ユーラシア大陸のスズメにおける原虫感染に関連する腸内マイクロバイオーム構成

2023年1月23日 10:53

ユーラシア大陸のスズメにおける原虫感染に関連する腸内マイクロバイオーム構成
セージ・D・ローラー、ブリアナ・Q・ロバートソン、ロン・M・チュビズ、パトリシア・G・パーカー
初出：2023年1月20日
https://doi.org/10.1111/jav.03027
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要旨
近年のマイクロバイオーム研究の発展により、居住微生物群集と血液寄生虫リスクとの関連が明らかになり、将来的にはプロバイオティクスなどの微生物疾患治療薬の可能性が確立された。しかし、この分野は主にヒトやモデル生物を対象としており、野生個体群や非哺乳類において微生物群集が寄生虫感染に直接的・間接的にどのような影響を及ぼすかについては不明な点が多い。野鳥におけるこのような知識基盤に貢献するため、我々は米国で野生のユーラシアツバメ（Passer montanus）の糞便および血液サンプルを収集し、血液寄生虫感染と腸内マイクロバイオームとの関連性を検証した。末梢血から81検体を採取し、広域分子アプローチにより原虫とヘモプロテウスを検査し、糞便検体を代理として腸内細菌叢の特徴を明らかにした。アルファおよびベータ多様性のいずれも、検出された原虫感染によって有意に変化しなかった。しかし、存在量の差の解析により、原虫感染鳥類ではProteobacteriaとFirmicutesの2つの門に最も多く存在し、有意に変化する細菌が多数あることが明らかになった。また、原虫感染鳥類では、ProteobacteriaとFirmicutesの2つの門に細菌が多く存在することがわかった。

はじめに
鳥類マラリア原虫は、南極大陸を除くすべての大陸に分布し、蚊を媒介とする原虫属の寄生が確認されている（Fecchio et al.2021）。原虫種や他のヘモスポリジウム寄生虫は、飼育下でも野生でも、免疫学的にナイーブな鳥類に高い死亡率をもたらすことがある（Hernandez-Colina et al.2021）。例えば、ハワイに蚊の媒介するレリクタム原虫が持ち込まれたとき、その導入により多くのハワイ原産の鳥類の個体数が劇的に減少し絶滅した（Warner 1968, LaPointe et al.）マラリア寄生虫との長い進化の歴史を持つ鳥類は、一般に感染に対して高い耐性を示すが、体力低下や死亡率などの悪影響は依然として観察されている（Marzalら2005、Lachishら2011、Ilgūnasら2019）。この感染症の世界的な重要性は、感染症に対する感受性と抵抗性に影響を与える要因を理解する必要性を強調している。

マラリア原虫は、鳥類宿主の体内で複雑なライフステージを経ます。蚊の媒介から宿主に寄生虫の胞子原体が注入された後、胞子原体は皮膚や組織細胞に侵入し、赤血球前性生殖の多段階を経てメロゾイトを生成します（Valkiunas 2005）。その後、一部のメロゾイトは赤血球に侵入し、赤血球内（赤血球内メロゴニー）と宿主組織内（赤血球外メロゴニー）で同時に無性生殖を続ける（LaPointeら2012、ValkiūnasおよびIezhova 2017）。配偶子形成（配偶子細胞の産生）は一部の感染赤血球内で起こり、配偶子細胞はベクターに取り込まれて寄生虫のライフサイクルの有性生殖段階を続けるまで赤血球内に留まります（Valkiunas 2005）。

鳥類の宿主への感染は、通常、急性期と慢性期の2段階で起こります（van Riper et al. 1986, Asghar et al.）最も高い寄生虫血症レベルは、最初の急性期に発生し、典型的には約2週間以内に発生するが、最初の投与量と多くの宿主特異的要因により、感染のタイムラインは変化し得る（van Riperら、1986、Atkinsonら、1995）。急性期を迎えた鳥はしばしば重度の貧血に陥り、死亡した鳥の剖検では一般的に肝臓や脾臓が腫れ、異常な色をしていることが判明する (van Riper et al. 1986, LaPointe et al. 2012)。生存している鳥類では、急性期の後に慢性感染が続くことが多く、これは何年も続くことがあり、長期的な体力への影響と関連している（Manwell 1934, LaPointe et al.2012, Asghar et al.2015 ）。寄生虫血症が減少し慢性期に入った後でも、外赤血球の侵入により脳毛細血管が閉塞し、脳虚血を起こすことで突然死することがあります（Ilgūnas et al.2016）。

