無細胞微生物DNA

哉百名

ゲノムバイオロジー(Genome Biol.) 2021; 22: 187. 2021年6月23日オンライン公開 doi: 10.1186/s13059-021-02401-3
PMCID：PMC8220693PMID：34162397
汚染物質制御解析フレームワークを用いた無細胞微生物DNAの検出
Enrique Zozaya-Valdés,#1 Stephen Q. Wong,#1,2 Jeanette Raleigh,1 Athena Hatzimihalis,1 Sarah Ftouni,1 Anthony T. Papenfuss,1,2,3,4 Shahneen Sandhu,1,2 Mark A. Dawson,1,2,5 and Sarah-Jane Dawsoncorresponding author1,2,5（共著）。
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概要
背景
ヒトのマイクロバイオームは、がんにおいて重要な役割を担っている。ヒト血液中の無細胞DNAには、常在細菌由来のDNAが微量に含まれ、新たながんバイオマーカーとして利用できる可能性があることを示す証拠が蓄積されている。しかし、低バイオマスのマイクロバイオーム研究で必ず起こるコンタミネーションを考慮した厳密な実験コントロールは限定的であった。

研究成果
16S-rRNA遺伝子配列と液滴デジタルPCRを組み合わせて、転移性黒色腫患者において無細胞微生物DNA（cfmDNA）の特異的検出が可能であるかどうかを検討した。一致する便および唾液サンプルと比較して、cfmDNAの絶対濃度は低いが、陰性対照から検出されるレベルを有意に上回っている。血漿中の微生物群集は、DNA抽出や配列決定の過程で混入する実験室や試薬の汚染物質によって強い影響を受ける。バッチに依存した存在量のアンプリコンシークエンスバリアント（ASV）や陰性対照で高い有病率を示すASVのフィルタリングを含むin silico除染戦略の適用により、フェカリス菌、バクテロイデス、ルミノコックスなどの既知の腸常在菌、およびその他の未同定のASVを同定しました。さらに血漿サンプルを分析し、健常者とがん患者のcfmDNAの違いを特定するための本フレームワークの可能性を明らかにした。

結論
これらの観察結果は、血漿には低レベルながら検出可能なcfmDNAが存在しうることを示している。この結果は、汚染を考慮することの重要性を強調し、癌や他の疾患における将来のバイオマーカー研究のためにcfmDNAを正確に検出するための分析的除染の枠組みを提供するものである。

補足情報
オンライン版には、10.1186/s13059-021-02401-3で利用可能な補足資料が含まれています。

キーワード 無細胞微生物DNA、血漿、マイクロバイオーム、がん、汚染、16S rRNA遺伝子
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背景
ヒトの微生物叢は、健康と疾病を支配する主要な要因である[1-3]。癌においては、腸内細菌叢が疾患の進行、治療反応、免疫療法に対する毒性に重要な影響を及ぼすことが明らかにされている[4, 5]。マウスモデルやメラノーマ患者を対象としたいくつかの画期的な研究では、チェックポイント阻害剤による治療後の腸内細菌叢の変化を調べ、治療反応が特定の細菌種の多様性と存在量に大きく依存することを発見しました[6-9]。これらの知見やその他の知見は、がん治療に対する反応を理解し、潜在的に操作するためには、宿主マイクロバイオームの特徴づけが決定的に重要であることを示唆しています。しかし、腸内細菌をがんのバイオマーカーとして分析するための大きな障壁は、便のサンプルを収集する必要があることです。この種の採取は患者の立場からは困難であり、望ましくないため、しばしば重大なコンプライアンス違反が発生します[10]。

他の種類の生物試料からヒトマイクロバイオームを評価することで、重要な癌バイオマーカーとなる可能性があるかどうかは、現在のところ不明である。血漿中に存在する無細胞DNA（cfDNA）の核酸およびミトコンドリア源に加えて、常在細菌由来のDNAもcfDNAの構成に寄与している可能性を示す証拠が蓄積されています[11-15]。しかし、低バイオマスのマイクロバイオーム研究に必ず影響を与えるコンタミネーションを考慮した厳密な実験コントロールの使用は、これまで限定的であった[16-18]。さらに、血漿中の特定の細菌DNAのソース、タイプ、および存在量については、十分に特徴付けられていません。これらのステップは、循環マイクロバイオームを潜在的ながんバイオマーカーとして調査し、臨床応用する前に不可欠である。

本研究では、血漿中の無細胞微生物DNA（cfmDNA）が、低バイオマス、高ホストDNAサンプルに適した、迅速かつハイスループットの16S-rRNA遺伝子ベースのアプローチで検出できるかどうかを確認することを目的としました。ステージ IV のメラノーマ患者と健常者の血漿サンプルの分析を通じて、汚染の影響を評価し、低バイオマスのマイクロバイオームに関連する課題に対処するために厳格なフィルタリング戦略を適用し、真の循環 cfmDNA 信号を回収できるか、健常者とがん患者の cfmDNA との違いを検出できるかを判断しました。

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研究成果
実験デザイン
本研究では、まず、感染の兆候を示さないステージIVのメラノーマ患者69人のコホートから収集した89の血漿サンプルを分析した（追加ファイル1：表S1）。血漿サンプルは、2つの異なるグループに分けられた（図（Fig.1）.1）。最初のグループ（サンプル、n = 16）は、低バイオマスのマイクロバイオームサンプル（血漿由来cfmDNA）を分析する際、腸（便）または口腔（唾液）などの高バイオマスのマイクロバイオームサンプルと比較して、潜在的な汚染の影響を評価するために使用された。そこで、各患者について、時間的に一致させた血漿、便、唾液サンプルを分析した。各血漿サンプルは、同じDNA抽出キットの異なるユニット（バッチAおよびB）を使用した2つの別々のDNA抽出バッチ（以下、DEB）間で複製抽出された。血漿サンプルの第二グループ（合計n = 60）は、3つのDEB（バッチC、D、E）にわたってcfDNAを抽出され、それぞれのDEBも同じDNA抽出キットの異なるユニットを使用した（図（図1）.1）。サンプルの入手可能性のため、グループ2の血漿サンプルは複製で抽出されず、時間的に一致する便や唾液のサンプルも存在しなかった。両群にわたって、すべてのDEBには6～12個のDNA抽出陰性対照（DENC）が含まれ、無核水がDNA抽出に使用される唯一の投入物であった。血漿からの DNA 抽出はすべて、使い捨ての手術着と手袋を着用し、すべての器具が消毒され DNA 洗浄（1% ビルコン、DNA 除染試薬、紫外線を使用）されたバイオセーフティ キャビネット（血液処理専用）で限られた人員により実施された。

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Fig.1
本試験の概略概要。ステージ IV のメラノーマ患者（感染の兆候なし）合計 69 名の生物試料を、（1）患者の便、唾液、血漿の試料が一致するグループ、（2）血漿の試料のみのグループの 2 つに分けて分析した。サンプルは、便はn = 1、唾液はn = 1、血漿はn = 5の異なるバッチでDNAが抽出された（バッチA〜E）。バッチAの16検体のうち13検体がバッチBの検体と一致した。左（バッチSt）から右（バッチE）にかけて描かれた各バッチで抽出されたDNA抽出陰性対照（DENC）の数はそれぞれ12、6、9、8、8、8であった。すべてのサンプルは16S rRNA遺伝子を増幅し、2つのグループのそれぞれに対応する2つのMiSeqランで配列決定された。

