光学顕微鏡および電子顕微鏡による健常人の血液微生物叢の形態学的評価
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オリジナル研究論文
Front. Cell. Infect. 2023年1月18日
Sec.健康と疾患におけるマイクロバイオーム
第12巻 - 2022年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.1091341
この論文は次の研究テーマの一部です
健康と疾患における血液微生物叢
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光学顕微鏡および電子顕微鏡による健常人の血液微生物叢の形態学的評価
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.1091341/full
Borislava Tsafarova1 Yordan Hodzhev1 Georgi Yordanov2 Vladimir Tolchkov1 Reni Kalfin3,4 Stefan Panaiotov1* 1．
1国立感染症・寄生虫病センター微生物部（ブルガリア、ソフィア
2ソフィア大学化学・薬学部、ソフィア、ブルガリア
3ブルガリア科学アカデミー神経生物学研究所、ブルガリア、ソフィア
4ネオフィット・リルスキー南西大学ヘルスケア学部、ブラゴエフグラド、ブルガリア
はじめに 血液微生物叢はいまだ謎に包まれている。臨床的に健康な人に血液微生物叢が存在することは、過去50年間に証明されている。放射性物質分析による間接的な証拠から、赤血球中に生きた微生物が存在することが示唆された。最近では、標的核酸配列決定により、臨床的に健康な人の血液中に微生物の生物多様性が豊富に存在することが示された。採血したての全血や培養した全血から分離した末梢血単核球（PBMC）における血液微生物叢の形態や増殖周期は不明である。
方法 血液微生物叢のライフサイクルを研究するために、我々は光学顕微鏡および電子顕微鏡による分析に焦点を当てた。健常人の採血したての血液から分離した末梢血単核球と、ビタミンK存在下、43℃でストレス培養した溶解全血から分離した末梢血単核球を調査した。
結果 ここで我々は、PMBC画分中の遊離循環微生物叢は、明瞭な細胞壁を有し、出芽または子孫体の押し出しに類似したメカニズムによって増殖することを証明した。対照的に、ストレス培養した溶解全血微生物叢は、細胞壁欠損微生物叢として、電子密体または電子透明体を形成して増殖した。電子密度体は、分裂により増殖するか、グラム陰性に染色された子孫細胞を連鎖的に産生するか、あるいは肥大・破裂して180〜200 nmサイズの子孫細胞を放出した。一方、電子透過体は、膜を透過して増殖し、子孫細胞を放出した。細胞内細胞」と呼ばれる血液微生物叢の新しい増殖メカニズムが観察された。これは、"母 "細胞内で増殖している子孫細胞内での子孫細胞の増殖を組み合わせたものである。
考察： 次世代シークエンシング技術によって血液中に同定された真核および原核微生物叢の豊かな生物多様性と、我々の顕微鏡観察の結果は、全血と培養血液における異なる増殖メカニズムを示唆している。我々の文書化された証拠と結論は、健常人における正常な血液微生物叢の存在について、より包括的な見解を提供するものである。
はじめに
従来、健康な人の血液は無菌であると考えられてきた。血液中の微生物の検出は感染の兆候と解釈されている。様々な慢性疾患や一過性・潜在性感染症に関連した全血中の微生物叢に関する報告は、長年にわたって文献に登場している。とはいえ、血液マイクロバイオームはいまだ謎に包まれており、健常人にも血液マイクロバイオータが存在することを示す証拠は着実に蓄積されつつある。
血液マイクロバイオームという用語は、すべての微生物のゲノムまたはゲノム断片の集まり、すなわちDNAおよび／またはRNAを指し、マイクロバイオータは血液中に見出されるウイルス（Liang and Bushman, 2021; Cebriá-Mendoza et al, 2021）、細菌（Damgaard et al, 2015）および真菌（Panaiotov et al, 2018）を指す。次世代シーケンサー技術は、健康な人の血液中のウイルス、細菌、古細菌、真菌を同定するために使用されてきた（Morgan and Huttenhower, 2012; Paisse et al.） とはいえ、それらの遺伝物質が生存微生物に属するものなのか、死滅微生物に属するものなのか、あるいは微生物無細胞核酸に属するものなのかの区別については議論がある。健康な人の血液中に微生物叢が存在することを裏付ける説得力のある証拠は少ない。(Tedeschiら、1969；DomingueとSchlegel、1977；Kalfin、1997；Damgaardら、2015；Markovaら、2015；Dimovaら、2017；Markova、2017；Panaiotovら、2018；Cebriá-Mendozaら、2021）。数十年にわたり、科学界では健康な人の血液中に正常な微生物叢が存在しうるかどうかが議論されてきた。健康な血液微生物叢は一過性の循環微生物である可能性を示唆する研究者もいる（Gorayaら、2022）。論争となっているのは、血液マイクロバイオームと血液微生物叢の存在の証拠に関するものである。研究者は3つのグループに分かれている。最も新しいグループは、1969年にG. Tedeschiが発表したもので、血液は以前考えられていたほど無菌ではないという仮説を支持している（Tedeschi et al.） 血液微生物叢は、個人の一生を通じて、出生時から休眠、潜伏、または培養不可能な微生物形態として血液中に自然に存在している（Markovaら、2016；Dimovaら、2017）。血液微生物叢の存在仮説を支持する研究者たちは、正常な血液微生物叢は宿主にとって有害ではなく、宿主の血液生態系の中で調和して生きている常在微生物であると考えるべきだと主張している。