鳥のマラリア感染リスクは、多くの要因に左右されます。生息地および／または気温は強い影響を与える可能性があり、標高の低い場所では気温が高く、寄生虫の発生段階であるベクター期に最適であることがあります（LaPointe et al.2010）。移動や営巣などの行動変化は感染率に影響を与える。最近のある研究では、巣の世話をよくする一部の鳥は、特に開いた巣を持つ鳥において、同じ地域のブルードパラサイトよりも大幅に高いヘモスポリジウム感染率を示すことがわかった（Ganser et al.2020)。このような育児コストは、営巣に伴う生理的変化の結果、あるいは営巣中のベクター回避能力の低下によるものと考えられる（Ganser et al.2020）。宿主の遺伝も疾病リスクの重要な予測因子であり、多くの研究が主要組織適合性複合体遺伝子とヘモスポリジウム寄生虫感染または感染強度の間に有意な関連を示している (Sommer 2005, Westerdahl et al. 2005, Bonneaud et al. 2006, Loiseau et al. 2008)。

感染リスクのこれらの多くの予測因子に加えて、最近のいくつかの研究では、主に実験室環境内の哺乳類系において、宿主マイクロバイオームとマラリアへの感受性の間の関連が実証されています。例えば、Plasmodium yoeliiに対する耐性マウスは、遺伝的に類似した感受性マウスと比較して、細菌遺伝子の発現の差を示す（Stough et al.2016）。また、耐性マウスは、腸内マイクロバイオームにおいてラクトバチルスとビフィドバクテリウムの著しい濃縮を示す（Villarino et al.2016年）。珍しいフィールド例では、マラリア原虫の高感染シーズンに縦断的に収集されたヒトの便サンプルが、マラリア感染リスクと相関する細菌群集プロファイルを明らかにした-耐性者はビフィドバクテリウム、レプトコッカス、腸内細菌科エシェリキア/シゲラの高い割合を有する（Yosephら2015）。原虫による感染は、今度はマイクロバイオームにおけるディスバイオーシスを引き起こす可能性があり、マウスにおける原虫ベルゲイ感染は、細菌群の変化だけでなく、物理的な腸の変化（腸の短縮や透過性の増加など）を伴う（Taniguchi et al.2015 ）。

場合によっては、以前は感受性であった動物に、微生物に関連した抵抗性が誘導される。例えば、マウスにLactobacillus caseiを注射すると、Plasmodium chabaudiに対する抵抗性が付与され、寄生虫負荷が減少し、感染期間が短くなる（Martínez-Gómez et al.2006）。感受性または抵抗性マウスから新しい無菌マウスに糞便マイクロバイオームを移植することで、同様にリスクまたは抵抗性を移転することができる（Villarino et al.2016）。感受性マウスに抗生物質を投与した後、乳酸菌とビフィドバクテリウムを含むヨーグルトプロバイオティクスを投与すると、寄生虫感染強度が低下することもある（Villarino et al.2016）。これらの例では、抵抗性の正確なメカニズムは不明ですが、宿主免疫反応のレベルの上昇は、マウスの感染強度の低下と相関しており（Villarino et al.2016）、マイクロバイオーム、宿主免疫系、病原体感染との相互作用の関係をほのめかしています。

マイクロバイオームと病原体の関連性については、寄生虫の侵入前に細菌が免疫系をプライミングすることが一つの機構的説明となり得る。病原体は一般的にα-gal（α-gal）と呼ばれる糖鎖エピトープを発現し、ヒト、類人猿、旧世界ザル（Galiliら1988）、鳥類を含むその他の非哺乳類脊椎動物（Yilmazら2014b、Mateos-Hernándezら2020）に免疫反応を引き起こす。α-galの産生は、数種の原虫で確認されており、胞子虫の表面に発現している（Yilmaz et al.2014b）。α-galに特異的な抗体は、原虫感染に対する抵抗力が強いヒトで高くなるが、抗体レベルは発熱性マラリアの転帰を予測するものではない（Yilmazら、2014年b）。注目すべきは、「ヒト様」マウス（α-galを発現する能力を欠く）を抗生物質で処理し、α-galの高い発現を示す大腸菌株O86：B7を接種すると、α-gal抗体産生の増加及び抗体による胞子虫の遮断による原虫によるコロニー形成に対する抵抗性の増加を示す（Yilmazら、2014年b号）。マイクロバイオームと宿主免疫反応および原虫リスクとを結びつける他の具体的なメカニズムを実証するために、さらなる研究が必要である。

