コンブチャ茶に関連する微生物が宿主の代謝経路をリモデリングし、脂質の蓄積を抑制する

2024年4月5日 13:03

研究論文
コンブチャ茶に関連する微生物が宿主の代謝経路をリモデリングし、脂質の蓄積を抑制する

https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1011003

レイチェル・N・デュメズ＝コルネゲイ、リリアン・S・ベイカー、アレクシス・J・モリス、ホイットニー・L・M・デローチ、ロバート・H・ダウエン

要旨
古くからあるプロバイオティクスが豊富な飲料であるコンブチャティー（KT）の人気は、代謝性疾患に対する予防を含むその健康効果に起因している。しかし、これらの謳い文句は厳密には検証されておらず、コンブチャティーに含まれるプロバイオティクスに対する宿主応答のメカニズムも不明であった。ここで我々は、コンブチャティー関連微生物（KTM）のみからなる飼料で線虫を維持する再現性のある方法を確立した。コンブチャティー関連微生物は、KTMを与えた動物の腸内にしっかりと定着し、正常な発育と繁殖をもたらした。興味深いことに、KTMを摂取した動物は、総脂質蓄積量と脂質滴サイズが著しく減少した。我々は、脂肪蓄積の減少という表現型は栄養吸収障害によるものではなく、むしろ宿主の腸内でプログラムされた代謝反応によって維持されていることを発見した。KTMの摂取は、脂質貪食の際に誘導される一連のリソソームリパーゼ遺伝子のアップレギュレーションを含む、脂質代謝の中核経路における広範な転写変化を引き起こす。リソソームリパーゼ活性の上昇は、脂質滴の生合成の減少と相まって、宿主の脂質含量の減少に部分的に必要である。我々は、KTMの摂取が、脂質利用を促進する転写プログラムを再配線することによって、線虫の腸における絶食様反応を刺激することを提唱する。この結果は、コンブチャティーに含まれるプロバイオティクスが宿主の代謝をどのように変化させるのか、またこの人気の飲料がヒトの代謝にどのような影響を与えるのかについて、メカニズム的な洞察を与えるものである。

著者要約
コンブチャは人気のある発酵茶であり、糖尿病や肥満のような代謝性疾患に対する予防を含め、ヒトに多くの健康効果があるとされてきた。これらの健康効果は、コンブチャ茶に含まれるプロバイオティック微生物（細菌と酵母の両方を含む）によってもたらされると考えられており、これらの微生物はヒトの腸内に定着し、宿主の生理機能を変化させる可能性がある。コンブチャティーに含まれるプロバイオティック微生物（KTM）が宿主の生理機能に影響を与えるメカニズムは、ほとんど解明されていない。線虫Caenorhabditis elegansを動物モデル系として用い、KTMに対する宿主の生理学的応答を研究した結果、KTMが線虫の腸にコロニー形成し、進化的に保存された脂質代謝遺伝子の発現に広範な変化を与え、その結果、宿主の脂肪レベルが低下することが示された。活発に発酵するKTMに対する宿主の代謝反応には、脂質を分解するタンパク質の増加と、トリグリセリドを作るタンパク質の減少が必要であり、これは絶食時に起こる現象を反映している。これらの知見は、コンブチャティーがヒトにもたらす健康効果と一致しており、コンブチャティーに関連する微生物に対する宿主の反応に関する新たな知見を提供するものである。

引用 DuMez-Kornegay、Baker LS、Morris AJ、DeLoach WLM、Dowen RH（2024）コンブチャ茶関連微生物は、脂質蓄積を抑制するために宿主代謝経路をリモデリングする。PLoS Genet 20(3): e1011003. doi:10.1371/journal.pgen.1011003

編集者ショーン・P・カラン、南カリフォルニア大学、アメリカ

受理された： 2023年10月4日受理：受理：2023年10月4日; 受理：2024年2月22日; 掲載：2024年3月28日 2024年3月28日発行

データの利用可能性：すべての関連データは論文およびそのSupporting Informationファイル内にある。全ゲノムシークエンスデータはSequencing Read Archive (PRJNA1044129)で入手可能。mRNA-Seqの生データおよび処理済みデータはGEO（GSE236037）に寄託されている。

資金提供本研究は、R.N.D.へのNIGMS助成金T32GM007092、R.N.D.へのNCCIH助成金F31AT012138、およびR.H.D.へのNIGMS助成金R35GM137985の支援を受けて行われた。

競合利益：著者らは、競合する利害関係は存在しないと宣言している。

はじめに
抗生物質が発見されて以来、人類は感染症の治療や環境の滅菌のために微生物を排除することに成功してきたが、病原微生物を排除するこの非特異的なアプローチによって、私たちが健康を維持するために常在微生物との相互作用にどれほど依存しているかがますます明らかになってきた。抗生物質の使用、欧米型の食生活、座りっぱなしのライフスタイル、そして多くの疾病状態は、代謝症候群、慢性炎症、精神疾患と関連する、微生物の多様性の低下、すなわちディスバイオシスを引き起こす可能性がある [1-3]。例えば、C.difficile大腸炎は抗生物質の使用とそれに伴う腸内微生物の多様性の低下によって発症し、重篤な胃腸症状と死に至る可能性がある。プロバイオティクス、すなわち健康に役立つ生きた微生物の摂取は、宿主に重要な微生物由来の代謝産物を供給しながら、健康な腸内細菌叢を促進または維持することができる [5-7] 。微生物、特にプロバイオティクス [8] に対する宿主の反応の根底にある分子メカニズムを理解することは、補完的ヘルスケアアプローチに取り入れる上で極めて重要である。

コンブチャティー（KT）は半甘味の発酵飲料であり、機能性食品（すなわち、栄養価を超えた健康効果をもたらす）として広く飲まれており、血圧低下、代謝性疾患からの保護、肝保護活性の向上（すなわち、肝臓毒素からの保護）、抗がん作用などの健康効果をもたらすとされるプロバイオティクス微生物を含んでいる[9-13]。これらのプロバイオティック微生物には、アセトバクター属、ラクトバチルス属、コマガタエイバクター属のメンバーが含まれる［14,15］。KTの糖尿病症状改善効果や成体マウスの体重増加抑制効果など、これらの健康効果の一部は動物モデルで検証され始めているが [16-19]、これらの表現型のメカニズム的背景については厳密には研究されていない。さらに、コンブチャティーに含まれる微生物（細菌種と酵母種の両方を含む）と宿主との相互作用については、まったく未解明のままである。コンブチャティーには生きたプロバイオティクス微生物が含まれており、健康に良いという根拠の乏しい謳い文句で広く飲用されているため、KTの飲用に対する宿主の生理学的・細胞学的反応についてメカニズム的知見を得ることが不可欠である。

ヒトは複雑な食事を摂取し、何兆もの微生物が腸内に生息しているため、個々のプロバイオティクス微生物、あるいはこの場合はコンブチャ関連微生物の小さなコミュニティーがヒトの生理機能に与える影響を解明することは困難であり、ヒトを対象とした宿主-微生物相互作用のメカニズム解明は不可能である。したがって、プロバイオティクスの摂取が宿主の生理学的プロセスにどのような影響を及ぼすかを調べるには、動物モデルの使用が不可欠である。線虫は、代謝調節のメカニズムや、栄養感知経路が生物の恒常性をどのように支配しているかを調べるために広く用いられてきた[20,21]。線虫はまた、腸内細菌叢が宿主の生理学に与える影響を研究するための新たなモデルでもある[22,23]。線虫の培養を鞭毛軸継代法で行うことで、これらの細菌食動物は生後すぐに無菌状態になるため、一生の間にどの微生物が消費されるかを実験的に完全に制御することができる（すなわち、動物は微生物の食物源に出会う前に無菌状態になっている）。さらに、摂食中の機械的破壊を免れた微生物は、腸管内腔にしっかりと定着することができる[22-24]。このように、線虫の単純な消化管は、食物源として提供される細菌によって効果的にコロニー形成されるため、特定の微生物の摂取に対する宿主の代謝反応を調べるのに理想的なシステムとなっている。実際、これまでの研究では、線虫を用いて、プロバイオティクスを含む個々の微生物種が、保存された遺伝経路の配線を変えることによって、どのように生理学的変化を引き起こすかを調べることに成功している[25-31]。

ここでは、線虫を用いて、コンブチャ関連微生物種（KT微生物またはKTM）による腸内コロニー形成が宿主の代謝を再配線するかどうかを調べる。我々は、市販および自家製のKTに含まれるすべての微生物（すなわち、アセトバクター属とコマガタエイバクター属の細菌と酵母1種）からなるKT微生物の芝生の上で動物を培養する再現性のある方法を開発した。我々は、KT微生物を自由摂取している動物は、大腸菌食、3種のKT関連微生物種のいずれか、またはこれら3種の単純な非発酵混合物のいずれかを摂取している動物よりも、脂肪の蓄積が有意に少ないことを見出した。さらに、我々のデータは、KTの摂取が、カロリー摂取を制限するのではなく、宿主の脂質代謝経路を調節することによって脂肪蓄積を減少させることを示唆している。このような脂質レベルの減少の根底にあるメカニズムを解明するために、我々はKT微生物を摂取させた動物のトランスクリプトーム解析を行った。その結果、脂肪貪食に機能するリソソームリパーゼの一群がKT微生物に反応して発現上昇し、トリグリセリド合成に重要な酵素が発現低下していることが明らかになった。この結果は、コンブチャティーの摂取が、リポファジーによる分解を促進することで脂質滴の動態を変化させると同時に、トリグリセリド合成のダウンレギュレーションによって脂質滴の拡大を抑制する可能性を示唆している。この研究は、遺伝学的に扱いやすい動物モデルを用いて、コンブチャティーが健康に役立つとされる分子メカニズムを解明するための重要な土台を築くものである。

研究結果
線虫をKT微生物の芝生の上で飼育すると、腸に再現性のあるコロニーが形成される。
KTの少量バッチ醸造は連続発酵プロセスであり、微生物によって生成されたバイオフィルムと少量の完全に発酵した液体培養物を新鮮なショ糖培地に移し、消費前に少なくとも1週間発酵させる。KTのこの伝統的な醸造方法は、ダイナミックな微生物群集をもたらし、発酵の過程でpHが変化する（pHは7から～4に低下する）。環境微生物による汚染は、pHが低下するにつれてこれらの種がKTの中核微生物（KTM）に駆逐されるため、限定的である[13,32-34]。さらに、KTMsがSCOBY（細菌と酵母の共生培養）と俗称される保護ペリキュラー・バイオフィルムを構築することで、外部からの汚染を減らすことができる [35]。遺伝子モデル系を用いてコンブチャティー摂取の生理学的・代謝学的効果を調べるため、我々はまず、抗生物質や抗真菌剤を含まない我々の標準的な寒天ベースの線虫増殖培地（NGM）上で餌を与えることにより、線虫動物にKTMを送達する再現可能な方法を確立することを目指した。私たちは、KT自家培養で活発に増殖しているKTMをNGMプレートに播種することで、4日間かけて個体数が拡大し、バイオフィルムを生成する微生物の芝生を生成するのに十分であることを見出した（S1AおよびS1B図）。

KT培養における微生物群集の動態をよりよく理解し、NGMプレート上でKT微生物群集を再現する能力を評価するために、発酵中のKT培養と、代表的な3つの醸造サイクルから分離したNGMプレートから洗浄したKTMの16S rDNA配列決定を行った（S1表）。発酵6日後、培養液とNGMプレート上の微生物群集は類似しており、すべての市販または自家醸造KTに不可欠な構成要素であるコンブチャ関連微生物（すなわち、アセトバクターおよびコマガタエイバクター種）の予想されるセットによって支配されていた（図1A、1BおよびS1C-S1E）[36]。注目すべきことに、KT培養微生物群集は発酵12日目まで同様であったが、NGMプレート上の群集は12日目にはもはや予想されたKTMに支配されておらず、これは環境微生物の拡大によるものと思われる（図1Aおよび1B）。そこで、その後の実験では、KTM播種後4～8日目はNGMプレートのみを使用した。KT微生物群をNGMプレート上で再現性よく培養するこの方法を確立することは、線虫をKT消費に対する宿主応答を研究するモデルとして活用する上で不可欠であった。

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図1. 図1. コンブチャ関連微生物（KTM）の摂取は摂食行動に影響を与えず、線虫の腸内に強固なコロニーを形成する。
(A) 従来から培養されているKTM、活発に発酵しているコンブチャティーのバイオフィルム、またはNGM寒天プレート上で増殖したKTMの16S rDNA配列決定。12日間（d1-d12）にわたる3つの生物学的複製について、既知のKTMの頻度（緑）を環境微生物汚染物質（灰色）に対してプロットしたもの。(B) 16S rDNA配列決定から得られた加重ユニフラックベータ多様性の主成分分析により、d5プレートとd6培養の類似性が明らかになったが、d12プレートでは乖離していた。(C)示した微生物の芝生上の1日目成体の画像（スケールバー、500μm）と(D)定量化（平均±SEM）（72時間の時点を比較、、P<0.001、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。(E）各微生物食物源を摂取した1日目成虫のポンピング速度の測定（平均±SD、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。(F) 各飼料を摂取した動物の微生物CFUを定量化した結果、KTMは対照飼料と比較して高いレベルで腸にコロニー形成していることがわかった（平均±SEM、*、P<0.0001、一元配置分散分析、3生物学的複製、複製あたり10匹）。(G)腸管内腔におけるKTMの代表的な走査型電子顕微鏡像（黒矢印は腸の微絨毛を指し、緑矢印の頭は無傷のKTMを示す；左スケールバー、2μm；右スケールバー、1μm）。パネルAの拡大データはS1 Tableに、パネルD、E、Fの生データはS1 Dataに掲載。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.g001

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この標準化されたKTM培養法を用いて、次に線虫の個体群をKTMのみからなる餌で飼育できるかどうかを調べた。KTMは微生物と酵母の混合種であることから、まず回避アッセイを行い、線虫動物が芝生の上に留まるか、あるいはそこから逃げ出すかを評価した。重要なことに、線虫は発生から成虫になるまで、大腸菌のコントロールと同程度のレベルでKTM微生物芝生の上に留まった（図1Cと1D）。これらの比較は、その後のKTMのすべての特性評価と同様に、2種類の標準的な実験用大腸菌飼料（OP50とHT115 [41]）と、KT培養から分離したアセトバクター・トロピカリス（Acetobacter tropicalis）菌株を併用して行った。A. tropicalisはすべてのKTの主要成分であり、KT中に見出される他の生理活性分子の中でも特にビタミンB12を産生する[14,15,34,35,42-45]。OP50株とHT115株の大腸菌は、線虫の生理機能に異なる影響を与えるが、これはビタミンB12レベルの違いに部分的に起因している可能性がある [28,46-48]。興味深いことに、食餌の選択肢が提示されたとき、動物はKTM芝生を選択しなかった（S2AおよびS2B図）。この行動は、異なる線虫野生株や他のCaenorhabditis種でも一貫しており（S2C-S2I図）、これらの動物が大腸菌に引き寄せられるか、KTM培養の成分によって忌避されるかのどちらかであることが示唆された。動物は他の食物源を好むようだが、KTMだけを与えられた動物は芝生から逃げないことから、線虫は標準的な自由摂食法を用いてKTM専用飼料で確実に飼育できることが示された。