微生物と宿主の間にこのようなバランスのとれた状態が存在しうるという実験的証拠は、細菌またはウイルス生ワクチンによる集団免疫である。弱毒化された生ワクチンは、実験室で弱毒化された（弱毒化された）細菌やウイルスに由来するもので、注射すると持続し、細胞に感染し、複製するため、全く、あるいはごく軽度の疾病しか引き起こさない。出生時の乳幼児への一次予防接種のための小児用量は、約0,025mgのBCG湿潤重量と0.75-3.0×105生菌単位を含む。BCG接種は、世界中で数十億人の小児に広く適用され、1921年以来実施されている。乳幼児期と思春期にBCGを接種すると、マイコバクテリア抗原の免疫学的記憶が誘導され、接種を受けた個体の大部分で少なくとも14年間は存在し、測定可能である(Weir et al., 2008)。他の著者は、マウスではワクチン接種後少なくとも16ヵ月間、生存可能なBCG菌が持続していたと主張している（Kavehら、2014年）。同時に、BCG接種者の血液培養は陰性である。論理的な疑問は、これらの生きたBCG細胞はどこに消えてしまうのかということである。BCG菌は培養不可能な細胞壁欠損型として宿主内に残存していると考えられる（Markovaら、2015年）。多くのウイルスは、血液中や組織中に溶解型や潜伏型として残存することがある。ウイルスの持続性は生涯維持される可能性がある。ヒトパピローマウイルスの持続感染は、感染を引き起こす能力ではなく、宿主の中でウイルスが長期間持続する能力にある（Della Feraら、2021年）。麻疹ウイルスRNAは、感染性ウイルスよりも4～5倍長く血液、気道、リンパ節に持続し、血液からのMeV RNAのクリアランスは長期化する（Lin et al.） 他の多くの微生物種にとって、これは血液中に寄生する選択肢となりうる。
もう1つの仮説は、血液中に同定された微生物DNAは、細胞を含まない循環DNA（Gosiewski et al., 2017; Kowarsky et al., 2017; Szilagyi et al., 2020; Zozaya-Valdés et al., 2021）、あるいは微生物代謝産物や断片化したDNAやRNAを含む微生物由来の小胞（Chronopoulos and Kalluri, 2020; Ricci et al.） 血液マイクロバイオームという考え方は賛否両論ある。健康な人の血液中に核酸やマイクロバイオータが存在するのは一過性のものであり、主に腸や口腔、皮膚の傷害からの微生物転座に伴う病理学的なものと考えられている（Emery et al.） 第3のグループは、健常人における謎めいた血中微生物叢の存在を否定している（Mitchellら、2016；Martelら、2017；Zozaya-Valdésら、2021；Tanら、2022）。血液微生物叢の確信に満ちた確認は、顕微鏡検査を含む高度な技術を適用することによって現れるだろう。
臨床的に健康な人における血液微生物叢の存在は、過去50年にわたって証明されてきた（Castillo et al.） 健康な動物の血液中の微生物含有量も研究された。健康なニワトリの対照群（Mandal et al., 2016）やネコの血液からは、NGS解析により相当数の細菌種が検出された（Vientos-Plotts et al., 2017）。健康なヒトの血液中に外来微生物が存在することを同定する研究が増えていること、血液微生物叢は必ずしも感染症や疾患状態と一致しないこと（Tedeschi et al., 1969; McLaughlin et al., 2002）という事実に基づき、これらの微生物構造は正常な常在血寄生微生物と想定できると考える。我々の以前の研究では、培養および非培養血液サンプルの16S rDNAおよび内部転写スペーサー（ITS）マーカーの標的配列決定により、血液サンプルの100％において血液微生物叢を同定し、豊富な微生物生物多様性を確認した（Panaiotov et al.） 我々は、健康な人の血液微生物叢を蘇生培養する特定の培地の能力を試験した。その結果、大部分の血液微生物叢が培養可能であることが示され、その増殖サイクルを研究することができた。
臨床検体中の多くの細菌は電子顕微鏡で可視化できるが、そのほとんどは培養できない。我々はすべての細菌を培養することに制限されているが、自然界には培養不可能な細菌は存在しない。それらはすべて増殖し、拡散する。細胞内であれ細胞外であれ、クリプティックな微生物はどこにでも存在する。開示されるには特別で適切な条件が必要である。疾患患者における血液微生物叢の形態について、光学顕微鏡や電子顕微鏡による証拠を報告している研究グループは少ないが（Domingue and Schlegel, 1977; Markova, 2020）、宿主内での生存やライフサイクルのメカニズムについてはまだ明らかではない。健康な個体にも血液微生物叢は存在すると考えられているが、それらがどのように増殖し、宿主によって制御されるかを予測することは困難である。健常人の血液中に生存・増殖可能な微生物構造が存在するかどうかについては、現在も議論が続いている。我々の以前の研究では、ストレス下にある血液中の微生物叢が生存機構を活性化し、増殖し始めることを明らかにした。我々は、高濃度のビタミンKと43℃での培養が血液微生物群の増殖を誘導することを明らかにした。本研究では、採血したての血液および培養した溶解血液から単離した末梢血単核球における血液微生物叢の増殖機構について、光学顕微鏡および電子顕微鏡による観察を行った。ヒト末梢血単核球は免疫系の重要な構成要素であり、体液性免疫と細胞媒介性免疫の両方に関与している。もし血液中に微生物叢が存在するのであれば、末梢血単核球分画から微生物叢を探すのが理に適っている。溶血し、0.22 µm濾過した血液は、クリプト細胞内微生物の研究に適している。
材料と方法
ブルガリア科学アカデミー神経生物学研究所（BAS、ソフィア、ブルガリア）による研究の生命倫理委員会承認（決定38/14.07.2016）および個人の書面による同意を得た。
