究が研究、実践、政策にどのような影響を与えるか
今回の発見は、乳化剤が微生物叢と宿主の両方に及ぼす有害な影響から保護する治療アプローチとして、A. muciniphilaを支持するものです。
A. muciniphilaは、通常、慢性炎症性疾患を促進する現代のストレスの中で、腸と代謝の健康を維持するのに役立つかもしれません。
はじめに
人類は、肥満やインスリン抵抗性を主な特徴とするメタボリックシンドロームと呼ばれる代謝異常の深刻な増加に直面しています。メタボリックシンドロームは、腸内細菌叢の組成の変化と関連しています1。マウスとヒトを用いた糞便微生物移植研究では、このような変化は単に代謝異常を示すだけでなく、むしろ代謝異常を促進すると論じられています2。変化した微生物叢が代謝異常を促進するメカニズムは完全には明らかではないが、微生物叢-上皮間距離と糖代謝異常の程度との逆相関3は、通常無菌に近い内側の粘液層に侵入する微生物叢の重要な役割を示唆しており、おそらくその侵入細菌が低レベルの炎症を促進し、その結果代謝異常が生じることを反映している。
高脂肪・低繊維の「欧米型」食事4や乳化剤と呼ばれる食品添加物5など、さまざまな要因が微生物叢の異常増殖や侵入を誘発する可能性がある。乳化剤は、保存期間を延ばし、有機的特性を改善するために多くの加工食品に配合されており6 7 、超加工食品の消費と慢性炎症性疾患の発症との関連性を示す重要な要因であると考えられています8 9 。乳化剤には、例えばレシチンのように天然の食物成分もあれば、カルボキシメチルセルロース（CMC）やポリソルベート80（P80）などのヒト合成創作物であるものがあります。CMCとP80の摂取は、マウスにおいて腸内細菌叢の組成を変化させ、細菌叢の侵食を誘導する。最近の報告では、CMCはヒトにおいても同様の作用をすることが示唆されている10）。このような微生物叢の異常や侵入は、野生型マウスでは代謝異常として現れる慢性低グレード腸炎に関連し、遺伝的にこの疾患になりやすいマウスでは大腸炎を増強する5。in vitroの微生物叢モデルを用いた研究では、CMCとP80が微生物叢に直接作用する結果、宿主-微生物叢の恒常性を乱すと考えられている11 12。
人間の食物消費の大部分を占める加工食品には、乳化剤をはじめとする添加物が多用されており、これらの添加物を避けることは困難である。そこで、乳化剤の対策として、メタボリックシンドロームにおいて存在量が減少し、さらに、外因的に投与することでメタボリックシンドロームから保護できる細菌Akkermansia muciniphilaに着目した13。14 A. muciniphilaは、粘液産生を刺激することで粘膜バリアを強化し、粘液破壊的な高脂肪食の下で粘液層を厚くし15 16、さらに、Reg3γなどの抗菌ペプチドの産生を誘導することで17。A. muciniphilaの有益な効果は、そのままの菌体、低温殺菌（オートクレーブは不可）したもの、あるいは外膜や分泌タンパク質を用いた場合に観察される15 18-20 から、その有益な特性が、粘液消化を含む代謝活性ではなく、表面・分泌分子と関連していることがうかがえる。A. muciniphilaの試験的な臨床研究では、ヒトにおいて、過体重の被験者における脂肪質量増加の低下やヒップ周径の減少、インスリン感受性の向上、内毒素血症と炎症の減少などの効果が示唆されています21。したがって、本研究の目的は、A. muciniphilaが、乳化剤によるホスト-微生物叢恒常性の障害を防ぐとともに、低級炎症と代謝に影響を及ぼす可能性について調べることにありました。その結果、A. muciniphilaを毎日投与することで、乳化剤による代謝異常やその原因とされる低グレードの腸内炎症からマウスを守ることがわかりました。さらに、A. muciniphilaは乳化剤による微生物叢の構成と局在の変化を防ぎ、大腸のトランスクリプトームの変化からも保護する。このようなA. muciniphilaの能力は、メタボリックシンドロームやその他の慢性炎症性疾患を促進する宿主と微生物叢の相互作用を乱す現代のストレス要因に対抗するための対策として利用されることを支持します。
研究成果
乳化剤の摂取がA. muciniphilaの糞便中の存在量に与える影響について
合成化合物であるCMCやP80を含むいくつかの食用乳化剤は、宿主と微生物叢の相互作用を破壊し、低グレードの腸内炎症や代謝異常を引き起こす可能性があります5 11 15 これらの乳化剤が微生物叢に与える影響には、相対種存在量の多くの変化や有益細菌の枯渇があります5。10 この考えと一致し、乳化剤処理マウスの微生物叢組成を解析したところ、CMCまたはP80の慢性的な摂取により、A. muciniphilaの糞便中の相対存在量が有意に減少した（図1A）。粘液を強化する能力を含む、この細菌の確立されたプロバイオティクス健康可能性16-20を考慮すると、A. muciniphilaの外因性投与による微生物叢の補充は、乳化剤摂取の有害な影響を打ち消すかもしれないという仮説が立てられた。
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図1
Akkermansia muciniphilaの投与により、乳化剤による代謝異常が抑制された。(A) 飲料水、CMC 1.0%またはP80 1.0%に慢性的に曝露したマウスの糞便中のAkkermansia muciniphilaの相対的存在量。(B) 実験デザインの模式図。マウスをCMC（オレンジ）またはp80（紫）を1.0％含む飲料水（青）に9週間曝露し、ビヒクル（滅菌PBS、実線およびバー）またはA. muciniphila（A. 粘液、ハッチング線およびバー）を週5日、経口摂取させた。C）ビークルまたは（D）A. muciniphilaを経口投与したマウスの経時的な体重増加。(E）最終体重、（F）精巣上体脂肪パッド重量、（G）毎日の食物摂取量測定、（H）15時間空腹時血糖値。(I-K）8週目に、マウスを5時間絶食させ、グルコース（体重2g/kg）の腹腔内ボーラスでチャレンジした。I）ビヒクルまたは（J）A. muciniphilaを投与したマウスにおいて、15、30、60、90、120分後に血糖値反応を測定した。