KTMが摂食行動を変化させ、その結果カロリー摂取量が減少するかどうかを調べるため、KTMまたはコントロールの餌を摂取した個体のポンピング速度（すなわち、餌を摂取するために動物の咽頭筋が収縮する速度）を測定した。その結果、KTMを摂取した動物のポンピング速度には、他の食餌源と比較して有意な差は見られなかった（図1E）。このことから、摂食行動はKTMの芝生上では変化しないことが示唆される。最後に、ヒトの消化管内でこれらのプロバイオティクス微生物が予想されるように、KTMが線虫動物の腸管内腔にコロニー形成するかどうかを評価した。異なる飼料で動物を飼育した後、表面微生物を除去し、腸内微生物を抽出し、存在するコロニー形成単位（CFU）を定量した。KTMを摂取した動物は、他の飼料を摂取した動物に比べて少なくとも5倍以上のCFUを含んでおり、KTMが線虫の腸内に強固にコロニー形成していることが示された（図1F）。この腸内コロニー形成をさらに調べるため、走査型電子顕微鏡を用いてKTMを摂取した動物の腸内を画像化したところ、腸管内腔に無傷の微生物細胞が存在していることがわかった（図1G）。これらの結果を総合すると、線虫動物をKTM専用飼料でうまく飼育できることが実証された。この飼料は、KT培養で見られる微生物群集を忠実に反映したものであり、その結果、腸内にKTMが強固にコロニー形成された。

コンブチャ微生物を摂取する動物は脂肪蓄積を減少させる
プロバイオティック微生物が産生するものを含む食餌成分は、脂質の蓄積や脂肪分解を含む宿主の代謝調節に大きな役割を果たすことができる [49-51]。一貫して、線虫の代謝は微生物食の違いに著しく敏感であり、非常に類似した大腸菌株でさえ、脂肪含量のレベルを著しく異ならせている [28,29,41]。ヒトにおけるKTの代謝上の利点（肥満リスクの減少など）が報告されていることから[9-13]、KTMの摂取は線虫の脂質レベルに影響を与える可能性があると考えられた。線虫動物の脂肪の大部分は、トリグリセリド（TAG）の形で脂質小滴内の腸上皮細胞に蓄積され、より小さな脂質沈着が皮下組織と生殖細胞に見られる[52]。中性脂質を染色する、よく知られた親油性色素オイルレッドOとナイルレッドを用いて、KTMを摂取した動物と対照微生物を摂取した動物の脂肪含量を調べた［52,53］。KT微生物を摂取した動物は、A. トロンピカスを含む他の食物源を摂取した動物よりも有意に脂肪蓄積量が少なかった。これは、A. トロンピカスがKTにおいて最も豊富な微生物種であることを考えると、特に注目に値する（図2A-2D）。これらの傾向は生殖期間中もその後も続いており（S3A図）、KTMが生殖期間中および加齢過程を通じて宿主の脂質蓄積を制限していることを示唆している。重要なことは、KTMを与えた動物では、体脂肪蓄積のかなりの割合が、成体になっても生殖細胞や発育中の胚に移行していることである（図2C）。オイルレッドOとナイルレッドの染色が減少していることから、KTMを摂取した動物は対照飼料を摂取した動物に比べてTAGレベルが低下している可能性が示唆される。そこで、生化学的アッセイを用いて、各飼料を摂取した動物の集団におけるTAGの総量を定量した[54,55]。我々の以前の観察と一致して、KTMを摂取した動物は、大腸菌OP50またはA. tropicalisを摂取した動物と比較して、TAGレベルがそれぞれ約85％または約90％減少した（図2E）。これらのデータを総合すると、KT微生物を摂取した動物は、大腸菌を摂取した動物よりも脂肪の蓄積が少ないこと、そしてKTに最も多く含まれる微生物であるA. tropicalisは、この表現型を再現するには不十分であることが明らかになった。KTの摂取は、げっ歯類モデルにおいてメトホルミンと同程度に体重増加を制限し、糖尿病症状を緩和することが示されていることから、この知見はヒトの健康に特に関連している[16-19]。

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図2. KTMは宿主における脂質の蓄積を制限する。
(A）オイルレッドOで染色した1日目成虫の代表的な画像（スケールバー、500μm）および（B）定量化（平均±SD、、P<0.0001、一元配置分散分析）、（C）ナイルレッドで染色した1日目成虫の代表的な蛍光画像（スケールバー、500μm）および（D）定量化（平均±SD、、P<0.0001、一元配置分散分析）。(E) 各餌を摂取した動物のトリグリセリド（1匹あたりのTAG）の生化学的定量化（平均±SEM, , P<0.001, , P<0.05, ns, 有意ではない, 一元配置分散分析）。(F) 表示した微生物飼料を摂取した動物の腸内脂質液滴におけるDHS-3::GFP (dhs, dehydrogenase, short chain)の代表的蛍光画像（スケールバー、5μm）。(G) 脂質滴の大きさの測定。各データポイントは1匹の動物の平均腸脂質滴直径を表す（平均±SD、、P<0.0001、一元配置分散分析）。(H) 脂質滴密度測定。各データポイントは1匹の動物の1μm2あたりの脂質滴数を表す（平均±SD、**、P<0.0001、、P<0.05、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。パネルB、D、E、G、Hの生データはS2 Dataに掲載。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.g002

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線虫における脂質の主な蓄積部位が腸内脂質滴（LD）であることから、KTMを与えた動物の腸内ではLDのサイズや存在量に影響があるのではないかと考えた。LDに常駐するDHS-3::GFPタンパク質（dhs, dehydrogenase, short chain）を発現するトランスジェニック株を利用して、それぞれの飼料を与えた動物の腸内細胞におけるLDの存在量とサイズを測定した。KTMを摂取した動物では、脂質滴のサイズと存在量の両方が、大腸菌やA. tropicalisを摂取した動物に比べて劇的に減少した（図2F-2HおよびS3B）。これらの結果から、KTMを摂取した動物で観察された脂質蓄積の減少は、脂質滴の合成または安定性の制御が原因である可能性が示唆された。

KTMの摂取は成長速度を加速し、繁殖力は実質的に変化しない
異なる微生物飼料は線虫の成長速度と繁殖力に大きな影響を与える可能性がある[29,30]。KTM食は発育速度を制限したり、生殖プログラムを変化させたりする可能性がある。さらに、KTM食に起因する栄養吸収の低下は、カロリー制限や脂質蓄積の低下につながる可能性がある。実際、カロリー制限の遺伝的または栄養学的モデル動物は、発育がより遅く、腸内脂肪の蓄積がより少なく、生殖期間が遅延し、最終的に子孫の生産量が減少する [28,56-58]。

そこで我々は、KTMを摂取した動物が、大腸菌食またはA. tropicalis食を摂取した動物よりも発育速度が遅く、子実体サイズが小さいかどうかを調べた。発育速度の変化を調べるため、mlt-10プロモーターの制御下でGFP-PESTタンパク質を発現するトランスジェニック株（Pmlt-10::GFP-PEST）を用いた（図3A）。PESTアミノ酸配列は、タンパク質分解によるGFPの迅速なターンオーバーを保証し、正確な時間分析を可能にする。KTMを摂取した動物の脱皮速度は、対照の餌を摂取した動物に比べ、加速はしないまでも同程度であり（図3A-3C）、KTMの摂取が発育速度を低下させないことを明確に示している。KTM摂取中の動物の発育をより包括的に見るために、大腸菌、A. tropicalis、またはKTMを摂取した成体動物のmRNA配列決定（mRNA-Seq）を行った。以前に線虫の発生に関連した2,229遺伝子を調べたところ[29]、KTMを摂取した動物と対照飼料を摂取した動物との間で遺伝子発現の違いはほとんど観察されず（図3D-3F）、KTMを摂取した集団は同期して成体に達することが示唆された。これらの結果を総合すると、KT微生物を摂取した動物は野生型の発生を示すことが示唆される。

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図3. KTM摂取中は発育のタイミングが早まり、生殖生産量はわずかに減少するだけであることから、KTM摂取によってカロリー摂取が制限されることはないことが示唆される。
(A-C)同調させたL1を指定の微生物に投下した後、発生を通してのPmlt-10::GFP-PEST発現のプロファイル。レポーターは幼虫の脱皮期にのみ発現する（Aでは灰色で示す）。パネルA-Cに1つの代表的な実験を示す。(D-F）mRNA-Seqによって決定された2,229個の発生遺伝子の発現を比較した散布図（RPKM、マップされた100万リードあたりの転写産物1キロ塩基あたりのリード数）。線形回帰分析と対応するR2値が各比較について報告されている。(G)自由摂取KTM、自由摂取大腸菌、またはカロリー制限大腸菌（108または109 CFUs/mL）プレート上で48時間成長させた後の野生型N2個体およびeat-2(ad465)個体の標記発生段階における頻度（平均±SEM）（***, P<0.0001、カイ二乗検定）。(H) 異なる飼料で飼育した野生型動物のブルードサイズ（平均±SD, , P<0.001, , P<0.05, 一元配置分散分析）。(I) 繁殖期間中の各日の子孫生産量のプロット。KTMを与えた動物は大腸菌OP50を与えた動物と比較して同様の産卵率を示した。(J) 正規化したvit-2遺伝子の発現値（RPKM、マッピングされた100万リードあたりの転写産物1キロベースあたりのリード数；平均±SEM、、P<0.05、T-検定）、および(K) 大腸菌OP50またはKTM飼料を摂取した動物の初期胚におけるVIT-2::GFP蛍光の定量化（平均±SD、、P<0.001、T-検定）。(L-N）mRNA-Seqによって決定された2,367の生殖遺伝子の発現を比較した散布図と線形回帰分析（R2値を報告）。パネルA-Nの基礎となる生データはS3 Dataに掲載。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.g003

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カロリー制限は、発育速度の低下など、線虫の生理機能に大きな影響を与える[58]。eat-2変異体はカロリー制限の遺伝学的モデルであり、eat-2の欠損は咽頭ポンプ機能の障害と栄養摂取量の減少をもたらす[58]。栄養の利用可能性を減少させること（すなわち、濃度109 CFU/ml以下の大腸菌OP50芝）は、カロリー制限の第二の効果的な方法を提供する［59］。したがって、KTMを摂取した動物がカロリー制限（CR）されているかどうかをさらに評価するために、野生型およびeat-2変異体動物に、自由摂取の大腸菌芝、CRの大腸菌芝（108-109 CFU/ml）、または我々の標準的な自由摂取のKTMの芝を摂取させ、発育速度アッセイを行った。この解析の結果、野生型動物およびeat-2動物ともに、大腸菌OP50飼料と比較してKTMを摂取すると発育速度が加速することが明らかになった（図3G）。重要なことは、eat-2動物がCR大腸菌の芝生上ではad libitum大腸菌の芝生に比べて発育速度が低下したことであり、これはeat-2突然変異の影響がさらなるカロリー制限によってさらに増強されることを示している；しかしながら、KTM摂食はeat-2突然変異の発育障害を部分的に抑制した（図3G）。これらのデータは、KTM摂取はカロリー摂取制限の効果を模倣するものではないことを示している。

線虫の繁殖出力（すなわち子房サイズ）は、おそらく転写レベルでの繁殖プログラムの調整を通して、食餌によって調節される[29,60]。そこで、KTMを摂取した動物と対照飼料を摂取した動物の産卵サイズを測定したところ、KTMを摂取した動物の平均産卵サイズは、大腸菌OP50を摂取した動物よりもわずかに小さかった（図3HとS4；295対240、P<0.05）。さらに、KTMを摂取した動物は大腸菌を摂取した動物と同程度の割合で産卵することがわかった（図3IおよびS4）。対照的に、eat-2変異体のようなカロリーを制限された動物は産卵期間が12日まで延長され、子実体サイズが大幅に減少し、eat-2変異体は平均100-175の子孫を残す[28,57]。したがって、KTMを与えた動物の繁殖力が20%程度低下したことは、CR動物のより深刻な産卵数の減少とは矛盾する。しかし、これは母動物が腸内脂肪貯蔵庫から卵母細胞へ脂質に富んだ卵黄を供給するプロセス（vitellogenesisと呼ばれる）の障害と一致する可能性がある。そこで次に、脂質の腸から卵母細胞への輸送を仲介するビテロジェニンタンパク質をコードするvit-2のmRNAレベルを調べたところ、vit-2レベルは大腸菌を与えた動物に比べてKTM飼料を与えた動物で増加していた（図3J）。同様に、内因性タグを付けたVIT-2::GFPタンパク質を用いて初期胚（44細胞期以前）で測定したビテロジェニンタンパク質レベルも、KTM飼料を与えた動物で上昇しており（図3K）、KTMの摂取が母体の脂質供給を損なわないことをさらに立証した。最後に、生殖に関与する2,367遺伝子の発現を調べたところ[29]、KTM摂取は対照食と比較して、生殖遺伝子の発現プログラムを広範に変化させないことがわかった（図3L-3N）。この結果は、KTMを摂取した動物では生殖プログラムが劇的に変化しないことを示している。この発見は、KTMを摂取した動物が野生型の発育速度を示すという観察結果とともに、KTM摂取中にカロリー摂取が損なわれないという主張と一致し、線虫を、コンブチャ関連微生物が宿主の代謝経路に与える影響を調べるモデルとして立証するものである。

宿主代謝のリモデリングには長期間のKTM共培養が必要である
市販および非商用の小バッチKTの塩基配列解析から、KTには再現性のあるコア微生物群が存在することが明らかになった [14,15,34,36,61]。これらには、アセトバクター属、コマガタエイバクター属、グルコナセトバクター属、グルコノバクター属、ラクトバチルス属の細菌、およびブレタノマイセス属、ジゴサッカロマイセス属、カンジダ属、デッケラ属、ラシャンセア属、シゾサッカロマイセス属の酵母が含まれる。さらに、Huangたちは最近、この微生物ミックスが（1）KTと同様に共存し、（2）KTに似た生化学的組成を生成し、（3）ペリクルを形成するという基準に基づき、伝統的な醸造KTの主要な側面を再現する最小限のKTマイクロバイオームを確立した。興味深いことに、発酵開始時の細菌と酵母の比率に関係なく、6日目にはこの比率は安定し、微生物種の濃度に関係なく、それぞれの種が比較的均等に存在するようになる [36]。

KTMが線虫の腸に強固にコロニー形成すること、そして既知の優占KT微生物であるA. tropicalisを動物に与えてもKTMに対する宿主応答を再現できないことから、我々はKTM摂取後の動物の腸にコロニー形成することができる微生物を、KT培養物からさらに同定しようとした。これらの微生物種を単離すれば、最小限のマイクロバイオームコアからなるKTM培養液の作製が容易になり、線虫動物に代謝表現型を付与するのに十分である可能性がある。KTMを与えた動物から腸内微生物を最初に抽出したところ（図1F）、細菌種であるAcetobacter tropicalisと、酵母種であるZygosaccharomyces属またはBrettanomyces属のいずれかが分離され、それぞれ16Sおよび18S rDNA配列決定によって同定された（S5AおよびS5B図）。これらの微生物はKTでよく見られる2つの種を代表しているが、ペリクルを形成することができないため、KTの最小培養にはならない[36]。そこで、ペリクルの形成に関与するセルロース産生種を培養液から分離することにした。KT培養からバイオフィルムの小片を取り出し、酵素消化（ドリセラーゼ）と機械的破砕（超音波処理）を組み合わせて、セルロースマトリックスから細菌を分離した。セルロース産生菌は、セルロースとキチンを染色し、紫外線で蛍光を発するCalcofluor Whiteを含むマンニトール寒天プレート上で単離された[62-64]。この戦略により、16S rDNA配列決定によりコマガタエイバクター属の一種であると同定されたKT微生物が、追加で単離された（S5C図）。