健常ボランティア
健康なボランティアは、以下の基準に従って選択された：年齢20～60歳、体重50kg以上、妊娠していないこと、重度の疲労、インスリン依存性糖尿病、感染症に罹患していないこと、過去2年間に入院や輸血をしていないこと、過去6ヶ月間に抗生物質や全身性コルチコイドによる内科的治療、歯科治療、外科的介入、ボディピアスをしていないこと。健康な7人は、24歳から58歳の女性3人と男性4人である。
サンプル
臨床的に健康な成人7名から3mlの血液を、抗凝固剤としてヘパリンとK3EDTAを使用したVacutainerチューブに採取した（Vacutainer K3EおよびVacutainer Heparin Tube、BD、USA）。すべてのサンプルは、16S rDNAおよびITS標的次世代シーケンシング（Panaiotov et al.） すべての血液サンプル200μlを、37℃で72時間、サブロー寒天培地と血液寒天培地90mmプレートで培養し、無菌性を検査した。
培養
顕微鏡分析のために、Emil Kalfin (Kalfin, 1997)によって開発された蘇生法を改良し、ストレス培養で血液微生物叢を培養・分離した。血液を3容量の滅菌水で室温で1時間溶解した。溶解していない細胞や膜を除去するため、血液溶解液を0.22 µmのメンブレンフィルター（Sartorius, Gottingen, Germany）でろ過した。溶解し濾過した血液200μlを1.8mlの培地に加えた。培養は滅菌した2mlポリプロピレンチューブで行った。培養基培地は、ブレイン・ハース・インフュージョン（BD, NJ, USA）培地と0.2％イーストレート（BD, NJ, USA）をpH6.8に調整し、滅菌したものである。最終濃度10%の滅菌（D+）スクロースと1 mg/mlの水溶性ビタミ ンK3-メナジオン重亜硫酸ナトリウム（Sigma-Aldrich, USA）を濾過滅菌し、ベース培地に添加した。43℃で蘇生増殖を行った。培養は7時間行い、30分間隔で14本のチューブを回収した。アリコートを光顕および電子顕微鏡実験用に取り置いた。TEM用に、アリコートを1:1(v/v)の4%グルタルアルデヒドを加えて固定した。
光学顕微鏡
顕微鏡スライドを2％塩酸アルコール（95％エタノール100mlと濃縮37％塩酸2ml）に2時間浸し、滅菌蒸留水で十分にすすいだ。PMBCおよび培養溶血の顕微鏡スライドをグラム染色し、1000倍の倍率で浸漬観察した。
暗視野顕微鏡観察
暗視野顕微鏡による観察は、光学顕微鏡Amplival（Carl Zeiss, Jena, Germany）の液浸暗視野コンデンサー（Pancratic）を用い、写真管アダプターと24MPカメラ（Canon 800D, Canon Inc.） エタノールで洗浄した厚さ1.0 mmのスライドグラスと厚さ0.17 mmのカバーグラスを使用した。10μlの培養または非培養血液試料を顕微鏡スライドに塗布し、カバーガラスで覆った。
走査型電子顕微鏡
走査型電子顕微鏡（SEM）は、SEM LYRA I XMU（Tescan Ltd.、チェコ共和国）を用いて行った。溶解した血液培養サンプルを、リン酸緩衝液（PBS）2.5％グルタルアルデヒド（メルク社、ドイツ）中で室温で1時間固定した。10マイクロリットルを顕微鏡用スライドグラスに置き、乾燥させた後、濃度を上げた50％、70％、85％、95％、100％エタノール中でそれぞれ5分間脱水した。これらの試料は非導電性であり、電子ビームから静電荷を集める可能性があるため（その結果、画像のアーチファクトが生じる）、導電性にするために炭素でコーティングし、電荷の蓄積を防ぐために電気的に接地した。材料のコーティングは、Quorum K450X カーボンスパッタリング装置（Quorum Ltd., UK）を用いて行った。SEM観察は、加速電圧10 kVで二次電子（SE）の検出により行った。二次電子は、電子ビームとの非弾性散乱相互作用によって試料の伝導帯または価電子帯から形成される。これらの電子はエバーハート-ソーンリー検出器で検出され、信号が画像に変換される。試料は10,000倍から120,000倍までのさまざまな倍率で観察された。
透過型電子顕微鏡
TEM観察用の全血試料は、採取後1時間以内に処理した。Vacutainerチューブ（BD、米国）に採取した滅菌ヘパリン化血液をPBS pH 7.4（Thermo Fisher Scientific、米国）で1：3に希釈し、Histopaque-1077（Sigma-Aldrich、米国）の密度勾配で400g、30分間遠心した。末梢血単核球をグラジエントから取り出し、PBSで3回洗浄した後、10％FCS（Sigma-Aldrich, USA）を添加したRPMI1640（Sigma-Aldrich, USA）培地で洗浄し、TEM用に処理した。細胞を3％低ゲル化温度アガロース（Sigma-Aldrich、米国）に再懸濁し、氷上に置いた。固化したアガロースを1 mm3角に切り、2.5%グルタルアルデヒド（Sigma-Aldrich USA）で固定し、1%四酸化オスミウム（Sigma-Aldrich, USA）で後固定し、30, 50, 70, 96%の濃度のエタノールで各10分間、100%エタノールで2×20分間、プロピレンオキシドで2×20分間脱水した。試料をプロピレンオキシド：Durcupan ACM（Sigma-Aldrich, USA）1：1に含浸し、Durcupan ACMに包埋した。重合は60℃のオーブンで18時間行った。試料を20 30 nmに薄切し、高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）JEOL JEM 2100モデルで加速電圧200 kVで観察した。