血漿からのcfmDNAの濃度レベル
すべてのサンプルタイプおよび対応するDENCにわたる微生物DNA濃度の絶対レベルを評価するために、72サンプルおよび58DENCのサブセットにわたってユニバーサル16S-rRNA遺伝子液滴デジタルPCR（ddPCR）アッセイを実行した（「方法」セクションを参照）。予想通り、血漿中の微生物DNA濃度（DNAの中央値101コピー/μl）は、便（DNAの中央値30436コピー/μl）および唾液（DNAの中央値17710コピー/μl）で測定した濃度よりはるかに低かった（図（図2A）.2A）。しかし、便や唾液よりもはるかに小さい試料対DENC比を示すにもかかわらず、血漿の全体的な微生物DNA濃度は、対応するDENCよりも大きかった（DNAの中央値71コピー/μl）。この濃度差とその他の差が統計的に有意かどうかを評価するために、一般化推定方程式（GEE）を適用した（「方法」セクションを参照）。血漿については、試料-対-DENCおよびDEBの間に有意な相互作用が認められた（p値＜0.001）。そこで、血漿とDENCの違いを各DEB内で評価した（図（Fig.2B）.2B）。血漿-vs-DENCのより高い微生物DNA濃度は、すべてのDEBにわたって観察され、これらの違いは、1つのDEBを除くすべてにおいて一貫し、統計的に有意であった（図（Fig.2B）.2B）。すべての血漿サンプルおよびDEBにわたって、血漿-DENCの1mlあたりの平均2719コピーに対して、核酸を含まない水の1mlあたりの平均1829コピーが観察された。さらに、血漿DENCサンプルの微生物DNA濃度レベルは、便および唾液DENCのそれよりも有意に高かったことから、血漿DNA抽出キット試薬は、使用した便および唾液DNA抽出キットよりも高いレベルの汚染DNAを含むことが示唆された（図（図22A））。

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Fig.2
唾液、便、血漿から得られた細菌DNAの絶対量。16S rRNA遺伝子のV4領域を標的としたdroplet digital PCR（ddPCR）を用いて、異なる生物試料の全細菌DNAの絶対量を測定した。A 本試験で採取した便 10 件、唾液 4 件、血漿 58 件のサブセットと、各サンプルタイプに対応する DNA 抽出陰性対照（DENC）12、4、40 件のサブセットについての細菌 DNA レベルを示す。DENCsについては、DNA抽出に使用したのはヌクレアーゼフリー水のみであった。無ヌクレアーゼ水がddPCR反応に使用された唯一のインプットであるnon-template control (NTC) の28レプリケートのレベルも示している。唾液、便、血漿のDENCに対するサンプルの中央値比は、それぞれ2064、2919、1.43であった。血漿-DENC対唾液-DENCおよび便-DENC比はそれぞれ8.23および6.77であった。B 血漿中の微生物DNAの濃度レベルは、個々のDNA抽出バッチ（DEB）ごとに、対応するDENCとともに示されている。DEB A〜Eについて検査した血漿サンプルの数は、それぞれ15、10、14、11、8であった。DEB A-Eで検査した血漿-DENCの複製数は、それぞれ9、9、8、8、6であった。DEB A〜Eの血漿とDENCの中央値比は、それぞれ1.62、1.2、1.84、1.34および1.6であった。群間差の統計的有意性は一般化推定方程式（GEE）検定により決定した；** p < 0.001, ns-not significant

cfmDNAの微生物群集解析
cfmDNA 濃度がバックグラウンド汚染レベル（すなわち DENC）よりも有意に高いことを確認した後、次に、微生物群集構造のレベルで違いが観察されるかどうか、また他の種類のサンプルと比較してどうであるかを評価しました。ここでは、患者コホートからの2つのサンプル群（図（Fig.1）1）を、Illumina MiSeqプラットフォームで16S rRNA遺伝子V4領域をカバーする別々のアンプリコンシーケンス実行にかけた（「方法」セクション、追加ファイル1：図S1参照）。品質処理とアンプリコンシーケンスリードエラーの修正により、アンプリコンシーケンスバリアント（ASV）が生成され、これにより可能な限りの系統学的解像度が得られた（「方法」のセクションを参照）。この結果、唾液、便、血漿の各サンプルから、それぞれ平均25161、34073、56674リードが生成されました（追加ファイル1：図S2）。唾液DENC、便DENC、血漿DENCは、それぞれ平均157、1333、56172リードを生成した（Additional file 1: Figure S2）。ライブラリ調製のバイアスを考慮し、均等に分布する20の細菌株のゲノムDNAからなる市販の模擬微生物群集を各シーケンス実行に含めました。解析パイプラインは、2回のMiseq実行にわたって、模擬微生物群集から1つの株（CutibacteriumまたはPropionibacterium）を除くすべての株に対応する属レベルの分類を持つASVを回収することができました（追加ファイル1: 図S3）。これは、16S rRNA遺伝子のV4領域の配列決定がCutibacterium属を著しく過小評価することを観察した以前の皮膚マイクロバイオーム調査と一致する[19]。16S rRNA遺伝子の塩基配列決定によく見られるPCRバイアスを反映して、回収されたASVは不均一な存在量分布を示した（追加ファイル1：図S3A）。しかし、この存在量分布は、別々のライブラリー調製および配列決定実験において一貫していた（追加ファイル1: 図S3B）。

患者と一致する血漿、便、唾液サンプル（図中のグループ1）1）の分類学的プロファイリングにより、門レベルでの微生物群集構造はサンプルの種類によって異なることが示された（図（図3A）3A）。予想通り、便サンプルはFirmicutes（平均41％）、Bacteroidetes（平均40％）、Proteobacteria（平均12％）、Verrucomicrobia（平均3％）が支配的であった。唾液では、Proteobacteria（平均34%）、Firmicutes（平均26%）、Bacteroidetes（25%）、Fusobacteria（平均11%）、Actinobacteria（平均4%）が主な菌種であった。一方、血漿サンプルには、主にProteobacteria（平均53%）、Bacteroidetes（平均15%）、Firmicutes（平均11%）、Deinococcus-Thermus（平均6%）、Candidate division OD1（平均3%）、Actinobacteria（平均3%）、Verrucomicrobia（平均3%）の菌が含まれていました。さらに、マイクロバイオーム組成がサンプルタイプによってどの程度異なるかを確認すると、これらの差は分類レベルの深さとともに増加し（追加ファイル1：図S4）、ASVレベルでも観察された（図（図3B）.3B）。ペアワイズBray-Curtis非類似度の反復測定認識順列分散分析（RMA-PERMANOVA）では、サンプルタイプ別（p値<0.001）およびすべてのサンプルタイプペア間（サンプルタイプの3ペアすべてでp値<0.001）で全体的に有意差がみられた。患者は、便と平均4個（0〜15個、ASVの12％、リードの16％）の血漿ASVを、唾液と1個（0〜7個、ASVの6％、リードの4％）を共有していました（追加ファイル1: 表S2）。