個別に分離したKT微生物の遺伝情報をさらに得るため、ゲノムDNAのショートリード全ゲノム配列決定を行った。その後、メタゲノム分類のためのバイオインフォマティック・パイプラインであるKrakenアルゴリズム[65]を用いて、個々のKT微生物のおおよその分類を決定した。これらの分類学的分類と、これまでに発表されたKT関連微生物のリストを基に、KT微生物の配列をいくつかの参照ゲノムにアラインメントし、種レベルの情報を得た（図4AおよびS2表）。この戦略により、KT微生物はKomagataeibacter rhaeticus（ENS_9a1a株とのアライメント率98.76.%）、Acetobacter tropicalis（NBRC101654株とのアライメント率87.55%）、Zygosaccharomyces bailli（CLIB213株とのアライメント率86.88%）と同定された[66]。

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図4. 宿主の脂質枯渇反応は、活発に発酵しているKTM培養物に特異的であり、個々の微生物や発酵していない混合物によってもたらされるものではない。
(A）コンブチャ培養から微生物を精製し、全ゲノム配列を決定した結果、核となるKTMが種レベルで同定された。(B）3種類のKT由来飼料（橙色：A. tropicalis；褐色：K. rhaeticus；灰色：Z. bailii；d,days）の調製と供給方法の概略図。甘茶培地は、紅茶と緑茶のミックスに5％のサトウキビ糖を加え、フィルター滅菌したものである。KTM培養は連続発酵によって維持され、KTM-MとKTM-FMはde novo培養である。(C) 指定の飼料を与えた1日目の成虫のオイルレッドO染色の定量（平均±SD、、P<0.0001、一元配置分散分析）。Z. bailiiの飼料は動物の発育をサポートしない。(D) DHS-3::GFPトランスジェニック動物の腸における代表的な蛍光画像（スケールバー、5μm）と(E)脂質滴径の定量（平均±SD、n = 10個体、、P<0.0001、不対T検定）。(D-E)に示したKTM脂質滴の画像とサイズ測定は、これらすべてのサンプルを並行して処理したため、図2Fと2Gにも表示されている。(F-G）示したKT飼料を摂取させた1日目の成体のオイルレッドO染色の定量化（平均±SD、、P<0.0001、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。(F)KTM-FMを摂取した動物はKTMを摂取した動物と同程度の脂質レベルを有するが、(G)KTM-Mは宿主の脂質蓄積を制限するために少なくとも14日間共培養する必要がある。(H）KTM培養上清が宿主の脂質減少に必要かどうかを調べるための実験デザイン。(I) KTM、5％スクロースで広範囲に洗浄したKTM、またはKTM-Mの食餌を与えた1日目の成虫のオイルレッドO染色の定量化（平均±SD、、P<0.0001、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。(J) 大腸菌、KTM、およびZ. bailiiを摂取した1日目の成体動物について、不活性栄養源として死んだ大腸菌を補充した場合としなかった場合のオイルレッドO染色の定量化（平均±SD、***、P<0.0001、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。(K）C1-BODIPY-C12を添加した飼料を与えた後の腸の代表的なDICおよび蛍光画像（星印は腸管内腔、矢頭は腸上皮細胞を示す；スケールバー、10μm）。パネルAの拡大データはS2 Tableに、パネルC、E、F、G、I、Jの生データはS4 Dataに掲載。

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培養から優勢なKT微生物を分離・同定したことで、個々のKT微生物、あるいは微生物の混合物の摂取が線虫の脂質代謝をどのように変化させるかをさらに調べることができた（図4B）。その結果、A. tropicalisまたはK. rhaeticusの食餌は、大腸菌を与えた動物と同程度の脂質蓄積を促進したが、酵母種Z. bailliの食餌は動物の発育を促進しなかった（図4CおよびS6A-S6D）。驚くべきことに、芝生中に存在するKTMの濃度を5倍（5x KTM）にすると、我々の標準的なKTM芝生と比較して、脂質レベルがさらに低下した（S6A-S6C図）。

そこで私たちは、K. rhaeticus、Z. bailii、A. tropicalisを混合したものが、KT微生物の最小コアであり、これらを共培養すると、スクロースを発酵させ、ペリクルを形成し、コンブチャ茶に類似した生化学的組成を生成するという仮説を立てた。そこで、フィルターで滅菌したKT培地（スクロースを5％程度含む紅茶と緑茶）に3種類のKT微生物を混合し、ペリクルが形成されるまで数週間発酵させた。このデノボKTを、KTM-Fermented Mixまたは「KTM-FM」と呼んでいる（図4B）。KTM-FM培養物が宿主の脂質代謝を変化させる能力を評価するため、KTM-FMまたは3種のKT微生物の単純な非発酵ミックス（KTM-Mix、略称「KTM-M」、図4B）を摂取した動物にオイルレッドO染色を行った。興味深いことに、KTM-M飼料は宿主の脂質蓄積、脂質滴のサイズ、脂質滴の量を減少させなかった（図4C-4EおよびS6E）。しかし、KTM-FMの摂取は元のKTM飼料と同程度に脂質レベルを減少させた（図4F）。重要なことは、KTM-M食もKTM-FM食も発育や行動プログラムを損なわなかったことである（S6F-S6I図）。これらの結果は、KT摂取に対する宿主の代謝反応には長期発酵が必要であることを示唆している。さらに、KT微生物の非発酵ミックスでは宿主の脂質蓄積を制限できないという観察結果は、KTMを与えた動物はカロリー制限を受けていないという結論をさらに支持するものである。

発酵時間の重要性をよりよく理解するために、異なる発酵期間のKTM-FM培養物を動物に与え、オイルレッドO染色を用いて脂質レベルを測定した。発酵期間が1週間未満のKTM-FMを与えた動物は脂質レベルが上昇したが、2週間以上発酵させたKTM-FMは宿主脂質の枯渇を促進した（図4G）。さらに、完全に発酵させたKTM上清を除去し、NGMプレートに播種する前にKTMを5％スクロース溶液で繰り返し洗浄しても、KTMに対する宿主脂質の蓄積は変化しなかった（図4Hおよび4I）。このことは、緑茶および紅茶に含まれる低分子は、宿主脂質の表現型を付与するのに必要ないことを示唆している。しかしこの結果は、紅茶由来の代謝産物が共生コンブチャ培養の確立に不可欠である可能性を否定するものではない。これらのデータを総合すると、KT微生物が宿主の脂質代謝経路を再構成するためには、確立されたコミュニティを形成する必要がある。

線虫の腸内にA. tropicalisがコロニー形成していることは確認されたが（図1F）、他のKT分離株であるK. rhaeticusやZ. bailiiが動物に摂取されているかどうかは不明である。生きた動物の腸内でこれらの微生物を可視化するために、大腸菌、K. rhaeticus、またはKTMを与えられた動物を、キチンやセルロースの多糖類を選択的に染色するカルコフルオールホワイトで染色した。動物の発育を支えるセルロース産生微生物K. rhaeticusが腸管内腔で観察されたことから（S6J図）、K. rhaeticus菌はセルロースを合成しながら腸に定着できることが示唆された。驚くべきことに、腸管内腔にはキチン産生酵母細胞も観察され、Z. bailiiは成体段階で動物に摂取される可能性があることが示された（S6KおよびS6L図）。重要なことに、これらの結果は、我々のKT培養から単離された3種のKT微生物（Z. bailii、K. rhaeticus、A. tropicalis）すべてが咽頭での機械的破壊を免れ、線虫の腸管内腔に存在できるという推定と一致している。KT微生物が腸内に定着する能力をさらに評価するために、大腸菌OP50、KTM、KTM-M飼料で飼育した動物の腸管内腔の大きさを定量した。ERM-1::GFPを発現する動物を用いると、腸管細胞の先端表面に局在し、管腔の測定が容易になる。KTM飼料を摂取した個体は、大腸菌OP50飼料を摂取した動物に比べて腸管内腔の直径が増大したが、KTM-M飼料を摂取した動物は増大しなかったことから、KT微生物を含む飼料はいずれも腸の膨満感を刺激することが示唆された（S6M Fig）。

Z.bailiiが腸内に存在し、腸の膨満感を助長していることから、酵母（あるいは他のKT微生物）が栄養吸収を制限し、その結果カロリー制限を引き起こしている可能性が考えられた。そこで、KTMおよびZ. bailiiの飼料に加熱死滅させた大腸菌OP50を添加し、オイルレッドO染色を用いて脂質レベルを評価した。大腸菌の補充はKTM飼料が宿主の脂質蓄積を制限する能力にほとんど影響を与えなかったが、Z. bailii飼料への補充は酵母の存在にもかかわらず動物の発育を支持し、脂質蓄積を促進した（図4J）。次に、餌と一緒に消費され、腸管頂膜を容易に通過するバイタル色素C1-BODIPY-C12をKTM芝に補充することで、KTM飼育動物の栄養吸収を評価した。BODIPYの3時間パルス投与後、大腸菌OP50、KTMおよびKTM-Mを摂取した動物はすべて、腸上皮細胞で検出可能なレベルのBODIPYを示した（図4KおよびS7）。KTMを摂取した動物では脂質小滴が非常に少ないため、BODIPY染色は腸細胞全体に拡散分布した。しかし、大腸菌OP50およびKTM-Mを摂取した動物では、色素は腸脂質小滴およびリソソーム関連小器官に局在した[53,67]。これらの所見は、KT微生物を単独あるいは組み合わせて摂取した動物が栄養吸収能力を損なわれるのではなく、むしろKTM食が宿主の代謝経路を調節することによって脂質の蓄積を制限している可能性が高いという、我々のこれまでの観察と一致している。

KTM摂取に対する腸管主導の代謝反応
KTMを摂取した動物は正常な発育を遂げ、栄養吸収に検出可能な障害は見られないが、KTM-M飼料を摂取した動物を含む対照動物に比べ、脂質の蓄積は著しく少ない。トランスクリプトーム解析から、発育や生殖に関与する遺伝子の発現は食餌間で一貫していることが示唆されたが、我々は代謝遺伝子の発現がKTM摂取によって特異的に変化する可能性があると仮定した。そこで、KTM、KTM-M、A. tropicalis、または2つの大腸菌食のいずれかを摂取した初日の成体動物から得られたmRNA-Seqデータについて追加解析を行い、これらの食餌によって特定の代謝プログラムが変化するかどうかを調べた。PCA解析の結果、同じ飼料を摂取した動物のトランスクリプトームはクラスター化し、KTM、KTM-M、A. tropicalisを摂取した動物のトランスクリプトームは、大腸菌を摂取した動物のトランスクリプトームとは明らかに離れてクラスター化していた（図5A）。KTM食の世代を超えたエピジェネティックな影響の可能性を排除するため、KTMを1世代与えた動物と5世代KTM食を与えた動物のトランスクリプトームを比較したところ、これらのトランスクリプトーム間に有意な差は見られなかった（図5AおよびS8A）。

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図5. 宿主の脂質代謝遺伝子発現はKTMの摂取によって調節される。
(A）示した食餌（1G、1世代KTM給餌；5G、採集前の連続5世代KTM給餌）の正規化mRNA-Seqデータの主成分分析。(B) 大腸菌OP50を基準として決定した、各食物源間の発現差遺伝子の重複。(C）KTMを摂取した動物で特異的に発現が異なる295遺伝子について行ったGene Ontologyエンリッチメント解析。(D) 示された組織で発現している遺伝子の差次的発現に対する濃縮度（観察／予想、超幾何学的P値報告）。値＜1は、示された組織タイプで発現した遺伝子が差次的に発現しない傾向があることを示し（濃縮不足）、値＞1は、差次的発現がランダムな偶然によって予想されるよりも一般的である組織を示す（濃縮過剰）。(E）代謝関連遺伝子5,676個のRPMK値の散布図と線形回帰（R2 = 0.9556）（目的の遺伝子は矢印で示す）。(F)各食餌（左からKTM、A. tropicalis、KTM-M、大腸菌HT115）の脂質代謝遺伝子の概略図と遺伝子発現ヒートマップ（大腸菌OP50に対するLog2倍変化値）。パネルA～Fの生データはS5 DataおよびS4 Tableに掲載。

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mRNA-Seqデータをさらに詳しく調査した結果、各KT関連食は、大腸菌OP50食と比較して、ある程度の遺伝子発現の差を確かにもたらしたことが明らかになった（A. tropicalis, 3,952遺伝子; KTM, 1,237遺伝子; KTM-M, 1,007遺伝子; 1% FDR; 図5BおよびS8B-S8F）。興味深いことに、295の遺伝子がKTM食に特異的であった（図5B）。これらのKTM特異的遺伝子の発現変化は、KTM食動物で特異的に観察された脂質レベルの低下の主要なドライバーである可能性がある。KTM特異的遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）濃縮解析[68]により、脂質代謝に機能的役割を持つと注釈付けられた遺伝子が濃縮されていることが明らかになった（図5C）。中心的な代謝遺伝子の過剰発現は長寿とストレス抵抗性経路を変化させるので[69,70]、これらの同じ遺伝子がDAF-2（すなわち、インスリン受容体）のレベルが減少した動物でも過剰発現しているかどうかを調べた。実際、腸を含む様々な組織[72]でDAF-2を枯渇させると、KTMを摂取した動物で見られたものと一致する転写変化が起こる（S8G-S8I図）。これらのデータを総合すると、発酵KT微生物の摂取は、宿主の脂質代謝とストレス回復経路をリモデリングし、脂肪蓄積を制限して健康寿命を改善する可能性が示唆される。

線虫では、腸は栄養吸収、脂質貯蔵、代謝調節の主要なハブとして機能している[52]。われわれのトランスクリプトームデータは、脂質代謝に関与する遺伝子がKTM摂取によって調節されることを示しており、KTMに対する宿主の転写応答が腸で起こるかどうかを調べることを促した。すでに確立された主要組織の遺伝子発現データを用いて、食事誘発性差次的発現遺伝子の各セットが特定の組織に濃縮されているかどうかを照会した[73,74]。その結果、KTM摂取に応答して、腸内遺伝子の差次的発現が顕著に濃縮され、神経系遺伝子と生殖細胞系遺伝子が減少していることがわかった（図5D）。これらのデータは、腸で発現する遺伝子はKTMを摂取した動物で共通して発現が異なるが、他の組織型で発現する遺伝子はKTMを摂取した動物では発現が異ならない傾向があることを示している。

KTM摂取による代謝の影響に関与すると考えられる候補遺伝子を同定するため、代謝に機能するとアノテーションされている5,676遺伝子の発現レベルを解析した[29]。その結果、脂質生物学で機能することが知られているいくつかの遺伝子の発現が、KTM摂取動物で変化していることが明らかになった（図5Eおよび5F）。これらには、脂質のβ-酸化（acdh-1、acdh-2）、脂肪酸脱飽和（fat-5、fat-6、fat-7）、トリグリセリド合成（dgat-2）に働く遺伝子の発現低下と、脂肪分解（lipl-1、lipl-2、lipl-3）に働く遺伝子の発現上昇が含まれる。これらのデータは、腸における特定の脂質代謝遺伝子の発現がKTMの摂取によって調節されることを示唆している。同様に、短鎖脂肪酸と分岐鎖アミノ酸を異化するアシル-CoAデヒドロゲナーゼをコードするacdh-1遺伝子のGFPベースの転写レポーターの腸内発現は、動物にKTM飼料を与えた場合に減少した（S8JおよびS8K図）。これらの結果を総合すると、KTMを摂取させた動物で観察された腸内脂質の減少は、少なくとも部分的には代謝遺伝子の転写制御が原因となっている可能性が示唆される。

