腸内細菌因子は多発性硬化症モデルマウスにおける疾患の重症度を予測する

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腸内細菌因子は多発性硬化症モデルマウスにおける疾患の重症度を予測する


Nature Microbiology(2024)この記事を引用する

要旨

腸内細菌は神経変性疾患と関連しているが、微生物叢組成以外のリスク因子は限られている。ここでは、多発性硬化症（MS）の前臨床モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を用いて、微生物のリスク因子を同定した。遺伝子型が異なり、複雑な微生物叢を持つマウス、あるいはヒトの合成微生物叢を6種類組み合わせたマウスを分析した結果、神経炎症が重篤化する確率は様々であった。しかし、疑われる微生物リスク因子の存在や相対量は、疾患の重症度を予測することはできなかった。MSにしばしば関連するAkkermansia muciniphilaは、背景微生物叢によってEAEの重症度との関連性が異なることを示した。同じ微生物叢を保有するマウス間で有意な個体間の疾患経過の差異が観察された。微生物の機能的特徴と宿主の免疫応答を評価した結果、発病前の特定の細菌の免疫グロブリンAコーティング指数が発病の個体差予測因子であることが示された。本研究は、神経炎症の重症度を予測する際に、微生物群集ネットワークと宿主特異的な双方向相互作用を考慮する必要性を強調している。

主な内容

自己免疫疾患患者は、多発性硬化症（MS）2も含め、健常対照者と比べて腸内細菌叢の組成が異なる1。したがって、患者をターゲットとした微生物叢の調節法を開発するためには、微生物叢組成を用いてMSの罹患や進行を予測できるかどうかを調べることが必要な前提条件となる（図1a）。MSを促進する微生物の予測因子を解明するための一般的なアプローチとして、患者と健常対照の細菌相対量の比較がある2,3,4,5,6,7,8,9。異なるMSコホート研究間で同定されたある種の発現量の異なる細菌は、対照群と比較して患者におけるAkkermansia 2,5,7,8,9の発現量の増加やPrevotella 3,6,8の発現量の減少など、一致する傾向がある。しかし、これらの症例対照研究は、疾患の進行における個人差を説明するようにはデザインされていない10。したがって、MSの疾患経過に影響を及ぼす微生物叢の特徴と、個人間の分類群の存在量を確実に関連付けることは、依然として困難である。

図1：複雑な微生物叢を持つマウスでは、アッカーマンシアの存在量の増加が神経炎症の低下と関連している。

b, Charles River Laboratories（CR）のC57BL/6Jマウス、SPF条件下で飼育されたMuc2 +/+およびMuc2 -/-同腹仔マウスに、繊維が豊富な餌（FR、標準的な餌）または繊維を含まない餌（FF）を20日間与えた。c, FRまたはFFの餌を20日間与えた後の糞便微生物群集のβ多様性解析。左：Bray-Curtis距離行列に基づく非計量多次元尺度法（NMDS）プロット。右：加重UniFrac距離行列を用いた主座標分析（PCoA）。d,bに描かれたマウスをEAE誘導に供し、毎日スコアリングを行いながら30日間観察した。f, 一元配置分散分析（one-way ANOVA）後にTukeyのポストホック検定（AUCおよびRelM）またはWilcoxon順位和検定（Max）を行い、Benjamini-Hochberg法を用いてP値を調整したEAE関連読み出し値。g, EAE中のキーイベント発生（1群内の全マウスに対する割合）のサンケイ図。h,エタ二乗（η2）計算により決定された、5つの食餌と遺伝子型の組み合わせ（n= 43）間のAUCを比較した、食餌と遺伝子型（CRおよびMuc 2+/+対Muc2-/-）により説明される分散。j, 5つのグループ（n= 28）間の各マウスについて、EAE誘導前の示された属の相対存在量とEAE関連読み出し値（fおよびgで定義）の間のスピアマン相関。線形回帰による統計的に有意な（P< 0.05）相関はアスタリスク（*）で示す。横棒（右）は、11属の組み合わせを単一寄与度の高いもの（下）から低いもの（上）に並べ、Bray-Curtis非類似度指数を用いて遺伝子型別（CRおよびMuc 2+/+対Muc2-/-）に累積説明分散を表したもの。一元配置分散分析にTukeyのポストホック検定を加えた。マウス番号はそれぞれのパネルに示し、生物学的複製として扱った。箱ひげ図（f,k）は中央値、四分位数、1.5×IQRを示す。

出典データ

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実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、微生物の危険因子と自己免疫性神経炎症の発症との因果関係を調べるために、日常的に利用されている前臨床マウスモデルである11,12,13,14。しかし、このようなアプローチ、すなわち比較的一貫性のある特定病原体非存在（SPF）微生物叢を保有するマウスにおいて、単一の生物種のみ、あるいは特定の微生物叢の因果関係を研究することの、MS患者に見られる多種多様な微生物叢組成への適応性については、まだ未解明である1。EAEを促進する微生物間相互作用が報告されているが11,15、微生物叢の疾患促進特性に対する背景微生物叢と潜在的な微生物リスク因子との相互影響は十分に理解されていない。

疾患関連常在菌を同定するための一般的なアプローチを評価するため、遺伝的背景や食餌が異なり、それぞれ異なる複雑な微生物群集を保有するマウスを用いて、前向きコホート研究デザインを実施した（Extended Data Fig.1）。我々は、疾患に関連する可能性のある細菌の特徴を同定し、この特徴がEAEと因果関係があるかどうかをgnotobiotic環境で徹底的に評価した。我々は、特定の細菌の特徴の相対的な存在量のみを考慮したマイクロバイオーム解析から得られた結論は、微生物叢の疾患媒介特性を確実に評価するには不適切であるという証拠を提供した。その代わりに、減少した複雑な微生物群集の個々のEAE促進特性を反映する特定の常在菌のIgAコーティング指数について報告する。これらの指標は、宿主特異的な疾患発症の予測に用いることができる。

研究結果

マウスにおける神経炎症関連腸内細菌の解析

微生物叢の構成がEAE発症に影響することが知られているため、まず、疾患の進行を予測する可能性のあるEAE関連細菌の分類群をリストアップした（図1aおよび拡張データ図1）。(1)チャールズリバー社（CR）の野生型C57BL/6Jマウス、(2)Muc2タンパク質欠損マウス（Muc2-/-）、(3)Muc2+/-マウスを交配させた同腹仔コントロールであるホモ接合体コントロールマウス（Muc2+/+）。Muc2-/-マウスは腸管粘液層が損なわれているため、微生物叢が大きく異なっていることが予想され16,17、宿主の遺伝学を考慮することなく、微生物叢に関連した情報のみから導き出された結論の妥当性を批判的に評価するのに役立つであろう。すべてのバックグラウンドの氷に、繊維質の豊富な（FR）標準飼料を与えた。さらに、CRマウスとMuc 2+/+マウスのサブグループには、細菌群集をさらに擾乱させるために、ファイバーフリー（FF）食を与えた18,19（図1b）。予想通り、5つの背景と食事の組み合わせすべてにおいて、ベースラインの微生物叢組成が異なることが検出された（図1cおよび拡張データ図2）。
さらに、出現しつつある疾患表現型の群間比較を行い、観察されたこれらの群間表現型を微生物叢組成のベースライン差に関連付けるために、すべてのマウス群にEAEを誘発し（図1d）、毎日スコアリングを行った（拡張データ図3）。その結果、Muc 2+/-マウスはMuc2 +/+マウスやCRマウスに比べてEAEを誘発しにくく（図1e-g）、食餌に関係なく（図1h）、遺伝子型間で病気の進行に統計学的に有意な差が認められた。興味深いことに、全体的な微生物叢のβ多様性はEAEの病態とは無関係であった（図1i）。5つの異なる遺伝子型と食餌の組み合わせが明らかに2つの異なるEAE表現型グループに分かれたので、「中等度」の表現型を示すMuc2-/-マウス（KO）と、「重度」の表現型を示すので、由来や食餌に関係なく全てのMuc2発現マウスを合わせたマウス（WT）を比較することで、EAEに関連する微生物叢の違いの可能性を評価した。EAE誘発前（pre-EAE）のWTマウスとKOマウスのBray-Curtis距離マトリックスで検出された分散の70％以上を説明する11の差異のある属を同定した。再EAEにおけるAkkermansia属の相対存在量だけで、(1)前記分散の14.4%を説明した（図1j（右））、(2)発病誘導時の様々なEAEリードアウトと負の相関を示した（図1j（左））、(3)WTマウスと比較してMuc2-/-マウスで有意に高かった（図1k）。これらの結果は、アッケマンソウが病気を予防する可能性を示唆している。しかしながら、このような横断的、群ごとのマイクロバイオーム解析では、宿主に起因する因子は無視されている。

EAEの重症度におけるアッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）の有用性

EAE発症におけるアッカーマンシアの因果的役割を検証し、疾患リスク予測因子としての可能性を評価するために、無菌（GF）C57BL/6Nマウスに、アッカーマンシア（A. muciniphila）18,20,21（図2aおよび補足表1）を含む機能的に特徴付けられた14メンバーの合成ヒト微生物叢（SM14）、またはアッカーマンシア（A. muciniphila）22,23,24を欠いた13メンバーの微生物叢（SM13）をコロニー形成させた。さらに、これらのマウス群にEAEを誘導した（図2b）。M13コローナイズマウスはSM14コローナイズマウスに比べ、重症度の低いEAE表現型を示した（図2c（左）,d-fおよびExtended Data Fig.4a）。このことは、EAE発症に対する微生物叢の一般的な寄与と、SM14微生物叢ベースマウスモデルにおけるA. muciniphilaの疾患促進的役割を強調している。対照として、A. muciniphila-mono-associated（SM01）マウスとGFマウスにEAEを誘発した（Extended Data Fig.） M01コロニーマウスおよびGFマウスは、低中等度から中等度のEAE疾患表現型を示した（Extended Data Fig.4b-d）。
図2：A. muciniphilaを含まない合成微生物叢（SM）は神経炎症を抑制する。
b, GF C57BL/6NマウスにSM14またはSM13（A. muciniphilaを含まないSM14）群集をコロニー形成させた。5日後、両群ともFR（標準飼料）またはFF飼料に切り替えた。20日間飼育後、すべてのマウスにEAEを誘発し、30日間経過を観察した。毎日のEAEスコアは、Benjamini-Hochberg法を用いてP値を調整したWilcoxon順位和検定を用いて比較した。左：FRで飼育したSM14およびSM13コロニーマウス。右： 同じSMの組み合わせを保有するFF飼育マウス。同じSMを保有し、異なる食餌を与えたマウスのEAEスコアは、すべての時点において統計的に有意ではなかった（P> 0.05）。e, 左：cに描かれた疾患経過のAUC分析。f, 左: 再発期（RelM、EAE誘導後26日目から30日目）の平均EAEスコア。ne-wayANOVAとTukeyのpost-hoc検定。右：RelMを4群間で比較した場合、食餌またはコロニー形成（SM）によって説明される分散（η2計算を用いて決定）。g：経時的（EAE誘導の翌日）なSM株の平均相対存在量（群ごとにファセット化）。欠測値は糞便サンプルが採取できなかった時間を示す。マウス番号はそれぞれのパネルに示されており、生物学的複製として扱われている。R-fed SM14およびSM13のデータは3回の独立した実験によるもの；FF-fed SM14のデータは2回の独立した実験によるもの；FF-fed SM13のデータは1回の実験によるもの。oxplots（e,f）は中央値、四分位数、1.5×IQRを示す。llの統計検定は両側であった。
データ
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SM14構成株の相対存在量の変化がEAEの病勢に影響を及ぼすかどうかを評価するために、SM14およびSM13コロニーを形成したマウスにFF食を与え、その後EAEを誘導した（図2b）。微生物に依存しないが食餌が介在するEAEへの影響を除外するため、FFマウスにもFF食を与えた。我々の以前の研究18,21,22,23,25と同様に、SM14をコロニー形成したマウスにFF食を与えたところ、同様にコロニー形成したFR食マウスと比較して、A. muciniphilaの相対量が有意に増加した（図2g）。しかし、同じ微生物叢を持つFR群とFF群との間で、EAEに関連する指標に統計学的に有意な差は認められなかった（図2c（右）,f）。SM14群集からA. muciniphilaを除去した場合、異なるEAE関連読み出し値の分散の28.5％未満しか説明できなかった（図2e,fおよびExtended Data図4a（右））。SM01にコロニー形成されたマウスは中間的な疾患表現型しか示さなかったことから（Extended Data Fig： 1）A. muciniphilaの存在は、SM14の他の特定の株と組み合わされた場合、重症EAEの潜在的な微生物リスク因子である。