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図3
血漿と患者と一致する便および唾液中の無細胞微生物DNAの群集構造。A 患者に適合した血漿（バッチAおよびBのみ）、便および唾液サンプルとそれぞれのDENCの門レベルでの分類学的プロファイル（16S rRNA遺伝子配列決定による）。最も多く存在する上位15門を示す。B 患者適合血漿（バッチAおよびBのみ）、便および唾液サンプル、ならびにそれぞれのDENCの微生物群集プロファイルから計算したペアワイズBray-Curtis非類似度のnMDS（ノン・メトリック多次元尺度法）、ASVレベル。C 血漿サンプル（バッチA～E）およびASVレベルの対応するDENCのペアワイズBray-Curtis類似度の階層的クラスタリング分析（UPGMA）に基づくデンドログラムは、配列決定ランおよびDNA抽出バッチ（DEB）によるバッチ効果を強調しています。BとCの両方において、Bray-Curtis非類似度を計算する前に、ASVカウントを希釈し（すなわち、最小サンプルサイズにランダムにサブサンプリング）、平方根変換を行った。D 観察されたASVの数（豊かさ）と逆シンプソン指数（多様性）に基づく、5つのDNA抽出バッチA〜Eにわたるすべての血漿サンプルとそれに対応するDENCのα多様性測定値。'+' p between 0.1-0.05, * p < 0.05, ** p < 0.01, ns-not significant

便および唾液サンプルの門レベルの分類学的プロファイルは、対応するDENCと著しく異なっており（図（3A）,3A）、これらの違いは分類学的レベルの深さとともに大きくなった（追加ファイル1：図S4）。また、ASVレベルの群集構造にも明確な違いが見られた（図3B;3B；'DNA抽出日'調整PERMANOVA p値<0.001、p値<0.01、それぞれ便対便DENCと唾液対唾液DENCの比較）。一方、血漿サンプルとそれに対応するDENCの分類学的プロファイルにははるかに高い類似性があり（図（図3A）,3A）、このパターンはASVレベルで観察されるのと同様に分類学的階層に沿って（追加ファイル1：図S4）維持されていた（図（図3B）.3B）。これらの結果は、便や唾液とは対照的に、血漿中のマイクロバイオームの特徴付けは、汚染されたDNAの影響を非常に受けやすいことを示すものである。

血漿と血漿DENCの微生物群集構造をさらに比較するために、患者コホート全体（DEB A-E）でこれら2つのサンプルタイプのみを分析した（図（11群1、2））。ASVレベルのBray-Curtis非類似度の階層的クラスタリング解析では、シーケンシングラン、DEB、DNA抽出日によるバッチ効果が示され（図3C3Cおよび追加ファイル1：図S5）、これらはすべて統計的に有意だった（「サンプルタイプ」調整RMA-PERMANOVA p値 < 0.05 for sequencing run および p値 < 0.001 for both DEB and DNA-extraction day）。同じDEBからの血漿およびDENCサンプルのほとんどが一緒にクラスター化する全体的なパターン（図3C）3C）と、各DEB内の高い分類学的類似性（図3A、3A、追加ファイル1：図S4およびS6）から、この効果は、少なくとも一部は、汚染DNAの結果であることが示唆された。DEBに関連するバッチ効果は、同じ血漿サンプルを表しているにもかかわらず、DEB AとBのほとんどのサンプルの微生物群集が別々にクラスター化していることから、特に明らかであった。これらのバッチ効果にもかかわらず、DEB内ではほとんどの血漿試料が対応するDENCと別々にクラスタリングし（図（3C）3C）、バッチ効果で調整した後、この違いはコホート全体で統計的に有意だった（RMA-PERMANOVA p値 < 0.05、配列決定実行とDEBで別々に調整した後、p値 < 0.001、DNA抽出日調整した後、0.001）。マイクロバイオームデータの構成的性質を考慮し[20]、Aitchison距離（すなわちclr変換データのユークリッド距離）に基づく階層的クラスタリング分析を追加で行った（追加ファイル1：図S7）。前回の結果と同様に、有意なバッチ効果が観察された（「サンプルタイプ」調整RMA-PERMANOVA p値<0.01、DEBとDNA抽出日の両方についてp値<0.001）。しかし、我々の以前の知見と一致して、cfmDNAと陰性対照のマイクロバイオーム組成の間に有意差があった（シーケンシングランとDEBを別々に調整した後のRMA-PERMANOVA p値＜0.05、DNA抽出日を調整した後のp値＜0.001）。

一般化推定方程式（GEE）検定では、DEBで調整した後、血漿サンプルの全体的なASVの豊かさはDENCsよりも有意に高く（p値<0.001）、この差は個々のDEBのうち3つで有意であった（図（Fig.3D）.3D）。血漿検体は、コホート全体でDENCsよりも小さな逆シンプソン指数を示した（GEE p値＜0.05）。しかし、個々のDEB内で比較すると、この差はDEB Bでのみ統計的に有意であった（GEE p値＜0.01）（図（Fig.3D）.3D）。全体として、これらの結果は、汚染DNAに関連する有意なバッチ効果がある一方で、一度調整すると、cfmDNAとDENCsのマイクロバイオーム組成の間に小さいが有意な差が観察されることを示す。

インシリコによる汚染除去で信頼性の高い血漿中ASVを同定
血漿から本物のASVを同定するために、我々はデータセットから汚染されたDNA配列を特異的に除去する戦略を開発しました。これまでの研究で、バイオマスの少ないサンプルで真のシグナルと汚染DNAを分離するためには、バイオインフォマティクス技術を組み合わせて適用する必要があることが示されています[18, 21]。我々のcfmDNA解析に影響を与える汚染DNAが大量に確認されたため、保守的なアプローチを用い、ASVが高信頼性血漿ASVと見なされるために満たすべき3つのバイオインフォマティクス除染基準を適用した（図（Fig.4 A):4A): (i) limma Rパッケージで評価したように、バッチ効果を引き起こす技術的変数（すなわち、配列決定ラン、DEBおよびDNA抽出日）による有意な存在量の差はない [23]、 (ii) 血漿 vs. DENCサンプルにおける有病率がより高いこと、(iii) 血漿-DENCサンプルにおける有病率がより高いこと。また、(iii) 患者と一致するDEB AおよびBにのみ存在するASVについては、評価者間信頼性カッパスコア（p値 < 0.05 およびカッパ > 0.4）を用いて複製間のASVの検出において有意な関連を有することです。これらの各フィルタリング基準を通過したASV、または通過しなかったASVの代表例をFig.に示す。Fig.4B-D.4B-Dに示す。例えば、Fig. Fig.4C4Cは、DEB Eに存在するすべてのASVと、「本物」または「汚染物」としてのdecontam分類にわたる血漿対DENCにおける有病率の代表例を示している。同様の結果が他のDEBでも観察された（Additional file 1: Figure S8）。

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図4
インシリコ除染フィルタリング戦略による高信頼性血漿中ASVの同定。A 高信頼性血漿ASVの同定に使用したバイオインフォマティクスフィルタリング戦略の概略説明。*DEB EとDEB Dで有意に濃縮されているため基準（i）を通過しなかったASV（Cupriavidus［青］）と、DEB間で有意な存在量の差がないためこの基準を通過したもの（候補部門OD1［赤］）の代表的な例。C 基準（ii）のフィルタリング戦略の代表的な例で、DEB Eに存在するすべてのASVと「本物」または「汚染物」としてのdecontam（22）分類の血漿対DENCにおける存在比を示すものです。データポイントの大きさで表される有病率は、血漿サンプル全体のASVの平均相対有病率（すなわち、サンプルサイズで正規化したリードの数）です。D DEBs AとBの患者適合血漿サンプル間の検出において有意な関連がないために基準(iii)を通過しなかったASV（Comamonadaceae [青]）と、患者適合サンプル間に有意な関連があるためにこの基準を通過したASV（Deinococcus [赤]）の代表例です。Cohenのカッパ相互信頼性係数は、マッチングサンプル間の検出の一致を評価するために使用されました。E フィルタリング基準（i）～（iv）を用いて同定された高信頼血漿ASV31種の血漿サンプルとDENC全体における有病率と存在量。存在比は血漿サンプルあたりのリードの割合をlog10変換したものである。F ASV特異的ddPCRを用いたFaecalibacterium ASVとClostridium sensu stricto 9 ASVの直交バリデーション。ddPCRと16S rRNAシーケンサーの結果間の検出の一致を評価するためにカッパ係数が使用された。B、D、F では、配列の豊富さは、サンプルごとの、上下のパネルにわたるリードの割合を表し、各バーは同じ血漿または血漿-DENC サンプルに対応するものである