培養血液サンプルのTEM分析には、以下の方法を適用した： 血液サンプルは、血液微生物叢用の蘇生培地で培養した。培養は7時間行い、30分間隔で14本のチューブを採取した。チューブを12.000rpmで5分間遠心分離した。ペレットを0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液pH7.4（シグマアルドリッチ、米国）中4%グルタルアルデヒドで4℃で一晩固定した後、遠心分離した。回収したペレットを3%アガロースと混合した。アガロースキューブを0.1Mカコジル酸緩衝液中、1%四酸化オスミウム（Sigma-Aldrich、USA）で後固定し、30、50、70、95%の濃度のエタノールで各15分間、100%エタノールで2×20分間、プロピレンオキシドで2×20分間脱水した。標本は、2：1のプロピレンオキシド：Durcupan ACM（Sigma-Aldrich、米国）、プロピレンオキシド：Durcupan ACM 1：1、プロピレンオキシド：Durcupan ACM 1：2にそれぞれ30分間含浸し、Durcupan ACMに包埋した。ゼラチンカプセル中での重合は56℃で48時間行った。試料は20-30 nmの切片に超薄切し、酢酸ウラニルで造影し、高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）JEOL JEM 2100モデルで加速電圧200 kVで観察した。
結果
健常人に正常な血液微生物叢が存在するという概念に、光学顕微鏡と電子顕微鏡の技術を用いて挑戦した。観察された細胞型の形態を説明するために、Domingueが提唱した用語（Domingue and Schlegel, 1977; Domingue, 1995）を採用した。"mother "細胞は、子孫細胞の起源となる成熟細胞に相当し、"electron-dense body "は電子密度の高い母細胞に相当する。
採血したての血液の光学顕微鏡検査
採血したての血液または溶解した全血試料から分離した末梢血単核球を入れたスライドをグラム染色し、油浸対物レンズを用い、倍率1000倍の光学顕微鏡で細菌を検査した。分析結果は陰性であった。
透過型電子顕微鏡
TEMは、特定の微生物構造の形態を高解像度で研究するのに適した技術である。TEMは、新鮮採血および培養血液サンプルから分離した末梢血単核球中の血液微生物叢の増殖メカニズムを研究するために適用された。採血後1時間以内に処理された新鮮血液サンプルでは、微生物表面に芽生えた多面からの子孫細胞の押し出しによって増殖する細胞壁の微生物構造が観察された。一次細胞 "または "一次体 "は、約180-200nmの球状に見え、次第に大きくなった。成長した細胞の表面は苔状に見えた（図1A）。細胞壁は明瞭で、明確な内膜（IM）、半透明のペリプラスム腔（PS）、外膜（OM）を区別していた。細胞質は薄い部分と不透明な部分が現れた。薄い構造物は細菌核と思われる。成長した初代細胞は、子孫細胞を生むことができる。肥大した一次細胞の中で、子孫細胞が形成され始める。細胞壁が開き、子孫細胞が押し出される（図1B、D）。細胞壁の開口機構は、細胞表面の膨らみの出現から始まり、次いで球状の開口部が形成され、そこから子孫細胞が「口からの出血」のように押し出される（図1D、黄色のリング）。しばらくの間、子孫細胞は「母小胞」に付着したままである（図1C、E）。子孫細胞は「母細胞」表面のさまざまな場所に押し出されることができた（図1B）。私たちは、子孫細胞の押し出しが起こりうる部位を少なくとも4箇所観察した（図1B）。子孫細胞が連鎖して形成されることもあるが、長い連鎖は観察されなかった（図1C、E）。私たちはまた、「母」細胞が隔壁形成とそれに続く娘細胞への隔壁分裂によって再生する、別の細胞分裂のメカニズムも疑っている（図1C）。このような細胞分裂のメカニズムが明確に確認されたわけではない。出芽による古典的な微生物増殖も観察された（図1F）。
図1
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図1 （A）苔状の細胞壁を持つ一次細胞。バーは50 nm。(B）新しい子孫細胞が噴出する細胞表面の突起（黒矢印）。(C）子孫細胞の接合部（隔壁）。(D）血液微生物叢の超微細構造。黒矢印は、内膜（IM）、中間半透明のペリプラスム空間（PS）、外膜（OM）、子孫細胞の押し出し部位（黄色リング）を示す。(E）「母」細胞に接着している子孫細胞（黒矢印）、押し出しの準備をしている子孫細胞（赤矢印）、「母」細胞内の子孫細胞（黄矢印）。(F）古典的な出芽。
私たちが観察した細胞壁の形態は、細胞質膜（内膜）と外膜という2つの異なる二重膜の間に挟まれた薄いペプチドグリカン層（〜5 nm）からなるグラム陰性細菌に相当する。この苔状の細菌細胞エンベロープはリポ多糖由来である可能性がある。
培養血液サンプルからの結果
溶血および0.22 µm濾過した全血検体を、前述のように培養した。培養初期は薄紅色であった。培養開始から1時間後、培養液は白濁し始めた。100倍の倍率で見ると、グラム染色可能な小さな丸い粒子が現れた。色は薄茶色に変化した。2時間後、顕微鏡視野は単細胞、連鎖、丸い細胞群でいっぱいになった。3時間目には、培養液の色はすでに茶色になっていた。4時間目から7時間目にかけて、培養液は暗褐色になり、目に見える沈殿物が形成された。遠心分離後、顕微鏡視野あたりの細胞数で測定すると、細胞量は増加した。我々の以前の実験（Panaiotov et al., 2018）では、光学顕微鏡で観察されたグラム染色血液微生物群のいくつかの形態学的形態を同定した：i. グラム陽性染色微生物構造の「密体」、ii. グラム陰性被膜に囲まれたグラム陽性染色体、iii. グラム陰性に染色された子孫細胞が連鎖する「密集体」（図2）。密集体」は核分裂によって分裂するか、グラム陰性に染色された「初代」細胞を連鎖的に産生する。光学顕微鏡により、血液微生物叢の急速な増殖が証明された。
図2
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図2 培養血液微生物叢の光学顕微鏡写真。(A）培養4時間後のグラム染色、800倍。スケールバー20μm。(B）培養6時間後のグラム染色、1000倍。(C、D）培養24時間後の培養物、1000倍。スケールバー10 µm。