このように、哺乳類におけるマイクロバイオームと原虫感染との間の間接的な影響を示す証拠がある一方で、鳥類のシステムでこの相互作用が生じるかどうかは依然として不明です。哺乳類マラリアと鳥類マラリアは、鳥類マラリアでは組織感染がより広範囲に及び、疾患がより重症化する傾向があるものの、病態において多くの類似点があり（Ilgūnas et al. 2016, Valkiūnas and Iezhova 2017, 2018）、寄生虫侵入に対する微生物の影響が哺乳類だけでなく鳥類にも存在することはもっともらしいと言えるでしょう。この潜在的な関係を検証する数少ない研究の1つは、家スズメPasser domesticusの尿道扁桃腺マイクロバイオームに焦点を当てた（Videvall et al.2021）。マイクロバイオームのαまたはβ多様性と感染状態の間に相関関係は認められなかったが、いくつかの尿道口腺細菌は、感染した鳥と感染していない鳥の間で異なる豊富さを示した（Videvall et al.）腸内マイクロバイオームが鳥類の血液寄生虫感染に影響を与えるかどうか、あるいは逆に影響を与えるかどうかについては、依然として未解決の問題である。

ここでは、野生のユーラシアツバメPasser montanusにおいて、腸内マイクロバイオームのいくつかの多様性と存在量の測定が、原虫感染と相関するかどうかを検証した。この地域的に豊富な種は、1870年にミズーリ州セントルイスに導入され、約20個体の創設集団となった（Louis and Barlow 1988）。範囲拡大は限られた範囲で北上し、このスズメは現在、主にミズーリ州北部、イリノイ州、アイオワ州に生息しています（Burnett et al.2017）。以前の研究では、ユーラシア大陸のツバメの地域集団におけるヘモスコピー寄生虫感染が60%にも上ると報告された（Lee et al.2006）。この導入鳥種は、マラリア寄生虫への感染歴が知られている保護懸念の低い種において、腸内マイクロバイオームと血液寄生虫感染との関連性を調べる機会を提供するものである。

我々は、ユーラシア大陸のツリースズメのマイクロバイオームの群集組成または特定のメンバーの存在が、血液寄生虫感染に対する抵抗性または感受性を与える可能性があると仮定していた。原虫に感染した個体ではα多様性が低く、感染状況によってグループ分けされた鳥の間ではβ多様性に基づく有意なクラスタリングが見られると予想された。哺乳類における先行研究の結果に基づき、乳酸菌、ビフィズス菌、連鎖球菌、大腸菌/赤痢菌などのグループにおいて、感染鳥と非感染鳥で豊富さが異なる細菌を予測した（Yoseph et al.2015、Villarino et al.2016）。

方法
ミズーリ州セントルイス郡のウェブスターグローブスの住宅地とコロンビアボトム保全地域のビジターセンター（住宅地に直接隣接）の2カ所で成鳥と幼鳥のユリカモメ（n = 81）を霧除けネットで捕獲した。これらの地点はおよそ20マイル離れている。糞は、サンプリング前にアルコールで拭き取った二重床の袋を使用して、各鳥から収集した；糞のサンプルは、袋の底のワイヤー床からすぐ下の清潔な表面に落ちる（Knutie and Gotanda 2018）。鳥は個体識別のためにバンドを付け、翼弦や体格などの基本的な計測を行った。上腕静脈から少量の血液サンプル（< 50 µl）を採取し、Longmireの溶解液（Longmire et al. 1997）で保存し、薄い血液塗抹標本とした。スライドは1時間以内にメタノールで固定し、その後ギムザで染色した。すべての鳥は処理後放鳥した。糞便サンプルは、サンプリング中は氷上に置き、野外から戻った後は直ちに冷凍保存した。