.EAEの重症度におけるムチニフィラ関連γ-アミノ酪酸

A.muciniphilaがSM14内の微生物叢の機能をどのように変化させるかを評価するために、EAE誘発および非誘発のGF、SM01、SM13、SM14コロニーマウス（すべてFR食のみ）の糞便および血清サンプルを用いて、メタボロームおよびメタトランスクリプトーム解析を行った。糞便中の代謝物プロファイルは、同じ微生物叢を保有するEAE誘発群と非EAE誘発群、およびEAE誘発SM13コロニー化マウスとSM14コロニー化マウス間で類似していた（図3a,bおよび補足表2）。より広範な代謝プロファイルはEAEの病態とは無関係であったことから（図3a）、もしあったとしても、EAEの病態に因果的に影響を及ぼす可能性があるのは、ごく少数の糞便代謝産物だけであると考えられた。
図3：A. muciniphilaが介在する神経炎症は、γ-アミノ酪酸の糞便中濃度の上昇と関連している。
-d、GF C57BL/6NマウスにA. muciniphilaのみをコロニー形成させた（SM01）、SM13、SM14をコロニー形成させた、あるいはGFのままとした。コロニー形成25日後（-EAE）またはEAE誘導30日後（+EAE）に糞便内容物を採取し、CE-TOF/MSベースのメタボローム解析を行った。c, 全サンプル（-EAEマウスと+EAEマウスの両方）およびグループごとの比較基準における線形回帰による、統計的に有意な正（PCor）または負（NCor）のスピアマン相関。EAE関連読み出し値に言及した相関（略号は図1と同じ）は、+EAEマウスのみから計算した。群間比較には、対数正規化濃度の対応のないt検定に基づき、Benjamini-Hochberg法を用いてP値を調整した有意差のある代謝物を含む。arplotは各基準を満たす代謝物の総数を示す。測定された175代謝物のうち、AUCと有意な相関を示した14代謝物のみを表示。d, GABA -EAEまたは+EAE条件のlog2-濃度の中央値、四分位数、および1.5×IQRを示す箱ひげ図。e, -EAE SM14-およびSM13-コロニー化マウスの糞便メタトランスクリプトームプロファイルの多次元化。SM14コロニー化マウスでは、A. muciniphilaに起因する転写物を除去し、SM13コロニー化マウスのメタトランスクリプトームプロファイルと公平に比較できるようにカウントを再正規化した。f, SM14-対SM13-colonizedマウスにおける遺伝子産物注釈付き転写産物量のlog2(fold change, FC)(x軸)と-log10(P値)(y軸)を示すボルケーノプロット。灰色線は有意閾値を表す。黄色と青の点は、それぞれSM14-またはSM13-colonizedマウスでのみ見つかった転写産物を表し、灰色の点は両群で見つかった転写産物を表す。右2列：SM14-colonizedマウスとSM13-colonizedマウスで発現量が増加または減少しているが、両群に存在する転写産物。マウス番号はそれぞれのパネルに示され、生物学的複製として扱われる。統計検定は両側で行った。
データ
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このようなEAEに影響を与える可能性のある代謝物を同定するために、4つの異なる基準を評価するメタボライトオブインタレストスクリーニングパイプラインを開発した（Extended Data Fig.） その結果、血清サンプルでは注目すべき代謝物が同定されなかったことから（補足表3）、代謝物がEAEの疾患経過に及ぼす潜在的な影響は腸内で局所的に生じることが示された。疾患経過終了時の濃度がAUCと有意に相関した14種類の代謝物（図3c）のうち、GABA（γ-アミノ酪酸）のみが糞便検体で注目すべき代謝物として浮上し、EAEと正の相関を示した（図3c）。重要なことに、GABA濃度は、A. muciniphilaを含む合成微生物叢（SM）を組み合わせた非EAE誘発マウスで有意に上昇した（図3d）。これらの結果は、疾患誘発前であっても糞便GABA濃度の上昇は主にA. muciniphilaの存在によるものであり、EAE誘発の結果ではないことを示唆している。したがって、糞便中GABA濃度を評価することにより、EAEの重症度を予測できる可能性がある。しかしながら、EAE非誘発マウス（図3d（左））とEAE誘発マウス（図3d（右））のGABA濃度が一致しているにもかかわらず、SM01コロニーマウスすべてがEAE誘発時に重症化するわけではなかった（Extended Data Fig.
A.ムチニフィラの混入が、微生物群集の全メンバーの転写活性にどのような影響を与えるかを理解するために、SM14群とSM13群の糞便微生物メトランスクリプトーム・プロファイルを比較し（図3e）、SM14コロニーマウスでのみ転写される117遺伝子を同定した（図3f）。これらの転写産物のほとんどはA. muciniphila由来であろうと予想されたが、実際には、これらの遺伝子のほとんどはRoseburia intestinalisまたはMarvinbryantia formatexigensによってのみ転写された（図3g）。SM13コロニー化マウスでのみ転写された30遺伝子のうち、大部分はEubacterium rectaleによって発現された（図3g）。これらの発見は、ある常在菌の存在が、他の微生物群集メンバーの遺伝子発現パターンに極めて重要な影響を与えることを浮き彫りにしている。このような微生物群集の機能に対する間接的な影響もまた、微生物叢を介したEAE発症への影響に寄与し、その結果、潜在的なリスク予測種の疾患媒介特性に影響を与える可能性がある。

EAEの

重症

度とは無関係な微生物ムチン分解能力

その結果、4つの菌株がSM14マウスと比較してSM13マウスで有意に高い発現量を示した（図4a）。これらの4つの菌株がEAE発症に寄与している可能性に着目し、さらに3つのSMの組み合わせでマウスをコロニー形成させた（図4bおよびExtended Data Fig. 腸内健康を促進することで知られ、MS患者10では減少していたecalibacterium prausnitzi-が、SM13マウスでは有意に増加していた（図4a（右端））。そこで、SM13マウスにおけるEAEの重症度低下がF. prausnitziiの保護効果によるものかどうかを調べるために、A. muciniphilaと F. prausnitziiを欠いたSM12群集（図4b）をGFマウスにコロニー形成させた。その結果、SM12をコロニー化したマウス（図4c-e）はSM13をコロニー化したマウス（図2）と同程度の疾患経過を示したことから、SM13をコロニー化したマウスにおけるF. prausnitziiの拡大は、SM13をコロニー化したマウスにおけるEAEの減少の原因ではないことが示唆された。 A

同時に、

これらのデータは

、

A. muciniphilaが抗炎症性細菌であるF.

prausnitziiの

増殖を抑制する効果を持つことを示唆している。
g. 4: 微生物のムチン分解はEAEの疾患経過とは無関係である

。
一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、ベンジャミニ・ホッホベルグ（Benjamini-Hochberg）法を用いてP値を調整した多重比較を行った結果、EAE誘発日において、FR-fed SM14コロニーマウスとFR-fed SM13コロニーマウスの間で統計的に有意な差を示した菌株の相対量。生物学的に意味のある多重比較を行った（同じSM、異なる食餌、異なるSM、同じ食餌）。c、時間の関数としてのEAE疾患スコア。単発EAEスコアは、Benjamini-Hochberg法を用いてP値を調整したWilcoxon順位和検定を用いて比較した。黄色のアスタリスクはFR飼育SM14飼育マウスとの比較を示す。< 0.05.d, EAE中のキーイベント発生（1群内の全マウスに対する割合）のサンケイ図。e, 左：cで描かれた疾患経過のAUC解析。各マウスは別々のドットで描かれている。ddle: マウスあたりの最大 EAE スコア(Max)。 R 右：再発期の平均 EAE スコア（RelM、EAE 誘発後 26 日目から 30 日目）。群間比較（AUCとRelM）には一元配置分散分析（one-way ANOVA）、Tukeyのpost-hoc検定（Tukeyのpost-hoc検定）、またはBenjamini-Hochberg法（Max）によるP値調整を伴うWilcoxon rank-sum検定（Wilcoxon rank-sum検定）を用いて解析した。青字はFRで飼育したSM13コロニーマウスとの比較、黄字はFRで飼育したSM14コロニーマウスとの比較を示す。 N は有意ではない。使用数はそれぞれのパネルに示され、生物学的複製として扱われる。 F -FF-fed SM14のデータは2回の独立した実験によるものであり、その他のグループはすべて1回の実験によるものである。xplots（a,e）は中央値、四分位数、1.5×IQRを示す。l統計検定は両側で

あっ

た。
データ

F
llサイズ

imageR
A.muciniphilaがSM14群集から移動した結果、SM13群集では3種のムチン糖鎖を分解するバクテロイーダータ18種がさらに拡大した（図4a）。次に、3種のムチン糖鎖分解株を単独でコロニー形成させた場合（SM03）、SM14をコロニー形成させたマウスと比較してEAEが減少するかどうか、またA. muciniphila（SM04）を加えた場合（SM04）、潜在的な有益効果が相殺されるかどうかを検討した。SM03およびSM04をコロニー形成したマウスは、SM14をコロニー形成したマウス（図2）と同程度のEAE発症経過（図4c-e）を示したが、SM13をコロニー形成したマウスとは有意に異なっていた。さらに、ムチン糖鎖を分解する3種のバクテロイーダ菌は、SM13群集の残りの10株が存在しない場合には、病気を軽減する性質は持たず、代わりに病気を促進する性質を持つようであった。これらのマウスで観察された結果に、ムチンのターンオーバー異常が関与しているかどうかを評価するために、腸管バリアの完全性に関する様々な間接的指標を評価した。しかし、EAEの転帰と糖鎖分解酵素活性（Extended Data 図6b-d）、血清中のリポ多糖（LPS）濃度、オクルジン濃度、ゾヌリン濃度、糞便中のリポカリン濃度（Extended Data 図6e,f）、短鎖脂肪酸濃度（Extended Data 図6g）との間に相関は認められなかった。

以上の

結果から、本研究で用いた微生物叢の組み合わせでは、細菌が介在する粘液糖鎖の分解やバリア機能の障害は、EAE発症の個々の予測因子ではないことが示唆された

。

微生物叢組成は重症

EAEの

確率を推定する

これまでのところ、EAE関連指標と微生物叢組成の群間比較では、EAE誘発マウスにおける疾患発症の信頼できる予測因子を同定することはできなかった。そこで次に、微生物叢が疾患経過に及ぼす影響について、より信頼性の高い潜在的な予測因子を明らかにするために、群ベースおよび個体レベルでの共通項を明らかにすることを目指した。st.では、試験した10種類の食餌とコロニー形成の組み合わせ（「群」）間で、EAEの転帰を群ベースで比較した（図5a,b）。主要なEAE関連読み出し値の群平均値（図5b）に基づく階層的クラスタリング（図5c）を形成した結果、3つの異なる群表現型が明らかになった：「中等度」、「中間」、「重度」。フローサイトメトリー解析（Extended Data図7a,b）により、これらのグループの表現型は、EAE誘発前から腸間膜リンパ節（MLN）と大腸固有層（CLP）における特徴的なT細胞分極パターンによって反映されていることが明らかになった（Extended Data図7c）。ル食餌はEAEに関連した測定値の分散の最大7.3％を説明し、微生物叢組成（SM）は11.2％から27.2％を説明した（図5d）。これらの低い値は、かなりのグループ内分散に根ざしているため（図5b）、全グループの全マウスを個別に処理して、個々のEAE表現型のクラスタリングを行った（図5e）。 T-分布の確率的近傍探索（T-分布の確率的近傍探索）により、EAE表現型のクラスタリングを行った。すべてのEAE誘発個体の分布確率的近傍埋め込み（t-SNE）解析の結果、2つの疾患クラスターが得られた：強いEAE症状を示すマウスからなる「クラスター1」と、軽いEAE症状を示すマウスからなる「クラスター2」である（図5e）。EAEを発症したマウスのMLNとCLPにおけるほとんどのT細胞サブセットの割合は、両クラスターのマウスで同様であった（Extended Data図7d）が、クラスター1のマウスでは脊髄（SC）にIL-17とIFNγを発現するTh細胞が有意に浸潤していることがわかった（Extended Data図7e）。SM03マウスとSM04マウスを除けば、他のすべての群に、様々な割合で両方の表現型のマウスが含まれていた（図5f）。その割合は、グループベースの表現型分類（Fig. まとめると、これらの結果（図5a-f）は、微生物叢の組成を知ることは、食餌条件に関する情報と組み合わせて、中等度または重度の疾患の確率を推定することは可能であるが、個々のEAEの転帰を予測するには不適当であることを示している

。
図5：微生物叢の特徴に基づくEAEの集団予測および個人予測

、
b,試験したすべてのコロニー形成と食事の組み合わせのEAE関連読み出し値をまとめた横棒グラフ。c,ユークリッド距離行列に基づくEAE関連読み出し値のグループ平均値をスケーリングしたクラスター樹状図。d, η2計算を用いて、すべてのコロニー形成-食事の組み合わせ（n= 65）間でEAE関連読み出しを比較したときの、食事またはSMによって説明される分散。e, 試験したすべてのコロニー形成-食事の組み合わせにわたるEAE関連読み出しのt-SNE分析（6つの初期次元で20のperplexity）による個体レベルのEAE表現型分類、 SM-食餌の組み合わせごとのクラスター1（強いEAE症状）に属するマウスの割合。g, SM14成分のカラーコードと略号。h, 両食餌を与えたマウスについて、EAE誘導前の菌株相対存在量とEAE関連読み出し値の間のピアソン相関。-株相関は棒グラフで、Max-株相関とRelM-株相関は色分けした四角形で示した。線形回帰による有意な相関（P< 0.05）は色で示し、有意でない相関は灰色で示した。4つの異なるSMの組み合わせについて計算した関係：SM 3 のみ；SM14 のみ；SM13 と SM14；および SM12、SM13、SM14。i, EAE 関連読み出し値の変動は、食餌に関係なく、SM12、SM13、および SM14 がコロニー形成されたマウスを組み合わせることによって実施された EAE 誘発前の株相対存在量によって説明される（n=40）j, 株の存在を独立変数とし、SM をランダム切片効果として予測 AUC の線形混合モデル回帰（n=40）k、 l, EAE誘発前のSM12、SM13、SM14コロニーマウス（n= 12）における主要なEAE関連測定値とSM14構成株のICIとの個体ベースのピアソン相関（上）およびスピアマン相関（下）。<0.05は線形回帰による MF m,B. ovatus ICI と AUC（左）および最大 EAE スコア（Max、右）との線形回帰による相関。線は線形回帰を表し、信頼区間は灰色で陰影をつけた

。
rce

データ

Fu
l size imageB

.
OVATUSIgAコーティングはSM

設定における

EAE重症度を予測する

次に、EAEの個々の転帰を予測するのに適した微生物叢関連因子を同定することを目的とした。図5g）、まず、EAE誘導前の相対的存在量（Extended Data 図8a）が、EAE誘導後の個々の疾患の経過を予測できるかどうかを評価した（図5h,i）。そのため、少なくとも12種類の株（SM12、SM13、SM14）を保有するマウスのみを分析した。各系統の関係は、それぞれの系統を経口投与されたマウスのみで評価し、SM12、SM13、SM14コミュニティを保有するマウス、またはそれらの組み合わせを解析に含めて計算を行った。 我々は その結果、いくつかの菌株では、EAE発症前の細菌の相対量とEAEに関連した測定値との間に、統計的に有意な相関が認められた（図5h）。しかし、統計的に有意な相関は一般的に弱く（R< 0.4）、ある菌株のピアソン相関値は背景微生物相に大きく依存していた（図5h）。同様に、菌株の相対的な存在量は、評価されたすべてのEAE関連読み出し値について、すべての群にわたって分散の非常に低い割合しか説明しなかった（図5i）