(K）グルコース負荷試験から得られた曲線下の面積。データは、平均値±SEMで表される。棒グラフについては、一元配置分散分析に続いてボンフェローニ・ポストホックテストを用いて統計分析を行い、有意差は以下のように記録した： *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 折れ線グラフについては、二元配置分散分析または混合モデル（欠損値の場合）を実行し、その後ボンフェローニ・ポストホックテストを行い、有意差は以下のように記録された： CMC対水、*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; P80対水、#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001. 傾向の正確なp値（0.05≦p<0.10）は、追加の表示のためにグラフに記録されている。ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；P80、ポリソルベート80。
Akkermansia muciniphilaの投与により、乳化剤による代謝異常が抑制された。
C57/Bl6マウスを水、CMC（1%）またはP80（1%）に9週間曝露し、同時にDerrienら13によって単離された#BAA-835（ATCC） A. muciniphila株を用いて、リン酸緩衝液（PBS）-ビークルまたはA. 粘菌で週5日間経口投与（図1B）。培養の純度は、菌の増殖、洗浄、分注（詳細は方法の項を参照）後、16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定により確認した（オンライン補足図S1A）。その後、これらの確認されたA. muciniphilaのアリコートを使用して、2.5×108 CFUで毎日マウスを処理した。このアプローチにより、qPCRアプローチで評価したA. muciniphila糞便相対存在量が、軽度ではあるが、有意に増加した（オンライン補足図 S1B）。
補足資料
[gutjnl-2021-326835supp004.pdf]
既報の通り、P80はコントロール群と比較してマウスの体重増加を引き起こし、CMC処理マウスでも同様の傾向が見られた（図1C）。この体重増加は、A. muciniphilaを投与したマウスでは抑制され、A. muciniphila投与群はすべて、乳化剤を投与していないコントロールマウスと同様の最終体重を示した（図1D、E）。対照的に、A. muciniphilaは水処理動物の体重を変化させなかった（図1D,E、p=0.80）。これは、A. muciniphilaが宿主代謝に直接影響を与えるのではなく、生物多様性障害の状態を改善する可能性と一致する。乳化剤の体重への影響は、図1Fに示すように、一般に脂肪パッド重量への影響と関連していた。さらに、A. muciniphilaの投与は、CMCおよびP80の過食および高血糖の誘発を完全に抑制した（図1G、H）。A. muciniphilaの投与がグルコースホメオスタシスに与える影響をよりよく評価するために、乳化剤曝露8週間後に腹腔内グルコース負荷試験（GTT）を実施しました。図1I,Jに示すように、CMC投与マウスとP80投与マウスはともにグルコース上昇曲線に大きな変化を示したが（図1I）、A. muciniphila投与マウスでは差が認められず（図1J）、CMC投与群とP80投与群はともに水のみ投与群に並んだ。曲線下の面積を測定すると、乳化剤による耐糖能異常がA. muciniphilaの毎日の投与によって完全に防止されることがさらに裏付けられた（図1K）。これらのデータから、A. muciniphilaの投与は、乳化剤による代謝異常の促進をほぼ防ぐのに十分であることが示されました。
A. muciniphilaの投与により、乳化剤による低グレードの腸内炎症が抑制された。
乳化剤が代謝に及ぼす悪影響は、病理組織学的分析、リポカリン-2（Lcn2）などの炎症マーカーの測定、結腸や脾臓の総形態変化で評価できる低級な腸内炎症によって引き起こされると考えられています。したがって、CMCとP80の両方を摂取すると、微妙ではあるが病理組織学的に明らかな結腸の炎症、特に粘膜と粘膜下層に浸潤する炎症細胞の数が増加した（図2A、B、オンライン補足表S1）。炎症の他の指標は、P80が糞便中のLcn2および結腸の重量/長さ比の上昇を、CMCが軽度の脾腫を誘発する点でより多様であった（図2C-G）。A. muciniphila単体では、水処理マウスにおいてこれらのパラメータに有意な影響を与えなかった。しかし、CMCとP80の両方による低グレードの炎症の誘発は、A. muciniphilaの投与によって抑制されたことから、この細菌が乳化剤の悪影響を広く防止することが示唆された。
補足資料
[gutjnl-2021-326835supp001.xlsx]
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図2
Akkermansia muciniphilaの投与により、乳化剤による低グレードの腸内炎症が抑制された。マウスをCMC（オレンジ）またはP80（紫）を1.0％含む飲料水（青）に9週間曝露し、ビヒクル（滅菌PBS、実線バー）またはA. muciniphila（A. muc.、ハッチングバー）を週5日経口摂取させた。(A）H&E染色した大腸切片の（B）病理組織学的スコアの代表画像；スケールバー、100μm。(C）63日目の糞便リポカリン-2（Lcn2）レベル、（D）体重／体長比、（E）結腸長、（F）結腸重量、および（G）脾臓重量。データは平均値±SEMで表した。n=4-5。統計解析は、一元配置分散分析に続いてボンフェローニ・ポストホックテストを用いて行い、有意差は以下のように記録した： *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 傾向の正確なp値（0.05≦p<0.10）は、追加表示のためにグラフに記録されています。ANOVA, 分散分析; CMC, カルボキシメチルセルロース; P80, ポリソルベート80.