各基準を個別に、あるいは組み合わせて満たしたASVの数を表1.1にまとめました。全血漿サンプルに存在する合計1506個のASVのうち、239個（16％）が基準（i）に合格し、これらのうち、中程度の存在度（0.1〜1％）と高い存在度（>1％）の血漿サンプルにそれぞれ存在するのは、8個と4個だけでした。合計329個のASV（22％）が基準（ii）を満たし、このうち16個は存在量が中程度であった。患者と一致するサンプル間で検出の有意な関連性を示した20個のASV（1.3％）が基準（iii）を満たし、このうち6個は存在度が中程度であった。基準 (i) と (ii) をすべての ASV に適用し、基準 (iii) を患者と一致する DEBs A と B にのみ存在する ASV に適用した結果、38 種類の低存在 (< 0.01%) ASV のリストが得られました。このリストは、実験室の試薬（例：DNA抽出キットのバッファ）に通常含まれる分類群のリストで、複数の低バイオマスのマイクロバイオーム研究で汚染物質として報告されているものを編集したものです。また、ASVの分類学的所属が常在菌またはヒトの病原体と特定された証拠となる文献も検索しました。バイオインフォマティクスによる汚染除去戦略を裏付けるように、常在菌または病原体としての役割を裏付ける証拠がないASVはわずか7/38（18%）で、このうち5つが「汚染物質ブロックリスト」に存在していました。これらは最終的な汚染除去ステップで除去され、本物のcfmDNAメンバーと思われる31の高信頼性血漿ASVの最終リストとなった（図4E4Eおよび追加ファイル2: 表S3）。

表1
各除染基準を個別に、または組み合わせて満たした血漿ASVの数

すべてのASV (%) 低存在率ASV (%) 中存在率ASV (%) 高存在率ASV (%)
合計 1506 (100) 1384 (100) 110 (100) 12 (100)
基準(i)
 シーケンシングランによるバッチ効果なし 612 (40.64) 582 (42.05) 25 (22.73) 5 (41.67)
 DEB によるバッチ影響はない 277 (18.39) 260 (18.79) 12 (10.91) 5 (41.67)
 DNA伸長日によるバッチ効果なし 1113 (73.9) 1069 (77.24) 38 (34.55) 6 (50)
 239 (15.87) 227 (16.4) 8 (7.27) 4 (33.33)いずれの技術変数もバッチに影響なし
基準(ii)
 DEB A の除染 183 (12.15) 144 (10.4) 36 (32.73) 3 (25)
 364 (24.17) 307 (22.18) 51 (46.36) 6 (50)
 DEB中の汚染除去装置 C 573 (38.05) 504 (36.42) 68 (61.82) 1 (8.33)
 DEB中の汚染除去装置 431 (28.62) 385 (27.82) 45 (40.91) 1 (8.33)
 DEB Eでの汚染除去 452 (30.01) 395 (28.54) 55 (50) 2 (16.67)
 DEBをまたがる除染 329 (21.85) 313 (22.62) 16 (14.55) 0 (0)
基準(iii)
 サンプルの関連性 20 (1.33) 14 (1.01) 6 (5.45) 0 (0)
 バイオインフォマティクスによる完全な除染戦略 38 (2.52) 38 (2.75) 0 (0) 0 (0)
 文献ベースのフィルタリング後の最終リスト 31 (2.06) 31 (2.24) 0 (0) 0 (0)
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低存在率：0.1%未満；中存在率：0.1-1%；高存在率：>1%；DNA抽出日：DNA抽出日；技術変数：技術変数

16 s rRNA 遺伝子配列の結果を直交的に検証するために、コホート全体の平均存在量に基づいて、Faecalibacterium および Clostridium sensu stricto 9 に分類される高信頼血漿 ASV 2種を選択して、ASV 特異的 ddPCR を行った（「方法」セクションを参照）。評価者間信頼性カッパスコアとスピアマンの相関を計算すると、これらのASVの検出においてddPCRと16S rRNA遺伝子配列の間に良好な一致が見られた（図（図4F）.4F）。これらの特異的ASVは、16S rRNAシークエンスアッセイで確立された検出限界内の、最低2×10-1コピー/μlのDNAをddPCRで測定した（追加ファイル1：図S1）。

高信頼性血漿中ASVのほとんど（n = 25）は、科または属レベルで分類することができ、これらすべてについて、常在菌または病原体であることを示す文献上の証拠を発見しました（追加ファイル2：表S3）。残りの6つの高信頼性血漿ASVは、高い分類レベル（すなわち目以上）でしか分類できず、したがってこれらのASVは、ヒトマイクロバイオームの新規または特性評価の低い細菌メンバーである可能性があることが分かりました。大きな系統的多様性をカバーする血漿ASVは、Firmicutes（48%）、Patescibacteria group（16%）、Bacteroidetes（13%）、Proteobacteria（10%）、Actinobacteria（6%）、Bdellovibrionota（3%）および Deinococcus-Thrmus（3%）に属することが確認された。興味深いことに，このコホートから得られた高信頼性ASVのうち18/31（58%）の分類群は，全メタゲノムシーケンス手法を用いた別の最近の研究でも真正cfmDNAと同定された（追加ファイル2：表S3）[15]．

また、高信頼性の血漿ASVと、便および唾液サンプルで同定されたASVとの重複を調べた。11個（35％）の高信頼性血漿ASVが、患者の2（13％）から12（80％）の範囲にわたって便にも存在した（追加ファイル2：表S3）。これらのASVのほとんどは、Faecalibacterium、Bacteroides、Ruminococcusなど、腸内でよく見られる細菌属に分類された。Veillonella属の高信頼性血漿ASVの1つだけが、唾液サンプルにも存在した。このASVは15人全員の唾液に存在し、3人の患者の便サンプルにも存在した（追加ファイル2：表S3）。cfmDNAの起源を特定することは本研究の範囲外であったが、これらの観察結果から、腸内細菌叢がcfmDNAの重要な供給源である可能性が示唆される。

健康な人とがん患者におけるcfmDNAの同定
次に我々は、現在のフレームワークを利用して、末期癌患者に加えて健常者の血漿から高信頼性のASVを同定できるかどうかを評価し、これらのグループ間のcfmDNAプロファイルを比較する機会を提供した。私たちは、直接比較できるように、ステージ IV のメラノーマ患者 (n = 15) (Additional file 1: Table S4) と健常対照者 (n = 15) の新しい拡張コホートに、私たちの 16S RNA 遺伝子配列決定プロトコルおよび解析パイプラインを適用しました（図 (5A) 5A）。ここでは、メラノーマおよび健常血漿サンプルは、各バッチで抽出された同じサンプルで2つのDEB（FおよびG）にわたって抽出されました。各DEBは3回の抽出（メラノーマ5回、健常者コントロール5回）で構成され、4回のDENCを含んでいます。すべてのサンプルは、1回のMiSeqランで実行されました（Fig.55A）。