。
ある菌株の有無が、個々のEAE発症のより良い予測因子となり得るかどうかを判断するために、3つのEAE関連読み出し値について、菌株の有無を独立変数、コロニー形成をランダム切片効果として線形混合モデル回帰を行った（図5jおよび拡張データ図8b）。試験したSMの組み合わせの設定上、A. muciniphilaと F. prausnitziiを別々に評価することしかできず、残りの12株を2つの組み合わせのグループで分析する必要があった。特定の菌株または菌株の組み合わせの有無は、試験したEAE関連読み出し値の個々の結果を予測するには不十分であった（図5jおよびExtended Data図8b）

。
宿主形質細胞由来IgAによる腸内常在菌の結合は、免疫恒常性27,28の維持に重要な宿主反応であり、自己免疫性神経炎症29,30との関連でも重要である。マウスの糞便中の回帰IgA（sIgA）レベルは、個々のEAEの結果とは無関係であったが（Extended Data 図8c）、微生物叢の組成を反映していた（Extended Data 図8d）。興味深いことに、sIgA濃度の群平均値と対応するEAE感受性の有病率との間に有意な相関が認められた（Extended Data Fig. これらの観察と、ある常在菌種の「IgAコーティング指数」（ICI）の変化が炎症と関連している可能性があることを考慮し31、各個体について、より多様性の高いSMの組み合わせ（SM12、SM13、SM14）内の各菌株についてICIを測定した（図5k-mおよび拡張データ図8f-h）。興味深いことに、ICIは異なるSMの組み合わせ間で異なる傾向があり（拡張データ図8f）、微生物叢組成は、B. ovatusと B. uniformisのICI間の分散のそれぞれ40.5％と55.0％を説明した（図5kおよび拡張データ図8g）。 このことは、菌株特異的IgAコーティングにおける背景微生物叢の重要な役割を示唆している（拡張データ図8h）。さらに、これらの菌株のICIは、異なるグループ間だけでなく、グループ内の個人間でも異なっていた。このことから、これらの菌株のICIは、特定の宿主における微生物叢の個々のEAE促進特性を反映している可能性が考えられた。EAE誘発前に採取した糞便検体から測定した菌株特異的ICIと同一個体におけるEAE転帰との関連解析から、2つの菌株でいくつかのEAE関連測定値と有意な相関が認められた（図5l）。しかし、個々のICIが2つの最も重要なEAE関連指標（AUCおよび最大達成EAEスコア）と有意な相関を示した唯一の株はB. ovatusであった（図5l,m）。したがって

、B

. ovatusを含むSMのすべての組み合わせにおいて、EAEの疾患経過を個々に予測することが可能である。

コーティングは複雑な群集におけるEAE発症を予測する

Nex
複雑な微生物叢を持つマウスにおいても、特定の生物種のICIから個々のEAE発症を予測できるかどうかを調べた。遺伝子型の異なるSPFマウス（図1）において、信頼性の高い微生物叢関連EAE予測因子を見つけるための探求を開始した我々は、同様の環境で種特異的ICIの疾患予測能を評価することにした。この評価には、Muc2-/-マウスを加えた。種の相対的存在量ではなく、種の存在量によって定義される複雑な微生物叢組成の数を増やすために、微生物叢の生着に宿主が与える影響を考慮して、遺伝子型を超えた糞便微生物叢の移植を行うことにした32,33。そこで、GFMuc 2-/-マウスとGF C57BL/6マウスを微生物叢レシピエントとして、SPFで飼育したMuc 2-/-マウスまたはSPFで飼育したMuc2 +/+マウスを微生物叢ドナーとして、使用済みの子マウスに飼育した（図6a）。種特異的なICIを同定することが目的であったため、21日間のコロニー形成期間後に全長16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子アンプリコン解析を行い、種レベルでの信頼性の高い分類学的情報を得た34。予想通り、われわれの微生物叢移植アプローチでは、すべての微生物叢レシピエントで明確な微生物叢組成が得られ（図6b,cおよび拡張データ図9a,b）、ほとんどのドナーとレシピエントの組み合わせで個体間にかなりのばらつきが見られた（図6c）。微生物叢ドナーの遺伝子型は、最終的な微生物叢組成に有意な影響を与えなかった（Extended Data図9c（上））。しかし、最終的な微生物叢組成は、微生物叢レシピエントの遺伝子型によって有意に影響を受けた（Extended Data図9c（下））

。
6：複合微生物叢の神経炎症促進特性を予測するためのレポーター種のIgAコーティング指数

、
SPFで飼育したMuc 2-/-（KO）マウスおよびMuc2 +/+（WT）マウスの微生物叢を、GF C57BL/6J（BL/6）マウスおよびMuc2-/-マウスに移植した。 その後 b, 4つのドナーとレシピエントの組み合わせにおける全長16S rRNA遺伝子配列決定による微生物叢組成のベン図。c、アークサイン平方根変換した相対存在量データのBray-Curtis距離行列から決定したEAE前の微生物叢組成のβ-多様性、主座標分析を用いて順位付け。d、拡張データ図9dに示した個々の疾患経過のAUC（左）および最大EAE疾患スコア（Max、右）。ドナー-レシピエントの組み合わせを被検変数とした一元配置分散分析（AUC）、またはドナー-レシピエントの組み合わせを被検変数としたクルスカル・ワリス検定（Max）。拡張データ図9fに基づく各AEEの表現型分類（「軽度」対「重度」）。e, EAE誘発前のEubacterium coprostanoligenesおよびPhocaeicola doreiのICIとEAE関連読み出し値（AUC、Max）の個体ベースのピアソンおよびスピアマン相関。すべてのドナーとレシピエントの組み合わせをこの解析に含めた。有意な相関は青または赤の濃淡で描かれている。f,E.コプロスタノリゲネスおよびP.ドレイの個々のICIとAUC（上）およびMax（下）の個々の値との線形回帰による相関。 Onl E.coprostanoligenesまたはP. doreiがソーティング後の両方のフラクションで検出可能であったマウスを示す。g,E.コプロスタノリゲネスまたはP.ドレイのICIを用いたAUC（上段）またはMax（下段）による分類に基づいて重症化する確率を予測する二項回帰モデル。疾患の重症度の定義については、Extended Data Fig. 微生物叢の組成だけでは、個人のEAE感受性や発症を予測することはできない。しかし、特定のレポーター種のICIによって反映される個々の宿主と微生物叢の相互作用は、個々のEAEの疾患経過を予測するのに適していた

。
ce

データ

Ful
サイズ

imageFol
すべてのマウスにEAEを誘発し、30日間病気の進行を観察した（図6a）。個々のEAE疾患経過（拡張データ図9d）は、微生物叢ドナーの遺伝子型（拡張データ図9e）およびドナーとレシピエントの組み合わせ（図6d）には依存しなかったが、レシピエントマウスの遺伝子型（拡張データ図9e）には依存した。 Cat 各マウスをバイナリーEAE表現型（Extended Data Fig.9f）に分類したところ、EAE表現型はEAE誘導前の微生物叢の分類学的β多様性（Extended Data Fig.9g）から切り離されており、全体的な微生物叢組成を評価するだけではEAE発症を予測する指標としては不十分

であることがわかった

Nex

。

そこで我々は、EAE誘発当日に採取した糞便サンプルから、IgAコート細菌と非IgAコート細菌を分離し（Extended Data図10a）、それぞれの画分について全長16S rRNA遺伝子配列決定を行った（Extended Data図10b,c）。EAE誘導前の種特異的ICIと個々のEAE関連読み出し値の相関解析から、Eubacterium coprostanoligenes、Phocaeicola dorei（図6e-g）、Enterocloster bolteae（拡張データ図10d,e）のICIは、背景微生物叢組成やレシピエントの遺伝子型に関わらず、個々のEAE発症の信頼できる予測因子であることが明らかになった。これらのマウスでは、B. ovatusの有病率が低すぎたため、B. ovatusICIの予測能を評価することはできなかった（Extended Data Fig.10f）。また、微生物叢が減少したマウス（図5l）を用いた結果と同様に、A. muciniphilaICIはその後のEAE発症とは無関係であった（Extended Data 図10g）。それにもかかわらず、複雑な群集における我々のデータは、いくつかの微生物種のICIが疾患の信頼できる予測因子となりうること、そしてそのような予測因子となる微生物種はマウスとヒトでは異なる可能性があることを裏付けている。したがって、縮小群集と複雑な群集の両方で得られた結果から、発病前にマイクロバイオームの特性を評価することで、EAEの発病を予測できると結論づけられる。ただし、ある微生物叢内の微生物ネットワークと、宿主-微生物叢相互作用の双方向の影響を考慮する必要がある（図6h）

。

考察
本研究では、潜在的な疾患関連微生物リスク因子を明らかにするために、一般的に採用されている横断的解析アプローチが適切かどうかを評価した。ヒトのコホートには当然、すでに疾患が確立しているボランティアが含まれるため、リスク因子候補の相対量の変化が疾患発症に先立つものなのか、あるいは疾患の結果なのかを読み解くことは不可能である。しかし、MSの確立された前臨床モデルであるEAEマウスを用いて、疾患発症前の微生物叢組成に基づいて微生物リスク因子を絞り込み、それらを疾患転帰と関連付けることができた。 Usi 異なる遺伝的背景を持ち、異なる複合微生物叢組成を持つマウス

において、

アッケマンシア属がEAEの発病と最も負の相関がある

ことがわかった

。
そこで、この知見が、A. muciniphilaを含む、あるいは含まない、基準微生物叢を減少させた様々な組み合わせを保有する、遺伝的に均質な同系マウスで再現できるかどうかを検討した。その結果、A. muciniphilaは特定の減少した群集を保有するマウスにおいて、EAEの重症度と正の相関があることがわかった。A.muciniphilaに関する矛盾した結果は、他のグループの知見によっても裏付けられた。uciniphilaは様々なヒトのコホートにおいてMS患者で増加したと報告されている2,5,7,10,35。しかし、A. muciniphilaの腸内恒常性維持作用36,37や、マウス38,39やヒト40における自己免疫性神経炎症の進行抑制作用については、研究報告されていない。A.ムチニフィラの遺伝子型および表現型は多様であることから41、報告されているこれらの相違は、宿主に対する株特異的な影響に根ざしている可能性がある。しかし、すべての同胞実験に同じA. muciniphila株を用いた我々の研究は、リスクと疑われる菌種と微生物環境との相互作用が、微生物叢全体の疾患に影響を及ぼす可能性を決定的に形成していることを示唆している。

このことは、

微生物叢のプロファイルからより信頼性の高い結論を得るためには、単一の分類群だけでなく、特定の分類群の組み合わせに注目することが不可欠であることを示唆して

いる

。

メタトランスクリプトーム解析から、微生物叢の構成にわずかな変化があったとしても、つまり、減少した群集からA. muciniphilaを取り除いたとしても、すべてではないが、いくつかの腸内微生物の遺伝子発現パターンが大きく変化したことが示唆された。したがって、特定の微生物間ネットワークを解明することは、与えられた微生物叢全体の疾患促進特性を予測するのに役立つかもしれない。まだ技術的・解析的に洗練されたアプローチではないが42、メタゲノムに基づくネットワーク解析は現在、解析ツールとして研究されている43。 K メラノガスターのフィットネスに対する複数の微生物叢組成の影響を評価した研究では、微生物ネットワークの相互作用が、ある種の相対的な存在量だけよりも重要であることがすでに指摘されている44。の

研究では、制御された脊椎動物の異所性疾患モデルにおける包括的なデータセットに基づき、同様の革新的な知見が報告されている。
Extraは、特定の細菌代謝産物の濃度が疾患発症を予測できるかどうかを調べようとした。これらの代謝産物は細菌間ネットワークの結果である可能性があるからだ。その結果、代謝物濃度と疾患表現型との相関関係のみに着目した解析アプローチでは、偽陽性の潜在的な予測因子を選別してしまうことが明らかになった。より厳密な、文脈に焦点を当てた解析パイプラインを用いることで、2つのA. muciniphilaを包括する微生物叢組成において、GABAの糞便中濃度の上昇のみがEAEの増加と関連していることが明らかになった。また、EAE前のGABA濃度は、重症EAEのリスクを評価するのみで、個々の疾患発症を予測することはできなかった。我々の知見とは異なり、MS患者の糞便中GABA濃度は健常対照群と比べて低下していた45。A.muciniphila 46や他の腸内常在菌47,48がGABAを産生することは以前から報告されているが、他の微生物への影響や、その結果生じる神経炎症促進または予防特性については、いまだ解明されていない。また

、GABAやその他の代謝産物の潜在的な予測能は、特定の微生物叢の文脈で見なければならないため、普遍的な、あるいは個々の疾患予測因子としての実用性は低い。
このような微生物相特異的な影響に加え、宿主特異的な影響もEAE発症の決定的な要因であるように思われた。宿主の遺伝が微生物叢の構成に及ぼす影響については、よく報告されている32,33。しかし、性別や年齢が同じで、全く同じ常在菌を保有し、同じ標準化された条件下で生活している遺伝的に均質なマウスであっても、EAEの疾患経過にはかなりの個体差が認められた（図5b）。病気の進行は、宿主と個々の微生物ネットワークとの双方向の相互作用に由来することが示唆された49,50（Extended Data Fig. 複数の微生物に関連した測定値を広範囲に評価した結果、ある種の常在菌のICIは、このような宿主と微生物叢の相互作用を反映していることがわかった。発病前にこれらの種のICIを測定することで、すべての微生物-宿主の組み合わせにおいて、個々のEAEの進行を正しく予測することができた。一方、B. ovatusのICIは減少型群集で同定されたが、E. coprostanoligenesと P. doreiのICIはマウスモデルの複合型群集で信頼できる予測因子であった。これらの種は、EAEの進行に対する宿主と微生物叢の双方向的な影響を反映する「レポーター種」として機能することが示唆された。我々の研究の欠点は、これらのレポーター種やGABAのような代謝産物と病気の重症度との関連をメカニズム的に検証していないことで