A. muciniphilaの投与により、乳化剤による微生物叢組成の変化が抑制された。
乳化剤が腸内細菌叢に与える影響は、腸の炎症とその下流域の結果を促進する上で中心的な役割を担っている。16S配列決定と重み付けされていないUnifrac距離の主座標分析（PCoA）により、投与開始前（0日目、図3A）のマウスのベースライン微生物相は均質であることがわかった。一方、CMCまたはP80を7週間投与すると、投与に基づく微生物叢のクラスタリングが明らかになり（49日目、図3A、B）、CMCおよびP80が微生物叢の構成を著しく変化させることが示されました。この微生物叢組成の明確な変化は、重み付けされていないUnifrac距離の定量化によって確認され、水処理マウスと比較してCMCおよびP80の摂取が微生物叢組成に与える影響が非常に大きいことが示された（図3C,D）。A. muciniphilaを単独で投与した場合も、微生物叢の構成に明確なクラスターが形成され（図3B）、これら2群のマウスを隔てるUnifrac距離が有意に増加した（図3D）が、微生物叢α多様性には影響が見られなかった（図3E）。しかし、A. muciniphila投与中のCMCおよびP80の摂取は、微生物叢の構成にわずかな影響しか与えなかった。具体的には、A. muciniphilaを投与したすべてのグループが、乳化剤の処理に関係なく、強固にクラスター化することが観察された。一方、加重なしUnifrac距離測定では、A. muciniphila非投与時のCMCおよびP80による誘発よりもはるかに少ないわずかなシフトが観察された。このことから、これらの乳化剤摂取により引き起こされたマイクロバイオータ乱れをA. muciniphilaがほぼ完全に防止したことが明らかになった。最後に、A. muciniphilaに基づくクラスタリングが、そのDNAが糞便中に排泄されることのみによるものではないことを確認するため、Verrucomicrobia門に関連するQiime2生成のアンプリコン配列変異（ASV）をすべて除去した後に、重み付けなしのUnifracを計算した（オンラインの補足図S2）。この方法は、上記のクラスタリングに影響を与えず、A. muciniphilaの日齢が、自身の門とは無関係に腸内細菌叢の構成に影響を与えたことを示している。
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図3
Akkermansia muciniphilaの投与は乳化剤による微生物叢組成の変化を抑制する。マウスをCMC（オレンジ）またはP80（紫）を1.0％含む飲料水（青）に9週間曝露し、無菌のビヒクル（無菌PBS、実線バー）またはA. muciniphila（A. muc.、ハッチングバー）を週5日、経口摂取させた。0日目と49日目に採取した糞便から細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定に供した。(A, B)0日目および(B)49日目の16S rRNA遺伝子配列決定により評価された微生物叢の重み付けされていないUnifracマトリックスの主座標分析（PcoA)を示す。各ドットは個々の動物を表し、色分けされている（青、水；オレンジ、CMC；紫、P80、水色、水-A. muciniphila；薄橙、CMC-A. muciniphila；薄紫、P80-A. muciniphila）。(C, D) (C) 0日目および(D) 49日目における異なるグループのマウスを分離するUnifrac距離の重み付け。 (E) 49日目におけるShannon alpha-diversityインデックス。データは平均値±SEMで表される。Unweighted Unifracの測定値についてはn=10-25、Shannon indexについてはn=4-5である。統計解析は、一元配置分散分析に続いてボンフェローニ・ポストホックテストを用いて行い、有意差は以下のように記録した： *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；P80、ポリソルベート80。
次に、MaAsLin2（Microbiome Multivariable Associations with Linear Models）分析を行い、水処理動物とCMC処理動物またはP80処理動物を比較し、乳化剤摂取によってより大きな影響を受ける特徴を特定しました（オンライン補足図S3）。そのうち、Allobaculum属に属するものが2種（オンライン補足図S3A,B）、Clostridiaceae科に属するものが2種（オンライン補足図S3C,D）、S24-7科が10種（オンライン補足図S3E-N）、Rikenellaceae科が2種（オンライン補足図S3O-P）、その他がTuricibacter属、Prebotella属、Odoribacter属、Ruminococcaceae科（オンライン補足図S3Q-T）である。興味深いことに、A. muciniphilaの投与は、これらの分類群のほとんどで、乳化剤の消費に起因する変化を防止したが、わずかな差は、A. muciniphilaを毎日投与した場合のベースライン（水処理）レベルに回復しなかった。例えば、S24-7ファミリーに属する様々なメンバーは、CMCとP80の摂取によって有意に増加した。一方、これらのOTUは、A. muciniphilaを毎日投与する中で、CMCやP80によって変化しなかった（オンライン補足図S3E-I）。さらに、乳化剤を投与したマウスでは、プレボテラに関連する機能が消失していることが確認されたが、A. muciniphilaの投与によりそのような減少が完全に防止された（オンライン補足図S3R）。したがって、これらのデータは、A. muciniphilaが腸内細菌叢の組成に顕著な影響を与え、乳化剤による変化を受けにくい微生物叢にしていることを実証しています。
A.muciniphilaの投与により、乳化剤による腸の異常と微生物叢の侵食が抑制された。