血液寄生虫検査
血液サンプルのDNAは、標準的なフェノール-クロロホルム法で抽出された。DNAサンプルは、ネステッドPCRプロトコルを用いて、原虫／ヘモプロテウスの血液寄生虫について3連で検査された。このプロトコルは、第1反応にプライマー対HAEMNFとHAEMNR2を、第2反応にプライマーHAEMFとHAEMR2を用いてチトクロームBの領域を増幅する（Waldenström et al.2004)。すべての陽性アンプリコンは Eurofins Genomics LLC でサンガーシークエンスに送られ、各陽性アンプリコンと、場合によってはアンプリコンの重複分（1羽につき最大3重複）についてもフォワードおよびリバースリードが取得された。

GEAR Genomics (www.gear-genomics.com/) の「Pearl」ツールを用いて、高品質のフォワードおよびリバーストレースファイルと重複を組み立てた (Rausch et al. 2020)。アセンブリから得られたコンセンサス配列は、MalAviデータベース（Bensch et al.2009）上のBLASTツールを用いて既存の寄生虫配列と照合された。組み立てられた痕跡は概ね生の痕跡と同じ系統に一致したが、コンセンサス配列を使用することで、ほとんどの場合、系統の一致率が大幅に向上した。系統の一致率が100%未満のサンプルは、再増幅し、再度配列を決定した。解析に含まれるすべてのサンプルは、MalAvi系統と100%一致した。

16S rRNA遺伝子配列の決定と処理
Qiagen Power Fecal Pro DNA Kitを用い、製造元の指示に従い、凍結糞便サンプルからDNAを抽出した。少なくとも〜20ngのDNA（Qubit蛍光光度計で測定）を有する抽出DNA試料を、Kozichら（2013）に記載のV4プライマーおよび方法を用いて、V4領域の16S rRNA遺伝子配列決定のためにミシガン大学医学部マイクロバイオームコアに送信した。サンプリングおよび抽出プロトコルの陰性対照も配列決定ラン用に送付し、2つの配列決定ランのそれぞれについて、Microbiome Coreによって追加の陰性配列決定対照（水）および陽性配列決定対照（ZymoBIOMICS Microbial Community Standard）が追加された。ポジティブ抽出コントロール（ZymoBIOMICS Gut Microbiome Standard）は、糞便サンプルと一緒に抽出され、2回目のシーケンスランに含められた。得られたシーケンスリードは、Dada2パイプライン（Callahan et al.2016）を使用して処理されました。品質フィルタリングおよびトリミングは、推奨されるDada2フィルタリングステップ（250～256 bp長のマージリードのみを保持）を使用して実施し、分類法は、SILVA v138を参照として使用してアンプリコン配列バリアント（ASV）に割り当てられた（Yilmaz et al.）ミトコンドリア、葉緑体、または古細菌に一致するリードは削除されました。Dada2によるフィルタリングの結果、2つの微生物群集標準において期待されるすべての属が検出され（参考情報）、未分類のリードおよび潜在的な汚染は、最初の実行では〜0%、2番目の実行では〜0.15%でした。しかし、低存在量のSalmonella（期待存在量0.009%）は、パイプラインによって腸内細菌科のAquamonasと誤って分類され、期待存在量が最も低い2つの細菌、Enterococcus（0.0009%）とClostridasは、腸内細菌科に属する細菌と誤って分類されたようである。また、Enterococcus (0.0009%) とClostridium (0.0002%) は検出されず（参考情報）、より豊富なコミュニティメンバーはこのパイプラインによって確実に検出されるが、最も稀なコミュニティメンバーはうまく表現されていない可能性があることが示された。また、分類されていないリードや汚染の可能性があるリードは、腸内細菌群の約0.05%に相当しました。

Rパッケージphyloseq (McMurdie and Holmes 2013, www.r-project.org)を用いて、フィルタリングされたリードをRにインポートして解析した。ネガティブコントロールを使用して、Rパッケージdecontamで汚染物質ASVの可能性が高いものを決定し、その後、検出された2つの汚染物質ASVをすべてのサンプルから削除した（Davis et al.2018）。リード数が 4000 未満のサンプルは除外した。フィルタリング手順の後、末梢血で原虫感染が明らかな14羽と、感染が検出されなかった67羽を含む81のサンプルが解析に含まれた。