暗視野顕微鏡法
暗視野顕微鏡法は、固定、染色、乾燥を必要とせず、血液微生物叢の新鮮なサンプルをより高いコントラストで観察するのに適した方法であることが証明された。細胞は暗い背景に白い点として見える。細胞はブラウン運動によって移動する。この技術の単純さを考慮すれば、簡単に適用できる。得られた画像は質が高く、有益であった。すなわち、i. 500 nm以下の大きさの光る点のような非常に小さな細胞で、より高い光強度でブラウン運動によってのみ見ることができるもの、ii. 殻と中央の「コア」を持つ1～2ミクロン程度の大きな球状構造体、iii. 粒状の内部構造と粗いエッジを持つ4～5 µmの細胞である（図3）。私たちが観察した構造体の大きさから、これらがウイルス由来である可能性は除外された。適切な連続撮像装置があれば、生きた細胞の増殖を観察することができる。
図3
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図3 （A、B）ビタミンK添加BHIブロス中、43℃で24時間培養した試験管内溶血の暗視野顕微鏡観察。
培養血液サンプルの走査型電子顕微鏡観察
溶血および 0.22 µm 濾過血液サンプルを 7 時間培養した。培養の最初の1時間後から、分析用に30分間隔でアリコートを取り置いた。サンプルを12.000rpmで遠心分離し、ペレットを走査型電子顕微鏡用に処理した。培養前の最初のサンプルは血液微生物叢陰性であった。ペレットは血液の残骸で構成されていた。次のサンプルは、培養1時間後に取り置いた。SEM分析では、光学顕微鏡およびTEMと相関して、200nmサイズの単一細胞様構造が可視化された（図4A）。細胞塊の急速な増殖が観察された。ペレットは、光学顕微鏡でも観察できる微小な、あるいはグラム染色された粒子／細胞群から構成されており、培養時間と共にその数が増加した（図4B、C）。培養の1時間目から4時間目までは、SEMで分析した調製物はほとんど変化しなかった（図4D, E）。培養5時間30分後には、形態学的に不均一な微生物形態が観察され、サイズの小さな細胞群の中に、粗い表面を持つ大きな球状細胞（>2 nm）が出現した（図4F）。大きな細胞から子孫細胞が鎖状に押し出された。出芽による増殖も観察された。培養7時間後、大きな細胞は単純分裂によって分裂し、あるいは出芽によって増殖した（図4G、H）。暗視野顕微鏡とTEMでも観察されたが、60,000倍に拡大すると、大きな「母」細胞は粗い表面を持つようになった（図4I）。表面の粗さは突起によって特徴付けられ、この突起が連鎖的に、あるいは出芽によって素細胞の子孫を生んでいる。母」細胞は子孫細胞の袋であると考えられる。TEM分析により、このような結論が支持された（図6、7）。
図4
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図4 培養した血液微生物叢のSEM像。血液サンプルを溶解し、0.22 µmフィルターで濾過し、7時間培養した。(A, B)1時間培養血液のSEM分析。(C-E）2-4時間後の培養。(F-H）5-7時間後の培養液。(I) 7時間培養後の大きな「母」細胞のSEM形態。
培養血液サンプルの透過型電子顕微鏡観察
TEM分析による微細構造の研究では、2種類の成熟した "母 "細胞が区別された。その形態は正反対である。黒い斑点として現れる電子密度の高い大きな「母」細胞（図5D, E）と、膜で区切られた電子透過性の「母」細胞（図6A-D）が観察された。一次構造は、180～200 nmの大きさの苔状細胞である（図5A, B）。一連の観察から、電子密度の高い「母」細胞は、出芽や子孫細胞の押し出しによって拡大し、連鎖的に増殖することが示された（図5F）。また、高密度の「母」体が素細胞に分解する様子も観察された。素細胞は急速に増殖し、2 µmを超える巨大な「母」細胞構造体にまで肥大化し、巨大な「母」細胞構造体の破裂後、小さな顆粒として見える多数の新しい素細胞を放出することで増殖サイクルを終了した。図5Cは、まれに観察される、膜のくぼみによる素体の押し出しを示す。
図5
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図5 素体と電子密集体のTEM。(A）苔状の素粒子。(B）大きさ180-200 nmの素粒子。(C）素体の押し出し。(D、E）「母」細胞とも呼ばれる大きな電子密集体。(F）電子密集体の連鎖増殖。
図6
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図6 電子透明体と電子密集体。(A-D）電子透過体。(B）電子透過体の破裂。(C,D）「母細胞」内で成長する素体は、細胞表面のどの部位からでも離脱できる。(E）成長段階にある電子透過体。細胞質は子孫細胞でいっぱいである。(F）電子密集体の破裂。
別の一連の観察により、「母」細胞が拡大し、素細胞に分解することが示された（図6E）。素細胞は急速に増殖し、2 µmを超える巨大な「母」細胞構造体へと成長し、「母」細胞の破裂後に小さな顆粒として見える多数の新しい素細胞を放出することで増殖サイクルを終了した（図6F）。
電子的に透明な「母細胞」の内部では、膜表面に出芽端が観察され、そこから子孫細胞が排出された。その前に、子孫細胞は「母細胞」の膜の内側に付着しているように見えた。出芽によって膜を通過し、周囲の液体培地に放出されると、さらなる増殖が起こり、増殖サイクルを繰り返した。
濾過していない血液のTEM観察では、特別な特徴が見られた。観察された "母 "細胞の大部分は電子的に透明であった。成熟の過程で、「母」細胞は生殖袋に変化する。成長した「母」細胞は子孫細胞で満たされていた（図7）。つのタイプの「母」細胞が観察された：i.膜で区切られただけの「母」細胞（図7A）と、ii.膜が厚い細胞外マトリックスで覆われた細胞（図7B、C）。このマトリックスはペプチドグリカン由来である可能性がある。細胞外膜はグラム陽性菌に似ていた。