CMCやP80によって誘導されるものを含め、微生物叢の組成の変化は、フラジェリンやLPSといった炎症性アゴニストのレベルに影響を与える可能性があります5。そこで次に、TLR5およびTLR4レポーター細胞を用いて、糞便中のこれらのアゴニストの機能レベルを測定しました。乳化剤がフラジェリン（FliC）とLPSを上昇させる傾向は観察されたが、統計的有意差には至らなかった（オンライン補足図S4A、B）。先行研究22-24を参考に、CMCとP80を摂取した動物の大腸形態学的変化を調べたところ、クリプトあたりの杯細胞数の減少が観察された（図4A、B）。一方、A. muciniphilaを毎日投与した動物は、乳化剤の杯細胞への影響から完全に保護されていた。さらに、乳化剤の摂取だけでは大腸陰窩の解剖学的構造に影響を与えるには十分ではなかったが、A. muciniphilaを投与したマウスは、先に述べたように陰窩の深さが増加した（図4A〜C）。11 25 このような微生物叢の侵入は、様々な自然免疫および適応免疫シグナルの活性化を通じて、乳化剤によって誘発される慢性低グレード腸炎および代謝異常の中心的役割を果たすと仮定されている。そこで、Carnoy固定結腸標本を用いた共焦点イメージングにより、微生物叢が上皮表面から離れる距離を測定し、微生物叢の侵入を検討しました。このアプローチにより、CMCまたはP80の摂取が微生物叢の侵入を誘導するという報告が再現され、平均細菌/上皮は、水処理マウスの13.80μmからCMC処理マウスでは4.75μm（p<0.001）、P80処理マウスでは5.55μm（<0.001）に減少しました（図4D、E）。このような微生物叢の侵食は、FliCおよびLPSに対する循環免疫反応にいかなる影響も与えなかった（オンライン補足図S4C,D）。A.muciniphilaの投与自体は細菌-上皮間距離を変化させなかったが、驚くべきことに、A.muciniphilaの投与は乳化剤による微生物群の侵入を完全に防ぎ、水処理、CMC処理、P80処理群ではそれぞれ14.21μm、13.56μm、12.99μmの距離が認められた（図4DおよびE）。このように、A. muciniphilaは、乳化剤によって誘発される微生物叢の侵入を防ぐことができ、これは腸の炎症の主要な特徴である。
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図4
Akkermansia muciniphilaの投与により、乳化剤による腸の異常と微生物叢の侵食が抑制された。マウスをCMC（オレンジ）またはP80（紫）を1.0％含む飲料水（青）に9週間暴露し、ビヒクル（滅菌PBS、実線バー）またはA. muciniphila（A. muc.、ハッチングバー）を週5日経口摂取させた。大腸は免疫染色と蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を行い、共焦点顕微鏡で微生物叢の局在を解析した。(A, B) 大腸切片をアルシアンブルーで染色し、1動物あたり17-23個のクリプト（大腸切片あたり3-5個）をランダムに選択し、クリプトあたりの杯細胞数（A）およびクリプト深さ（B）を決定した。(C) 5生物学的複製から得られた代表写真、アルシアンブルー染色。スケールバー：100 µm。(D) マウス1匹につき5つの高倍率フィールドで、条件ごとに最も近い細菌と腸管上皮細胞（IEC）の距離。 (E) 5生物学的複製から得られた代表写真、微生物叢と粘液の染色、n=4-5。MUC2（緑）、アクチン（紫）、細菌（赤）、DNA（青）。スケールバー、50 µm。統計解析は、一元配置分散分析の後にボンフェローニ・ポストホックテストを用いて行い、有意差は以下のように記録した： **p<0.01, ***p<0.001. ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；P80、ポリソルベート80.
A. muciniphilaの投与により、乳化剤による大腸トランスクリプトームの変化が抑制された。
次に、乳化剤による微生物叢組成の変化をA. muciniphilaが改善することで、腸内遺伝子発現にどの程度影響を与えるかを検討した。乳化剤の摂取が大腸の遺伝子発現に与える影響と、A. muciniphilaの補給が果たす潜在的な調節機能を明らかにするために、アンターゲットRNA-seq解析を実施した。RNA-seqデータセット全体を用いたBray Curtis距離のPCoAによって明らかになったように、CMCとP80の摂取はともに大腸トランスクリプトームに有意な影響を与え（図5A、Permanova p=0.048）、CMCとP80はそれぞれ351と478の遺伝子発現を有意に変化させていた（図5B，C、Cuffdiff cut-off q-value<0.05 ）ことが確認されました。さらに、A. muciniphilaの投与は、乳化剤によるトランスクリプトームの変化を完全に止めることはできないが、劇的に減少させた（図5Dおよびオンライン補足図S5）（Permanova p=0.430）（図5E）。発現差のある遺伝子（DEG）の詳細な解析により、CMCとP80は、CMCで202遺伝子、P80で329遺伝子、および両方の乳化剤で149遺伝子の、共有および化合物固有の変化を誘導することが明らかになった（図5B、オンライン補足図5B、C、オンライン補足表S2およびS3）。興味深いことに、研究した変数の数と影響を受けた遺伝子の割合から、CMCとP80が独立したメカニズムで結腸の遺伝子発現に影響を与えるなら、149の代わりに8つの共通遺伝子しか観察されないはずであり、これら2つの化合物が粘膜炎症に関連しそうな共通の変化を引き起こすことを裏付けています。このことは、これらの遺伝子に着目したBray Curtis距離のPCoAによってさらに支持され、PC1に沿って水処理群と乳化剤処理群の間で強い差分クラスタリングを示し、PC2に沿ってCMC群とP80群の間ではそれほどでもなかった（オンライン補足図S5F、Permanova p=0.006）。さらに、A. muciniphilaの補充は、オンライン補足図S5G（Permanova p=0.150）で示したように、このクラスタリングを完全に防止し、A. muciniphila投与がCMC誘導およびP80誘導の両方のトランスクリプトーム変化に対抗できることを示していた。
補足資料
[gutjnl-2021-326835supp002.xlsx]
補足資料
[gutjnl-2021-326835supp003.xlsx]
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図5