KTMの摂取は、脂質滴の動態を制御することによって脂質の蓄積を抑制する。
腸内脂質蓄積の調整は、外部シグナルに応答して脂質小滴を動的に変化させる転写および翻訳後メカニズムの両方によって支配されている。LDの拡大は、デノボ脂肪新生と、TAG合成の最終段階を触媒するアシルCoA：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）酵素の作用によって行われる [75,76]。対照的に、リパーゼと選択的LDオートファジー経路であるリポファジーは、それぞれLDのサイズと数を制限し、脂質の異化を促進する [77-81]。KTMを与えた動物は脂質レベルと脂質滴サイズの減少を示すことから、我々はトリグリセリドリパーゼの発現がKTMに反応して誘導されるのではないかと推論した；しかし、脂肪細胞トリグリセリドリパーゼ遺伝子（atgl-1/ATGL）、すなわちLD関連および飢餓応答性TAGリパーゼをコードする遺伝子[52,82]、およびホルモン応答性TAGリパーゼをコードするホルモン感受性リパーゼ遺伝子（hosl-1/HSL）の発現はKTM摂食によって変化しないことがわかった（図6Aおよび6B）。次に、mRNA-Seqデータから残りのリパーゼ遺伝子の発現を調べたところ（図5F）、3つのATGL様リパーゼ遺伝子（すなわち、lipl-1、lipl-2、lipl-3）が、大腸菌またはKTM-M飼料を摂取した動物に比べ、KTM飼料を摂取した動物で顕著に発現が増加していた（図6C-6E）。興味深いことに、lipl-1,2,3遺伝子の発現は絶食時に増加することが知られており、コードされたタンパク質はすべて腸内のリソソームに局在し、そこでリポファジーによりLDに関連したTAGを分解する[83]。これらの観察と一致して、シングルコピーのPlipl-1::mCherry転写レポーターの発現は、他の食物源と比較して、KTMに応答して腸で特異的に誘導された（図6FおよびS9A）。リソソームリパーゼ遺伝子lipl-1,2,3のアップレギュレーションと、それに伴うTAGの減少は、KTMを与えた動物が十分な栄養がある状態でも絶食に似た状態を経験する可能性を示唆している。

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図6. KTM摂取は宿主の脂質異化を刺激し、TAG合成を阻害する。
(A-E）示したリパーゼ遺伝子の正規化遺伝子発現値（RPKM、マップされた100万リードあたりの転写産物1キロベースあたりのリード数、平均±SEM、, P<0.0001, , P<0.05, ns, 有意ではない、一元配置分散分析）。(F) Plipl-1::mCherry転写レポーターを発現している動物の代表的な画像。(G) KTM-M（左群）またはKTM（右群）を摂取した1日目の野生型N2およびlipl変異体成体におけるオイルレッドO染色腸内脂質の定量（平均±SD、, P<0.0001, , P<0.001, **, P<0.01, ns, 有意ではない、一元配置分散分析）。以下の変異体のデータを示す：丸印がlipl-1(tm1954) lipl-2(ttTi14801)、三角印がlipl-1(rhd279) lipl-2(rhd282)、菱形印がlipl-1(tm1954) lipl-2(ttTi14801) lipl-3(tm4498)、六角印がlipl-1(rhd279) lipl-2(rhd282) lipl-3(tm4498)。(H)野生型N2およびlipl-1(tm1954) lipl-2(ttTi14801) lipl-3(tm4498)変異体におけるDHS-3::GFP含有脂質滴の代表的な画像（スケールバー、5μm）と(I)脂質滴密度測定（平均±SD、、P<0.0001、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。(J）TAG合成遺伝子dgat-2の正規化遺伝子発現値（平均±SEM、***、P<0.0001、一元配置分散分析）。(K）野生型N2および腸内でDGAT-2を構成的に過剰発現するDGAT-2::GFPトランスジェニック動物（dgat-2 OE; 平均±SD, ****, P<0.0001, T-test）における腸内脂質のオイルレッドO染色の定量化。(L) KTMによる宿主脂質代謝経路の調節モデル。1) 脂肪貪食に不可欠なリソソームリパーゼの誘導、2) TAG合成遺伝子dgat-2のダウンレギュレーション。パネルA-E、G、I-Kの生データはS6 Dataに掲載されている。

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リソソームリパーゼがKTに対する宿主の反応に必要であるかどうかを評価するために、オイルレッドO染色を用いて、以前に作製したlipl変異体の腸内脂質レベルを測定した[83,84]。その結果、lipl-1(tm1954); lipl-2(ttTi14801)二重変異体およびlipl-1(tm1954); lipl-2(ttTi14801); lipl-3(tm4498)三重変異体では、KTMを摂取すると野生型動物に比べて脂質レベルが上昇することがわかった（図6G）。また、CRISPR/Cas-9を用いてlipl-1およびlipl-2遺伝子に推定機能喪失型ナンセンス変異を作製し、これらの対立遺伝子を既存のlipl-3(tm4498)変異体[83]と交配させ、得られた三重変異体のオイルレッドO染色を行った。われわれの最初の観察と一致して、lipl-1,2またはlipl-1,2,3の同時欠損は、KTM飼育動物の脂質レベルを増加させた（図6G）。LIPL-1,2,3タンパク質はリソソームに局在し、LDに関連するTAGを異化することから、KTMを摂取したlipl-1,2,3変異体ではLDのサイズまたは存在量が変化している可能性があると考えられた。そこで、DHS-3::GFPレポーターをlipl-1(tm1954); lipl-2(ttTi14801); lipl-3(tm4498)三重変異体に交配し、腸内LDを測定した。KTM-M食ではなくKTM食を与えた三重変異体動物では、野生型動物に比べてLDが多かった。しかし、LDの大きさは野生型動物と変異体動物で同程度であった（図6H-6IおよびS9B）。このことから、LIPL-1,2,3タンパク質はKTM食動物においてLDの分解を促進するが、LDの縮小は促進しないことが示唆された。これらの結果から、コンブチャティー摂取に伴うリソソームリパーゼのアップレギュレーションは、KTMに対する宿主の代謝反応を部分的に支配し、脂質の異化を促進することが示された。

脂質異化経路の誘導に加えて、コンブチャ関連微生物はTAGの蓄積やLDの拡大を阻害する可能性がある。mRNA-Seqデータを用いてこれをさらに調べるため、大腸菌OP50、KTM、またはKTM-Mを与えた動物について、LD合成または拡大に機能することが知られている遺伝子の発現レベルを比較した[75,85]。seipin（seip-1）、lipin（lpin-1）、およびacs-22/FATP4（長鎖脂肪酸トランスポーターおよびアシル-CoA合成酵素）のレベルはKTM摂取に反応して変化しなかったが、dgat-2/DGAT2遺伝子はKTM摂取により劇的に特異的に発現低下した（図6JおよびS9C-S9E）ことから、これらの動物ではTAG合成が障害されている可能性が示唆された。dgat-2のダウンレギュレーションがKTM摂取動物における脂質の蓄積を制限するかどうかを調べるために、KTM摂取に反応しないと予測される構成的な腸内プロモーターの制御下でdgat-2を発現する株（Pvha-6::GFP::dgat-2）を用いた。実際、dgat-2の構成的発現は、KTM依存性の腸内脂質貯蔵量の減少を部分的に抑制した（図6K）。これらの結果を総合すると、dgat-2のダウンレギュレーションとリソソームリパーゼ遺伝子のアップレギュレーションを同時に行うことで、LDの分解を促進しながらTAG合成を制限し、コンブチャの摂取に反応して腸内脂質の蓄積を抑制するというモデルが支持される（図6L）。

考察
コンブチャティー摂取の最初の記録は、一般的な医療行為に取り入れられていた古代中国にまで遡ることができる [86] 。コンブチャティーの人気は歴史を通じて拡大してきたが、最近の世界的な消費の急増により、コンブチャティーは最も人気のあるプロバイオティクス含有発酵飲料の1つとなっている。このような長い歴史と、コンブチャティーが代謝の健康を改善するという広範な逸話的証拠[9-13]があるにもかかわらず、コンブチャティーの摂取が宿主の代謝を変化させるかどうか、また変化させるとすればどのようなメカニズムで起こるのかについては、ほとんど知られていない。コンブチャティーの作用を動物モデル系で調べるために、我々は、標準的な自由摂食法で線虫にKT関連微生物（KTM）の餌を与える再現性のある方法を確立した。摂食によるKTMの供給は、線虫の正常な発育と繁殖をサポートし、重要なことに、腸管内腔へのKTMの強固なコロニー形成をもたらす。本研究は、宿主におけるコンブチャ茶の作用の分子メカニズムを解明するために、確立された動物モデル系を活用した初めての研究である。

ここでは、オイルレッドOとナイルレッド染色、生化学的トリグリセリド測定、腸内脂質滴のサイズ計算により、KTMを摂取した動物は他の微生物飼料を摂取した動物に比べて脂質が著しく欠乏していることを証明した。これらの結果を総合すると、KTMの摂取は線虫において従来のカロリー制限モデルとは異なる絶食様状態を刺激することが示唆される。実際、KTMを摂取した動物はカロリー制限を受けていないと主張する証拠がいくつかある。例えば、1）KTMの摂取は野生型とカロリー制限を受けた動物（eat-2変異体）の両方で発育速度の増加をサポートする、2）KTMを摂取した動物は受胎可能である（すなわち、ほぼ正常な子房の大きさを示す、 3）個々のKT微生物（A. tropicalis、K. rhaeticus、Z. bailliに大腸菌の死骸を添加したもの）、および3つの微生物の単純な混合物（KTM-M）は、宿主の脂質蓄積を減少させることができなかった。重要なことは、カロリー制限された動物は、成長および繁殖に重大な欠陥があり [28,56-59]、KTM消費によって生じる表現型とは矛盾することである。最後に、宿主の脂質利用は、濃縮したKTM微生物をプレーティングする前に、ショ糖のみのナイーブ培地で洗浄しても維持されることがわかった。このことは、宿主の脂質代謝を変化させる生理活性分子は、無細胞の発酵茶上清に存在するのではなく、KTM微生物に内在するものであるという仮説を支持する。これらのKTM由来の代謝産物を同定することは、KTの作用の分子メカニズムを解明する上で極めて重要である。

コンブチャに対する宿主の代謝反応を包括的に捉えるため、KTMを摂取した動物のmRNA配列決定を行った。発育または生殖遺伝子の発現は全体的に変化しなかったが、多数の脂質代謝遺伝子の発現はKTMに応答して特異的に変化し、腸で機能することが知られている遺伝子に強く濃縮された。これらには、脂質のβ酸化（acdh-1とacdh-2）、脂肪酸脱飽和（fat-5とfat-7）、トリグリセリド合成（dgat-2）、脂肪分解（lipl-1、lipl-2、lipl-3）など、脂質生物学の様々な側面で機能する遺伝子産物が含まれる。ステアロイル-CoAデサチュラーゼ遺伝子、特にfat-5とfat-7はKTM飼育動物で発現が低下していた。線虫の脱飽和酵素は脂質の基質選択性を持っているため、個々の脂肪遺伝子の発現の差は特定の一価不飽和脂肪酸または多価不飽和脂肪酸の存在量に変化をもたらす可能性があることから、この発見は注目に値する [87]。パルミトレイン酸（16:0）を脱飽和してパルミトレイン酸（16:1n-7）を生成するFAT-5は、KTMを摂取した動物では転写調節が低下しており、その結果、パルミトレイン酸が減少し、パルミチン酸またはパルミチン酸から誘導される他の不飽和脂肪酸が増加する可能性がある。一価不飽和脂肪酸あるいは多価不飽和脂肪酸の存在量における特異的な変化が、KTM摂取動物が示す絶食様状態に寄与している可能性がある。しかし、KTM摂取に対する宿主応答を媒介する線虫デサチュラーゼの役割を解明するには、脂肪酸補充実験や遺伝子解析と組み合わせたリピドミクス研究が必要である。

本研究では、3つの腸内ATGL様リパーゼ遺伝子lipl-1、lipl-2、lipl-3がKTM摂取動物で特異的に発現が上昇する一方、他の5つのlipl遺伝子、脂質滴リパーゼ遺伝子atgl-1とhosl-1は変化しないことに注目した。これらの結果は、コンブチャの摂取が脂質の蓄積を制限する特異的な異化反応を引き起こすことを主張している。lipl-1,2,3遺伝子は、おそらく冗長的に作用する3つのリソソームリパーゼをコードしており、LD関連TAGのリポファジーを介した分解に機能している [83]。ここで我々は、lipl-1,2,3遺伝子がKTMを介した脂質異化に部分的に必要であることを証明し、リポファジーがKTMの消費によって誘導されることを示唆した。リポファジーは、脂質滴のTAGを標的にして遊離脂肪酸を遊離させ、さらに異化を進める選択的なオートファジーの一形態であり、低栄養状態や絶食状態における脂質の恒常性と生存に不可欠である。これらの条件に加えて、ホメオスタシス経路は、異なる栄養およびストレス関連条件下（すなわち、摂食状態、絶食状態、および酸化ストレス状態）で、リポファジー誘導を動的に制御することができる [80] 。例えば、リップル3の転写は、DAF-16/FOXO、PHA-4/FoxA、HLH-30/TFEB転写因子の相互作用によって、特定の状況下で制御される [80]。我々は、KTMの摂取が線虫の絶食様状態を刺激し、リポファジーを介して脂質の利用を促進すると提唱している。しかし、KTMに反応してリポファジーが誘導される正確な分子メカニズムを解明するには、今後の研究が必要である。Xuら[19]によるげっ歯類での最近の研究は、脂質利用障害や脂質異常症によく関連する疾患状態である肥満や2型糖尿病に対する予防など、ヒトのKT摂取に関する健康強調表示を支持する生理学的証拠を実質的に提示していることは注目に値する[81,88-90]。KTM食を摂取した線虫動物は、リポファジーレベルが上昇し、より広範なオートファジー駆動型代謝リプログラミングを起こす可能性があるという我々の発見は、これらの主張と一致しており、コンブチャ茶摂取に対する宿主応答を分子レベルでデコンボリューションする今後の研究が、コンブチャ茶がヒトの代謝をどのように変化させるかについての洞察を提供することを示唆している。