図7
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図7 溶解、非濾過、培養血液のTEM像。(A）素細胞で満たされた2µm以上の成熟細胞-黄色の矢印。(B）「母」細胞内で成長する子孫細胞内における子孫細胞の成長（C）膜の外側に厚い莢膜物質が形成されるか、あるいは付着した素細胞。(D）膜で区切られた微生物様構造物（赤矢印）。
もう一つの特別な特徴は、"細胞の中の細胞 "という構造が観察されたことである。"母 "細胞内の膜で区切られた、成長中の透明な子孫細胞である（図7B）。興味深いことに、内側の子孫細胞は、膜の内側に付着した子孫細胞によっても満たされていた。この血液微生物叢増殖の特殊なレアケースは、「母」細胞内で増殖している子孫細胞内での子孫細胞の増殖を組み合わせたものである。すべての構造は共通して成熟し、増殖する。我々の知る限り、これは血液微生物叢ではこれまで報告されていない、新しいマトリョーシカのような微生物増殖メカニズムの一例である。
考察
腎炎（Ponigら、1972年）、リウマチ熱（Carapetisら、2016年）、特発性血尿（Domingueら、1993年）、クローン病（Rathnaiahら、2017年）、マイコバクテリア感染症など、慢性感染症や潜伏感染症の患者において、クリプティック細菌が分離されたり、間接的に確認されたりしている（Domingue and Woody、1997年）。次世代シーケンシングと超微視的研究により、いくつかの非伝染性疾患（Potgieterら、2015年）と健常者（Paisseら、2016年；Panaiotovら、2018年；Castilloら、2019年）において、本物の血液マイクロバイオームが同定されている。
最近まで生命科学の専門家たちは、血液は免疫学的によく管理された無菌環境であり、血液への微生物の侵入は一過性の感染症や伝染病につながると考えていた。この認識は、ヒトや動物の血液中に血液微生物叢や循環微生物代謝産物が存在することを報告する研究により、過去50年間で変化した（Mandal et al., 2016; Vientos-Plotts et al., 2017; Castillo et al., 2019; Goraya et al.） それにもかかわらず、血液マイクロバイオームは未だ謎に包まれており、健康な個体における血液マイクロバイオータの存在を示す証拠は着実に蓄積されつつある。健常人から採取した血液を用いた我々の実験では、採血したての血液から分離した末梢血単核球で観察された微生物の形態を、宿主の侵襲（敗血症）や病理と関連付けることはできなかった。我々は、このような微生物構造は、出生初期から宿主の血液中に自然に存在すると考えている。さらに、健康な人の血液にも微生物叢が存在すると考える。
健康な人の血液中にウイルス、細菌、真菌が存在し、正常な微生物叢として存在していることを示す直接的、間接的な証拠が、宿主の免疫監視に与える影響や、慢性全身性炎症性疾患におけるそれらの役割に光を投げかけている（Potgieter et al, 2015; Cebriá-Mendoza et al, 2021）。細菌が消化管から体内の細胞外間質空間（「組織空間」）や血流などの腸管外部位に移行するメカニズムを説明するモデルでは、以下のような病態が予測される： (a)腸内細菌の過剰増殖を可能にする消化管の生態学的平衡の崩壊、(b)腸管粘膜バリアの透過性の亢進、(c)宿主免疫の欠乏(Schatten et al., 1955; Berg, 1999)。宿主と共生している消化管微生物叢を類推すると、血液中に移行した腸内細菌叢は、宿主とうまく制御されたバランスのとれた共生を形成していることがわかる。共存の論理は微生物抗原性の枯渇と関連しており、宿主にとっての主な利点は免疫系の成熟、調節、維持であると考えられる。これは、生ワクチンを用いた生涯にわたるワクチン接種（BCG Halling-Brown et al.） このような厳格な制御の基礎となるメカニズムはわかっていない。私たちは、微生物の転座は自然な出来事であり、宿主の病理学的変化とは無関係であると考えている。腸管バリア、口腔、皮膚表面を介した微生物転座に伴う、血液中の微生物叢の正常集団の起源は、まだ確認されていない。この意味で、微生物が移動するために腸管上皮バリアが損傷している必要はない。微生物移動のための腸管透過性は、内臓やシステムが外部の微生物世界とコミュニケーションするために必要な自然のプロセスなのかもしれない。血液微生物叢は、微生物叢と皮膚、粘膜、腸などとの共生と同様に宿主と自然共生しており、そのためヒト細胞と共存し、古典的な病理を引き起こさない。
Paisseらは2016年、健康な血液中に多様なマイクロバイオームが存在することを実証した。血中細菌DNAの大部分はバフィーコート細胞血画分（93.74％）に存在し、赤血球には血漿（0.03％）よりも多くの細菌DNA（6.23％）が含まれていた（Paisse et al.） 血液微生物叢と慢性疾患との関連を報告した研究がある（Domingue and Woody, 1997; Potgieter et al., 2015; Visser et al., 2019; Hammad et al., 2020）。血液微生物叢の起源に関する現在の見解は、腸（Gautreauxら、1994年；Berg、1999年）、口腔（Korenら、2011年；Amar and Engelke、2015年；Seringecら、2015年；Emeryら、2021年）または皮膚（Visserら、2019年）を介した微生物転座（atopobiosisとしても知られる事象）と関連している。微生物転座の大部分は、腸-脳軸、心臓-腸軸、腸-肝臓軸など、いわゆる軸を形成する腸を介して起こる。腸間膜リンパ節（Gautreaux et al., 1994）、肝臓（Pinzone et al., 2012）、脾臓、泌尿生殖器系を含む微生物転座に関連した病態が報告されている（Domingue et al, 1993）。かなりの数の研究が、罹患個体で見られる細胞壁欠損微生物構造やL-フォームを可視化している（Fernandes and Panos, 1977; Errington et al.） 最近の研究では、健常人と疾患患者の内臓や組織がそれぞれのマイクロバイオームを持っていることが示された（Salihoglu and Önal-Süzek, 2021）。組織のディスバイオシスとがん、神経変性疾患、炎症性疾患との関連が報告されている（Pisaら、2015；Nejmanら、2020；Pooreら、2020）。乳がん組織には特異的な微生物プロファイルがあることが判明しており（Mengら、2018）、ハンチントン病やアルツハイマー病などの脳疾患は、脳組織の微生物コロニー形成がリスク因子であることを示唆している（Alonsoら、2019）。