Akkermansia muciniphilaの投与により、乳化剤による大腸のトランスクリプトームの変化が抑制された。マウスをCMCまたはP80を1.0%含む飲料水に9週間曝露し、滅菌PBSまたはA. muciniphila(A.)を週5日、経口投与した。大腸RNAを抽出し、NextSeqシークエンスに供した。(A）大腸トランスクリプトーム（全遺伝子を含む）のブレイ・カーティス距離マトリックスの主座標分析（PCoA）で、ドットを処理別に色分けした（水＝青；CMC＝オレンジ；P80＝紫）。また、様々なグループからサンプルを分離したブレイカーチス距離も表示されています。(B) CMC（オレンジ）および/またはP80（紫）により発現が有意に変化した遺伝子の数を示すベン図。(C) 大腸トランスクリプトーム（全遺伝子を含む）のBray-Curtis距離行列のPCoAを、処理別にドットで着色したもの（水-A. muciniphila＝水色、CMC-A. muciniphila＝薄橙、P80-A. muciniphila＝薄紫）。また、様々なグループからサンプルを分離するBray-Curtis距離も表示されている。(D) A. muciniphila処理群において、CMC（オレンジ）および／またはP80（紫）により発現が有意に変化した遺伝子の数を示すベン図である。(E) CMC対水、P80対水の比較で変化したパスウェイ/機能を表すヒートマップ。PERMANOVAによるp値は、各PCoAの下部に表示されている。CMC、カルボキシメチルセルロース、P80、ポリソルベート80。
機能レベルでは、乳化剤に反応して変化したDEGは、炎症（マクロファージマーカー、抗原処理および提示、インターロイキン-7およびインターロイキン-27シグナル伝達経路、サイトカイン刺激に対する応答の制御）および代謝（不飽和脂肪酸代謝プロセス、脂質代謝プロセス分泌の制御）プロセスを含む機能の配列からなる（図5Cおよびオンライン補足図S6）。A.muciniphilaを毎日投与すると、これらの遺伝子やプロセスの発現量が基礎レベルに回復することが、オンライン補足図S6、S7で示されたように、この細菌が、通常、慢性腸炎や代謝異常と関連する状況で健康な粘膜環境を促進するという考えをさらに支持するものである。
考察
微生物叢異常の特徴として、有益な細菌の枯渇を伴う種構成の変化や、通常は無菌に近い内側の粘液層への細菌の侵入が増加することで定義される微生物叢の侵入があります3 。5 このような侵入微生物群は、腸の炎症を促進する上で非常に大きな役割を果たすと考えられています3 5。微生物相の異常や侵入の根本的な原因は多岐にわたると思われますが、慢性炎症性疾患の発生率の増加は、環境（すなわち、非遺伝的）決定要因の大きな役割を支持しています30。例えば、乳化剤の摂取は、微生物叢の組成の変化と侵入を引き起こし、その結果、低悪性度炎症とメタボリックシンドロームを引き起こすことが、我々や他の研究者によって示されている5。33-36 我々は、乳化剤によって内因性のA.muciniphilaが枯渇する一方で、外因性のA.muciniphilaを投与すると、乳化剤が微生物叢と宿主に与える影響を完全に防ぐことができることを確認した。特に、CMCとP80が微生物叢の構成、微生物叢の局在、大腸の遺伝子発現、炎症指標、代謝に与える顕著な影響は、A. muciniphila投与マウスでは皆無であることがわかった。したがって、A. muciniphilaの投与は、乳化剤の摂取による有害な結果を回避するための一つの手段となり得る。
この細菌は2004年にDerrienらによって初めて単離され13、その後、マウスとヒトに存在し、前臨床試験と臨床試験の両方で代謝異常の予防に役立つことが確認されて注目されています16。 -A. muciniphilaがこれらの疾患に効果を発揮するメカニズムは、まだ完全に解明されていませんが、この粘液を愛する細菌が、粘液を消化する能力によって、粘液産生を刺激する可能性があり、また、最も考えられるのは、表面および/または分泌分子によって宿主の防御と粘液分泌をアップレギュレートし、粘液回転を速め、それを強化できるかもしれないことです 17。37 A. muciniphilaが乳化剤から腸を保護するメカニズムはまだ解明されていないが、膜結合型Amuc_100、17 38分泌型P9、19膜結合型リン脂質ジアシルホスファチジルエタノールアミン、39およびADPヘプトース様分子（最近A. muciniphilaがNF-kBシグナル経路を調節する能力で放出すると同定）が関係しているかもしれない40。さらに、A. muciniphilaと宿主との相互作用には、TLR2シグナル伝達経路17 39やIL10およびIL22サイトカインの調節が関与していることを示唆する証拠が蓄積されています。
本研究は、乳化剤がin vitroのヒト微生物叢に直接影響を与えるという過去の報告11 12とともに、A. muciniphilaは微生物叢の構成に直接影響を与えることなく、乳化剤による微生物叢の侵入と炎症および代謝への影響を防ぐことができるという仮説に至ったものである。しかし、A. muciniphilaは、意外にも乳化剤による微生物叢の組成の変化を防ぐことができるようです。したがって、今回の結果について考えられるのは、A. muciniphilaの主な作用機序は、乳化剤による大腸杯細胞の減少を抑制することから示唆されるように、粘液バリアの強化にあり、in vivoでは、微生物叢組成の変化は、in vitro研究で示唆されていた乳化剤と微生物叢の直接的相互作用を反映しているというよりも、侵食による炎症の結果であるということである。しかし、この可能性を否定するために、我々はA. muciniphilaに応答して、それ自体または乳化剤の存在下で粘液の遺伝子発現に変化を観察しなかった。そこで、我々は、A. muciniphilaの作用メカニズムについて、別の、あるいは追加の可能性を提案する。具体的には、A. muciniphilaが微生物叢に直接作用し、その組成を乳化剤の擾乱に対して抵抗性のあるものに変化させる可能性があると考えるのである。しかし、A. muciniphilaがどのようにして乳化剤から微生物相を保護するのか、さらなる研究が必要である。私たちは、粘液の分泌と機能の動態を研究するために、生体外の大腸摘出物を使用することを想定している44。この研究は、A. muciniphilaの補給中に微生物叢の組成が変化することを長期的に調査するとともに、粘液と微生物叢の関係に対するこのプロバイオティックの影響を明らかにするものである。さらに、他の常在菌の影響を分析することで、A. muciniphilaが介在する保護の特異性を調べることも重要である。これには、Bifidobacterium、Prevotella、Faecalibacteriumなど、乳化剤への曝露によって有害な影響を受ける他の微生物叢メンバー5 10や、Bacteroides thetaiotaomicronなど、粘液層の恒常性を調節する能力を持つ細菌が含まれます45。これらの研究を総合すると、A. muciniphilaが食事性乳化剤の消費からどのように保護するかについてのメカニズムが理解できると予想されます。