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Fig.5
健常者とメラノーマ患者の拡張コホートの配列解析。A ステージ IV のメラノーマ患者と健常者の血漿サンプルのエクステンションコホートで使用された実験デザインの概略図。B 血漿（バッチFおよびG）とそれぞれのDENCの微生物群集プロファイルからASVレベルで算出したペアワイズBray-Curtis非類似度の非計量多次元尺度法（nMDS）。C バイオインフォマティクスによる除染基準をすべてクリアし（κ=0.667、p値<0.001）、Castellaniella属に分類されたASVの血漿サンプルとDENCにわたる存在量。メラノーマと健常対照血漿の間では、limmaを用いた解析により、有意な存在量の差が観察された（FDR < 0.01）。

最初のコホートで使用したのと同じ模擬微生物群集の配列決定により、以前の観察結果と一致する結果が得られました（追加ファイル1：図S9A）。品質処理とASVの生成後、健康な血漿、メラノーマ血漿、血漿DENCは、平均してそれぞれ27630、26394、27679リードを生成しました（追加ファイル1: 図S9B）。血漿サンプルの分類学的プロファイリングは、最初のコホートと同様のマイクロバイオーム構成を示し、メラノーマと健常サンプルの両方で血漿と血漿DENCの間に高い類似性を示した（追加ファイル1: 図S9C）。このことは、血漿サンプルは、メラノーマ患者や健常者のものにかかわらず、汚染されたDNAの影響を強く受けることを示している。

最初のコホートのASVレベルでのBray-Curtis非類似度分析と一致して、「サンプルタイプ」調整RMA-PERMANOVA検定は、DEBおよびDNA抽出-ランによるバッチ効果の証拠を示した（追加ファイル1: 表S5）。しかし、最初のコホートとは対照的に、ここでは、これらの技術的変数が群集構造に及ぼす影響の大きさはより小さかった（図（Fig.5B）.5B）。この小さな効果量と同様に、Aitchison距離に基づくPERMANOVA検定を用いた組成分析でも、DEBまたはDNA抽出-runによる統計的に有意な差は認められなかった（Additional file 1: Table S5）。初期コホートにおける我々の観察と同様に、Bray-Curtis非類似度分析は血漿とDENCサンプルの間にある程度の分離を示し（図（5B）5B）、バッチ効果を調整した後、PERMANOVA検定は、一緒に分析したすべての血漿サンプルと別々に分析した健常者と黒色腫サンプルの両方でこの差が統計的に有意であることを示した（追加ファイル1: 表 S5）。Aitchison距離に基づくPERMANOVA検定も同じ結果を示した（Additional file 1: Table S5）。最初のコホートとは対照的に、バッチ効果調整GEE検定では、血漿とDENCのASVリッチネスに統計的に有意な差は見られなかった（追加ファイル1：図S9Dおよび表S5）。しかし、最初のコホートと同様に、血漿サンプルはDENCsよりも統計的に有意に小さい逆シンプソン指数を示し、これは一緒に分析したすべての血漿サンプルと別々に分析したメラノーマと健常サンプルの両方で観察できた（追加ファイル1：図S9D、表S5）。全体として、これらの結果は、汚染DNAに関連する同じバッチ効果が、健常者の血漿サンプルを分析する際に存在し得ることを示している。しかし、一度調整すると、健常者とDENCからのcfmDNAのマイクロバイオーム組成の間に小さいが有意な差が観察されるようになる。

健常者とメラノーマサンプルのコミュニティ構造を比較したところ、観察可能な差も統計的に有意な差も見られなかった（図5B5Bおよび追加ファイル1: 表S5）。ASVの豊富さについては統計的に有意な差は認められなかったが、逆シンプソン指数を用いたDNA抽出による調整GEE検定では、健常者の血漿がメラノーマ患者の血漿よりも多様性が高いことが示された（追加ファイル1：図S9D、表S5）。

拡張コホートから信頼性の高い血漿ASVを同定するために、私たちはインシリコ除染フレームワークを適用しました（追加ファイル1：表S6）。このデータセットで観察されたバッチ効果が小さいこと（サンプルサイズが小さく、DEBの数が少ないことが寄与していると考えられる）と一致して、大部分のASV（1674/1675（99.9%））は有意なバッチ効果を示さず、基準（i）をクリアーしました。合計347個（21％）のASVが基準（ii）に合格し、血漿対DENCサンプルで有意に高い有病率を示し（追加ファイル1：図S9E）、38個（2.3％）のASVが基準（iii）に合格し、DEB間の患者一致サンプル間の検出の有意な関連性を示しました。合計6つのASVが3つの基準すべてに合格し（追加ファイル1：図S9F）、これらのうち2つが文献に基づく基準（iv）に合格しました（追加ファイル3：表S7）。これら6つのASVのうち2つの属は、全メタゲノム配列決定アプローチを用いた最近の研究において、本物のcfmDNAとして同定された（Additional file 3: Table S7）[15]。

基準（i）～（iii）をクリアした6つの高信頼性ASVは、最初のコホートで見つかった31の高信頼性ASVのリストには含まれていなかった。しかし、3つのASVはGracilibacteria class、Weeksellaceae family、Deinococcus genusに分類され、同じ分類群に属するASVは第1コホートの高信頼性リストに含まれていた（追加ファイル3: 表S7）。基準（i）および（ii）を通過した347のASVのリストのうち、Absconditabacteriales（SR1）、OxalobacteraceaeおよびBlautiaに分類される3つのASVは、最初のコホートで見つかった31の高信頼性ASVの一部であった。Pseudomonas属、Deinococcus属、Bacteroides属、Chryseobacterium属、Bacillus属、Lactococcus属、Clostridium senso stricto 9属、Blautia属に属するASVと、Oxalobacteraceae属は、両方のASVリストで共通して検出された。

健康なサンプルとメラノーマサンプルで異なる量のASVを特定するために、基準（i）および（ii）を満たした347個のASVのセットに対してリンマ仮説検定を適用しました。DEBとDNA抽出-runを別々に調整した線形モデルを用い、多重検定を補正した結果、差次的に豊富なASVは1つしか見つからなかった（図（5C）.5C）。このASVは健常者のみに存在し、血漿DENCサンプルのいずれにも存在しなかった。これはCastellaniella属に分類され、高バイオマス試料の分析からこの属がヒトの常在菌または病原体を表す可能性を示す文献は見つからなかったが、3つのin silico除染基準すべてをクリアし、最近本物のcfmDNAメンバーとして確認された［15］（付加ファイル3：表S7）。