ある

。
以上のことから、微生物叢の特徴に基づいた疾患経過の予測は一般的に可能であるが、微生物叢のメンバーの存在や存在量を調査するほど簡単ではないことが示された。我々は、病気の初期段階で我々のモデルを評価することはできなかったが、このような検証は、ICIを用いてレポーター種を同定することの臨床的妥当性を高めるだろう。しかし、このような宿主と微生物叢の双方向的な影響を反映するシグナルが、症状が現れると、より広範な免疫の変化によってマスクされてしまう可能性もある。このような微生物叢に関連した予測因子を同定するには、最終的に発病する未診断の患者を長期的にサンプリングする必要がある。このような研究計画は困難であるが、現在進行中のフィンランド健康早期微生物叢（HELMi）縦断的出生コホート51は、このようなアプローチを実施している研究の一つである。そのため、ある個人における疾患の経過を予測する能力は、その患者の治療計画に関して、より良い情報に基づいた臨床的決定を下すための貴重な要素となる。したがって、本研究で得られた知見に沿って、微生物叢に関連したデータ解析アプローチの再考と、微生物叢に基づく疾患経過予測因子の同定を目的とした前向きコホート研究の計画を推奨する

。

論文

マウス

実験
マウス実験は2段階の動物実験計画書承認手順に従った。ルクセンブルク大学動物実験倫理委員会（AEEC）が無菌およびgnotobiotic動物を用いた実験を、ルクセンブルク保健研究所動物福祉システム（AWS）がSPFマウスを用いた実験を、それぞれ評価・事前承認した後、ルクセンブルク農業・ブドウ栽培・農村開発省（Ministry of Agriculture, Viticulture and Rural Development）が最終承認した（プロトコル番号：LUPA2020/02、LUPA2020/02、LUPA2020/02）。020/02, LUPA2020/27, LUPA2020/32, LUPA2019/43, LUPA2020/2 and LUPA2019/51). 本試験は、欧州実験動物科学連盟（FELASA）に従って実施された。本研究は、2010年9月の欧州議会および欧州理事会による「科学的目的に使用される動物の保護に関する指令2010/63/EU」に基づき、「科学的目的に使用される動物の保護に関する2013年1月11日付大教訓（Règlement grand-ducal du 11 Janvier relatif à la protection des Animaux utilisés à des fins Scientifiques）」に従って実施された。SPFで飼育された野生型マウスとMuc2-/-マウスのEAE発症経過（AUC）（図1f（左））、α誤差0.0033（15群間比較までのボンフェローニ補正後）、検出力80％を考慮すると、我々の研究が十分に統計的に検出力を持つことを保証するためには、1群あたり最低4匹のマウスが必要であると判断された。

マウスの種類と飼育

条件

マウスは毎日12時間の光にさらされ、水と飼料は自由摂取とした。トビオティック実験では、Taconic Biosciences社から購入した雌のGF C57BL/6Nマウスを飼育し、ルクセンブルク大学のGF施設で飼育した。 マウスw 実験開始前に、GFの状態を調べた。実験開始時、すべてのマウスのGF状態は、2種類の非選択的培地（脳心筋注入ブロスおよび栄養ブロス）を入れた5ml培養管で糞便サンプルを嫌気的および好気的に培養した結果、細菌の増殖が観察されなかったことを確認することで確認した。
図1に示すように、SPF条件下で実施した実験では、Charles River Laboratories（フランス）から購入した5～8週齢の雌のC57BL/6J野生型マウスを用い、ルクセンブルク保健研究所のSPF施設に収容した。 さらに、M. さらに、スイスのベルン大学から入手したMuc2遺伝子欠損マウス（系統名：129P2/OlaHsd×C57BL/6-Muc2<tm1Avel>）をGF条件下で使用した。 GF 129 2/OlaHsd×C57BL/6-Muc2<tm1Avel>マウスをSPF飼育したC57BL/6Jマウスと交配させ、Muc2遺伝子の存在に対してヘテロ接合体（Muc2+/-）の子孫を得た。 Muc 2+/-マウスはMuc2+/-マウスと交配させた。マウスは、SPF飼育した親C57BL/6Jマウスと同じSPF条件下で飼育した。 次に、雌雄のMuc2マウスをSPF飼育した、 雌雄のMuc2 +/-マウスを交配し、Muc2遺伝子の有無について遺伝子型を決定した。 ホモ接合体Muc2+/-マウス

この交配で

得られたMuc2-/-マウスとMuc2 +/+マウスを実験に

用いた

。

Muc2遺伝

子の有無に関する遺伝子型

決定

ジェノタイピング
マウスの耳組織からMuc2遺伝子の有無を調べるには、SampleIN Direct PCR kit (HighQu, DPS0105)を用い、メーカーの指示に従って行った。プライマー1：5′-TCCACATTATCACCTTGAC-3′；プライマー2：5′-GGATTGGGAAGACAATAG-3′；プライマー3：5′-AGGGAATCGGTAGACATC-3′）を用いた。 PC は、アニーリング温度56℃、40サイクルで実施した。 プレゼン Muc2遺伝子が存在すると280bpのアンプリコンが得られ、存在しないと320bpのアンプリコンが得られた。nsは1.5％アガロースゲル上でゲル電気泳動により可視化された。

無菌マウスに合成微生物

叢を

投与

した場合。

ヒト合成細菌叢の細菌株を、Coy Laboratories社製のB型ビニール製嫌気チャンバーを用いて、嫌気条件下で培養・処理した。 合計で 6種類のSMの組み合わせを用い、ケージごとに無作為にGFマウスをコロニー形成させた。 非コロニー形成GFマウス 対照群として、コロニー化したGFマウスを用いた。 胃内投与 投与菌株の経口投与およびコロニー形成の確認は、別記20に詳述したとおり行った。 詳細 使用した14種類の

菌株について

、補足表1にまとめた。

マウス
標準的なマウス飼料（ファイバーリッチ）で維持するか、またはケージごとに無作為にファイバーフリー飼料に切り替えた。 を用いた。食物繊維を15％程度含むFR飼料：25 kGyガンマ線照射滅菌したgnotobioticマウス用のSAFE A04 chow（SAFE Diets, U8233G10R）、および9 kGyガンマ線照射滅菌したSPF飼育マウス用のSDS Standard CRM (P) Rat and Mouse Breeder and Grower diet（Special Diets Service, 801722）。 FF飼料：25 kGyガンマ線照射滅菌したSPF飼育マウス用のSDS Standard CRM (P) Rat and Mouse Breeder and Grower diet（Special Diets Service, 801722）。etはgnotobioticおよびSPF飼育マウスの両方に使用され、前述18.のようにHarlan TD.08810飼料を改良したものをベースにSAFE Dietsが特注製造した

。

マウス

実験の

タイムライン

非共生

条件下で

行わ

れた。


5～8週齢のマウスにFR飼料を与えながら、様々なSMの組み合わせ（上記参照）でコロニー形成させた。 5日後 最初のコロニー形成後、マウスは実験終了までFR食で維持するか、FF食に切り替えた。 マウスは以下のようにした。

最初の

経口投与から20日後にEAEを誘発するか（原稿では「+EAE」と表示）、EAEを誘発せずに最初の経口投与から25日後に臓器収集のために安楽死させた（原稿では「-EAE」と表示）。

SPF

条件下で

実施

遺伝子型はFR飼料で飼育・維持した。 6週齢時 6週間後、マウスをFF食に切り替えるか、FR食を維持した。 20日後、 いずれの食餌を与えたマウスにもEAEを誘導した。 経過

非同居

およびSPF条件下でのEAEは30日間観察された。

実験

微生物
SPFマウスからGFマウスへの移植として、SPF飼育Muc2-/-マウスまたはMuc2 +/+マウス（「ドナーマウス」）の3日齢の産仔を用い、新鮮な産仔と1:1 (v/v)で混合した。 この混合物を GFMuc2-/-o その後、C57BL/6Jマウス（「レシピエントマウス」）をGF施設からSPF施設に輸送した。 レシピエントマウス このリッターミックス入りケージで21日間、SPF条件下で飼育した。 ケージを避けるために

-レシピエントマウスの

遺伝子型に関係なく、各レシピエントマウスが他のレシピエントマウスと少なくとも5日間過ごすようにした。

utoimmune脳脊髄炎マウスを

免疫

した。

Hooke kitMOG35-55/CFA Emulsion PTX (Hooke Laboratories, EK-2110)を用い、製造者の指示に従って免疫した。 簡潔に言えば、マウスはMOG35-55/CFAエマルジョンPTXで免疫した。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質由来ペプチド（MOG35-55）と完全フロイントアジュバント（CFA）をプレフィルドシリンジで皮下注射して免疫した。 皮下注射 MOG/CFA（MOG35-551 mg ml-1および死菌結核菌H37Ra 2-5 mg ml-1/mlエマルジョン）混合物を、マウスの脇腹の両側それぞれ2回100μl（合計200μl）注射した。 さらに、百日咳毒素を注射した、 百日咳毒素（PTX）溶液は、MOGペプチド免疫化当日および最初の注射から48時間後に注射した。 グリセロールバッファー 安定化したPTXを滅菌PBSで希釈し、400 ng PTX(gnotobiotic実験)または150 ng(SPF条件下実験)を100 μlのPTX溶液で腹腔内注射した。 EAEの臨床症状スコアは、MOGペプチドを免疫したマウスと同じであった。症状スコアは、Extended Data Fig.3に示したスキームに従って毎日評価した。しかし、バイアスを防ぐため、EAEのスコアリングは独立した2人の研究者（A.S.とM.N.）によって行われた。 EAE関連指標 読み出し値は以下のように定義された：AUC、area-und Max、最大EAEスコア、RelM、再発期（27～30日目）の平均EAEスコア、SusO、感受性発現（少なくとも1日間2.5スコア）、RemO、寛解発現（Maxと比較してEAEスコアが1.5ポイント減少）、RelO、再発発現（寛解スコアと比較して1.0ポイント増加）。

サンプル採取

全群

マウス

ups（'-EAE'および'+EAE'）は、ミダゾラム（5 mg kg-1）、ケタミン（100 mg kg-1）およびキシラジン（10 mg kg-1）の組み合わせの腹腔内投与による終末麻酔を行い、その後氷冷PBSで心臓灌流を行った。 大腸内容物 糞便内容物、血液および臓器は、下流の分析のために採取した。 血清の分離 m、全血を37℃で30分間インキュベートし、続いて845×g、r.t.で30分間遠心分離した。MLN 細胞は、70 µm のセルストレーナーで機械的に通過させ、ホモジナイズした。氷冷PBSで800×g、10分間洗浄した後、氷冷PBSに再懸濁し、さらに使用するまで氷上で保存した。 大腸および回腸 脊髄を摘出し、Ca2+とMg2+を含まないHank's balanced salt solution（HBSS (w/o)）（10mMのHEPESで緩衝化）に氷上で一時保存し、摘出した脊髄はカルシウムを含むDulbecco's phosphate-buffered saline（D-PBS）に一時保存した。 3つの臓器はすべて、膵臓、膵臓、膵臓、膵臓に移植した。その後、以下のように

リンパ

球抽出を行った。

臓器

摘

出後

CLP、小腸固有層（SILP）およびSCからリンパ球を抽出した。 CLPおよびSILPリンパ球 SILPリンパ球はlamina propria dissociation kit（Miltenyi Biotec, 130-097-410）を用いて抽出し、SCリンパ球はbrain dissociation kit（Miltenyi Biotec, 130-107-677）を用いて、製造者の指示に従って抽出した。 簡単に言えば、結腸 糞便および脂肪を除去した。発行物を除去し、臓器を縦に開き、HBSS（w/o）で洗浄し、横方向に0.5cmの長さに切断した。 組織片 w 臓器を20 mlの消化前溶液（HBSS（w/o）、5 mM EDTA、5%ウシ胎児血清（FBS）、1 mMジチオスレイトール）に移し、連続回転下、37 °Cで20分間静置した。 試料は、攪拌後、濾過した。を10秒間ボルテックスし、100 µmのセルストレーナーにかけた。 最後の2つのステップを1回繰り返した。psを1回繰り返した。 組織片w その後、HBSS（w/o）に移し、連続回転下、37℃で20分間静置した。 ボルテックス後 その後、組織片を HBSS（w/o）に移し、37℃で20分間連続回転させた。その後、2.35 ml の消化液を含む GentleMACS C Tube（Miltenyi Biotec, 130-093-237）に移し、GentleMACS Octo Dissociator（Miltenyi Biotec, 130-096-427、プログラム 37C_m_LPDK_1）でホモジナイズした。 ホモジネートを以下のように調製した。5mlのPBバッファー（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.2、0.5%ウシ血清アルブミン含有）に再懸濁し、70μm細胞ストレーナーを通し、300×g、10分間、4℃で遠心した。氷冷したPBバッファーに再懸濁し、さらに使用するまで氷上で保存した。 脊髄索の調製 試料は、消化液の入ったGentleMACS C Tubeに移すまで、氷冷D-PBSで保存した。 試料は、GentleMACS C Tubeで処理した。GentleMACS Octo Dissociator（プログラム37C_ABDK_01）上で回収し、70 μm細胞ストレーナーですすいだ。 細胞懸濁液は、GentleMACS Octo Dissociator（プログラム37C_ABDK_01）上で回収し、70 μm細胞ストレーナーですすいだ。イオンフロースルーを300×gで 10 分間、4℃で遠心分離した。細胞ペレットを1,550μlのD-PBSに再懸濁し、450μlのデブリス除去液を加え、2mlのD-PBSでオーバーレイすることにより実施した。 サンプルはセ 4℃で3,000×g、10分間遠心した。サンプルを吸引し、細胞懸濁液を冷D-PBSで希釈した。 サンプルは、D-PBSで希釈した。細胞を再懸濁し、さらに使用するまで氷冷D-PBSに保存した。