我々のmRNA-Seqデータは、アシル-CoA:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）酵素をコードするdgat-2が、KTM摂取に反応して劇的に発現低下することも明らかにした。DGAT酵素はジアシルグリセロールと脂肪アシル-CoAからトリグリセリドの合成を触媒し、その結果TAGが産生され、脂質滴が拡大する。dgat-2を恒常的に過剰発現させると、KTMを摂取した動物の脂質蓄積が増加したことから、dgat-2の発現低下、ひいてはTAG合成の減少が、KTに対する宿主のプログラムされた反応の一部である可能性が示唆された。注目すべきことに、線虫におけるdgat-2の誘導は、病原体であるステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）に反応してLDを拡大することを支持していることから［91］、dgat-2の発現は、LD内の脂質貯蔵レベルを制御するために、栄養感知または自然免疫経路によって動的に制御されている可能性が示唆される。dgat-2の発現は、LIPL-1,2,3リソソームリパーゼの発現を制御するのと同じシグナル伝達ネットワークによって制御されている可能性がある。このことは、LIPL-1,2,3の欠損がLDの量を増加させるが、大きさは増加させないことの説明にもなる。

近年、線虫はヒトのプロバイオティクス微生物の作用機序を解明し、ヒトの健康に役立つ可能性のある微生物を同定するための強力な研究系であることがますます明らかになってきている [23,25,26,31,92-94]。我々の研究は、線虫の遺伝的な扱いやすさを利用して、プロバイオティック微生物に対する宿主の生理的・機構的反応を調べる、厳密で再現性の高い、広く応用可能な系を確立した。これはエキサイティングな提案であるが、ヒトとプロバイオティクスの相互作用を調べるモデルとして線虫を用いて行われた他の研究と同様に、この研究はヒトの健康転帰に直接的に変換できるものではなく、ヒトがコンブチャティーを摂取する際の臨床的なアドバイスや背景を提供するものではないことに注意する必要がある。我々はまた、現在人気のあるこの発酵飲料の起源が、古代中国の医療行為に深く根ざしており、我々とは異なる文化によって作られたものであることを認める。したがって、我々はコンブチャティーを人間の医療行為やレクリエーションに使用することに関して、判断や結論、主張をしているわけではないことを明確にしたい。しかしながら、我々の発見は、KT微生物が介在する宿主の代謝再プログラミングの可能性のあるメカニズムに関する興味深い洞察を提供し、コンブチャティーの潜在的な健康効果の生物学的裏付けを解明する可能性のある哺乳類モデル系における将来の研究の基礎を築くものである。

材料と方法
線虫系統と維持管理
線虫株はすべて、大腸菌OP50を含むNematode Growth Media（NGM）寒天培地プレート上で20℃で維持した。本研究で用いた菌株の全リストを S3 Table に示す。すべての線虫株は、実験に使用する前に少なくとも3世代は十分に飼育した。特に断りのない限り、卵は大腸菌OP50で飼育した妊娠成虫から漂白により採取し、室温で一晩インキュベートすることにより動物をL1期に同期させた。漂白によるL1動物の調製は、次世代におけるコンブチャNGMプレートの大腸菌汚染を防ぐために必要であった。

Plipl-1::mCherryトランスジェニック株は、Mos1-mediated Single Copy Insertion (mosSCI)を用いて構築した。lipl-1プロモーター（1,228bp；染色体V：12,918,779-12,920,006；WS288）をPCRで増幅し、ギブソンアセンブリーによりpCFJ151中のmCherry::unc-54 3'UTRに融合した。得られたプラスミド、pRD172[Plipl-1::mCherry::unc-54 3'UTR + cb-unc-119(+)]をEG6699にマイクロインジェクションし、シングルコピーのインテグラントrhdSi53[Plipl-1::mCherry::unc-54 3'UTR + cb-unc-119(+)]を単離した。lipl-1(rhd279[A391*])とlipl-2(rhd282[A423*])のナンセンス対立遺伝子はCRISPR/Cas9遺伝子編集によって作製した。簡単に言うと、一本鎖オリゴヌクレオチドHRドナー分子とCas9::crRNA:tracrRNA複合体（crRNA配列：5'-UAGAGAACUUCUACUCAAAA-3'）を、以前に記載されたように野生型動物の生殖系列にマイクロインジェクションした[97]。このHRドナー配列には新しいXbaIカット部位が含まれており、サンガー配列決定の前にPCRと制限消化による遺伝子型決定を行うことができた。転写レポーター株rhdSi53[Plipl-1::mCherry::unc-54 3'UTR + cb-unc-119(+)]およびwwIs24[Pacdh-1::GFP + cb-unc-119(+)]は、DS-Qi2モノクロームカメラを搭載したNikon SMZ-18実体顕微鏡で10倍ズームで画像化した。

コンブチャの抽出
コンブチャの醸造は、自家製コンブチャキット（The Kombucha Shop）を参考にした連続発酵法で行った。超純水（1L）を3分間沸騰させ、火から下ろし、乾燥茶葉（アッサム紅茶2.5gと緑茶2.5g）をインフューザーを使って5分間蒸らした。インフューザーを取り出した後、128gのグラニューきび砂糖（ドミノ）を茶葉に溶かし、溶液を清潔な5Lのガラス製抽出ジャーに注いでから、3Lの冷やした超純水を加えた。溶液が30℃以下まで冷めたら、SCOBYと前回の発酵コンブチャブロスを500mLほど加え、発酵中の汚染を防ぐため、しっかりと織ったモスリン布をジャーの開口部に貼り付けた。その後、ジャーを室温（24～28℃）の間接日光の当たる場所に置き、最低8日間発酵させてから新しい培養を開始した。

NGMコンブチャプレート
単一微生物飼料では、NGMプレートに、25℃で16時間培養した大腸菌（OP50またはHT115）、または25℃で3日以上培養したA. tropicalis、K. rhaeticus、Z. bailiiのいずれかを播種した。A. tropicalis、K. rhaeticus、Z. bailiiは、1% D-グルコースと1%グリセロールを添加した25mLのマンニトール増殖培地（1L中、酵母エキス5g、ペプトン3g、マンニトール25g）で、振とう培養（250rpm）した。菌株は4,000rcfで5分間遠心分離して濃縮し、5mLの適切な培地に再懸濁した後、NGMプレートに播種した。食品源の微生物濃度を算出するため、OD600を測定した後、連続希釈を行い、CFUを定量した。

KTM NGM寒天培地を調製するために、発酵2日目または3日目のコンブチャティー培養液50mLを除去し、4,000rcfで5分間遠心分離して微生物を濃縮した。上清を除去し、5mLを残してペレット化したKTMを再懸濁した。ボルテックスによる再懸濁後、300μLまたは2mLの濃縮KTを、それぞれ6cmまたは10cmのNMGプレートの中央に添加した。5xKTMプレートでは、250mLの培養液を5mLに濃縮した。プレートを実験に使用する前に、室温で4日間熟成させた。KTM-M NGMプレートは、まずA. tropicalis、K. rhaeticus、Z. bailiiをそれぞれ20 mL培養して調製した。その後、微生物を遠心分離で濃縮し、フィルター滅菌した茶培地（アッサム紅茶2.5g、緑茶2.5g、グラニュー糖128g、水1L）で再懸濁し、1つの培養液にまとめ、滅菌した茶培地で洗浄し、遠心分離で再濃縮し、上清5mLに再懸濁し、NGMプレートに播種し、室温で4日間培養した。フィルターで滅菌した茶培地に微生物や芽胞がいないことを確認するため、滅菌した茶培地をNGMプレートに播種し、14日間にわたって生育をモニターしたところ、微生物が生育していないプレートが得られた。

同様に、微生物を単独で増殖させ、収穫し、滅菌茶培地中で結合させて小規模KTM-FM培養物を作製し、これをゆるく蓋をした50mLコニカルチューブに入れて室温で維持した。異なる時点で30mLを取り出し、30mLの新鮮な滅菌茶培地と交換した。翌日、培養液から25mLを取り出し、遠心分離で濃縮し、NGMプレートに播種し、使用前に室温で4日間培養した。KTM-FMの長期樹立培養も同様の方法で開始したが、培養はチーズクロスで覆った500mLメスシリンダーで行い、新鮮な滅菌茶培地50mLを加える前に発酵培養液（プレートに使用）50mLを除去し、経時的に連続発酵させた。

コンブチャ培養液とプレートの16S rDNA配列決定
コンブチャ茶の培養を開始し、KTMを上記のようにプレートに播種した。培養1日目のタイムポイントでは、1mLの10倍濃縮コンブチャを16,000krcfで10分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを液体窒素で瞬間凍結した。KTMプレートは、10倍濃縮コンブチャを用いて、同時に16S配列決定用に調製した。その後の培養サンプリングでは、KTを10mL採取し、遠心分離によりKTMを採取した。KTMプレートサンプルについては、異なるタイムポイントでNGMプレートからセルスクラッパーを用いて微生物を除去し、1mLのUltraPure DNase/RNaseフリー水に回収し、遠心分離によって濃縮し、凍結した。すべての16S rDNAシーケンシングは、UNC Microbiome CoreがIllumina MiSeq装置（PE 250）を用いて行った。データ解析は、Qiime2 [98]を用いてサンプルあたり32,000～95,000の生リードで行った。

芝生回避アッセイ
約50匹の同調したL1動物を各微生物芝生の外に落とし、48時間後、72時間後、96時間後に各芝生上の動物の数を数えた。芝生の外に出た動物の割合は、各時点のNoff lawn/Ntotalとして計算した。各生物学的複製は3つの技術的複製を平均し、データはPrism 9を用いて平均±SEMとしてプロットした。通常の一元配置分散分析に続いてシダックの多重比較検定を行い、群間の統計的有意性を算出した。

食物選択アッセイ
NGMプレートを4象限に播種し、それぞれに4種類の食物源（大腸菌OP50、HT115、A. tropicalis、KTM）のうち1種類を30μLずつ添加した。約50匹の同調したL1動物をプレートの中央に落とし、48時間後に異なる微生物芝生上の動物の割合を数えた。

汲み上げ速度の測定
同調させたL1動物から各飼料で生育させ、1日目の成虫15匹の汲み上げ速度をNikon SMZ800N実体顕微鏡を用いて手動で数えた。1分間の咽頭収縮回数を数え、Prism 9を用いて平均値±SDでプロットした。一元配置分散分析に続いてTukeyの多重比較検定を行い、群間の統計的有意性を算出した。

腸内コロニー形成アッセイ
各食餌摂取後の線虫動物の細菌負荷の測定は、以前に記載された方法で行った[99]。簡単に説明すると、～150匹の動物を各食餌で同調させたL1から成虫まで成長させ、～30匹を空のプレートに30分間ピックし、芝生からの細菌移行を最小限にした。10匹の動物を100μg/mLのレバミゾールを含むM9培地に手で摘み、沈降させ、レバミゾールとゲンタマイシン（100μg/mL）を含むM9培地で3回洗浄した。電動卓上ホモジナイザー（BioSpec Mini-beadbeater）を用い、1.5 mm滅菌酸化ジルコニウムビーズ（Next Advance）30個を用いて、250 μLの1% Triton X-100中で動物を溶解した。1.5 mL チューブを 90 秒間 2 回振とうした後、溶解液を連続希釈し、標準 NGM プレートにプレーティングした。CFU/ 個体値は、記述 [99]に従って算出した。データは Prism 9 を用いてプロットし、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）により食物源間の統計的有意性を判定した。

線虫腸のSEMイメージング
1日目の成虫を150mMリン酸ナトリウム緩衝液（PB、pH7.4）中2%パラホルムアルデヒドで室温固定し、4℃で保存した。サンプルをPBで3回洗浄した後、水で3回すすぎ、エタノール勾配（30％、50％、75％、100％、100％、100％）を用いて脱水し、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）交換で2回洗浄し、HMDS中で乾燥させた。乾燥した動物を13 mmのアルミニウム製スタブに取り付けた両面カーボン接着剤にブラッシングし、メスを用いて線虫動物を接着剤に接着させたまま、動物の体を上方に刃を引き上げるようにしてスライスした。その後、マウントしたサンプルを5 nmの金パラジウムでスパッタコーティングした（60 Au:40 Pd、Cressington Sputter Coater 208HR、モデル8000-220、Ted Pella Inc）。画像は、5 kVで作動するZeiss Supra 25 FESEMを用いて、InLens検出器、～7 mmワーキングディスタンス、30 μmアパーチャー（Carl Zeiss SMT Inc）を使用し、5,000倍および15,000倍ズームで撮影した。

カルコフルオールホワイト染色
キチンおよびセルロースを染色するCalcofluor White（または蛍光増白剤#28）をレバミソール麻痺液に約1mg/mL添加した。異なる飼料を与えた動物をレバミソールとCalcofluor Whiteを含む寒天パッドに採取し、カバースリップで覆い、10分間染色した。K. rhaeticusおよび大腸菌OP50のイメージング（S6J図）のために、動物を、63Xのオイル対物レンズ（Plan-Apochromat、1.4NA）を用いて、Hamamatsu ORCAFusion GENIII sCMOSカメラを装備したスピニングディスクヘッド（89 North）付きxLIGHT V3共焦点顕微鏡を備えたLeica DMI8でイメージングした。KTM（S6L図）の撮像には、100Xの油対物レンズ（Plan Apo λ）を用い、浜松ORCA-Fusion BTカマラを装備したTi2広視野顕微鏡で動物を撮像した。重要なことは、染色は急速に光退色しやすいため、関心領域はDICチャンネルを使用して見つけ、動物は画像取得中のみ蛍光灯に照射したことである。Nikon Elementsを使用してKTM画像のノイズ除去およびデコンボリューションを行い、Fiji v2.9.0[100]で両方の画像セットを処理して擬似着色を導入した。

オイルレッドOおよびナイルレッド染色
約 150 匹の同調した L1 を、異なる食物源を含む NGM プレート上で 20℃、72 時間培養した。日目の成体動物をM9培地でプレートから洗浄し、氷上で落ち着かせ、S-basal培地で3回洗浄し、60％イソプロパノールで固定した。オイルレッドO染色では、固定した動物を濾過した0.5%オイルレッドOで7時間処理した後、既述のようにS-basal中の0.01% Triton X-100で動物を洗浄した[101]。ナイルレッド染色では、イソプロパノール固定した動物を新鮮なナイルレッド／イソプロパノール溶液（40％イソプロパノール1mLあたり0.5mg/mLのナイルレッドストック150μL）で2時間染色した［29］。全身を分析するために、動物を寒天パッドにマウントし、DS-Qi2モノクロームカメラを搭載したNikon SMZ-18実体顕微鏡を用いて3倍ズームでオイルレッドO染色を、または浜松ORCA-Fusion BTカメラを搭載したTi2広視野顕微鏡を用いて4倍ズームでナイルレッド染色を行った。オイルレッドO染色動物のカラー画像は、Nikon DS-FI3カラーカメラを装着したTi2広視野顕微鏡を用い、10倍の倍率で得た。腸のオイルレッドO染色の解析（図6Gおよび6K）のために、Hamamatsu ORCA-Fusion BTカメラを装着したTi2広視野顕微鏡で動物を10倍で撮影した。

オイルレッドO染色の定量化のため、Fijiを用いて動物全体の輪郭を描き、各個体の平均グレー値（0～65,536）を測定した。得られた値は65,536から差し引かれ、強く染色された動物の値が高くなるようにスケールが反転した。真のバックグラウンド値は各動物内の非染色領域であるが、これらの領域を客観的に同定することは不可能である。したがって、バックグラウンドの減算は行わず、データを小さな範囲の値（55,000から65,000、我々は5.5から6.5と報告）に圧縮した。この方法は再現性が高いことがわかった。腸管オイルレッドO染色解析（図6Gと6K）については、最初の2つの腸管細胞内に描かれたボックス（25x25ピクセル）内で平均グレー値を計算し、解析は上記のように行った。ナイルレッド染色については、Fijiを用いて平均蛍光強度も測定し、バックグラウンドサブトラクションは行わなかった。すべてのデータはPrism 9を用いて平均値±SDでプロットし、各実験について一元配置分散分析（one-way ANOVA）に続いてTukeyの多重比較統計検定を行った。染色実験の各セットについて、少なくとも3つの生物学的反復を行い、同様の結果を得た。