に進む。
考察
近年、がんにおけるマイクロバイオームの役割は、免疫療法に対する反応や毒性への影響も含め、ますます認識されてきている[5, 8, 9]。したがって、マイクロバイオームベースのがんバイオマーカーの開発への関心が高まっていることは驚くにはあたらない [15, 24, 25]。癌におけるマイクロバイオームの特徴を示す証拠の多くは、腸内細菌群の研究から得られている。現在、無細胞の微生物核酸に関する理解は限られており、これらが臨床応用に有用であるかどうかは不明である。ここでは、血漿DNAの16S rRNA遺伝子配列決定法を用いて、本物のcfmDNAシグナルを検出することができるかどうかを検討しました。この解析から、がん患者や健常者の血漿中のcfmDNAの特性は、その低バイオマス性から、微生物の多様性と群集構造に大きなバッチ効果をもたらす汚染DNAの影響を大きく受ける可能性があることがわかりました。しかし、これらのバッチ効果によって生じるばらつきを調整すると、血漿中の細菌濃度は対照群と比べてわずかではあるが有意に高く、この両者の群集構造には有意差があることが分かった。さらに、実験デザインを活用して、信頼性の高い血漿中のASVを同定することができました。これらのことから、健常者とがん患者の血漿には、低いながらも検出可能なレベルのcfmDNAが存在しうること、そしてこの枠組みを利用して、健常者とがん患者のcfmDNAの潜在的な差異を特定できることが明らかになった。

我々の発見は、血漿中の無細胞微生物核酸の存在を分析した最近のいくつかの研究の結果を支持するものである。全ゲノム配列決定により血漿中のcfmDNAを探索した最近の研究には、ヒトマイクロバイオームのこれまで同定されていなかった多数のメンバーを報告したKowarskyら[12]や、健康な女性と早期発症乳癌患者の間で特定の分類群の多様性と存在量に違いがあることを発見したHuangら[11]の研究が含まれています。しかし、これらの研究では、厳格な除染分析を報告しておらず、マイクロバイオーム研究、特に血漿のような内因性バイオマスの少ない研究において汚染がもたらす影響は、文献で広く報告されている [16, 21, 26-29]。我々の知見と先行研究の知見は、血漿中にcfmDNAが存在することを支持しているが、我々の観察は、汚染の影響を考慮すると、そのレベルおよび多様性は、従来考えられていたよりもかなり低いことを示唆している。微生物はどこにでも存在するため、汚染 DNA の発生源には、研究者自身だけでなく、実験室の環境、実験用試薬、実験手順などがある [26, 27, 29-31]。特に、実験室の試薬やキットに広く含まれる汚染DNAは、異なる実験室間で一貫して見られるため、これを「キトーム」と呼ぶ研究者もいる[26]。Pooreらによる最近の研究[15]は、血漿由来のcfmDNAを分析する際に、厳格な除染戦略を適用した最初のものである。彼らは、血漿由来のcfDNAの全メタゲノム配列解析と汚染制御を行うことで、大規模な組織および血液サンプルのコレクションを解析して特定された、明確な癌タイプ固有のcfmDNAシグネチャーを検証することができた。これは、適切な汚染除去戦略を適用した場合、癌におけるcfmDNAに基づく診断の可能性を明らかにするものである。

ここでは、汚染の影響に対処するためのガイドラインを採用した、cfmDNAの分析に利用可能なフレームワークを実装した[16, 32]。我々のアプローチには、（1）汚染を軽減するためのDNA抽出手順の変更、（2）各DNA抽出とシーケンスライブラリ調製に適切な陰性コントロールを含めること、（3）16S rRNA遺伝子ベースのddPCRとシーケンスによる陰性コントロールの汚染分類群のレベルと種類の分析、（4）技術的変数に関連するバッチ効果の評価と調整、（5）汚染配列を除外し高信頼性血漿ASVを特定するin silico汚染除去基準の適用、が含まれていた。今後、追加のデータセットおよび/またはシミュレーションされた微生物コミュニティの解析により、精度と感度をさらに最適化するためのin silico decontamination criteriaを改良できる可能性があります。本研究では、全メタゲノム解析ではなく、16S rRNA遺伝子シーケンスを実施することにしました。以前の研究では、全ゲノムシーケンスを利用して、血漿から循環細菌DNAのポジティブな検出を示しましたが、これは、循環細菌DNAから得られるシーケンシングリードが全体のごく一部に過ぎないため、非効率なアプローチとなりえます[12, 15]。対照的に、16S rRNA遺伝子シーケンスは、微生物DNAを特異的にターゲットとするため、血漿のような微生物バイオマスの少ないサンプルにより適したオプションとなります。しかし、16S rRNA 遺伝子の解析では、16S rRNA 遺伝子のサブセグメントが特定されている細菌に調査が限定されるため、循環血中に検出される可能性のある微生物 DNA の全範囲を正確に表していない場合があります [12、15]。

今回の結果は、無細胞微生物 DNA の解析とその臨床応用の可能性に対して大きな示唆を与えています。理想的には、全血のような他の種類の試料で行われているように、分析に混入する汚染 DNA の量を最小限に抑える超簡単な無細胞 DNA 抽出キットを開発することである。このことは、cfDNA抽出キットのDNA汚染レベルが、便や唾液サンプルのマイクロバイオーム解析用に設計された抽出キットに比べてはるかに高いという、我々の結果からも裏付けられます。新しいキットと、汚染DNAの外部ソースを最小限に抑え、技術的なばらつきを考慮できるワークフローを組み合わせることで、バッチ効果を大幅に低減し、ノイズから実際のシグナルをより正確に切り分けることができるようになる。この最適化されたワークフローを使用して、癌と健常者とで異なるASVを同定・検証し、cfmDNAを臨床管理のためのバイオマーカーとして利用できるかどうかを判断するには、さらに大規模なコホートでの分析が必要である。

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結論
我々の結果は、cfmDNA解析の課題と注意点、そして将来的な可能性を浮き彫りにするものである。高レベルの汚染DNAにもかかわらず、我々の証拠は血漿中に本物の無細胞微生物DNAが存在することを示唆しているが、これは厳格な除染分析を適用した場合にのみ正確に判断することが可能である。癌やその他の疾患に対する臨床的に有効な低侵襲バイオマーカーとして活用するためには、実験室やバイオインフォマティクスにおける今後の開発および改良が必要である。

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方法
臨床コホートと検体採取
血漿、便、唾液のサンプルはすべて、ビクトリア州メルボルンのPeter MacCallum Cancer Centreにおいて、メラノーマバイオマーカー研究の一環としてステージ IV のメラノーマ患者から採取されたものである。健康な対照血漿は、Victorian Cancer Biobank (Study ID VCB_ 19014)を通じてドナーから収集された。血液はEDTAチューブで採取され、採取後2時間以内に処理された。全血をまず1600gで10分間遠心分離して血漿と末梢血細胞を分離し、さらに20,000gで10分間遠心分離して残った細胞および/または残骸をペレット化した。血漿は、血漿DNA抽出まで-80℃で保存した。便サンプルは、製造業者のプロトコールに従って1×OMNIgene®-GUT（OMR-200）チューブに採取された。これらは検査機関に配送するために室温で保管し、最大2ヶ月間保存された。唾液サンプルは、メーカーのプロトコールに従って、1×Oragene® Saliva Collection Kit (DNA Genotek, OG500)チューブに採取された。