およびフローサイトメトリー細胞

(106) （MLN
細胞懸濁液、およびCLP、SILP、SCからのリンパ球抽出液）を、2μlのBrefeldin A入り細胞活性化カクテル（Biolegend、423304）を添加した1mlの完全細胞培養培地（10％FBS、2mMグルタミン、50Uml-1ペニシリン、50μgml-1ストレプトマイシン、0.1％メルカプトエタノールを含むRPMI）に再懸濁し、37℃で4時間インキュベートした。500×gで5分間フーガし、100μlのZombie NIR（PBS中1:1,000、Zombie NIR Fixable Viability kit、Biolegend、423106）に再懸濁し、96ウェルプレートに移し、暗所4℃で20分間インキュベートした。 細胞を洗浄した。FACS バッファー（1x PBS/2% FBS/2mM, EDTA pH 8.0）で希釈した 50μl の Fc-ブロック（1:50, 精製ラット抗マウス CD16/CD32, BD, 553142）に懸濁した。 細胞をインキュベートした。暗所、4℃で20分間静置した後、150μlのPBSで2回洗浄し、400×g、4℃で5分間遠心した。BD Cytofix/Cytoperm solution（BD、554722）で30分間静置し、PBS中で一晩保存した。 細胞外および細胞内の場合 細胞内蛍光細胞染色を行った後、BD Perm/Wash buffer（BD, 554723）で15分間細胞を透過処理した。 Tリンパ球の評価 以下の抗体を用いて評価した：ラット抗マウスIL-17A（TC11-18H10.1, 1:50, Biolegen d、506922）、ラット抗マウスRORγt（AFKJS-9、1：44、eBiosciences、17-6988-82）、ラット抗マウスCD3（17A2、1：88、Biolegend、10 0241）、ラット抗マウスCD45（30-F11、1:88、BD、564225）、ラット抗マウスCD4（RM4-5、1:700、Biolegend、100548）、ラット抗マウスIFN-γ（XMG1.2、1:175、eBiosci ences、61-7311-82）、ラット抗マウスFoxP3（FJK-16s、1:200、ThermoFisher、48-5773-82）、ラット抗マウスCD8（53-6.7、1:700、Biolegend、100710）。 最適染色濃度 すべての抗体の濃度は、染色前に評価した。 細胞をインキュベート FACS バッファーで希釈した抗体で、暗所、4℃で 30 分間染色した。 サンプルは、1.5μg/mL で 2 回洗浄した。その後、150μlのBD Perm/Washバッファーで2回洗浄し、200μlのPBSに再懸濁し、NovoCyte Quanteonフローサイトメーター（NovoCyte Quanteon 4025、Agilent）を用いてデータを取得した。 すべての取得データ FlowJoソフトウェア（v.10.7.2、BD、2019）を用いて解析した。 蛍光最小値 シグナル陽性細胞および陰性細胞を適切に評価するために、各抗体-フルオロフォアの組み合わせについて、FMOを使用した。 単一抗体染色ウルトラFMO FlowJoでコンペンセーションマトリックスを作成するために、染色されたUltraComp eBeadsコンペンセーションビーズ（Fisher Scientific, 01-2222-42）を使用した。 単一抗体染色コンペンセーションビーズは、FlowJoでコンペンセーションマトリックスを作成するために使用した。染色されたコンペンセーションビーズは、サンプルに使用された抗体と全く同じロットを用いて、各ランごとに別々に作成された。 不十分であったため BV786結合ラット抗マウスCD45抗体（30-F11, 1:88, BD, 564225）をコンペンセーションビーズに結合させた後、BV786結合抗マウスSiglec-F抗体（E50-2440, BD, 740956）を用いてコンペンセーションマトリックスを計算した。 コンペンセーションサンプル FSC-HおよびSSC-Hチャンネル内のコンペンセーションビーズの集団にゲーティングし、対応する抗体の陽性集団と陰性集団を、強い蛍光スピルオーバーのあるチャンネルの二次元描写で同定した。 コンペンセーションマット 各ランについて個別に氷を計算し、この特定のランのサンプルに適用した。 tを適用した後、補正マトリクスを適用した。補正行列を計算したサンプルは、ゲーティング戦略を受け、Extended Data Fig. 単離されたリンパ球は盲検化され、ゲーティング戦略は少なくとも2人で検証された。 検体の質w SSC-H対FSC-H」および「Live/Dead対SSC-H」の描出におけるイベント分布を評価し、品質およびイベント数が不十分なサンプルは解析から除外した。 SSC-H対FSC-H」の描出におけるイベント分布を評価し、品質およびイベント数が不十分なサンプルは解析から除外した。EAE誘発マウスの脊髄へのCD45+リンパ球の差分浸潤は、EAE関連リンパ球集団の割合を「Viable」ゲートの細胞のパーセンテージとして計算した。 サンプルを採取するには 軽度/重度EAEクラスター間で%Vを比較できるようにし、下流の解析バイアスを減らすため、「全」解析サンプルの平均±s.d.の範囲内に%Vがあるサンプルのみを対象とした（Extended Data図7e（左上パネル））。 サンプル採取後 その結果、残存するゲーティングバイアスが排除され、ダウンストリームゲートの違いに対処するための均質な親集団が得られた。 ダウンストリーム解析 標的細胞集団の相対的な割合の測定は、RStudio（v.4.2.1）を用いて行った。 個々のサンプル EAE非誘発マウスの場合は標的細胞集団、臓器、EAEグループの表現型ごとに、EAE誘発マウスの場合は標的細胞集団、臓器、EAE重症度クラスタごとにグループ分けした。 外れはグループごとに判定した。

V4 16S rRNA遺伝子の

塩基配列は、

グループごとに

決定され

、平均値±2σの範囲内にない値はデータセットから削除された。

配列決定および解析細菌

DNA抽出
大腸および回腸内容物からの作用は、既報18 と同様に行った。 A Qubit dsDNA HS dsDNA 濃度の定量には ssay kit（Life Technologies、Q32854）を使用した。 16S rRNA 遺伝子の V4 領域 16S rRNA遺伝子は、文献52に記載のデュアルインデックスプライマー（フォワード：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；リバース：5′-TAATCTWTGGGVHCATCAGG-3′）を用いて増幅した。 ライブラリーの前処理 参考文献 nは、Quick-16S NGS Library Prep kit（Zymo Research、D6400）を用いて、製造業者のプロトコールに従って実施した。 プールされたライブラリーは、配列決定された。ルクセンブルクのIntegrated BioBank（IBBL、Dudelange、ルクセンブルク）にて、MiSeq Reagent kit v.2 (500-cycle) (Illumina, MS_102_2003)を使用し、Illumina MiSeqシステムで配列決定を行った。 プログラムmothur ur（v.1.44.3）53を使用し、MiSeqプロトコルに従ってリードを処理した。 異種動物サンプルについて サンプルについて、SM14分類群および潜在的汚染物質（Citrobacter rodentium、Lactococcus lactissubsp.cremoris、Staphylococcus aureus、S. epidermidis）に対応するカスタム参照データベースに対して、k-最近傍コンセンサスアプローチを用いて分類を割り当てた。 SPFサンプルについて、 SILVA v.132データベースに対してWang法を用いてaxonomyを割り当てた。 グループワイズ解析 RStudio(v.4.2.1)を用いて、8,765の初期シードセットでアノテーションされたリードの解析を行った。 オペレーショナル分類群 少なくとも1つのグループ（グループ平均）内のリードの0.01%以上を構成しないmicユニット（OTU）は解析から除外した。 多様性指標 veganパッケージ(v.2.6.2)の'diversity()'関数を用いて求めた。 非計量的多次元尺度法 Bray-Curtis距離行列のメンシオナル・スケーリングは、veganパッケージの'metaMDS()'関数を用いて計算し、重み付けされたUniFrac距離行列の主座標分解は、apeパッケージ(v.5.6.2)の'pcoa()'関数を用いて計算した。 すべての分析は、OTUごとに行った。OTU、属、ファミリーレベルで実施した。 OTUs and genera c veganパッケージの'simper()'関数を用いて、選択したグループ間の群集の違いに最も寄与するものを抽出した。 特に指定がない限り

以上より

、SMマウスの菌株構成はすべてV4 16S rRNA遺伝子配列決定に基づいている。

f SM14の構成株

系統

樹を作成した。

全長16S rRNA遺伝子配列に基づいて系統樹を作成し、Geneious Prime v.2021.2.2を用いて解析した。アーカイブ(ENA)のアクセッション番号は、補足表1に記載されている。 近傍結合樹（neighbor-joinin ツリービルドモデルは、フリーエンドとギャップを含むグローバルアライメント、65%類似性インデックスコストマトリックス、Tamura-Nei遺伝的距離モデルを用いて作成した。

absolomicsの処理と解析糞便

代謝物
凍結乾燥したサンプル約10 mgから、内部標準物質として20 μMのメチオニンスルホンおよび20 μMのD-カンファー-10-スルホン酸を添加した500 μlの100%メタノールで激しく振盪することにより抽出した。 4つの3 mmジルコニアビーズ ビーズ（BioSpec社製）と0.1 mmジルコニア/シリカビーズ（BioSpec社製）～100 mgをこの混合液に添加した。 その後、サンプルを振とうした。次に、500μlのクロロシリカビーズを添加した。roformと200μlのMilli-Q水を加え、再び5分間激しく振とうした後、4,600×g、4℃で30分間遠心分離した。内容物の上清と血清サンプルをメタボローム解析用の 5 kDa カットオフフィルターカラム（Ultrafree MC-PLHCC 250/pk）に移した（Human Metabolome Technologies）。 フロースルーは真空下で乾燥させた。残渣は真空下で乾燥させた。基準化合物（200 μM 3-アミノピロリジンおよび200 µMトリメシン酸）を含む50 μlのMilli-Q水で抽出した。 余分な代謝物のレベル 代謝物は、Agilent 6230 TOF LC/MS システム (Agilent) を搭載した Agilent 7100 キャピラリー電気泳動システム (Agilent) を用いて、キャピラリー電気泳動-飛行時間質量分析 (CE-TOF/MS) により、正イオンモードと負イオンモードの両方で測定しました。 メタボロームスペクトル nd 濃度の計算 (補足表2および3) は、既報54 と同様に、ソフトウェア「MasterHands」v.2.19.0.2 (慶應義塾大学、日本) を使用して、盲検下で実施しました。
濃度は nmolg-1caecal content から pmolg-1 に変換した。 175代謝物のみ これらの代謝物は、7つの試験群のうち少なくとも50％の検体で検出可能であった。 検出不可能な濃度 特定のサンプルにおけるこれらの175代謝物の比率は、全グループにわたるこの特定の代謝物の検出可能な最低値の1/3の値で置換された。 濃度は次のように計算された。短鎖脂肪酸濃度 id定量は既述の方法で行った19。

スクリーニングパイプライン

EAEの

表現型が

メタボローム全体のパターンから代謝物の種類が切り離されたため、観察された EAE 疾患の経過の違いを説明する可能性のある単一の代謝物を探しました。 特に、次のことを行いました。そこで、A. muciniphilaの存在と関連する可能性のある代謝物を特定することに興味を持ち、以下のようなスクリーニングパイプラインを実装しました。EAEの転帰におけるA. muciniphilaに関連した違いを説明する可能性のある潜在的な注目代謝物を同定するために、18の独立した分析からなるスクリーニングパイプラインを構築した。 これらの分析には以下が含まれる。代謝物濃度とEAE関連測定値との相関分析（Extended Data Fig.5a）、代謝物濃度の群間比較（Extended Data Fig.5b）、およびA. muciniphilaの存在または任意の微生物叢の存在との相関分析を行った。 これらの分析から得られた情報を組み合わせることで、A. muciniphilaの存在または任意の微生物叢の存在との相関が明らかになった。これらの解析から得られたイオンは、EAE誘発マウスにおけるEAE発症を予測できる微生物群誘導性糞便代謝産物のショートリストを作成し、これらがA. muciniphilaと関連しているかどうかを評価することを目的とした。 その結果、A. muciniphilaと関連している可能性のある代謝産物は、EAE発症を予測できる微生物群誘導性糞便代謝産物であることが判明した。(1)全体的に有意な濃度差がある。一元配置分散分析(ANOVA)により、7群間で濃度が有意に異なること（図3c, 'SIG'および拡張データ図5c, 'SIG'）。 以下のように観察された。(2)EAE誘発マウスにおいて、試験したすべてのEAE関連測定値（図3 c、'AUC'、'RelM'、'SusO'、'Max'および拡張データ図5a,c）と有意な相関があった。A.muciniphilaの有無によって異なるEAE表現型が観察されたため、'AM'（拡張データ図5c）；および（4）非EAE誘導SM13コロニー化マウスと非EAE誘導SM14コロニー化マウスを比較した場合、これらの微生物叢組成を保有することによって、EAE誘導時に異なるEAE表現型が観察されたため、有意に異なる濃度が観察された（図2c（左））。 この基準は、EAE誘導マウスにおけるA.