本研究では、主にA. muciniphilaに焦点を当てましたが、その作用を研究する過程で、RNA-seq解析により乳化剤による微生物叢の侵入が大腸トランスクリプトームに与える影響について初めて非標的研究を実施しました。このアプローチにより、両乳化剤によって誘発される宿主の深い反応が明らかになりました。制御された遺伝子の22%はCMC処理マウスとP80処理マウスで共通していましたが、78%は一方の化合物にのみ特異的でした。これは、これら2つの乳化剤が宿主と微生物叢の境界において共通および特異的メカニズムで作用するという、これまでの観察を裏付けるものでした。乳化剤によって誘発される腸の炎症について、さらに詳細な特徴を調べる必要がある。例えば、フローサイトメトリーによる免疫細胞の表現型解析や、シングルセルRNAシーケンサーによる乳化剤摂取による細胞レベルのトランスクリプトームへの影響を調べることで、乳化剤摂取に対する宿主反応や、この文脈におけるA. muciniphila投与の影響について、より深く理解することができるはずです。
乳化剤による代謝異常は、ディスバイオシスを改善する可能性のある扱いやすいモデルであるが、このモデルにおけるA. muciniphilaによる保護は、他の炎症の引き金にも広く適用できる可能性がある。実際、CMCとP80はWTマウスで代謝異常を促進する一方で、遺伝的にこれらの疾患に罹患しやすいマウスでは大腸炎と癌の発生率と重症度を増加させる5。さらに、CMCやP80に暴露された場合、A. muciniphilaによって同様の保護がもたらされたことが報告されましたが、これらはいずれも非メタボリズムであり46 47、異なるメカニズムで腸内細菌叢に作用することから11、観察された保護は化合物に依存しないことを示唆します。しかし、A. muciniphilaのサプリメントが、微生物叢の構成と炎症誘発の可能性に著しい悪影響を与えることが判明したカラギーナン乳化剤などの他の添加物から保護する能力を調査する必要があります12。同様に、より安定した微生物叢と、より迅速に更新する粘液層が、微生物叢の異常、ひいては炎症を誘発するような現代の様々なストレス因子から保護すると予想されます。この見解は、カニの研究室と共同研究者による、生きたムチニフィラや低温殺菌したムチニフィラが、マウスだけでなく、被験者のメタボリックシンドロームがさまざまな多因子性根本原因から生じたと推定される小規模臨床試験においても代謝パラメータを改善することを立証した結果と一致する16。 -つまり、複数の乳化剤を含むことが多い超加工食品の消費との関連性が認識されつつあることから、そのような食品の消費者はA. muciniphilaのサプリメントから恩恵を受ける可能性が特に高いと推測されます。このような食品を保護するための実用的な戦略を設計するには、根本的なメカニズムの理解を深める必要があるが、最終的には、これらの食品のマイナス面を軽減する手段となることが証明されるかもしれない。
材料と方法
材料
ナトリウムCMC（平均MW〜250 000）およびP80は、シグマ（Sigma, St.Louis, MO）から購入した。Derrienら13によって以前に単離されたA. muciniphilaは、ATCCから購入した（参照番号BAA-835）。ATCCの推奨に従い、A. muciniphilaをBrain Heart Infusion brothで37℃、72時間、厳密な嫌気条件下で培養した。その後、4500gで15分間の遠心分離により細菌をペレット化し、滅菌PBSで2回洗浄し、6.32×108個/mL（連続希釈とBrain Heart Infusion寒天プレートへのプラッティングにより決定）で分注し、-80℃にて保存した。得られたアリコートの純度は、細菌DNA抽出および16S rRNA遺伝子配列決定によって決定され、A. muciniphila懸濁液に環境汚染がないことを明らかにした（オンライン補足図S1A）。
マウス
5-6週齢の野生型C57BL/6雄性マウスをThe Jackson Laboratoryから購入した（文献番号000664）。マウスは、ジョージア州立大学において、機関承認のプロトコル（Institutional Animal Care and Use Committee No A18006）のもと、ランダムにグループ分けして収容し（1ケージあたりn=5）、LabDiet rodent chow diet #5001 ad libitumと逆浸透処理したアトランタ市水ad libitumで飼育した。水（対照群、N=10）、CMC（N=10）またはP80（N=10）を飲料水で希釈した溶液（それぞれ1.0% w/vおよびv/v）を9週間、1週間ごとに溶液を交換しながらマウスに投与した。各群について、半数のマウス（N=5）を400μLの滅菌PBS（ビヒクル）で週5日、半数のマウス（N=5）を2.528×108コロニー形成単位のA. muciniphilaを含む400μLのPBSで週5日処理した。体重は1週間ごとに測定した。食物摂取量は、同じ週に2回、マウスのグループを清潔なケージに入れ、既知の量の食物を入れて24時間置き、その時点で残りの食物を重量測定した。食物摂取量は、24時間あたりマウス1匹あたりのグラム数で表した。0日目、49日目、63日目に新鮮な糞便を採取し、下流域の分析に使用した。投与9週間後（63日目）、マウスを安楽死させ、片側の副睾丸脂肪パッド重量、脾臓重量、結腸重量および結腸長を測定した。以下に詳述するように、下流の解析のために組織を収集した。詳細な実験デザインは、図1Bに表されている。
空腹時血糖値測定
5週間の投与後、マウスを清潔なケージに入れ、15時間絶食させた。その後、Nova Max Plus Glucose Metreを用いて血中グルコース濃度を測定し、mg/dLで表示した。
経口GTT
投与8週後、マウスを15時間絶食させ、GTTを実施した。グルコースのボーラス（2g/kg体重）を腹腔内に投与し、グルコースチャレンジ前と15、30、60、90、120分後の血糖値をNova Max plus Glucose metreを用いて記録しました。
ELISAによる糞便中リポカリン-2（Lcn-2）の定量化