DNA 抽出と抽出コントロール
血漿 DNA は、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen) を用いて、最大 2 ml の血漿から製造者の説明書に従って抽出された。血漿DNA抽出はすべて、血漿DNA抽出専用のバイオセーフティレベル2のキャビネット内で、無菌状態（使い捨ての手術着と手袋を使用）で行い、すべての器具は70％エタノール、1％ Virkon、DNA除染試薬（Sigma LookOut DNA Erase）と紫外線を用いて最低30分間消毒とDNAクリーニングを行った。血漿DNAは50 μlのAVE緩衝液に溶出し、-20 °Cで保存した。糞便検体は、MoBio PowerFecal DNA isolation kit (Qiagen)を用いて、製造者の指示に従いDNAを抽出し、-20℃で保存した。唾液検体は Qiasymphony SP および QIAsymphony DSP DNA キット（Qiagen）を用いて DNA 抽出を行った。DNA Extraction Negative Controls (DENC) は、異なる抽出キットに起因する汚染の可能性を評価するために、各抽出でnuclease-free water (Promega) を唯一のインプットとして使用した。大腸菌由来DNAは、DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen）を用いて製造者のプロトコルに従って抽出し、Qubit high-sensitivity dsDNA kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量し、希釈系列はnuclease-free waterで希釈した。

16S rRNA 遺伝子配列の決定
Earth Microbiome Projectの16S rRNA遺伝子Illuminaアンプリコンプロトコルに基づき、細菌16S rRNAマーカー遺伝子のV4超可変領域（16Sv4）をPCR増幅の対象とした［33、34］。このPCRプロトコルは、多種多様な環境およびヒトのマイクロバイオームの研究に複数回使用されている[35]。プライマー515F-OH1 (ACACTGACGACATGGTTCTACAGGACTACNVGGTWTCTAAT) および806R-OH2 (TACGGTAGCAGACTTGTCTGTGYCAGCMGCCGCGTAA) が使用された。これは、Illumina MiSeq装置でのペアエンドシーケンスのためのアンプリコンターゲットに、その後のIlluminaシーケンスアダプターおよびFluidigmインデックスバーコードの導入のためのターゲットを提供するコンセンサス配列（下線）を含んでいた[36-38]。一次16S rRNA遺伝子PCR増幅は、Platinum Hot-Start PCR Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific) を用いて、以下の条件で二重に実施した。94℃、3分、便および唾液サンプルでは25サイクル、血漿では94℃、45秒、55℃、1分、72℃、1分を30サイクル行い、最後に72℃、10分で伸長させた。その後、一次増幅で得られたアンプリコンを1/10に希釈し、二次増幅の鋳型として使用した。二次増幅では、オーバーハング配列を使用して、イルミナシーケンスアダプターとFluidigmインデックスバーコードをアンプリコンターゲットに導入した。増幅後、生成物をプールし、AMPure XPビーズを用いて精製し、Agilent D1000 screentape (Agilent Technologies) を用いて定量した。インデックスされたプールを6pMに希釈し、ペアエンド600サイクル（2×311）キットを用いてMiSeqシステム（Illumina）で配列決定した。PCR増幅の均一性を評価するために、各PCR増幅ランにモック細菌群コントロール（20 Strain Even Mix Genomic Material-ATCC® MSA-1002 T）を含めた。また、PCR増幅過程でのDNA汚染を評価するため、非鋳型コントロールも各実行で含まれた。

シーケンシングアプローチの検出限界を決定するために、大腸菌ゲノムDNAを104から10-2ゲノムコピー/μlまでの10倍希釈系列に適用した（追加ファイル1：図S1）。その結果、102ゲノムコピー/μlのDNA濃度から、希釈度の増加とともにリードの総数が減少し、336個の大腸菌リードを回収した最低濃度の10-2ゲノムコピー/μlのDNAで大腸菌配列が検出可能であることが示された。以前の研究で示されたように、微生物 DNA の連続希釈数の増加は、配列決定された汚染 ASV の多様性（および割合）と相関していた[26, 39]。

塩基配列の処理
3回のシーケンス実行のそれぞれから得られた脱多重化16S rRNA遺伝子アンプリコン配列を、QIIME2スイート（バージョン2018.11.0）［40］を使用して個別に処理した。デフォルトのパラメータで「qiime cutadapt trim-paired」を使用してPCRプライマー配列をトリミングした後、「qiime dada2 denoise-paired with --p-trunc-len-f 246 and --p-trunc-len-r 213」を使用してサンプル数テーブルごとのアンプリコンシークエンスバリアント（ASV）を作成した。qiime feature-classifier classify-sklearn' と Silva データベース (119 SSU Ref NR 99 515F/806R release) [41] を用いて、ASV の代表配列を分類した。各シーケンス実行からのサンプル数ごとのASV、代表配列、分類学的分類に対応するQIIME2アーティファクトをマージし、下流の解析用にエクスポートした。

比較多様性と統計解析
Phyloseqパッケージ（バージョン1.28.0）[42]を用いて、サンプル数ごとのASVs、代表配列、サンプルコレクション全体を網羅する分類学的プロファイルを含むファイルをRにインポートした。真核生物、ミトコンドリア、または葉緑体として分類されたASVは削除されました。同じ生物学的サンプル（例えば、ある日に抽出された特定の患者からの血漿DNAサンプル）からのシーケンスPCR複製は、すべてのカウントを合計することでマージされました。同じサンプルタイプのサンプル間のアバンダンスが0.01%未満のASVは削除されました。各比較多様性解析の前に、比較するサンプルのサイズによって異なる最小サンプルサイズ（すなわちリード数）に希釈（すなわち置換なしのサブサンプリング）して、サンプルを正規化した。

アルファ多様性解析のために、phyloseqのestimate_richness関数とplot_richness関数を用いて、それぞれrichness（観測されたASV数）とinverse Simpson値、プロットを取得した。血漿と血漿-DENC間のα多様性の違いを調べるために、geepack Rパッケージ（バージョン1.3-1）[43]のgeeglm関数を使って一般化推定方程式（GEE）を適用し、ファミリーパラメータをデフォルト「ガウス型」に設定した。この関数は、DNA抽出バッチ（DEB）AおよびBの患者適合血漿サンプルのように、反復測定間の潜在的な相関を考慮する。回帰モデルには、「サンプルタイプ」、DEBおよびそれらの相互作用項（「サンプルタイプ」×DEB）を含み、DEB間で血漿および血漿DENC間のアルファ多様性の違いが変わるかどうかを検証した。

ベータ多様性解析は、phyloseqの「distance」機能を用い、method = 「bray」で、全ペアのサンプル間の群集構造のBray-Curtis非類似度を算出することにより行った。Bray-CurtisベースのUPGMA階層型クラスタリングと非メトリック多次元尺度法解析は、それぞれR statsパッケージのhclust (with method = 'average') 関数とphyloseqのordinate関数 (with method = 'NMDS' and distance = 'bray') を用いて実行された。両可視化手法に用いたカウントデータは平方根変換したものである。マイクロビオーム研究で得られたリードの量は、シーケンシングプロセスによって課せられた任意の数であるため、マイクロビオームカウントデータは、実際には、各成分の存在量が他のすべての成分に依存する組成物である[20, 44]。データの組成的性質を考慮し、Bray-Curtisに基づく解析と比較するために、サンプル間のAitchison距離も計算した。このために、オフセット'1'を非修飾・非変換ASVカウントデータに加え、組成Rパッケージのclr関数を用いて中心対数比変換（CLR）した。Aitchison 距離を得るために、次にユークリッド距離を適用した。血漿および血漿-DENCサンプルの円形UPGMA階層型クラスタリングデンドグラムは、Dendroscope (version 3.7.2) [45]を使用してR出力を修正することで得られました。繰り返し測定のない異なるサンプル群（例：便対便-DENC）のコミュニティ構造間の統計的有意性を評価するために、vegan Rパッケージ（バージョン2.5-6）[46]のadonis関数を使用して、Bray-Curtis非類似度またはAitchison距離に基づくPERMANOVA（順列分散分析）検定が実施された。サンプルが同じ患者に属する場合（例えば、異なるサンプルタイプ（血漿、便、唾液）からのサンプル、または複製で抽出された血漿サンプル（すなわち、DEBs A/BとDEBs F/Gにまたがる）、反復測定を考慮したPERMANOVA（RMA-PERMANOVA）を実装するadonisの修正バージョンであるPERMANOVA_repeated_measuresという既発表の関数が使われました [47]（PERMANOVA=The PERMANOVA, the PERMANOVA=The PERMANOVA, aptitude of Permutation, aptitude of Permutation））。反復測定を考慮するために、この関数は、被験者内でブロックされた並べ替えを実行します。サンプルタイプ（すなわち、血漿、便、唾液）間の全体的および一対の比較のために、因子「サンプルタイプ」のみが統計モデルに含まれた。DNA抽出日」による潜在的な変動を調整するために、この因子を「サンプルタイプ」と相互作用（「DNA抽出日」×「サンプルタイプ」）と共に、サンプルと対応するDENCが異なる日にわたって共抽出された、便対便-DENC、唾液対唾液-DENC、血漿対血漿-DENC比較に含めている。血漿対血漿DENCの比較では、「DNA抽出日」ではなくDEBまたは「シーケンス実行」で調整し、これらの因子と「サンプルタイプ」の相互作用も含めた検定も実施した。