メタトランスクリプトーム

解析により、

糞便代謝物濃度の予測的側面が評価できる。

ysesフラッシュ

凍結した

糞便

内容物

RNAProtectバクテリア 試薬（1 ml、Qiagen、76506）を各サンプルに加え、ウェットアイス上で10分間解凍した。 サンプルを遠心分離した。RNAProtect Bacterial Reagentをピペッティングにより除去した。 次に、250 µlの酸で洗浄した。edガラスビーズ（212-300μm）、500μlのバッファーA（0.2M NaCl、0.2M Trizma base、20mM EDTA pH 8）、210μlの20% SDS、500μlのフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール（125:24:1、pH 4.3）をペレットに加えた。 hでのビーズビーティング ミキサーミルを用いて最頻度（30Hz）を5分間行い、18,000×g、4℃で3分間遠心分離した後、水相を回収した。各サンプルにmyl alcohol（500 μl、125:24:1、pH 4.3）を加え、前述と同様に遠心分離した。 再び、水相を回収した。seを回収し、1/10容量の3M酢酸ナトリウム（pH～5.5）と1容量の氷冷100%エタノールを加え、転倒混和した。 サンプルをインキュベートした。氷冷70％エタノール500μlで2回洗浄し、18,000×g、4℃で5分間遠心した。DNase 処理は p 10µlの10Xバッファー、40µlのヌクレアーゼフリー水（最終容量が100µlになるように）、2µlのDNase I（Thermo Scientific、DNase I、RNase-free kit、EN0521）を加え、37℃で30分間インキュベートした。ample）を加え、65℃で10分間熱不活性化した。RNeasy Mini kit (QIAGEN, 74106)を用いて、製造元の指示に従って実施した。 RNA量と質 tyはRNA 6000 Nano kitを用いてAgilent 2100 Bioanalyzerで評価した。 ライブラリー調製w Stranded Total RNA Prep, Ligation with Ribo-Zero Plus kit (Illumina, 20040529)を使用し、プールライブラリーを作製した。その後、Illumina NextSeq 550プラットフォーム上で、High Outputフローセル、続いてLuxGen PlatformのMedium Outputフローセルを用いて、2 × 75 bp構成でシーケンスした。 RNAシーケンスファイル 前処理はkneaddata(https://github.com/biobakery/kneaddata)を用いて行った。 アダプターは除去した。BowTie2(ref.56)を使用した。rRNAデータベースまたはMusculusゲノムのいずれかに対応するコンタミネーションリードをマップし、除去するために使用した。 Clean fastqファイルを作成した。HUMAnN3(参考文献57)に渡す前に連結した。 カスタムタクソノミータブ メタゲノムマッピングのために、プールされた16S rRNAシーケンスのアバンダンスに基づくeがMetaPhlAnに提供された。 未アラインメントリードは、以下のように翻訳された。HUMAnN3内で提供されているUniRef90データベースを使用して、タンパク質同定のために翻訳された。 全サンプルのデータ 結果を1つのテーブルに結合し、100万リードあたりのカウント数(CPM)に正規化した。 結果をグループ化した。アノテーションがない場合 UniRef90の転写産物IDから可能であれば、異なるIDを別々の遺伝子産物として扱った。 以下の遺伝子産物のみ。調査した 8 サンプルのうち、少なくとも 2 サンプルで 50 CPM 以上を示した t を下流の解析に含めた。 その結果、2,213 件の転写産物が得られた。その結果、全 CPM の 80%～85%に相当する転写産物が下流解析に含まれ、解析グループ間に有意差は見られなかった。 CPM の再計算 その後、R Studio (v.4.2.1)の'edgeR'パッケージ(v.3.38.4)を用いてさらに解析を行った。 多次元リダクション トランスクリプトームプロファイルの変化は、'plotMDS.DGEList'関数内でlog(fold change (FC))法を用いて計算した。 グループワイズ比較 f遺伝子発現は'exactTest()'関数を用いて計算した。

ndex

細菌を決定する
IgAコーティング指標は、以前に発表されたアプローチ31に従った。 糞便サンプルの保存 糞便ペレット1個あたり500μlの氷冷滅菌PBSに-20℃で再懸濁し、プラスチック製接種用ループを用いて機械的にホモジナイズした。 ペレットは、その後、十分に振盪した。サーモミキサー（エッペンドルフ社製）で、1,100 r.p.m.、4 °C で 20 分間振盪した。氷冷したPBSを加え、100×g、4℃で3分間遠心し、未溶解の残渣を沈殿させた。 透明な上清を回収し、この残渣を濾過した。70μmのふるい（PluriSelect, 43-10070-40）を通過させた後、10,000×g、4℃で5分間遠心し、細菌を沈殿させた。 上清を除去した。ペレットを1mlの氷冷PBSに再懸濁した。 次に、光学密度 この懸濁液の600 nm（OD600）を検出し、OD600＝1＝5×108個/mlと仮定して、おおよその菌濃度を推定した。109個の菌に相当するペレットを10,000×g、4℃で5分間遠心した。400μlの5%ヤギ血清（Gibco, 11540526）中 PBSに懸濁し、氷上で20分間インキュベートした。 インキュベート後、ペレットを除去した。ペレットを氷冷PBSで1回洗浄し、10,000×g、4℃で5分間遠心した。4μgのフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合ヤギ抗マウスIgA抗体（SouthernBiotech, Imtec Diagnostic, 1040-02）を含む100μlの氷冷PBSに懸濁した。 4μgの抗体と4μgのFITC結合ヤギ抗マウスIgA抗体（SouthernBiotech, Imtec Diagnostic, 1040-02）の比率は、10,000×g、4℃で5分間遠心した。Rag1-/-マウスの糞便サンプルを非IgAコート陰性対照として用い、109個の細菌を染色するためのそれぞれの抗体は、非IgAコート細菌を非特異的に染色することなく使用できる抗体の最大量であると以前に評価された。 サンプルはその後、インキュベートされた。インキュベーション後、1mlの氷冷PBSを加え、10,000×g、4℃で5分間遠心した。フローサイトメトリー検出またはIgA+菌とIgA-菌の分離に供した。 即時フローサイトメトリー検出の場合 測定後、ペレットを200 µlのDNA染色液（0.9% NaCl in 0.1 M HEPES, pH 7.2, 1.25 µM Invitrogen SYTO 60 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain, Fisher Scientific, 10194852）に懸濁し、氷上で20分間インキュベートした。 PBSで1回洗浄した後、ペレットをPBSで1回洗浄した。ペレットを 100 µl の PBS に懸濁し、NovoCyte Quanteon（NovoCyte Quanteon 4025、Agilent）で直ちに測定しました。 IgA+の分離のために IgA-細菌からの分離には、Miltenyi社のMACS細胞分離システムを使用した。 ペレットの再懸濁 菌109個あたり10μlの抗FITCマイクロビーズ（Miltenyi社製、130-048-701）を含む100μlの染色バッファー（PBS中の5％ヤギ血清）中にIgA+とIgA-を添加し、よく混合した後、4℃で15分間インキュベートした。その後、ペレットを菌体109個当たり 5 ml の染色バッファーに再懸濁し、MACS LD 分離カラム（Miltenyi, 130-042-901）にロードし、IgA-画分を含むフロースルーを回収した。 カラム除去後 IgA +画分を回収した。MACS LS 分離カラム（Miltenyi, 130-042-401）に負荷し、フロースルーを回収した。カラム除去後 マグネットからIgA+菌画分を流し出し、回収し、前のIgA+画分と合わせた。 両者を合わせた画分 その後、IgA+とIgA-を10,000×g、4℃で10分間遠心分離した。を1mlのPBSに懸濁し、2種類の下流分析に供した。フローサイトメトリーによる各サンプルの両分画のうち、懸濁液量の10％を、上述のSYTO 60赤色蛍光核酸染色液を用いた細菌DNA染色に用いた；(2) 細菌を精製するため その後のV4（SMマウス）または全長（SPFマウス）の16S rRNA遺伝子配列決定のために、懸濁液量の90％を10,000×g、4℃で10分間遠心分離し、上清を捨て、乾燥ペレットを-20℃で保存した。その後、RNA遺伝子配列決定を以下のように行った。 ある種のICI ciesx（ICIx）は、Ax +がIgA+画分における株特異的相対存在量を表し、Ax-がIgA-画分における株特異的相対存在量を表す、以下の式を用いて算出した： \{{rm{ICI}}}_{x}={ log }_{10}left(￢frac{A}_{x}^{+}}{{A}_{x}^{-}}￢)￢ F

ull-length 16S rRNA g

eアンプリコンの配列決定と解析DNAを

I
マウス糞便サンプルの A+、IgA-、および全分画（未分画）を、既報の方法18. で分離した後、PCR を行った。アニーリング温度51℃の16S rRNA遺伝子特異的フォワードプライマー（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）およびリバースプライマー（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）を用いたormed PCR支援完全長16S rRNA遺伝子増幅。精製したサンプルは、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit (Macherey Nagel)を用いて、メーカーの指示に従い、1 kbpを超えるリードに対して推奨される方法に従って精製した。 二本鎖DNA濃度 Qubit dsDNA HS assay kit (Life Technologies, Q32854)を用い、Invitrogen Qubit 4.0 fluorometer (Life Technologies, Q33226)でクリーンアップ後の挿入量を測定した。 DNA修復とエンドプレップメント レーション、ネイティブバーコードライゲーション、アダプターライゲーションおよびクリーンアップは、製造元がNanopore Community（Oxford Nanopore）で提供する2022年9月15日からのNative Barcoding Kit 96 V14（SQK-NBD114.96） プロトコルに記載されているとおりに実施した。 バーコード化サンプルライブラリ MinIONフローセル(R10.4.1)にドロップワイズでロードし、MinKNOW(v.23.07.15)の400bps出力モードで65時間シーケンスし、約680万リード(N50 1.5kb)を生成した。 Fast5のRawデータファイルは、以下のように変換した。POD5 Tools (v.0.2.0)を用いてpod5形式に変換した後、super-accuracy modeでベースコールし、Dorado (v.0.4.3)を用いてgpuパーティション上でSQK-NBD114-96キットのバーコードに従ってデマルチプレックスした。 デマルチプレックスしたbam fは以下の通り。lesはsamtools（v.1.16.1）のbam2fastqを用いてfastq形式に変換され、NanoFilt（v.2.8.0）を用いて、Phred quality scoreが10以上、read lengthが1,300～1,700 bpのものだけが保持されるようにフィルタリングされた。 分類学的分類法 emu（v.3.4.5）を使用し、-keep-countsフラグを付け、rrnDB v.5.6と2020年9月17日時点のNCBI 16S RefSeq、および同日時点のNCBIのタクソノミーを組み合わせたデフォルトのEmu 3.0+データベースを使用した。 完全未アサインリード rarecurve()'関数は、'rarecurve()'関数と'rarecurve()'関数を組み合わせたものである。veganパッケージ(v.2.6-4)を用いてアンダーサンプリングサンプルを同定し、これもダウンストリーム解析から除外した。 残りのサンプルのカウントテーブル phyloseqパッケージ(v.1.40.4)を用いて、α-多様性を決定した。 α-多様性を構成しないバクテリアの特徴 各群の微生物相-ドナーおよび微生物相-レシピエントの組み合わせにおいて、少なくとも2匹のマウスで0.01%以上のリードを占めたサンプルは解析から除外した。 リードカウントは正規化した。相対的存在量を計算し、アークサイン平方根変換を行う。 ベータ多様性指標 相対存在量はphyloseqパッケージ(v.1.40.0)を用いて求めた。分類単位とサンプルはfantaxticパッケージ（v.0.2.0）を用いて可視化

した

。

の

一晩

コーティングの

場合

。

高結合性384ウェルプレート（Greiner, 781061）を用い、1ウェルあたり10 ngのウサギ抗マウスIgA（Novus, NB7506）を、1ウェルあたり20 µlの炭酸-炭酸水素緩衝液（Sigma, C3041）に溶解した。 その後、プレートを洗浄した。洗浄バッファー（10 mM Trizma Base、154 mM NaCl、1%(v/v) Tween-10）中に 75 µlのブロッキング液で洗浄する。 次に、75 µlのブロッキング液で洗浄する。バッファー（15 mM Trizma Acetate, 136 mM NaCl, 2 mM KCl, 1% (w/v) bovine serum albumin）を各ウェルに加え、r.t.で2時間インキュベートした。 洗浄バッファーでもう1回洗浄した後、サンプルと標準品を希釈バッファー（ブロッキングバッファー+0.1% (w/v) Tween-20）で希釈した。 標準品として、マウスIgを用いた。ouse IgA アイソタイプコントロール（Southern Biotech, 0106-01）。 20 µl の標準品溶液を調製した。希釈液を各ウェルに添加し、r.t.で90分間インキュベートした後、さらに洗浄ステップを行い、アルカリホスファターゼを結合させた二次ヤギ抗マウスIgA抗体（Southern Biotech, 1040-04）を希釈バッファーで1:1,000に希釈したものを添加した。 二次抗体は、1:1,000に希釈バッファーで1:1,000に希釈したものを添加した。プレートを4回洗浄した。 基質として、リン酸塩錠1個を用いた。錠剤（Sigma, S0642-200 TAB）を 10 ml の基質バッファー（1 mM 2-amino-2-methyl-1-propanol and 0.1 mMMgCl2× 6H2O）に溶解した。 この基質溶液のうち、40 µm を、0.1 mM MgCl2 × 6H2O に溶解した。n, 40 µlを各ウェルに添加し、37℃で60分間インキュベートした。m を SpectraMax Plus 384 マイクロプレートリーダーで検出

した

。

血清中の糖鎖

LPSレベルの

定量

血清中のリポ多糖の定量は、Pierce Chromogenic Endotoxin Quantification kit（ThermoScientific, A39552）を用い、メーカーの指示に従って行った。 解凍した血清サンプルは、以下のようにした。測定前に、70 °C で 15 分間ショックを与え、1:50 に希釈した。 ブランク除去後、最終エンドトキシン濃度を測定した。lエンドトキシン濃度は、供給された標準物質の検出ODを基に、RStudio（v.4.2.1）を使用し、'drc'パッケージ（v.3.0.1）の助けを借りて標準物質のODの4パラメータ非線形回帰を適用し、'drm(OD~concentration, fct = LL.4())'関数を使用して計算した。 検体濃度は、'drm(OD~concentration, fct = LL.4())'関数を使用して計算した。その後、同じパッケージの'ED(type = 'absolute')'関数を用いて抽出

した

。

血清中のオクルジン

濃度を

測定する。


血清中のゾヌリン(ZO-1)とオクルディン(OCLN)の定量には、それぞれMouse Tight Junction Protein ZO-1 ELISA kit (MyBioSource, MBS2603798)とMouse Occludin (OCLN) ELISA kit (Reddot Biotech, RD-OCLN-Mu)を使用し、製造元の指示に従って行った。 ブランク減少後、最終的なZO-1の濃度を測定した。ZO-1 と OCLN の濃度は、供給された標準物質の検出 OD を基に、R Studio（v.4.2.1）を用い、drc パッケージ（v.3.0.1）を用いて標準物質の OD を 4 パラメーターの非線形回帰に当てはめ、drm(OD~concentration, fct = LL.4())関数を用いて算出した。 検体濃度は、t. 同じパッケージのED(type = 'absolute')関数を用いてenを