アバンダンス差分解析
Rパッケージphyloseqを用いて、フィルタリングされたリードをさらに刈り込み、少なくとも5%のサンプルで3回以上見つかった分類群に限定しました。次に、phyloseqオブジェクトをDESeq2形式に変換し、DESeq2をデフォルト設定（データ正規化ステップを含む）で実行し、モデル内のシーケンス実行、年齢、季節、および場所を制御しながら、Plasmodium状態に基づく差分分類群を同時にテストしました（Love et al.2014）。非感染個体はDESeq2の基準レベルとして設定された。偽発見補正はBenjamini and Hochberg法を用いて行い、偽陽性の確率を下げるためにα=0.01を用いて修正p値をフィルタリングした（Benjamini and Hochberg 1995）。ここでは、修正p値＜0.01のASVのみを報告する。

アルファとベータの多様性
フィルタリングされたサンプル（DESeq2の追加プルーニングなし）は、4000以上のリード数が最も少ないサンプルと一致するように、phyloseqでサンプルあたり4005リードにサブサンプリングされました。phyloseqで、希薄化したASVテーブルに基づいて、Observed richnessとShannon Diversityを算出した。グループ間のα多様性の有意な変動は、シーケンスラン、場所、季節、年齢をモデルに含めたANOVAを使用してRで検定した（Supporting information）。ベータ多様性は、Bray-Curtis非類似度を使用して希薄化ASVテーブルから計算し、phyloseqおよびggplot2（Wickham et al.2019）を使用して可視化した。感染群と非感染群間のベータ多様性の有意性は、Rパッケージvegan（Anderson and Walsh 2013, Anderson 2017, Oksanen et al.2019）を用いて、配列決定ランを制御し、季節、場所、年齢をモデルに含めたPERMANOVAを用いて評価された。有意なPERMANOVAの結果は、分散が交絡因子であるかどうかを判断するためにPERMDISPで確認された（Anderson and Walsh 2013, Oksanen et al.2019）。

結果
すべての寄生虫の配列は、Plasmodiumに分類された（表1）。2つの系統、SEIAUR01とWW3は、Webster GrovesとColumbia Bottom Conservation Areaの両方で検出された。3番目の系統であるPADOM11は、コロンビアボトムでのみ検出された。この2つの場所で検出された原虫の有病率は、Webster Grovesで14％（7/47）、Columbia Bottom CAで20％（7/34）、このサンプルセット（14/81）での合計有病率は17％でした。系統ごとのサンプルサイズが小さいので、原虫の系統に基づく潜在的な多様性を検討せず、すべての原虫感染を1つのグループとして考慮した。

表1. サンプリング地点と原虫系統
サンプリングサイト総サンプル数総陽性数 SEIAUR01 WW3 PADOM11
ウェブスター・グローブ 47 7 3 4 0
コロンビアボトム CA 34 7 3 2 2
16S rRNA遺伝子配列の解析から、これらの群集の主要な細菌群はFirmicutes、Proteobacteria、Actinobacteriaであることがわかった（図1）。低分類群レベルの細菌群集組成は非常に多様であり、17の細菌ファミリーが1%以上の割合で検出された。特に、Catellicoccaceae, Enterobacteriaceae, Staphylococcaceaeが最も多く検出された（図1）。

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図1
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アルファ多様性は、シーケンスラン、場所、季節、年齢という潜在的な交絡変数を制御したANOVAで、観察された豊かさまたはシャノン多様性として測定した場合、感染状態または他の変数間で有意に変化しなかった（Supporting information）。Bray-Curtis非類似度に基づく主座標分析では、2つのグループ間にかなりの重複があることが示された（図2）。グループ間のベータ多様性の変化を検定するPERMANOVAは、感染状態に基づくいずれのサイトでも、各サイトの別々のモデル、または場所を制御する統合モデルで配列決定ラン、季節、年齢をこの順に含めても有意ではなかった（Columbia Bottom、PERMANOVA、R2 = 0.02702, p = 0.5658; Webster Groves、PERMANOVA、R2 = 0.02197, p = 0.2396; 複合PERMANOVA、R2 = 0.01329, p = 0.2110; Supporting information）。複合モデルでは、場所（PERMANOVA, p = 0.0001, R2 = 0.03678; PERMDISP, p = 0.655）、季節（PERMANOVA, p = 0.0001）においてベータ多様性の有意な変化が観察された。 0001, R2 = 0.07285; PERMDISP, p = 0.002）、シークエンスラン（PERMANOVA, p = 0.3375, R2 = 0.01212）や年齢（PERMANOVA, p = 0.0591, R2 = 0.01605）には関係しなかった。