脂質滴の定量化
生きた1日目の成体ldrIs1[Pdhs-3::dhs-3::GFP]動物をレバミソールで寒天パッドにマウントし、63Xのオイル対物レンズを用い、Hamamatsu ORCA-Fusion BT camaraを装備したTi2広視野顕微鏡で画像化した。最後の2つの腸細胞ペアを捉えた明視野DICおよびGFP画像を、サンプル間で同じ設定を用いて0.2μmスライスで撮像した。撮影後、Nikon Elementsを用いて、スタックの中央の代表的なスライスを選択し、Fijiを用いて下流解析を行った。DIC画像を用いて腸管細胞対の輪郭を描き、ラインツールとROIマネージャーを用いて、GFPチャンネル内の脂質滴の直径を手作業で測定した。各食物源について、代表的な10動物の最後の腸細胞対から測定値を収集し、Prism 9を用いて各動物の平均脂質滴測定値をプロットした。一元配置分散分析に続いてTukeyの多重比較検定を行い、群間比較を行った。2つの独立した実験が行われ、同様の結果が得られた。

生化学的トリグリセリド測定
各食物源を摂取した 1 日目の成体動物を収穫し、前述のように処理した [55]。Triglyceride Assay Kitを用い、製造元の説明書に従ってトリグリセリドを測定した（Abcam, ab65336）。生物学的反復を3回行い、データをPrism 9でプロットし、一元配置分散分析に続いてTukeyの多重比較検定を行って群を比較した。

脱皮アッセイ
mgIs49[Pmlt-10::GFP::PEST]L1を1～8個同調させ、NGM培地を含む24ウェルプレートの各ウェルに滴下し、各食物源20μLを播種した（各食物源につき1プレート）。動物は20℃で飼育し、Nikon SMZ-18 Stereo 顕微鏡で70時間、1時間ごとに蛍光顕微鏡で観察した。各時点で、動物は緑色（脱皮している）または緑色でない（脱皮していない）と採点された。動物のいないウェルは打ち切った。各時点で脱皮した動物の割合を計算し、Prism 9を用いてプロットした。実験は少なくとも2回行い（KTM-MとKTM-FMを除く）、同様の結果を得た。

発生時期の測定
野生型N2およびeat-2(ad465)変異体を成体まで成長させ、上記のように卵を前処理した。大腸菌OP50を108または109 CFUs/mL含むカロリー制限プレートは既述のように調製した[59]。約 20 個の同調した L1 をテクニカルトリプリケートで各食糧源に投下し、20℃で生育させた。正確に48時間後、外陰部の形態に基づいて、若齢成虫、L4幼虫期、またはL4幼虫期未満として動物を採点した。各幼虫期の動物の割合を3つの生物学的複製について計算し、データをPrism 9を用いて平均値±SEMとしてプロットした。

ブルードサイズの測定
動物をそれぞれの餌源で48時間成長させ、その時点で15匹のL4幼虫を対応する餌源に移し、成熟させた。6日間、24時間ごとに新しいプレートに移した。雌雄同体の成虫が新しいプレートに移された 2 日後、L3/L4 の子孫を数え、取り除いた。孵化していない卵は数えなかった。個々の雌雄同体の総子孫数をPrism 9を用いて平均値±SDでプロットし、Tukeyの多重比較補正を加えた一元配置分散分析検定を行った。また、1日あたりの平均生殖生産量も計算し、これらの平均値間の差異を同定するために、対応のないT検定を行った。

VIT-2::GFPの定量
内因性レベルでVIT-2::GFPを発現している動物（BCN9071株）を成虫まで成長させ、卵を前処理し、上記のように室温で一晩かけて孵化させた。飢餓状態のL1をそれぞれの餌で播種したNGMプレート上に落下させ、20℃で72時間培養した。妊娠1日目の成虫をNGMプレートから洗い落とし、漂白によって卵を遊離させた。M9培地で3回洗浄した後、胚を寒天パッドにマウントし、浜松ORCA-Fusion BTカマラを装備したTi2広視野顕微鏡で20X対物レンズを用いて画像化した。明視野DICおよびGFP画像を撮影し、各条件の初期胚（44細胞期以前）30個の蛍光強度をFijiを用いて測定した。平均蛍光強度±SDはPrism 10を用いてプロットし、群間の統計的差は対応のないT検定を用いて算出した。独立した生物学的複製を3回行い、同様の結果を得た。

腸管内腔の測定
各飼料を摂取した1日目の成体ERM-1::GFP動物（BOX213株）をレバミソールを添加した寒天パッドにマウントし、DS-Qi2モノクロームカメラを搭載したNikon SMZ-18実体顕微鏡を用いて画像化した。少なくとも10個体について明視野とGFP画像を取得した。Fijiを用いて腸管内径を3回測定した（前腸、外陰部、後腸）。各個体について、体幅に対する内腔の幅の比を、動物に沿った3つの位置のそれぞれで計算し、3つの値を平均した。各生物学的複製について10個体を測定し、データは3生物学的複製の平均±SEMとして報告した。Prism10でTukeyの多重比較補正を用いた一元配置分散分析検定を行った。

BODIPY染色
C1-BODIPY-C12（Thermo Fisher、D3823）をDMSOに懸濁し、10 mMのストック溶液を調製した。この溶液をS-basal培地で希釈し、NGMプレート内の最終濃度が10μMになるように微生物芝生の上に重ねた。日目の成体動物をBODIPYプレートにピックする前に、プレートを暗所で少なくとも1時間乾燥させた。3時間後、動物をレバミソールで寒天パッドにマウントし、浜松ORCA-Fusion BTカマラを装備したTi2広視野顕微鏡で40X対物レンズを用いて画像化した。少なくとも20匹の動物について、腸の前部と後部の両方で明視野DICおよびGFP画像を撮影した。検出可能なレベルのBODIPY染色を示す代表的な画像を2つの独立した実験から選び、図4KとS7に示した。

コンブチャ微生物の全ゲノム配列決定と解析
1％D-グルコースと1％グリセロールを添加したマンニトール増殖培地にKT関連微生物を接種し、25℃で48時間振盪培養した。WizardゲノムDNA精製キット（Promega, A1120）を用いて細胞ペレットからgDNAを単離した。DNA-Seqライブラリーの調製とイルミナショートリードシーケンス（PE 150）は、Novogene社（カリフォルニア州サクラメント）が行った。はじめに、Kraken 2 [65]を用いて偏りのないメタゲノム解析を行い、各コンブチャ関連微生物の候補微生物種を同定した。次に、各候補種の様々な菌株の全ゲノム参照配列をNCBI Genomeデータベースからダウンロードし、Bowtie 2をデフォルト設定で使用して、これらの参照ゲノムに対して我々のリードをマッピングした[102]。Bowtie 2アルゴリズムによって生成された全体的なアライメント率を報告した。全ゲノムシーケンスデータはSequencing Read Archive (PRJNA1044129)で入手可能。

mRNA配列決定
野生型N2動物を10cmのNGMアガロースプレート（1000匹/プレート）上でそれぞれの食物源の存在下で増殖させた。1日目の成体を回収し、M9緩衝液で3回洗浄し、急速凍結した。Trizol（Thermo Fisher）を用いて全RNAを単離し、クロロホルム抽出、イソプロパノールによるRNA沈殿を2回繰り返し、RNAペレットを80％エタノールで洗浄した。場合によっては、RNA Clean & Concentrator-25キット（Zymo社、R1017）を用いてサンプルの純度を高めた。mRNA-Seqライブラリーを調製し、Novogene社（Illumina社、PE 150）でシーケンスした。データは、以前に記載されたとおりに正確に処理した[103]。RPKM値および差次発現遺伝子の同定（1％FDR）は、DESeq2アルゴリズム[104]を用いて計算した。発生、生殖、および代謝遺伝子のリストは以前に記載されており[29]、これらの遺伝子の発現レベルを示す散布図はDESeq2のRPKM値を用いて作成した。ヒートマップおよびPCAプロットは、それぞれpheatmap [105]およびtidyverse [106] Rパッケージを用いて作成した。mRNA-Seqデータを示すその他のプロットはすべてPrism 9で作成した。生データおよび処理済みmRNA-SeqデータはGEOに寄託されている（GSE236037）。

サポート情報
S1 図：NGMプレート上のKTMの系統学的プロフィールはKT培養のそれと類似している。

(A）KTM芝生を播種したNGMワームプレートの画像。新しいKT醸造サイクルが開始される0日目に調製を開始し、1日目に微生物を播種し、KTMプレートを使用する前に室温で5日目まで培養する。(B）発酵1日目と7日目のKT醸造酒の代表写真。KTMは1日目に培養物から抽出され、プレーティングされる。(C）発酵中のKombucha培養物、播種したNGMプレート、またはKombucha培養物からのペリキュラーバイオフィルムから得られたKT微生物の16S rDNA配列決定結果の総合図。プロットはそれぞれの種の頻度を示している（最も豊富な8種の微生物を表示；完全なリストはS1 Tableにある）。(D）フェイスの系統的多様性指数のプロットで、示したサンプル間のα多様性の違いを示す（**, p<0.01, one-way ANOVA）。(E) 示したサンプルの微生物多様性と種の豊かさを測定したPielouの均等性多様性指数（ns、有意ではない、一元配置分散分析）。パネルC～Eの生データはS7 Dataに掲載。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s001

(TIF)

S2 図：KTM飼料よりも他の飼料を選択するミミズ。

(A）食物選択アッセイの概略図。(B）L1投下48時間後のL4ステージにおける野生型N2動物の各食物源における割合（n>200/trial、3生物学的複製）。(C-E）L4ステージ（L1投下48時間後、n>150/trial、3生物学的反復）でスコア化したN2、MY10、およびJU1212線虫C. elegans系統の食物選択アッセイ。(F-I) 線虫N2株、PB2801 C. brenneri株、AF16 C. briggsae株、PB4641 C. remanei株（n>75/trial、3生物学的複製）。すべての食物選択データは平均値±SEMでプロットされている。すべての食餌選択アッセイはn>150匹/反復を含み、データは平均値±SEMでプロットされている（****, P<0.0001, ***, P<0.001, **, P<0.01, *, P<0.05, ns, not significant; one-way ANOVA）。パネルB-Iの生データはS8 Dataにある。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s002

(TIF）

S3 図：生殖期間中および個体間の宿主脂質分布。

(A）オイルレッドOで染色した3日目と5日目の成虫の定量（平均±SD、****、P<0.0001、一元配置分散分析）。(B）大腸菌OP50、KTM、またはKTM-Mixを摂取した10個体間で測定した個々の脂質滴の大きさの測定値（平均±SD、n＝10匹/試験、2生物学的複製）。脂質液滴サイズの分布は、同じ飼料を摂取した個体間で類似している。パネルAおよびBの生データはS9 Dataに掲載。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s003

(TIF)

S4 図：1日あたりの平均子孫数。

生殖期間中の1日あたりの平均産卵数を示した表は、KTMを与えた動物は大腸菌OP50を与えた動物と同等の産卵率を示したことを示している（平均、、P<0.0001、、P<0.001、**、P<0.01、、P<0.05、ns、有意ではない、T検定）。図の基礎となる生データはS10 Dataにある。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s004

(TIF）

S5 図. rDNA配列決定によるKTM候補の同定。

分離したKTMの16S rDNA配列決定の結果から、（A）A. tropicalisと（C）Komagataeibacter属の一種がコンブチャ培養の構成菌であることが示された。(B）分離されたKTM酵母のITS領域の配列決定から、この菌株はBrettanomyces属またはZygosaccharomyces属に属することが明らかになった。パネルA～Cの生データはS1 Tableに掲載。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s005

(TIF)

S6 図：コンブチャティーのデコンボリューションにより、KTMの発酵および非発酵混合物の作成が容易になった。

(A-B）各指定微生物ミックスまたは単一微生物培養における微生物濃度の測定（平均±SEM、、P<0.0001、一元配置分散分析）。(C)大腸菌OP50、KTM-Mix、またはKTMs飼料、および5倍濃縮バージョンのKTM飼料を与えた1日目の成体動物のオイルレッドO染色（平均±SD、、P<0.0001、一元配置分散分析）。KTMsの濃度を高めると、脂質の貯蔵が減少する。(D）L1投下72時間後にZ. bailii酵母の芝生の上にいる動物といない動物の代表的な画像。Z. bailii飼料を摂取すると動物が発育しないことを示す（ワームは白い矢印の頭で示す；スケールバー、500μm）。(E）KTMまたはKTM-M飼料を摂取した動物の最後の2つの腸細胞について、各データポイントが1μm2あたりの脂質滴数を表す脂質滴密度測定（KTMデータは図2Hにも示す；平均±SD、、P<0.01、T-検定）。(F）mRNA-Seq（RPKM、マップされた100万リードあたりの転写産物1キロベースあたりのリード数）によって決定された、大腸菌を摂取した動物とKTM-Mを摂取した動物における2,229個の発生遺伝子の発現を比較した散布図。線形回帰分析と対応するR2値が報告されている。(G)L1を落としてから48時間後に、L4ステージの野生型N2動物が指示された食物源上にいる部分を示す選択アッセイ（n>200/trial、3生物学的複製；平均±SEM、***、P<0.0001、、P<0.05、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。(H-I) Pmlt-10::GFP-PESTレポーターを発現する動物にKTM、KTM-Mix、またはKTM-FM飼料を与えたときの発育速度。J）キチンまたはセルロースを産生する腸内微生物を選択的に標識するカルコフルオロホワイトで染色した後、K. rhaeticusまたは大腸菌OP50を摂取した動物の代表的な画像（白矢印の頭は腸管内腔を示す；スケールバー、10μm）。(K）KTMを摂取した動物の腸内の酵母細胞とスライド上の酵母細胞を示す代表的な明視野DIC画像（灰色の矢頭は酵母細胞を示し、明瞭化のために拡大した挿入画像を示す、スケールバー5μm）。(L）カルコフルオールホワイトで染色した後、KTMを摂取した動物の代表的な画像（挿入図の灰色の矢頭は酵母細胞を示す；スケールバー、5μm）。(M) 大腸菌OP50、KTMおよびKTM-M飼料を摂取した動物の腸管内腔幅の測定。データは、腸管内腔が占める体幅の割合として報告されている（平均±SEM、、P<0.01、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。パネルA-C、E-I、Mの生データはS11 Dataに掲載。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s006

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S7 図：BODIPY脂質はKTM飼育動物の腸管細胞に吸収される。

大腸菌OP50、KTM、またはKTM-M飼料を与えた動物の腸管上皮細胞へのC1-BODIPY-C12吸収を示す代表的なDICおよび蛍光画像。ピンク色の星印は腸管内腔に残存するBODIPYを、ピンク色の矢頭は腸管細胞への部分的なBODIPY吸収を、白色の星印は腸管内腔に残存するBODIPYの欠如を、白色の矢頭はBODIPYを吸収した完全に染色された細胞を示す（スケールバー、10μm）。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s007