抽出

した。

糞便中の

糞便リポカリン

2を測定する。

(LCN2)濃度を測定するために、糞便ペレットを1% Tween-20を加えた500μlの氷冷PBS中でホモジナイズした。 サンプルは、1% Tween-20を加えた500μlの氷冷PBS中でホモジナイズした。サーモミキサー（エッペンドルフ社製）を用いて、4℃で20分間、2,000 r.p.m.で撹拌し、その後、4℃で10分間、21,000×gで遠心分離した。最終的なLCN2検出は、LCN2 検出用培地を用いて行った。Mouse Lipocalin 2/NGAL DuoSet Elisa（R＆D Systems、DY1857）を用い、製造元の指示に従った。

定量的リアルタイム PCRT による

相対量の

検出

非遺伝子組換えマウス（SM01～SM14）の糞便サンプルから常在細菌を定量するため、他で発表されたqPCRプロトコール20に従った。 株-sp用プライマー配列

糖

鎖分解酵素活性の

測定結果は、

補足表1に

示す。


糞便中のes

α-フコースの活性を

検出する

ために

ダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、およびサルファターゼを、-20℃で保存した糞便サンプル

より測定した

。

1匹あたりの値
useは生物学的複製を表す。 hが予想されたデータセット。残差の正規化分布を、Tukeyのポストホック検定を用いた一元配置分散分析を用いて解析した。 データ分布は正規分布と仮定した。正規分布でないデータまたは順序データは、正規分布であることを確認した。Kruskall-Wallis 検定と複数の Wilcoxon rank-sum 検定を用い、Benjamini-Hochberg 法でP 値を調整した。 相関分析は未調整。方向性は仮定されなかった したがって、実行された検定はすべて両側検定であった。 すべての箱ひげ図は個々の点を表示する。中央傾向の指標として中央値に重なるように、四分位範囲（IQR、第1または25パーセンタイルから第3または75パーセンタイル）を枠で囲み、「最小値」（第1四分位値から1.5×IQRを引いた値）と「最大値」（第3四分位値に1.5×IQRを加えた値）をひげで囲んだ。 統計的有意性は次のように定義された。有意でない比較にはラベルを付けないか、「NS」と

表示

する。

研究計画
署名は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryで入手

可能

である。
本研究の報告
16S rRNA遺伝子シーケンス（V4および全長アンプリコン）およびRNAシーケンスは、EMBL-EBIのEuropean Nucleotide Archive (ENA)にアクセッション番号PRJEB60278(https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB60278)で寄託されている。 CE-TOF/MSの生スペクトルデータ エタボローム解析は、メタボローム統合データリポジトリMetaboBankのプロジェクトID MTBKS223(https://mb2.ddbj.nig.ac.jp/study/MTBKS223.html)で利用可能です。 フローサイトメトリーデータは利用可能です。Zenodoデータリポジトリ(https://doi.org/10.5281/zenodo.12528901)59。ソースデータは本論文に添付されています。論文.

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参考文献をダウンロード

謝辞
tsこの

研究は
によって移植された。
M.S.D.の研究室における助成金：ルクセンブルク国立研究基金（Luxembourg National Research Fund (FNR）CORE助成金（C15/BM/10318186およびC18/BM/12585940）、BRIDGES助成金（22/17426243）およびFNR INTER Mobility助成金（16/11455695）。 p（11602973）をA.P.に、E.T.G.はFNR PRIDE助成金（PRIDE17/11823097）およびルクセンブルク財団の庇護の下、Fondation du Pélican de Mie et Pierre Hippert-Faberの支援を受けた。 MEDICE Arzneimittel Püttに感謝する。r GmbH and Co. KG（ドイツ）、Theralution GmbH（ドイツ）。ドイツ、官民パートナーシップFNR BRIDGES助成金(22/17426243)による資金援助に感謝する。 H.O.は日本学術振興会の助成を受けた。E.M.は、日本学術振興会特別研究員（KA）の助成を受けた。ENHI（19K05907）、（財）ロッテ財団、（財）日本ワックスマン財団、（財）飯島記念食品科学技術振興財団、（財）アステラス製薬代謝疾患研究振興財団 S.F.（CE-TOF/MSメタボローム含む mic解析）は日本学術振興会科研費（22H03541）、JST ERATO（JPMJER1902）、AMED-CREST（JP22gm1010009）および財団法人食品科学総合研究所の助成を受けた。 謝意を表し、N. Nicoに謝意を表する。LuxGenプラットフォームおよびIntegrated BioBank of Luxembourg (IBBL)のB. De Witt、L. Castillo、W. Ammerlaanにはシークエンシングの支援を、National Cytometry Platform (NCP)のM. KostadinouとF. Hedinにはフローサイトメトリーの支援を受けた。 NCPはLuxembourの支援を受けている。また、C. Jäger、X. Dong a.、C. Jäger、X. Dong a.に感謝する。d.GC-MS分析のサポートをしてくれたLuxembourg Centre for Systems Biomedicine (LCSB) Metabolomics PlatformのF.Gavotto、ベルン大学からMuc2-/-マウスを提供してくれたK.McCoy。 最後に、Luxembourg Center for Systems Biomedicine (LCSB)のメンバーに感謝する。LIHの栄養・マイクロバイオーム・免疫チームには、原稿修正時に建設的なフィードバックをいただいた：Y. Baumann, H. De Franco, M. Joja オープンアクセスのため、A.Rolofに謝意を表する。助成金契約から生じる義務を果たすため、著者は本投稿から生じたすべての

Author

Accepted ManuscriptバージョンにCreative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0)ライセンスを適用した。

  1. これらの著者は
    等しく貢献
    Alex Steimle, Mareike Neumann.

Au 著者および所属

  1. 部局

    感染免疫学部
    y, Luxembourg Institute of Health, Esch-sur-Alzette, Luxembourg
    Alex Steimle, Mareike Neumann, Eri
    a T. Grant, Stéphanie Willieme, Alessandro De Sciscio, Amy Parrish, Markus Ollert & Mahesh S. Desai

  2. Faculty of Science, Technology

  3. and Medicine, Luxembourg.

  4. Medicine, University of Luxembourg, Esch-sur-Alzette, Luxembourg
    Mareike Neumann, Erica T. Grant & Mahesh S. Desai.
    my Parrish

  5. 皮膚・アレ

  6. 科

  7. gy Center, Odense Research Center for Anaphylaxis, University of Southern Denmark, Odense, Denmark
    Markus Ollert & Mahesh S. Desai

  8. RI

  9. EN統合医療センター
    l Sciences, Yokohama City, Kanagawa, Japan

  10. Eiji

  11. Miyauchi & Hiroshi Ohno

  12. Insti

  13. .

  14. 先端生命科学研究所
    慶應義塾大学、山形、日本
    曽我朋義 & 福田真司

Con
業績概要M

.S.D.が監修した

。


研究, 収穫

A.S.、M.N.、M.O.、E.M.、H.O.、M.S. A.S.、M.N.、E.M.、H.O.およびM.S.D.は研究を発案した。A.S.、M.N.、S.W.およびA.D.S.が実験を実施した。E.T.G.とA.P.はマウス実験を手伝った。A.S.とM.N.はEAE scorを実施した。T.S.とS.F.はCE-TOF/MSを実施した。A.S.、M.N.および E.T.G.は、EAE のスコアリングを行った。TA.A.S.はRスクリプトを作成した。A.S.、M.N.、E.T.G.およびM.S.D.がプライマーとなった。A.S.はRスクリプトとグラフを作成した。

コレスポンディング・オーサー

Correspondence

Mahesh S. Desai.

Et

倫理的

宣言競合する

利益
sM

.S.D.

は以下の役職を務めている。


コンサルタントおよび広告

S.F.は、Metagen, Inc.の創設者兼CEOであり、ドイツ、Theralution GmbHのソリーボードメンバーである。他の著者は、競合する利益はないと宣言している。興味・関心

査読

査読情報

Nat
マイクロバイオ

GyよりMarlies Meiseに感謝
本研究の査読に貢献したFrancisco QuintanaとJune Roundに

感謝

する。査読者レポート

が入手可能である

。

関連情報出版社

ノート
シュプリンガー・ネイチャー
発表された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立である。

概要

ステップ1（図1も参照のこと）：まず、以下のように評価

した

。

どの細菌遺伝子が 5つの異なる複合微生物叢組成を保有する遺伝的に異種なマウスにおいて、EAE発症に最も関連する微生物が1つであった。 の相対存在量が低いことがわかった。kkermansia属（暗赤色の細菌アイコン）は重症EAE発症の高リスクと関連し（赤丸）、この属の存在量が多いほど中等症および低発症リスクと関連した（緑丸）。 ステップ2（図2- 4も参照）：このように、我々はEAE発症と関連する細菌属を評価した。EAEの発症リスクは、この属の存在と再存在のどちらが高いかを検討した。EAEを誘発する前に、Akkermansiatype speciesAkkermansia muciniphilaの存在量が高ければ、その後の発病を予測できる可能性がある。 これを検証するために、マウスにEAEを誘発した。これらの微生物群を保有するマウスでは、A. その結果、A.muciniphilaが存在するかしないか、存在する場合は相対存在量が高いか低いかのどちらかであった。 我々は、A.muciniphilaが存在する場合は相対存在量が高いか低いかのどちらかであることを見いだした。その結果、重篤な疾病を発症するマウスの割合によって、「ハイリスク」と「ローリスク」の微生物叢組成が決定された。 しかし、疾病感受性は認められなかった。ステップ3（図5も参照）：我々はさらに、同じ微生物叢を保有するマウス間で均一な微生物叢組成を決定した。その結果、相対的な存在量と微生物叢の組成は、どちらも同じであることが判明した。A.muciniphilaの存在量、あるいはその他の菌株の有無は、個々のマウスの異なる群集におけるEAE発症を確実に予測することはできなかった。 しかし、EAE発症前のIgA c.値は、EAE発症前のIgA c.値よりも低いことがわかった。コンソーシアムのメンバー株であるバクテロイデス・オバータス（Bacteroides ovatus）のating index（ICI）は、微生物叢の構成にかかわらず、疾患誘発後の個々のEAEの転帰と有意な相関を示した。 ステップ4（図6も参照）：次に、以下のステップに成功した。有効性の完全検証 様々な複雑な微生物叢を持つ遺伝的に異なるマウスにおいて、疾患誘発前に決定された種特異的ICIが、個々の疾患の重症度を予測する。 結論：EAEの発症を予測する。発症予測

微生物

叢の特性に関する解析（すなわち個々の疾患リスクの評価）は可能であるが、そのためには、与えられた個々の微生物叢内の微生物間相互作用（「ネットワーク」）と、特定の微生物叢組成に対する宿主特異的応答を考慮しなければならない

。
SPF飼育マウスのユニットレベルベースの微生物叢

解析

。

同じ解析パイプライン。 操作分類学的単位（OTU）のみ 少なくとも1つのグループで平均相対存在量が0.01%以上のハットを解析に含めた。 交差点解析による分類群の同定、 Muc2-/-マウスにのみ存在する、あるいは存在しないOTUを「存在する」とみなした。ある分類群の群平均相対存在量が0.01%以上であった場合、その分類群は「存在しない」とした。 それ以外の場合、その分類群は「存在しない」とした。左のパネル、OTUの交差サイズ 5つのグループ間の交点の大きさは3種類ある。中段は、5つのグループ間のOTUの交点の大きさを示すベン図（「Distinct」、「Intersect」、「Union」）。 中段は、5つのグループ間のOTUの交点の大きさを示すベン図。濃い赤色は、Muc2-/-mにのみ存在する分類群。ce；水色はMuc2-/-マウスには存在しないが他の全てのマウスには存在する分類群；オレンジは5つのグループ全てのマウスが共有するコアマイクロバイオーム。 3つのグループに属するOTUのリスト 出典データ拡張

データ図3 実験結果
実験的自己免疫

この

デシジョンツリーは、日常的なアセスメントが

どのように行われるかを示している

。

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）のスコア付けを行った。 薄いグレーのボックスはマウスの取り扱いに関する指示を示す。マウスの取り扱いとEAEの表現型に関連する質問（Q）は太字で強調表示されている。 濃いグレーのボックスは可能な回答を示す。(赤丸は得られた EAE スコアを示す。すべての矢印(選択肢)は、相互に異なる。Exclusive.