健常人における正常な血液微生物叢の存在を確認するため、私たちは採血したての血液から単離した末梢血単核球と、溶解・ろ過した培養血液サンプルについて、光学顕微鏡、暗視野顕微鏡、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡観察を組み合わせた比較分析を行った。これらと我々の以前の結果（Panaiotov et al., 2018; Panaiotov et al., 2021）により、特定のライフサイクルの特徴を示す微生物構造からなる臨床的に健康な人の血液微生物叢の存在が確認された。我々は、採血したての血液から単離した末梢血単核球と培養溶解血液において、血液微生物叢の異なる増殖様式を同定した。液体培地中で培養した血液微生物叢は、ラグ期、対数期、プラトー期、死滅期、休止期といった微生物培養の古典的な増殖動態を示した（データは示さず）。
採血したての血液から分離した末梢血単核球では、内膜と外膜からなる細胞壁を持つ微生物の球状細胞が観察された。血液中の微生物種は、いくつかの増殖メカニズムによって制御されていた。母体」細胞内での子孫細胞の増殖と、「母体」からの子孫細胞の押し出しが、増殖の主な様式であった。出芽も観察された（図1）。子孫細胞の連鎖的な押し出しが疑われたが、確認はされなかった。血液中の常在菌種は、少ない形態で持続していることが予想された。
培養血液サンプルは、細胞壁欠損L型細菌に似た膜で区切られた微生物相を示した。培養における血液微生物叢のライフサイクルは、いくつかの段階を経て判明する。まず、溶解した血液に由来する球状微生物L形細胞が、増殖中の植物性 "母 "細胞の細胞質内で発達した子孫を生み出す。細胞膜は厚い細胞外マトリックスで覆われている（図7A）。成熟の過程で、「母」細胞は生殖袋に変化する。私たちは、電子密度の高い小体（図5Dおよび図6E）と電子透過性の小体（図6C）の2種類の「母」細胞を観察した。子孫細胞は、どの部位でも「母」細胞膜を通過することができた（図6D）。子孫細胞は数を増やし、細胞膜を破裂させた（図6B、F）。密集体」は、細胞質内で成長した後、体膜を離れたり破裂したりする「一次」細胞で構成されていると結論した。透明体と電子密度の高い体の間には遷移状態があるようだ。おそらく血液微生物叢の種によって、透明体や電子密度の高い体を形成する特定の発達形態をとるのであろう。私たちは、バースト後に子孫体を蓄積・放出する半電子密体を観察した（図6E, F）。Domingue (Domingue, 1995; Domingue and Woody, 1997)およびMarkova (Markova, 2017; Markova, 2020)は、慢性感染症および健常人における電子密度の高い小体および細胞質粒子について記述しており、これは血液微生物叢に関する我々の観察結果と類似している。培養中の血液微生物叢は、元の細菌に戻ることのない安定したL-フォームとして挙動する。
我々の結果は、これまでの知見（Kalfin, 1997; Domingue, 1995; Domingue and Woody, 1997; Markova, 2017; Markova, 2020）と相関し、確認するものである。記載された光学顕微鏡および電子顕微鏡による微生物構造および増殖サイクル機構は、細胞壁欠損L形細菌について以前に記載されたものと異ならなかった（Greenら、1974；DomingueおよびSchlegel、1977；Domingue、1995；DomingueおよびWoody、1997；Leaverら、2009；Errington、2017）。古典的な細菌とは対照的に、L-formsは、不規則な二元分裂、出芽、管形成、小胞形成、大きな体からの素体や顆粒の突出-放出、細胞質の細胞内断片化を伴う多重分裂、あるいはすべてのタイプの組み合わせなど、多種多様な珍しい様式で生殖することができる（Prozorovskiï et al.） これらの生殖モデルの一部は、血液中の微生物叢で観察された。
アクリジンオレンジ、DAPI（4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）、ヘキスト33342を用いたDNA染色の標準的な手順を蛍光顕微鏡に適用したところ、培養した血液微生物叢の調製物において高レベルの自家蛍光が観察された。染色結果は陰性で、おそらく細胞透過性に関連した不適切な染色手順によるものであろう。TEMでは、細胞体を覆う厚い殻が観察された（図7C）。他の染色条件についてはテストしていない。血液微生物群のライフサイクルは、主に白血球と赤血球における細胞内増殖を含むと考えられている。Pohlodら(1972)は、フルオロクロム染色により、循環赤血球中に細胞壁欠損微生物が存在することを示した。著者らは採血したての血液を検査し、微生物と思われる構造が赤血球から根生フィラメント状に伸びていることを報告した（Pohlod et al., 1972）。