(TIF）

S8 図：KTMの消費は遺伝子発現に広範な変化をもたらす。

(A）KTMを1世代（1G）または5世代（5G）摂取した動物における全遺伝子の発現を比較した散布図と線形回帰分析から、KTMによる遺伝子発現の世代を超えた広範なエピジェネティック制御は考えにくいことが示唆される。(B-F)大腸菌OP50サンプルに対する各サンプルの発現差遺伝子を示すボルケーノプロット。(G)オーキシンデグロンシステム[72]を用いて、KTMを与えた動物とDAF-2::AIDを欠損させた動物に共通する差次的発現遺伝子の濃縮度（観察値/予想値、超幾何学的P値報告）。1以上の値は、過剰発現、すなわちKTMを摂取した動物とDAF-2を欠失させた動物の両方において、ランダムな偶然と比較して同じ遺伝子が異なって発現する傾向があることを示す。H）KTMを摂取した動物とDAF-2::AIDを枯渇させた動物で、腸内で（H）発現が増加した、または（I）発現が減少した、異なる発現遺伝子の重なり（超幾何学的P値を示す）。(J）代表的な蛍光画像（スケールバー、500μm）と（K）アシル-CoAデヒドロゲナーゼPacdh-1::GFPレポーターの定量化（n = 40、平均±SD、****、P<0.0001、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。パネルA-IおよびKの生データはS12 Dataに掲載。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s008

(TIF）

S9 図. KTM摂取により腸内でlipl-1遺伝子の発現が調節されるが、リソソームリパーゼ遺伝子lipl-1,2,3は脂質滴の大きさを制限するのに必要ない。

(A）大腸菌OP50、KTM、KTM-Mで生育した動物におけるリソソームリパーゼPlipl-1::mCherryレポーターの発現レベルの定量化（n>200、平均±SD、、P<0.0001、一元配置分散分析）。(B)野生型N2およびlipl-1(tm1954) lipl-2(ttTi14801) lipl-3(tm4498)変異体動物における脂質滴サイズの測定。各データポイントは1匹の動物の平均腸脂質滴直径を表す（平均±SD、、P<0.001、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。(C-E）示されたTAG合成遺伝子の正規化遺伝子発現値（平均±SEM、**、P<0.001、、P<0.05、ns、有意ではない、一元配置分散分析）。パネルA-Eの生データはS13 Dataにある。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s009

(TIF)

S1表。16S rDNA配列決定から得られた分類報告書を含むExcelスプレッドシート。

コンブチャティー培養物、コンブチャティーバイオフィルム（1つの複製）、および線虫NGMプレートから分離されたコンブチャティー関連微生物の生物学的複製の個々の配列決定結果を示す。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s010

(XLSX)

S2表。コンブチャティー関連微生物の全ゲノムシーケンスから得られたシーケンスリードのアライメント率。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s011

(PDF)

S3表本研究で使用したC. elegans株。

菌株名、遺伝子型、関連文献を示す。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s012

(PDF)

S4表 mRNA-Seq解析からのDESeq2出力。

全遺伝子の遺伝子数（RPKM、マッピングされた100万リードあたりの転写産物1キロベースあたりのリード数）、および以下の比較の差分遺伝子発現コールを含むExcelスプレッドシート：大腸菌OP50対大腸菌HT115、大腸菌OP50対Acetobacter tropicalis、大腸菌OP50対KTM、および大腸菌OP50対KTM-M。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s013

(XLSX)

S1データ。図1D、1E、1Fの基礎となる数値データを別々のタブに分けたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s014

(XLSX)

S2データ。図2B、図2D、図2E、図2G、図2Hの基礎となる数値データを別々のタブに分けたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s015

(XLSX)

S3データ。図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H、3I、3J、3K、3L、3Mおよび3Nの基礎となる数値データを別々のタブに分けたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s016

(XLSX)

S4データ。図4C、4E、4F、4G、4Iおよび4Jの基礎となる数値データを別々のタブにまとめたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s017

(XLSX)

S5データ。図5A、図5B、図5C、図5D、図5E、図5Fの基礎となる数値データを別々のタブに分けたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s018

(XLSX)

S6 データ。図6A、図6B、図6C、図6D、図6E、図6G、図6I、図6J、および図6Kの基礎となる数値データを別々のタブに分けたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s019

(XLSX)

S7データ。S1C, S1D, S1E Fig.の基礎となる数値データを別々のタブにまとめたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s020

(XLSX)

S8データ。S2B, S2C, S2D, S2E, S2F, S2G, S2H, S2I Fig.

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s021

(XLSX)

S9データ。S3AおよびS3B Fig.の基礎となる数値データを別々のタブにまとめたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s022

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S10データ。S4 Fig.の基礎となる数値データを別々のタブに分けたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s023

(XLSX)

S11データ。S6A、S6B、S6C、S6E、S6F、S6G、S6H、S6I、S6Mの数値データを含むExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s024

(XLSX)

S12データ。S8A、S8B、S8C、S8D、S8E、S8F、S8G、S8H、S8IおよびS8Kの基礎となる数値データを別々のタブに分けたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s025

(XLSX)

S13データ。S9A、S9B、S9C、S9DおよびS9Eの基礎となる数値データを別々のタブにまとめたExcelスプレッドシート。

doi:10.1371/journal.pgen.1011003.s026

(XLSX)