Extended Data 図4 実験的自己免疫

疾患。

無菌マウス、SM01マウス、SM13マウス、SM14マウスにおける脳脊髄炎発症の経過

。
FR飼育SM13コロニー化マウス、FF飼育SM13コロニー化マウス、FR飼育SM14コロニー化マウス、FF飼育SM14コロニー化マウスにおける個体差（最大値）。 ウィルコクソンの順位和検定とp値隣接検定 Benjamini-Hochberg法を用いた。 統計的に有意な群間差は認められなかった。ncesが観察された。b-d、無菌(GF)C57BL/6NマウスをA. muciniphilaで単コロニー化(SM01)またはGFのままFRまたはFF食を与えた。GFマウスにEAEを誘導 SM01コロニー化マウスでEAEが誘導された 25 全群で発病経過を観察した。b,FR飼料を与えたGFマウス、FF飼料を与えたGFマウス、FR飼料を与えたSM01コロニーマウスのEAE発病スコアの経時変化（EAE誘導後日数）。 点は1日の群平均値、破線は1日の群平均値。破線はSDを表す。d,パネルbに描かれた疾患経過のAUC分析。 各マウスは別々の点で描かれている。 一元配置分散分析(One-way ANOVA)とTukey's post-ho(Tukeyのpost-ho)。統計的に有意な群間差は認められなかった。マウス番号はそれぞれのパネルに示されている。箱ひげ図（a,d）は中央値、四分位数、a,b,c,dを示す。d 1.5×四分位範囲

出典データ拡張

データ Fig.
e-of-intere

a:代謝物のピアソン相関（Pearson's correlation of metabolite co
EAEに関連する主要な読み出し値（AUC、Max、RelM、SusO）を持つ濃度。 EAE誘発マウスのサンプルのみu. 有意な相関はitで示す。有意でない相関は示さない。代謝物はKEGG Iの下に記載されている。(GABAについてはC00334）。 代謝物名と対応する相関の一覧 b, Benjamini-Hochberg 法で p 値を調整した対応のない t 検定に基づくlog2 正規化代謝物濃度について、色分けした凡例で示した群間比較のボルケーノプロット。 各ドットは代謝物 1 つを表す。 Metab 有意差のある代謝物 c, 少なくとも1つのグループの少なくとも50%のサンプルで同定された175の検出代謝物の基準交差分析。 基準は相関に分類された。基準、全群の全サンプル（EAE誘発マウスと非誘発マウスの両方）および群間比較基準にわたって、統計的に有意な正（PCor）または統計的に有意な負（NCor）のいずれかのスピアマン相関の結果をまとめたもの。 EAE関連に言及した相関関係 eadoutsはEAE誘発マウスのみのサンプルを用いて計算した。 グループワイズ比較には代謝物を含む Benjamini-Hochberg法を用いてp値を調整したlog2正規化濃度の対応のないt検定に基づいて、有意に異なる（調整p < 0.05）ことが

わかった

。

障壁の

a,SM03-における菌株相対存在量、S,SM03-における菌株相対存在量、S,SM03-における

菌株相対存在量

。

株特異的プライマーを用いたqPCRによって検出された、初期コロニー形成後の04-およびSM12コロニー形成マウス（補足表1）。EAE誘導前（START）、EAEスコアが最大となる段階（PEAK、14〜20日目、個体差あり）、および寛解期（REM、EAE誘導後21〜25日目）に採取した糞便中のアラクトシダーゼ（Gal）、β-グルコシダーゼ（Gluc）、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Nag）、およびサルファターゼ（Sulf）。一元配置分散分析（One-way ANOVA）およびTukeyのポストホロ 統計的差はコンパクトな文字で表示。c. EAE誘発マウスの糞便酵素活性を、クラスター（図5e）およびフェーズ（START、PEAK、REM）に基づきボックスプロットしたもの。 ペアt検定；ns、有意ではないd、 EAE誘発前のEAE誘発マウスの糞便酵素活性と、同一個体におけるEAE誘発後の主要なEAE関連測定値とのearson相関。 すべての相関は有意ではなかった。非EAE誘導マウス（-EAE）またはEAE誘導マウス（+EAE）における、EAE誘導後30日目のリポカリン2（LCN2；SM01 FRから外れ値1個を除去）およびリポポリサッカライド（LPS）、オクルジン（OCLN）、ゾヌリン（ZO-1；SM04 FRおよびSM14 FRから外れ値1個を除去）の血清中濃度。 一元配置分散分析（One-way ANOVA）。nsは有意でない。試験したすべての微生物と食事の組み合わせにおいて、EAE誘発前の糞便中LCN2濃度、血清中OCLN濃度、血清中LPS濃度および血清中ZO-1濃度と、同一個体における主要なEAE関連測定値との間のrson相関。 すべての相関は有意ではない。EAE非誘発マウスにおける短鎖脂肪酸(SCFA)濃度。 一元配置分散分析(One-way ANOVA)およびTukey's post-分析(Tukey's post-分析)。oc検定。ct文字表示：割り当てられた文字を共有する2群、p＞0.05；割り当てられた文字を共有しない2群、p＜0.05。箱ひげ図（b,c,e,g）は中央値、四分位値。es

、および1.5×四分位範囲である。

T細胞の

a,b

,

IL-17aを決定するゲーティング戦略

。

EAE誘発マウスと非誘発マウスのTヘルパー細胞におけるnd IFNγ発現。 順光または側光で標識した軸 抗原に結合した蛍光色素は、IL-17aとIFNγの発現を決定する。検出されたイベントの数は上の青色で表示。プロット内の数字は、各プロットで検出された抗原の数を示す。4回目以降のゲーティングステップでは、ゲーティングされた事象の個体数を、直前のゲーティングステッ プの個体数と比較した。 4回目以降のゲーティングステップでは、ゲーティングされた事象の個体数を、直 前のゲーティングステップの個体数と比較した。ライブ/デッド vs. SSC-H'のゲートはSSC-Hのゲートを示す。腸間膜リンパ節（MLN）、大腸固有層（CLP）および小腸固有層（SILP）については、CD45+細胞のプレゲーティングステップを含み、これはバックゲーティングによって確認された。 代表的なEAE誘発（パネルa） EAE非誘発マウス（パネルb）では、EAE中の脊髄（SC）におけるCD45+細胞浸潤の違いが強調されている。 非CD45+細胞の自家蛍光によるもの c,非EAE誘発マウスのMLN、CLP、SILPにおけるリンパ球サブセットの割合（CD45+細胞の割合）。 CD45+細胞が不十分なためSCは除外した。EAE非誘発マウスのリンパ球数。EAE誘導時の表現型（図5c）。 パーセンテージを計算することでスケーリングした平均値。ns, 有意ではない; *, p < 0.05 Unpaired t-test.d, EAE誘導マウスのEAE誘導30日後のMLN、CLP、SILPにおけるリンパ球サブセットの割合（CD45+細胞の割合）。 クラスター1に割り当てられたEAE誘導マウス（s クラスター2（軽いEAE症状；図5e）。 スケーリング方法はパネルcと同じ。e,親集団の偏りに対処するためのフィルタリングを行った後（Methodsを参照）、EAE関連リンパ球集団の割合を「Viable」細胞の割合としてクラスター1とクラスター2のマウスで比較した。 アンペアt検定。 Boxplotsは中央値、quを示す。1.5％であった。

統計検定はすべて両側検定

。ceデータ拡張

データ 図8 マイクロバイオ
a-関連
実験的自己免疫性脳脊髄炎発症の予測因子

。
b,菌株の存在を独立変数とし、コロニー形成をランダム切片効果とした、EAE中の予測最大スコア（Max）および再発期の平均スコア（RelM）の線形混合モデル回帰。c,EAE誘導30日後に採取した糞便サンプル中の分泌性IgA（sIgA）濃度（糞便重量で正規化）。 個々のEAE表現型ごとにグループ化したマウス 図5e）。 利用可能な材料が不足したため、sIgA c 一部のマウスでは測定できなかった。 クラスター1、強いEAE症状；クラスター2 ウィルコクソン順位和検定。糞便重量で正規化した糞便中sIgAの値。 コロニー形成と食事の組み合わせでグループ分けしたマウス。イオンとEAE誘導状態（EAE誘導マウスではEAE30日後に採取）。 クラスカル・ワリス検定とウィルコクソンの順位和検定。ank-sum検定。右図、sIgA濃度の分散。nsはSMまたは食餌のどちらかによって説明される。e, あるSMを保有するEAE誘発マウスの疾患感受性と、同じSMを保有する非EAE誘発マウスの糞便中sIgA平均値との線形回帰による相関。 各ドットは1つのSMの組み合わせを表す。SMに依存する各系統のIgAコーティング指数（ICI）。 一元配置分散分析（One-way ANOVA）。ICIの計算 M.formaのICIは算出できなかった。na、該当せず；ns、有意ではない。g、エタ二乗（η2）計算による、バックグラウンド微生物叢（SM12、SM13、SM14；FRのみ）によって説明されるIgAコーティング指数（ICI）の分散。Aについては 分散を計算できなかった。uciniphilaは1つの微生物叢の組み合わせにのみ存在した。h, SM14構成株の微生物叢組成によるIgA高被膜株、中間株、低被膜株への分類。 箱ひげ図（a,c,d,f）は、中央値、四分位値、平均値を示す。出典データ拡張

データ 図9 実験結果
自己免疫

SPF飼育Muc2-/-(KO)の微生物叢 a
Muc2+/+（WT）マウスを無菌（GF）C57BL/6JマウスおよびMuc2-/-マウスに移植した（図6a）。 Muc2+/+（WT）マウスをMuc2-/-マウスに21日間曝露すると、EAEが誘発された。a,EAE誘発マウスにおけるEAE誘発日（d 0; 'pre-EAE'）の糞便微生物叢組成を、ドナーとレシピエントの組み合わせで並べたもの。 微生物叢組成は、EAE誘発日（d 0; 'pre-EAE'）の糞便微生物叢組成に基づいて決定した。完全長16S rRNA遺伝子配列決定による菌種レベル。 植物ごとに最も豊富な上位5種。Verrucomicrobiotaの場合、アッカーマ（Akkerma）。b. EAE前の微生物叢組成のα-多様性の尺度としてのシャノン指数。 ドナー-レシピエントの組み合わせによる一元配置分散分析（One-way ANOVA）。c,アークサイン平方根変換した相対存在量データのBray-Curtis距離行列から、主座標分析を用いて順序付けしたEAE前微生物叢組成のβ-多様性。 上段は、EAE前微生物叢組成の遺伝子型別に色分けしたマウス、下段は、EAE前微生物叢組成の遺伝子型別に色分けしたマウス。下段は、EAE前微生物の遺伝子型別に色分けしたマウス。どちらか一方の遺伝子型を用いたPERMANOVA。d, マウス（パネルaと同じマウス）のEAE疾患経過を、ドナーとレシピエントの組み合わせで分け、時間の関数としてのEAE疾患スコアとして可視化した（EAE誘導の翌日）。 ドットは1日の平均EAEスコアを表し、dasは1日の平均EAEスコアを表す。e, 個々の疾患経過のAUC(パネルd)またはマウスあたりの最大達成EAE疾患スコア(Max)を用いたEAE疾患経過の評価。 左はドナーの遺伝子型別に色分けしたマウス。ht, レシピエントの遺伝子型で色分けしたマウス。ドナーとのウィルコクソン順位和検定（左） 箱ひげ図は中央値、四分位数、1.5倍率を示す。f,「重度」および「軽度」のEAEを決定するための個々のAUCおよびMax値の分布; 従って、AUC=30およびMax=2が、個々のEAE表現型の二値分類を確立するための閾値として選択された。個々のAUC（左）またはMax（右）に基づく二値表現型分類（パネルf）によって色分けされた、パネルcのxおよびPCoA-調整。 示された表現型を用いたPERMANOVA cl ssificationをテスト変数とする。

種について
複雑な微生物叢を有するマウスにおける個々の疾患経過予測因子としてのs特異的IgAコーティング指標

。
(a,同じ糞便サンプルから得られたIgA +およびIgA-画分をFITC結合抗マウスIgA抗体で染色し、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度（MFI）を測定した。 アンペアt検定。 Boxplotsは中央値、quは平均値を示す。rtiles、および1.5 b, 3つの異なるサンプル（IgA+、IgA-、および未分別）の微生物叢組成のβ-多様性（全長16S rRNA遺伝子配列決定によって決定された、種レベルでのアークサイン平方根変換相対存在量データから得られたBray-Curtis距離行列から）。 未分別画分の組成はsh。深さが十分でないサンプル（n= 3）。IgA+画分とIgA-画分のβ-多様性（Bray-Curtis距離行列を再計算し、未分類のサンプルを分析から除外した後）。 破線はIgA+画分とIgA-画分を結ぶ。分離後のフラクションを用いたPERMANOVA。d,少なくとも1つの有意な相関を示した種のEAE前のICIと主要なEAE関連測定値（AUC、Max）の個々のピアソンおよびスピアマン相関。 有意な相関をシャで示す。nsは有意でない相関。 ICI計算の詳細はMethodsを参照。e, 左,Enterocloster bolteaeのICIとAUC（上段）およびMax（下段）との線形回帰によるピアソン相関。 右, 2項回帰モデルによるEAE前のICIとの相関。E. bolteae ICIを用いたAUC（上）またはMax（下）に基づく、パネルfで定義した重症化確率。E. bolteaが検出されたマウスのみを示す。は、ソーティング後の両方のフラクションで検出可能であった（n = 8）。 重複する場合はドットをジッターで分割した（上図）。f,EAE誘発当日の未選別サンプルにおけるSM14種の有病率。 種は、相対的有病率が高い場合、存在するとみなした。種の略称と色分けについては、以下の通り。g, 線形回帰によるAkkermansia muciniphilaICIとAUC（上）およびMax（下）とのピアソン相関。

要約
ピアレビューファイルサプル
表1-3

補足Ta
le 1 14 dの詳細
合成微生物群集の異なる菌株と、qPCRによる菌株特異的定量化のためのプライマー配列。 表2 腸内代謝産物の濃度（nmolg-1 表2 繊維リッチ（FR）食を摂取させたgnotobioticマウスにおけるCE-TOF/MSによるベースライン時（BL）と30日間のEAE経過終了時のl代謝産物。 NDは検出されなかった。 表3 濃度 μM）の血清メタ CE-TOF/MSによるBL時および30日間のEAE経過終了時のFR食を与えたgnotobioticマウスのオライト。
ソースデータ

出典データ Fig.

統計的ソースデータ

出典データ Fig.

統計的ソースデータ。

ソースデータ Fig.

統計的ソースデータ。

ソースデータ Fig.

統計的ソース

データ。

出典

データ


統計ソースデータ

。
rceデータ拡張

図2統計

データ

ソースデータ 拡張D

a 図4統計的

出典

ソースデータ拡張

データ


図5

統計

サワー

ソースデータ拡張

データ


図6統計

的

ソース

データ

データ.

ソースデータ

拡張データ


図

7

統計的

ソース
データ.

ソースデータ

拡張データ


g. 8

統計的

ソース
ata.

ソースデータ拡張データ

統計

的

ソース

データ

ソースデータ

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10

統計的

ソース

データ

ta.

権利と権限オープン

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記事Steimle

, A., Neuma
n, M., Grant, E.T.

腸内細菌
多発性硬化症モデルマウスにおけるl因子の重症度予測Nat Microbiol(2024). https://doi.org/10.1038/s41564-024 01761-3

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Received28

  • June 2023

  • Accepted14 June 2
    24

  • 公開15年7月
    y 2024

  • DOIhttps://do

  • org/10.1038/s41564-
    24-01761-3

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