我々は培養によって、血液中の微生物膜が厚い細胞被膜、カプセル、あるいは殻に覆われていることを発見した（図7C、D）。血液微生物叢からDNAを抽出する信頼性の高い方法を開発するのに多くの実験的試行を要し、培養血液サンプルと非培養血液サンプルの両方で継続的に改良されたことから、厚い被膜が細胞をストレスから保護している可能性が示唆された。細胞被膜のこのような特殊な特徴は、休眠、凝集、遮蔽などの生存メカニズムに関連している可能性があり、免疫中立性、すなわち細胞性および体液性免疫応答性の完全な欠如につながる。
培養条件のわずかな変化が、血液微生物叢の染色能力、形態、サイズ、形状に影響を与えることが観察された。環境条件の変化に伴う同様の変化は、他の著者によっても観察された（Markova, 2020）。我々の結果は、血液微生物叢が増殖するためのメカニズムをほとんど採用せず、自由生活微生物とはまったく異なる形態をとりうることを示唆している。
本研究には、顕微鏡による形態学的解析に関連したいくつかの限界があり、それが所見の解釈に影響を与えた。光学顕微鏡や走査型顕微鏡では、観察された構造物の微生物的起源を正確に特定することはできなかった。我々は細菌が優勢ではないかと考えている。真菌を除外することはできなかったが、真菌の特徴的な部分は観察されなかったか、あるいは暗視野観察などでは確定的ではなかった。我々の研究のもう一つの弱点は、ウイルスを対象にしていないことである。我々は細菌と真菌の観察に重点を置いた。素細胞」の大きさは200nm以下である。これらの "謎めいた "生命微生物叢構造は、0.22μmのフィルター膜孔を通過する。この研究では、微生物叢の細胞壁と膜構造が実証された。血液微生物叢の細胞内ライフサイクルは研究されていない。今後の研究では、微生物群の細胞内での持続性と増殖について研究する予定である。我々の実験的培養では、再培養後に血液中に残存する微生物叢が培養可能な細菌に戻ることはない。このため、彼らの生理を十分に研究する可能性は限られている。
NGS解析によって健康な人の血液中に同定された真核および原核微生物叢の豊かな生物多様性は、新鮮な採血および培養血液から分離された末梢血単核球における増殖の異なるメカニズムについて、より深い解析を必要としている。今後の実験では、赤血球やその他の血液細胞における血液微生物叢の細胞内生存のメカニズムを解明する予定である。
結論
TEM画像から、本来の血液微生物叢の明瞭な細胞構造が示された（図1）。TEMおよび培養の結果から、血液微生物叢は、脂質やヘモグロビン複合体のような血液成分の分解によって生じた残骸ではなく、生存可能な構造体であることが確認された。我々は、採血したての血液や培養した血液から分離した末梢血単核球において、血液微生物叢がさまざまな形態変化を伴う複雑なライフサイクルを送っていることを観察した。Lフォームと同様に、血液微生物群は、不規則な二元分裂、出芽、大きな電子密体からの子孫細胞の突出-脱出、小胞形成、管状化、初発の子孫細胞を伴う袋の拡大、破裂やすべてのタイプの組み合わせなど、さまざまな様式で繁殖することができる。また、「細胞の中の細胞」と呼ばれるマトリョーシカのような新しい増殖現象も観察された（図7B）。我々が文書化した証拠と結論は、健常人における正常な血液微生物叢の存在について、より包括的な見解を提供するものである。今後の研究では、健常人の血液細胞における血液微生物叢増殖の細胞内メカニズムを解明する必要がある。
データの利用可能性に関する声明
本論文の結論を裏付ける生データは、著者らにより、不当な予約なしに入手可能である。
倫理声明
ヒト参加者を含む研究は、ブルガリア科学アカデミー神経生物学研究所（BAS、ソフィア、ブルガリア）の生命倫理委員会承認（決定38/14.07.2016）により審査・承認され、個人の書面による同意を得た。患者/参加者は、本研究への参加について書面によるインフォームド・コンセントを提供した。
著者貢献
SP、GY、RK：構想、調査、監督、原案執筆、準備。BT：データ収集、査読、編集。YHとVT：原稿の校閲と書式設定。SPとRK：資金提供。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。
資金提供
本研究は、国家科学プログラムVIHREN内のブルガリア国家科学基金、契約番号КP-06-DV/10-21.12.2019、およびスマートな成長のための科学・教育運営プログラム2014-2020を通じた欧州地域開発基金、助成金BG05M2OP001-1.002-0001-C04から資金提供を受けた。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈され得る商業的または金銭的関係がない中で実施されたことを宣言する。
発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
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キーワード：血液微生物叢、TEM、SEM、顕微鏡、形態、増殖周期
引用 健康な人の血液中の微生物叢の形態を、光および電子顕微鏡で評価した。Front. Cell. Infect. Microbiol. 12:1091341. doi: 10.3389/fcimb.2022.1091341
受理：2022年11月06日 06 November 2022; Accepted： 受理：2022年12月30日；
発行：2023年1月18日
編集者
メフメト・デミルチ、クルクラレリ大学、トルコ
査読者
Velmurugan Ganesan, KMCH研究財団、インド
Xiang Wang、南京大学、中国
Copyright © 2023 Tsafarova, Hodzhev, Yordanov, Tolchkov, Kalfin and Panaiotov. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
*文責 ステファン・パナイオトフ、spanaiotov@yahoo.com
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