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図2
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DESeq2解析により、シーケンスラン、年齢、季節、場所を制御した場合、感染鳥と寄生虫が検出されない鳥の間で有意に異なるいくつかの細菌分類が同定された（図3）。10の細菌クラスにおける27のASVが、調整されたp値に基づいて有意に変動した。6つのASVはBacilliクラス、6つはGammaproteobacteriaクラス、5つはActinobacteriaクラス、4つはAlphaproteobacteriaクラスに属し、残りのクラスはそれぞれ1つのASVで表されていた。最も高い塩基平均（> 15）を持つ7つのASVのうち4つは、Streptococcus属（97.362）、Ligilactobacillus属（40.189）、Staphylococcus属（30.11）、Weissella属（18.363）（参考情報）のBacilliクラスからであった。高い塩基平均値を持つ他のASVは、Gammaproteobacteriaクラス（Shimwellia, 250.24 base mean, and Escherichia-Shigella, 18.78 base mean）とAlphaproteobacteriaクラス（Candidatus Tokpelaia, 54.177 base mean）でした（Supporting information）．

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図3
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考察
これらの結果は、腸内マイクロバイオームと原虫感染との間にASVレベルの関連があることを示しているが、より広範なコミュニティ構造への大規模な変化にはつながっていない。DESeq2解析により、シーケンスラン、季節、場所、鳥の年齢による交絡効果を制御しながら、感染鳥で異なる豊富さを示した27の細菌ASV（フィルタリングステップ後の合計373のASVのうち）がハイライトされた。しかし、αおよびβ多様性は、交絡変数で制御しながら、Plasmodium感染によって変化せず、感染状態は、2つのサイトを合わせたβ多様性の〜1.33％を説明するだけであった。このように有意に変化する細菌分類群は、腸内細菌叢の構成員と鳥類マラリア感染との小規模な関係を示しているのかもしれない。腸内細菌叢と血液寄生虫感染との因果関係は哺乳類系で以前に確認されているが、鳥類で同様の関連を示した研究は今回が初めてである。

27種のASVのうち、6種がBacilli、Gammaproteobacteriaに属し、次いでAlphaproteobacteriaから5種、Actinobacteriaから4種が検出されました。Chloroflexia, Oligoflexia, Planctomycetes, Polyangia, Gitt-GS-136, Myxococciaはそれぞれ1つのASVで表現されていた。属レベルの結果は非常に多様で、Ligilactobacillus（旧Lactobacillus）のような比較的有益なグループの細菌と、Escherichia-Shigella、Pseudomonas、Shimwellia、Enterococcus、Streptococcus、Staphylococcus、Serratiaなどの病原性メンバー種を持つ多くの属が含まれています (Devriese et al. 1994、Benskin et al. 2009)。やや意外なことに、病原性を持つ可能性のある細菌群のほとんどは、原虫に感染した鳥類では存在量が著しく減少し（有意に濃縮されたStaphylococcusを除く）、一方、有益と考えられるLigilactobacillusは、感染した鳥類で有意に濃縮されていました。これらの結果には、Streptococcus、Lactobacillus、Escherichia-Shigellaなど、Plasmodiumに感染した哺乳類で有意に異なることが判明している細菌群も含まれている（Yoseph et al.2015, Villarino et al.2016）．

これらの結果の解釈は、どの非感染鳥がナイーブで、どの鳥が以前にクリアまたは検出不可能な感染症を持っていたかを知ることが不可能であるため、複雑である。さらに、急性感染症の鳥は霧除け網にかかる頻度が低いため（Lachish et al.2011）、本研究で検出された感染症の鳥のほとんどは、慢性感染症である可能性が高い。したがって、本研究で明らかになった細菌分類群と原虫感染との関連性の方向性を確認するためには、さらなる研究が必要であり、サンプルセット内の感染鳥の割合を増やすか、全体のサンプルサイズを大きくすることが有益であると思われる。また、血中寄生虫の感染が微生物群集の変化を促した可能性もある。これらの結果は相互に排他的ではなく、どちらもマウスの実験的研究で以前に発見されている（Taniguchi et al.2015、Villarino et al.2016）。