ELISAによる糞便中Lcn-2の定量には、凍結した糞便サンプルを0.1% Tween 20を含むPBSで最終濃度100 mg/mLに再構成し、20分間ボルテックスして均質な糞便懸濁液を得た48。透明な上清を回収し、分析まで-20℃で保存した。Lcn-2 レベルは、比色ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジンを用いた Duoset murine Lcn-2 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) を用いて上清中に推定し、光学密度は 450 nm で読んだ (Versamax microplate reader).
illumina technologyを用いた16S rRNA遺伝子配列決定による微生物叢の解析
微生物叢の分析は、食餌性乳化剤曝露前（0日目）および曝露後（49日目）に実施した。図1Aに示したA. muciniphilaの相対存在量は、16週間の食事性乳化剤暴露後に、以前のプロトコルで測定したものである。16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定は、Earth Microbiome Projectのプロトコルに従い、MOBIO PowerSoil DNA Isolation KitのDNA抽出手順（https://press.igsb.anl.gov/earthmicrobiome）に修正を加えてIllumina MiSeqテクノロジーを用いて行った。50バルクDNAは、Mobio Laboratories（米国カリフォルニア州カールズバッド）のPowerSoil-htpキットで凍結糞便から機械的破壊（ビーズビート）しながら抽出した。16S rRNA遺伝子、領域V4は、複合フォワードプライマーと、Golayエラー訂正スキームを用いて設計された固有の12塩基バーコードを含むリバースプライマーを用いて、それぞれのサンプルからPCR増幅し、PCR産物にタグ付けした50）。フォワードプライマー515F 5'- AATGATACGGCACCGAGATCTACGCTXXXXXXXXXTATGTAATTGT GTGYCAGCMGCCGCGTAA-3' を使用しました：斜体配列は5'イルミナアダプター、12 X配列はゴレイバーコード、太字配列はプライマーパッド、斜体および太字配列はプライマーリンカー、下線配列は保存細菌プライマー515Fである。使用したリバースプライマー806Rは、5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCAGCCAGCC GGACTACNVGGTWTCTAAT-3'：斜体配列はイルミナアドプターの3'逆相補配列、太字配列はプライマーパッド、斜体および太字配列はプライマーリンカー、アンダーライン配列は保存済みバクテリアプライマー806Rである。PCR反応は、Hot Master PCR mix (Quantabio, Beverly, Massachusetts, USA)、各プライマー0.2 mM、10-100 ng templateからなり、反応条件はBiorad thermocyclerで95℃で3分、その後95℃で45秒、50℃で60秒、72℃で90秒の30サイクルとした。PCR産物をAmpure magnetic purification beads (Agencourt, Brea, California, USA)で精製し、ゲル電気泳動で可視化した。産物は、Quant-iT PicoGreen dsDNAアッセイを用いて定量した（BIOTEK Fluorescence Spectrophotometer)。精製した生成物から等モル比のマスターDNAプールを作成した。プールした生成物をQuant-iT PicoGreen dsDNAアッセイを用いて定量し、Cornell University, IthacaのIllumina MiSeqシーケンサー（ペアエンドリード、2×250 bp）を用いて配列決定した。
16S rRNA遺伝子配列解析
16S rRNA配列は、QIIME2-version 2019を使用して分析した51。イルミナアンプリコン配列データを検出して補正するために、QIIME2のデフォルトパラメータを使用してDada2法52で配列の多重化を解除して品質フィルターをかけ、Qiime2アーテファクトのテーブルを作成した。次に、系統多様性解析のために、align-to-tree- mafft-fasttreeコマンドを用いて木を生成し、core-metrics-phylogeneticコマンドを用いてアルファおよびベータ多様性解析を計算した。実験グループ間のばらつき（β多様性）を評価するためにPCoAプロットを用いた。分類学分析のために、特徴はGreengenes参照データベース13_8とのペアワイズ同一性の99%閾値で運用分類単位（OTU）に割り当てられた。53 未処理のシーケンスデータは、BIG Data Centre, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, accession number XXXXXでゲノムシーケンスアーカイブ（GSA）に寄託されており、一般には http://bigd.big.ac.cn/gsa でアクセスできる。
定量的PCR解析
QIAamp Fast DNA Stool Mini kit（Qiagen社製）を用いて、連続希釈したA. muciniphila株から製造者の指示に従い細菌性DNAを抽出した。その後、LigthCycler 480装置（Roche Molecular Systems）を用いて、連続希釈したA. muciniphilaストックからのDNA、および28日目に採取した糞便サンプルから抽出したDNAに対して定量PCRを実施した。QuantiFast SYBR Green PCR kit（Qiagen）を用い、A. muciniphila特異的プライマーとして、フォワード A. muciniphila, CAGCACGTGAAGGTGGGGAC、リバース A. muciniphila, CCTTGCGTTGCTTCAGATを用いた。16結果は、A. muciniphilaストックを連続希釈して得た標準曲線に基づいて、A. muciniphila /mg糞便で表した。
大腸組織の染色と病理組織学的解析