謝辞
参考文献
1.DeGruttola AK, Low D, Mizoguchi A, Mizoguchi E. Current Understanding of Dysbiosis in Disease in Human and Animal Models： Inflamm Bowel Dis. 2016;22: 1137-1150. doi: 10.1097/MIB.000000000750.
2.Levy M, Kolodziejczyk AA, Thaiss CA, Elinav E. Dysbiosis and the immune system. Nat Rev Immunol. 2017;17: 219-232. doi: 10.1038/nri.2017.7. pmid:28260787.
3.Wang P-X、Deng X-R、Zhang C-H、Yuan H-J. 腸内細菌叢とメタボリックシンドローム。Chin Med J (Engl). 2020;133: 808-816. doi: 10.1097/CM9.000000000696.
4.Smits WK, Lyras D, Lacy DB, Wilcox MH, Kuijper EJ. クロストリジウム・ディフィシル感染症。Nat Rev Dis Primer. 2016;2: 16020. doi: 10.1038/nrdp.2016.20. pmid:27158839.
5.Tsai Y-L, Lin T-L, Chang C-J, Wu T-R, Lai W-F, Lu C-C, et al. Probiotics, prebiotics and amelioration of diseases. J Biomed Sci. 2019;26: 3. doi: 10.1186/s12929-018-0493-6. pmid:30609922.
6.Kumar R, Sood U, Gupta V, Singh M, Scaria J, Lal R. Recent Advancements in the Development of Modern Probiotics for Restoring Human Gut Microbiome Dysbiosis. Indian J Microbiol. 2020;60: 12-25. doi: 10.1007/s12088-019-00808-y. pmid:32089570
7.Aponte M, Murru N, Shoukat M. Therapeutic, Prophylactic, and Functional Use of Probiotics： A Current Perspective. Front Microbiol. 2020;11: 562048. doi: 10.3389/fmicb.2020.562048.
8.Hill C, Guarner F, Reid G, Gibson GR, Merenstein DJ, Pot B, et al. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2014;11: 506-514. doi: 10.1038/nrgastro.2014.66.
9.Martínez Leal J, Valenzuela Suárez L, Jayabalan R, Huerta Oros J, Escalante-Aburto A. A review on health benefits of kombucha nutritional compounds and metabolites. CyTA-J Food. 2018;16: 390-399. doi: 10.1080/19476337.2017.1410499.
10.Jayabalan R, Malbaša RV, Lončar ES, Vitas JS, Sathishkumar M. A Review on Kombucha Tea-Microbiology, Composition, Fermentation, Beneficial Effects, Toxicity, and Tea Fungus：コンブチャのレビュー.... Compr Rev Food Sci Food Saf. 2014;13: 538-550. doi: 10.1111/1541-4337.12073.
11.Ernst E. コンブチャ：臨床エビデンスの系統的レビュー。2003;10: 85-87. doi: 10.1159/000071667.
12.Kapp JM, Sumner W. Kombucha: a systematic review of the empirical evidence of human health benefit. Ann Epidemiol. 2019;30: 66-70. doi: 10.1016/j.annepidem.2018.11.001. pmid:30527803.
13.Kaczmarczyk D, Lochyński S. PRODUCTS OF BIOTRANSFORMATION OF TEA INFUSION-PROPERTIES AND APPLICATION.
14.Marsh AJ, O'Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD. 複数のコンブチャ（茶菌）サンプルの細菌および真菌組成の配列に基づく分析。Food Microbiol. 2014;38: 171-178. doi: 10.1016/j.fm.2013.09.003. pmid:24290641.
15.Coton M, Pawtowski A, Taminiau B, Burgaud G, Deniel F, Coulloumme-Labarthe L, et al. Metabarcoding and culture-based methods by Unraveling microbial ecology of industrial-scale Kombucha fermentations. FEMS Microbiol Ecol. 2017;93. doi: 10.1093/femsec/fix048.
16.Shenoy C. マウスにおけるバイオ茶の血糖降下活性。
17.Hartmann AM, Burleson LE, Holmes AK, Geist CR. コンブチャの慢性摂取がc57-bl/6マウスの野外行動、寿命、食欲行動、臓器に及ぼす影響：パイロットスタディ。Nutrition. 2000;16: 755-761. doi: 10.1016/s0899-9007(00)00380-4. pmid:10978857
18.Sai Ram M, B A, T P, Prasad D, Kain AK, Mongia SS, et al.アルビノラットにおけるクロム酸(VI)誘発酸化ストレスに対するコンブチャ茶の効果。J Ethnopharmacol. 2000;71: 235-240. doi: 10.1016/s0378-8741(00)00161-6.
19.Xu S, Wang Y, Wang J, Geng W. Kombucha Reduces Hyperglycemia in Type 2 Diabetes of Mice by Regulating Gut Microbiota and Its Metabolites. Foods. 2022;11: 754. doi: 10.3390/foods11050754. pmid:35267387
20.An L, Fu X, Chen J, Ma J. Caenorhabditis elegans in Lipid Metabolism Research. このような背景のもと、線虫を用いた脂質代謝研究への応用が進められている。
21.Hashmi S, Wang Y, Parhar RS, Collison KS, Conca W, Al-Mohanna F, et al. ヒトの代謝調節を研究するための線虫モデル。Nutr Metab. 2013;10: 31. doi: 10.1186/1743-7075-10-31.
22.Cabreiro F, Gems D. Worms need microbes too: Caenorhabditis elegansにおける微生物叢、健康、老化。EMBO Mol Med. 2013;5: 1300-1310. doi: 10.1002/emmm.201100972.
23.Zhang F, Berg M, Dierking K, Félix M-A, Shapira M, Samuel BS, et al. Caenorhabditis elegans as a Model for Microbiome Research. Front Microbiol. 2017;8. doi: 10.3389/fmicb.2017.00485. pmid:28386252.
24.Labrousse A, Chauvet S, Couillault C, Léopold Kurz C, Ewbank JJ. Caenorhabditis elegansはSalmonella typhimuriumのモデル宿主である。2000;10:1543-1545.doi:10.1016/s0960-9822(00)00833-2.pmid:11114526.Curr Biol.
25.Higurashi S, Tsukada S, Aleogho BM, Park JH, Al Y, Tanaka M, et al. Bacterial diet affects the age--dependent decline of associative learning in.
26.中川博之、塩崎哲也、小畠恵美子、細谷哲也、守屋武彦、酒井史郎、他。線虫におけるラクトバチルス・ガセリ菌SBT2055による増殖の効果とメカニズム。Aging Cell. 2016;15: 227-236. doi: 10.1111/acel.12431. pmid:26710940
27.Watson E, MacNeil LT, Arda HE, Zhu LJ, Walhout AJM. 代謝および遺伝子制御ネットワークの統合が線虫の食餌応答を調節する。Cell. 2013;153: 253-266. doi: 10.1016/j.cell.2013.02.050.
28.Brooks KK, Liang B, Watts JL. 線虫の脂肪蓄積における細菌食の影響。Melov S, editor. PLoS ONE. 2009;4: e7545. doi: 10.1371/journal.pone.0007545. pmid:19844570
29.Stuhr NL, Curran SP. このような研究は、生物学的な見地から、生物学的な観点から、生物学的な観点から、生物学的な見地から、生物学的な見地から、生物学的な見地から行われている。このような研究は、生物多様性保全の観点からも重要である。
30.Samuel BS, Rowedder H, Braendle C, Félix M-A, Ruvkun G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proc Natl Acad Sci. 2016;113. doi: 10.1073/pnas.1607183113. pmid:27317746
31.Goya ME, Xue F, Sampedro-Torres-Quevedo C, Arnaouteli S, Riquelme-Dominguez L, Romanowski A, et al. Probiotic Bacillus subtilis Protects against α-Synuclein Aggregation in C. elegans. Cell Rep. 2020;30: 367-380.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2019.12.078. pmid:31940482
32.José Santos Júnior R, Andrade Batista R, Alves Rodrigues S, Xavier Filho L, Silva Lima Á. コンブチャコロニーで発酵させたブロスの抗菌活性。J Microb Biochem Technol. 2009;01: 072-078. doi: 10.4172/1948-5948.1000014.
33.May A, Narayanan S, Alcock J, Varsani A, Maley C, Aktipis A. Kombucha: a novel model system for cooperation and conflict in a complex multi-species microbial ecosystem. PeerJ. 2019;7: e7565. doi: 10.7717/peerj.7565. pmid:31534844.
34.Villarreal-Soto SA, Beaufort S, Bouajila J, Souchard J-P, Taillandier P. Understanding Kombucha Tea Fermentation：総説：コンブチャ茶の発酵を理解する.... J Food Sci. 2018;83: 580-588. doi: 10.1111/1750-3841.14068. pmid:29508944.
35.Jayabalan R, Malini K, Sathishkumar M, Swaminathan K, Yun S-E. コンブチャ発酵中に生産される茶菌の生化学的特性。Food Sci Biotechnol. doi: 10.1007/s10068-010-0119-6.
36.Huang X, Xin Y, Lu T. A systematic, complexity-reduction approach to dissect the kombucha tea microbiome. 2022;11: e76401. doi: 10.7554/eLife.76401. pmid:35950909
37.Melo JA, Ruvkun G. Inactivation of Conserved C. elegans Genes Engages Pathogen- and Xenobiotic-Associated Defenses. Cell. 2012;149: 452-466. doi: 10.1016/j.cell.2012.02.050.
38.Pujol N, Cypowyj S, Ziegler K, Millet A, Astrain A, Goncharov A, et al. 線虫表皮における感染と創傷に対する異なる自然免疫応答。2008;18:481-489.doi:10.1016/j.cub.2008.02.079.pmid:18394898.Curr Biol.
39.Zhang Y, Lu H, Bargmann CI. 病原性細菌は線虫において回避的嗅覚学習を誘導する。Nature. 2005; 438: 179-184. doi: 10.1038/nature04216.
40.Schulenburg H, Ewbank JJ. The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans. Mol Microbiol. 2007;66: 563-570. doi: 10.1111/j.1365-2958.2007.05946.x. pmid:17877707.
41.Revtovich AV, Lee R, Kirienko NV. ミトコンドリアと食餌の相互作用が線虫の病原体抵抗性とストレス抵抗性を媒介する。Garsin DA, editor. PLOS Genet. 2019;15: e1008011. doi: 10.1371/journal.pgen.1008011. pmid:30865620.
42.Malbaša RV, Lončar ES, Vitas JS, Čanadanović-Brunet JM. コンブチャ飲料の抗酸化活性に及ぼすスターター培養の影響。Food Chem. 2011;127: 1727-1731. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.02.048.
43.Chakravorty S, Bhattacharya S, Chatzinotas A, Chakraborty W, Bhattacharya D, Gachhui R. Kombucha tea fermentation：微生物および生化学的動態。Int J Food Microbiol. 2016;220: 63-72. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2015.12.015. pmid:26796581.
44.Bauer-Petrovska B, Petrushevska-Tozi L. Mineral and water soluble vitamin content in the Kombucha drink. Int J Food Sci Technol. 2000;35: 201-205. doi: 10.1046/j.1365-2621.2000.00342.x.
45.Mousavi SM, Hashemi SA, Zarei M, Gholami A, Lai CW, Chiang WH, et al. コンブチャ飲料の化学組成、製造、薬理効果における最近の進歩： A Complementary and Alternative Medicine. Chen J, editor. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020: 1-14. doi: 10.1155/2020/4397543.
46.Winter AD, Tjahjono E, Beltrán LJ, Johnstone IL, Bulleid NJ, Page AP. 食餌由来のビタミンB12は線虫をチオール還元剤から保護する。BMC Biol. 2022;20: 228. doi: 10.1186/s12915-022-01415-y. pmid:36209095
47.Watson E, Olin-Sandoval V, Hoy MJ, Li C-H, Louisse T, Yao V, et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. 2016;5: e17670. doi: 10.7554/eLife.17670.
48.Kadner RJ. 大腸菌におけるビタミンB12の輸送：膜間のエネルギー結合。Mol Microbiol. 1990;4: 2027-2033. doi: 10.1111/j.1365-2958.1990.tb00562.x. pmid:2089218
49.Hemarajata P, Versalovic J. 腸内細菌叢に対するプロバイオティクスの効果：腸管免疫調節と神経調節のメカニズム。Ther Adv Gastroenterol. 2013;6: 39-51. doi: 10.1177/1756283X12459294.
50.Visconti A, Le Roy CI, Rosa F, Rossi N, Martin TC, Mohney RP, et al. ヒト腸内細菌叢と宿主代謝の相互作用。Nat Commun. 2019;10: 4505. doi: 10.1038/s41467-019-12476-z. pmid:31582752
51.Cox TO, Lundgren P, Nath K, Thaiss CA. マイクロバイオームによる代謝制御。Genome Med. 2022;14: 80. doi: 10.1186/s13073-022-01092-0. pmid:35906678
52.Srinivasan S. 線虫における体脂肪の制御。2016.
53.O'Rourke EJ, Soukas AA, Carr CE, Ruvkun G. C. elegans Major Fats Are Stored in Vesicles Distinct from Lysosome-Related Organelles. Cell Metab. 2009;10: 430-435. doi: 10.1016/j.cmet.2009.10.002. pmid:19883620
54.Klapper M, Ehmke M, Palgunow D, Böhme M, Matthäus C, Bergner G, et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. 2011;52:1281-1293.doi:10.1194/jlr.D011940.pmid:21421847。
55.Sandhu A, Singh V. 線虫における総トリグリセリド定量。BIO-Protoc. 2020;10. doi: 10.21769/BioProtoc.3819.
56.Walker G, Houthoofd K, Vanfleteren JR, Gems D. 線虫における食事制限：生活速度効果から栄養感知経路まで。Mech Ageing Dev. 2005;126: 929-937. doi: 10.1016/j.mad.2005.03.014.
57.Farris M, Fang L, Aslamy A, Pineda V. Steroid signal mediates longevity responses to the eat-2 genetic model of dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Transl Med Aging. 2019;3: 90-97. doi: 10.1016/j.tma.2019.09.003.
58.Lakowski B, Hekimi S. 線虫におけるカロリー制限の遺伝学。Proc Natl Acad Sci. 1998;95: 13091-13096. doi: 10.1073/pnas.95.22.13091. pmid:9789046
59.Ching T-T, Hsu A-L. 固形プレートを用いた線虫の食事制限。J Vis Exp. 2011; 2701. doi: 10.3791/2701.
60.Franco-Juárez B, Gómez-Manzo S, Hernández-Ochoa B, Cárdenas-Rodríguez N, Arreguin-Espinosa R, Pérez De La Cruz V, et al. 高炭水化物および脂質摂取が線虫の寿命に及ぼす影響. Cells. 2021;10: 2359. doi: 10.3390/cells10092359.
61.Teoh AL, Heard G, Cox J. Kombucha発酵の酵母生態学。Int J Food Microbiol. 2004;95:119-126.doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2003.12.020.pmid:15282124.
62.Harrington BJ, Hageage GJ. Calcofluor White：臨床真菌学および寄生虫学におけるその用途と応用の総説。Lab Med. doi: 10.1309/EPH2TDT8335GH0R3.
63.Lavasani PS, Motevaseli E, Shirzad M, Modarressi MH. イランの伝統的なビネガーからコマガタエイバクター・キシリヌスを分離・同定し、分子解析した。
64.Monheit EJ, Conwan DF, Moor D. Calcofluor Whiteと蛍光顕微鏡を用いた組織中の真菌の迅速検出。Arch Pathol Lab Med. 1984;108: 616-8.
65.Wood DE, Lu J, Langmead B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 2019;20: 257. doi: 10.1186/s13059-019-1891-0. pmid:31779668.
66.Suh S-O、Gujjari P、Beres C、Beck B、Zhou J. Zygosaccharomyces parabailii sp. nov.およびZygosaccharomyces pseudobailii sp. nov.の提案、Zygosaccharomyces bailiiに近縁の新規種。Int J Syst Evol Microbiol. 2013;63: 1922-1929. doi: 10.1099/ijs.0.048058-0. pmid:23524351
67.Yen K, Le TT, Bansal A, Narasimhan SD, Cheng J-X, Tissenbaum HA. 線虫Caenorhabditis elegansにおける脂肪蓄積量のラベル法およびラベルフリー法による比較研究。Melov S, editor. PLoS ONE. 2010;5: e12810. doi: 10.1371/journal.pone.0012810.
68.Holdorf AD, Higgins DP, Hart AC, Boag PR, Pazour GJ, Walhout AJM, et al. WormCat: An Online Tool for Annotation and Visualization of Caenorhabditis elegans Genome-Scale Data. GSA Journals; 2019. p. 97266344 Bytes. doi: 10.1534/genetics.119.302919. pmid:31810987.
69.Hansen M, Flatt T, Aguilaniu H. 生殖、脂肪代謝、寿命：その関係は？Cell Metab. 2013;17:10-19。doi: 10.1016/j.cmet.2012.12.003.
70.Templeman NM, Murphy CT. 栄養感知経路による生殖と寿命の制御。J Cell Biol. 2018;217: 93-106. doi: 10.1083/jcb.201707168. pmid:29074705.
71.Podshivalova K, Kerr RA, Kenyon C. How a Mutation that Slows Aging Can Also Disproportionately Extend End-of-Life Decrepitude. Cell Rep. 2017;19: 441-450. doi: 10.1016/j.celrep.2017.03.062. pmid:28423308.
72.Zhang Y-P, Zhang W-H, Zhang P, Li Q, Sun Y, Wang J-W, et al. 腸特異的DAF-2除去により、線虫の寿命はわずかなフィットネスコストでほぼ2倍になる。Nat Commun. 2022;13: 6339. doi: 10.1038/s41467-022-33850-4. pmid:36284093
73.Kaletsky R, Lakhina V, Arey R, Williams A, Landis J, Ashraf J, et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 2016;529: 92-96. doi: 10.1038/nature16483.
74.Pauli F, Liu Y, Kim YA, Chen P-J, Kim SK. 線虫における腸内発現遺伝子の染色体クラスター形成とGATA転写制御。Development. 2006;133: 287-295. doi: 10.1242/dev.02185.
75.Xu N, Zhang SO, Cole RA, McKinney SA, Guo F, Haas JT, et al. FATP1-DGAT2複合体は、小胞体-脂質滴界面での脂質滴拡大を促進する。J Cell Biol. 2012;198: 895-911. doi: 10.1083/jcb.201201139.
76.Yen C-LE, Stone SJ, Koliwad S, Harris C, Farese RV. テーマ別レビューシリーズ：グリセロ脂質。DGAT酵素とトリアシルグリセロール生合成。J Lipid Res. 2008;49: 2283-2301. doi: 10.1194/jlr.R800018-JLR200.
77.Singh R, Kaushik S, Wang Y, Xiang Y, Novak I, Komatsu M, et al. オートファジーは脂質代謝を制御する。Nature. 2009;458: 1131-1135. doi: 10.1038/nature07976.
78.Czaja MJ, Cuervo AM. リソソームのリパーゼ、何のため？Autophagy. 2009;5: 866-867. doi: 10.4161/auto.9040.
79.Kounakis K, Chaniotakis M, Markaki M, Tavernarakis N. Emerging Roles of Lipophagy in Health and Disease. Front Cell Dev Biol. 2019;7: 185. doi: 10.3389/fcell.2019.00185. pmid:31552248.
80.Mony VK, Drangowska-Way A, Albert R, Harrison E, Ghaddar A, Horak MK, et al. 転写因子相互作用のネットワークレベルの迂回を介したリソソーム脂肪分解の文脈特異的制御。このような遺伝子発現を制御するために、転写因子の相互作用をネットワークレベルで迂回させることで、リソソームの脂肪分解を文脈特異的に制御している。
81.Shin DW. Lipophagy: Molecular Mechanisms and Implications in Metabolic Disorders.
82.Lee JH, Kong J, Jang JY, Han JS, Ji Y, Lee J, et al. Lipid Droplet Protein LID-1 Mediates ATGL-1-Dependent Lipolysis during Fasting in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 2014;34: 4165-4176. doi: 10.1128/MCB.00722-14.
83.O'Rourke EJ, Ruvkun G. MXL-3とHLH-30は、脂肪分解とオートファジーを栄養供給に転写的に関連付ける。Nat Cell Biol. 2013;15: 668-676. doi: 10.1038/ncb2741.
このような研究により、遺伝子発現を制御することが可能になった。Genetica. 2009;137: 39-46. doi: 10.1007/s10709-009-9361-3. pmid:19343510
85.Papsdorf K, Miklas JW, Hosseini A, Cabruja M, Morrow CS, Savini M, et al. 脂質滴とペルオキシソームは、一価不飽和脂肪酸に応答して寿命延長を促進するように共制御されている。Nat Cell Biol. 2023;25: 672-684. doi: 10.1038/s41556-023-01136-6.
86.Antolak H, Piechota D, Kucharska A. Kombucha Tea-A Double Power of Bioactive Compounds from Tea and Symbiotic Culture of Bacteria and Yeasts (SCOBY). 抗酸化物質。2021;10: 1541. doi: 10.3390/antiox10101541.
87.Watts JL, Ristow M. Caenorhabditis elegansにおける脂質と糖質の代謝。Genetics. 2017;207: 413-446. doi: 10.1534/genetics.117.300106. pmid:28978773.
88.Wondmkun YT. 肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病：関連性と治療的意義。Diabetes Metab Syndr Obes Targets Ther. 2020;Volume 13: 3611-3616. doi: 10.2147/DMSO.S275898.
89.Mooradian AD. 2型糖尿病における脂質異常症。Nat Rev Endocrinol. 2009;5: 150-159. doi: 10.1038/ncpendmet1066.
90.Kaze AD, Santhanam P, Musani SK, Ahima R, Echouffo-Tcheugui JB. 2型糖尿病における代謝性脂質異常症と心血管アウトカム： Look AHEAD Studyからの所見。J Am Heart Assoc. 2021;10: e016947. doi: 10.1161/JAHA.120.016947.
91.Xie K, Liu Y, Li X, Zhang H, Zhang S, Mak HY, et al. 食餌性S. maltophiliaは、線虫の脂肪生成およびER-LD接触を増強することにより、超大型の脂質滴を誘導する。Gut Microbes. 2022;14: 2013762. doi: 10.1080/19490976.2021.2013762.
92.Sang Y, Ren J, Aballay A. The transcription factor HLH-26 controls probiotic-mediated protection against intestinal infection through up-regulation of the Wnt/BAR-1 pathway. Cadwell K, editor. PLOS Biol. 2022;20: e3001581. doi: 10.1371/journal.pbio.3001581.
93.Kumar A, Baruah A, Tomioka M, Iino Y, Kalita MC, Khan M. Caenorhabditis elegans: a model to understand host-microbe interactions. このような研究成果は、生物多様性の保全に大きく寄与している。
94.Kim Y, Mylonakis E. Caenorhabditis elegans Immune Conditioning with the Probiotic Bacterium Lactobacillus acidophilus Strain NCFM Enhances Gram-Positive Immune Responses. Urban JF, editor. Infect Immun. 2012;80: 2500-2508. doi: 10.1128/IAI.06350-11.
95.Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 1974;77: 71-94. doi: 10.1093/genetics/77.1.71.
96.Frøkjær-Jensen C, Wayne Davis M, Hopkins CE, Newman BJ, Thummel JM, Olesen S-P, et al. Caenorhabditis elegansにおける導入遺伝子のシングルコピー挿入。Nat Genet. 2008; 40: 1375-1383. doi: 10.1038/ng.248.
97.Ghanta KS, Mello CC. dsDNAドナー分子の融解は、線虫における高精度ゲノム編集を大幅に改善する。Genetics. 2020;216: この論文では、ゲノム編集の精度を向上させるために、dsDNAドナー分子を融解させることに成功した。
98.Bolyen E, Rideout JR, Dillon MR, Bokulich NA, Abnet CC, Al-Ghalith GA, et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 2019;37: 852-857. doi: 10.1038/s41587-019-0209-9. pmid:31341288.
99.Walker A, Bhargava R, Vaziriyan-Sani A, Brust A, Czyz D. BIO-Protoc. BIO-Protoc. 2022;12. doi: 10.21769/BioProtoc.4291.
100.Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9: 676-682. doi: 10.1038/nmeth.2019.
101.Wählby C, Lee Conery A, Bray M-A, Kamentsky L, Larkins-Ford J, Sokolnicki KL, et al. 線虫における脂肪量および体脂肪分布の高スループットおよび低スループットスコアリング。Methods. 2014;68: 492-499. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.04.017. pmid:24784529.
102.Langmead B, Salzberg SL. Bowtie 2による高速ギャップドリードアライメント。Nat Methods. 2012;9: 357-359. doi: 10.1038/nmeth.1923.
103.Dowen RH. CEH-60/PBXとUNC-62/MEISは線虫の生殖を支える代謝スイッチを調整する。Dev Cell. 2019;49:235-250.e7.doi:10.1016/j.devcel.2019.03.002.pmid:30956009
104.Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15: 550. doi: 10.1186/s13059-014-0550-8. pmid:25516281
105.Kolde R. Pheatmap: pretty heatmaps. R Package Version. 2012;1: 726.
106.Wickham H, Averick M, Bryan J, Chang W, McGowan L, François R, et al. Welcome to the Tidyverse. J Open Source Softw. 2019;4: 1686. doi: 10.21105/joss.01686.
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