飼育鳥に実験的に原虫を接種することを含む今後の研究は、初期の腸内マイクロバイオーム構造とコミュニティメンバーが、感染による結果と変化をどのように予測するかを理解するのに役立つだろうが、多くの種における飼育下と野生のマイクロバイオームの違いは、飼育下研究からの野生マイクロバイオームに関する推測を制限する（Alberdiら、2021、San Juanら、2021）。鳥類を対象としたサイトフィディリティの高い縦断的研究では、理想的には寄生虫曝露の前後に同じ個体をサンプリングすることで、野生集団におけるこの関係の方向性を明らかにすることができる。また、本研究で注目した細菌分類は、マイクロバイオームと血液寄生虫の間接的な相互作用に関する今後の研究の出発点として、例えば、この細菌の組み合わせによる治療が、制御された条件下で鳥類のマラリア感受性の測定に影響を与えるかどうかを調べるために利用できる可能性があります。

急速に進展する動物マイクロバイオームの分野では、動物の感染症の予防や治療にプロバイオティクスを利用する方向に向かい始めている（McKenzieら2018、Stedmanら2020）。例えば、絶滅の危機に瀕した両生類において、新興真菌症であるツボカビ症（数種の両生類の絶滅の一因となっている）に対する潜在的防御策として、抗真菌特性を有するプロバイオティクスが検討されているが（Woodhams et al.2016，Harrisonら2020）、宿主免疫系との相互作用により潜在的治療法が複雑になる（Woodhams et al.）さらに、Aeromonas salmonicida感染からのマスの生存率を高める治療法として（Balcázar et al. 2007）、ミツバチのアメリカフウロ病などの病気を防ぐために（Audisio 2017、Daisley et al. 2020）など、さまざまなシステムでプロバイオティクスを研究している。常在菌（ラクトバチルスやビフィドバクテリウムなど）からなるプロバイオティクスは、商業用鳥類の細菌感染の重症度を下げるために、すでに家禽飼料に用いられている（Redweik et al.2020）。しかし、マイクロバイオームと疾病の関係や、特定のプロバイオティクスを使用して鳥類の予後を改善する方法の両方を完全に理解するには、まだ多くの作業が必要である。

哺乳類におけるいくつかの研究では、微生物を利用した治療が血液寄生虫感染の重症度を調節する可能性がすでに示されています。制御された条件下で、原虫感染強度は、寄生虫感染前にマウスにプロバイオティクスを注射する（Martínez-Gómez et al. 2006）、耐性マウスから感受性マウスにセカルマイクロバイオームを移植する（Villarino et al. 2016）、またはマウスにヨーグルトプロバイオティクスを処理するなど（Villarino et al.）しかし、鳥類系では、マイクロバイオームと血液寄生虫の相互作用についてはほとんど知られていない。本研究の結果は、感染した野生のスズメで存在量に差があるいくつかの細菌分類群を示しており、野鳥の腸内マイクロバイオームと原虫感染の関係を検討する今後の研究の基礎となり得るものであった。

謝辞

本研究に貴重な貢献をしてくれたフィールドおよびラボのアシスタント、特にデータ収集に協力し、プロジェクトにフィードバックをくれたUMSL Parker Labのメンバーに感謝する。また、ミズーリ州自然保護局とコロンビア・ボトム保全地域には、許可とサイトへのアクセスを提供していただき、感謝している。本研究は、ミシガン大学医学部マイクロバイオームコアの一部支援を受けて実施した。追加のシークエンスはEurofins Genomics, LLC（ケンタッキー州ルイビル）により実施された。

資金提供

本研究は、米国国立科学財団の大学院研究奨学金1945995、Whitney R. Harris World Ecology Center Graduate Research Grant、Sigma Xi Grant in Aid of Research G2020100193156089、NIH Grant AI137984 および Des Lee Collaborative Visionから多大な資金提供を受けた。

許可証

鳥類の取り扱いプロトコルは UMSL の Institutional Animal Care and Use Committee（プロトコル番号 1568558）により承認された。サンプリングの許可は、ミズーリ州環境保全局（Wildlife Collector's Permit No.18682および19163）およびコロンビアボトム保全地域特別使用許可証により取得した。

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