マウス近位結腸をメタノール-カルノイの固定液（60%メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸）に室温で3時間以上入れ、4℃で保存した。その後、組織をメタノール2×30分、絶対エタノール2×15分、エタノール／キシレン（1：1）15分、キシレン2×15分で洗浄し、パラフィンに縦向きに包埋した。その後、組織を4μmの厚さで切開した。組織学的スコアのために、標準的なプロトコルを用いてスライドをH&Eで染色した。画像は、Hist'IMプラットフォーム（INSERM U1016、パリ、フランス）でLamina Slide Scanner（Perkin Elmer）を使用して取得しました。組織学的スコアリング（0～36）は、既報の通り、各大腸について盲検で決定した。54 簡単に言うと、各大腸は、粘膜、粘膜下層、筋・漿膜における上皮障害と炎症浸潤の程度に基づいて 4 つのスコアを割り当てられた。4 つのスコアそれぞれに、変化が局所の場合は係数 1、斑状の場合は 2、拡散性の場合は 3 を掛け、大腸ごとに 4 つのスコアを追加した48。
大腸切片（4 µm）をAlcian Blueで染色し、ムコ多糖類を優先的に染色し、1頭あたり17-23個の陰窩（大腸切片あたり3-5個）をランダムに選択して陰窩あたりの杯細胞数および陰窩深さを測定した。
統計解析
データは平均値±SEMで表され、統計解析はGraphPad Prismソフトウェア（V.8）を用いて行われた。有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）を用いて決定し、棒グラフについてはボンフェローニ・ポストホックテストを行い、以下のように記した： *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 折れ線グラフの形で異なるタイムポイントで収集したデータについては、二元配置反復測定ANOVAまたは混合効果モデル（欠損値の場合）、Bonferroni post hoc testを実施し、有意性を以下のように記した： CMC vs 水, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; P80 vs 水, #p <0.05, ##p<0.01, ###p<0.001. 結果はp<0.05で有意とみなした。微生物叢データの統計解析のため、Microbiome Multivariable Associations with Linear Models (MaAsLin 2)を用いて、最も有意に差のある20の特徴を特定した。21 Volcanoプロットの閾値はq<0.05とした。
補足方法についてはオンライン補足資料を参照されたい。
補足資料
[gutjnl-2021-326835supp005.pdf]
データの利用可能性に関する声明
データは合理的な要求があれば入手可能です。未処理のシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveにアクセッション番号PRJEB57855で寄託されています。
倫理に関する声明
掲載に関する患者さんの同意
該当なし
謝辞
Hist'IM および Genom'IC プラットフォーム（INSERM U1016, Paris, France）の協力に感謝する。また、Emilie Viennois博士とOmry Koren博士には、原稿の批判的なレビューや有益な議論をしていただきました。
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補足資料
補足データ
このウェブ専用ファイルは、著者から提供された電子ファイルからBMJ Publishing Groupが作成したもので、内容の編集は行われていません。
データ補足1
データ補足2
データ補足3
データ補足4
データ補足5
フットノーツ
ツイッター @NoemieDaniel2、@BenoitChassaing
貢献者 ND、ATG、BCは、本試験の構想および設計に貢献した。NDとBCは、実験の実施と分析を行った。NDとBCは、統計解析を行った。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。BCはこの研究の保証人である。
資金提供この研究は、欧州連合のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムの下、欧州研究会議（ERC）からのスターティンググラント（助成契約No. ERC-2018-StG- 804135）、IdEx Université de Paris - ANR-18-IDEX-0001 の Chaire d'Excellence、Kenneth Rainin Foundation の Innovator Award、Fondation de l'avenir (AP-RM-21-032) の賞、ANR grant EMULBIONT (ANR-21-CE15-0042-01) と DREAM (ANR-20-PAMR-0002) および INSERM の National program 'Microbiote' の助成金を得た。研究計画、データ収集、分析、解釈、原稿執筆において、資金提供者は何ら関与していない。
競合利益なし。
患者および一般市民の参加この研究の設計、実施、報告、普及計画には、患者および一般市民は関与していない。
Provenance and peer review 委託されたものではなく、外部からの査読を受けたものである。
©著者（またはその雇用主）2023年。CC BYのもとで再利用が許可されている。BMJ が発行した。
補足資料本コンテンツは著者から提供されたものである。BMJ Publishing Group Limited（BMJ）による審査を受けておらず、査読を受けていない可能性があります。議論されている意見や推奨事項は、あくまでも著者のものであり、BMJが承認したものではない。BMJは、本コンテンツに依拠することから生じるすべての責任および義務を否認します。コンテンツに翻訳物が含まれる場合、BMJはその翻訳物（現地規制、臨床ガイドライン、用語、医薬品名、医薬品用量を含むがこれに限定されない）の正確性および信頼性を保証せず、翻訳および翻案から生じる誤りおよび/または省略、あるいはその他の点について一切責任を負いません。
キーワードは以下の通りです：微生物叢、粘液、乳化剤、代謝、炎症、プロバイオティクス、Akkermansia muciniphila、腸内トランスクリプトーム
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