高信頼性血漿中ASVの同定
汚染源に由来するのではなく、血漿中に本当に存在する可能性が高いASVを検索するために、血漿サンプルで観察されたASVのそれぞれに対して、3つの独立したバイオインフォマティクスフィルタを適用しました。これらの基準は、他の低バイオマスのマイクロバイオームの研究に適用されており[18, 26]、この文脈では、汚染問題に対処するための戦略として推奨されています[16, 21, 32]。

基準(i)は、バッチ効果を引き起こす技術的変数（すなわち、配列決定ラン、DEBおよび「DNA抽出日」）に関連する有意な差分存在量のないASVの同定から構成されている。これには、limma Rパッケージ（バージョン3.40.2）[23]が使用されました。ライブラリサイズは、trimmed mean of log expression ratios (TMM) method [48]を用いて正規化した。ASVのカウントは、voom [49]を使用して、関連する精度の重みを持つlog2-counts per million (CPM)に変換された。ASVのサンプルごとのカウントの高いスパース性を考慮し、「遺伝子ごと」（この場合は「ASVごと」）の分散を過小評価することができるため、補正を適用した[50]。反復測定（すなわち、同じ患者に属する異なるサンプル）を考慮するために、「患者ID」をブロック化したlmma duplicateCorrelation関数を使用して、lmFit関数と経験的ベイズモデレートt統計に組み込まれたコンセンサス相関を取得しました。DNA抽出日」がDEBにネストされ、これが「シーケンス実行」にネストされるという実験デザインであったため、「DNA抽出日」を唯一の因子とする単一の線形回帰モデルを構築し、関心のある比較をコントラストとして定義しました。DEBの効果を検証するために、すべての可能なDEBの組み合わせに対応するコントラストが実行された一方で、'DNA抽出日'の効果を検証するために、コントラストはDEB内の日数のみで行われました。P値は、FDRを制御するためにBenjamini and Hochberg法で調整された。3つの技術変数（すなわち、「DNA抽出日」、DEBおよび「配列決定実行」）のそれぞれの影響を試験するために行われた対照のいずれかにおいて、FDR≦0.05のASVはバッチ効果として考慮された。

基準(ii)は、血漿対血漿DENCサンプルでより高い有病率を持つASVの同定で、これには、decontam Rパッケージ（バージョン1.4.0）のisContaminant関数（メソッドは「有病率」、しきい値は0.55、バッチはDEB）［22］が使用されました。この関数は，各ASVに対して，真の試料と陰性対照の2×2の有・無表現表にカイ二乗統計量（試料数が少ない場合はフィッシャーの正確検定）を適用し，スコア統計量Pをその値におけるカイ二乗分布の尾確率と定義した．isContaminant関数の「batch」パラメータを使用して、スコア統計量は各DEBについて独立して計算され、その後、バッチ間で最小スコアを取ることによって結合されました。

基準(iii)は、患者と一致するDEB（バッチAとBまたはFとG）間で、複製間で検出の一致を示したASVの同定で構成されています。このために、カテゴリーデータにおける2人の評価者間の一致の指標であるCohenのカッパ係数を実装したirr Rパッケージ（バージョン0.84.1）のkappa2関数を使用しました。カッパスコア＞0.4、p値＜0.05のASVは、基準を満たすと判断された。

基準(i)と(ii)を満たすASV、および患者と一致するDEBs AとBまたはFとGにのみ存在するASVで基準(iii)も満たすASVを選択した。これらのASVを、Silvaデータベースの最新版（138 SSU Ref NR 99 515F/806R release）を用いて、Naive Bayes分類器（qiime feature-classifier classify-sklearn）とコンセンサスBLASTアプローチ（qiime feature-classifier classify-consensus-blast with parameters --p-perc-identity 0.9 --p-min-consensus 0.8）の両方を使用して分類した。これら2つのアプローチで得られた分類のコンセンサスを手動で構築し（追加ファイル2：表S3および追加ファイル3：表S7参照）、フィルタリングしたASVを、各ASVを6つの互いに排他的なカテゴリーの1つに分類する基準（iv）に従わせた。これらのカテゴリーは、低バイオマスのマイクロバイオーム研究における「一般的な汚染分類群」の既発表リスト [16] と、その分類群が「ヒト病原体または常在菌」である可能性を示す文献検索でのASVの分類群の存在に基づいて定義されたものである。この文献検索では、血液や血漿サンプルを分析した研究ではなく、バイオマス量の多いマイクロバイオーム研究（例：腸管、口腔）のみを対象としています。これらのカテゴリの定義は、Additional file 2: Table S3 に記載されている。汚染物質である可能性が高い」または「常在菌または病原体の証拠なし」のASVは破棄し、残りのASVはすべて高信頼度の血漿ASVと見なした。

微生物 DNA 濃度の測定
FAM標識蛍光レポーター液滴デジタルPCR（ddPCR）アッセイにより、フェカリス菌に分類された高信頼性血漿ASVの16S-rRNA遺伝子配列決定結果を検証（DADA2 feature ID: 59777186ad2e0947e97615b5d6225136）およびClostridium sensu stricto 9（DADA2 feature ID: 82a260faafef55efd1b8176ecb781ecf）をカスタム設計しました。このために、血漿、血漿-DENC、NTCサンプルから得られたASVの代表配列から、それぞれGreengenes 13_8 99%参照系統樹と「qiime alignment mafft」、「qiime fragment-insertion sepp」を用いて多重配列アライメントと系統樹を構築しました。系統樹に基づき、高信頼性血漿ASVが存在するクレードと隣接するクレードの配列が選択された。次に、多重配列アラインメントのこのサブセットを、高信頼性血漿ASVと近隣ASVとの間のミスマッチの数を最大にするプライマー／プローブの標的領域について、手作業で検査した。アッセイの特異性を制御するために、高信頼性血漿ASVのDNA配列と近隣クレードASVのDNA配列を用いて、それぞれ陽性と陰性のgBlock遺伝子断片（Integrated DNA Technologies）を合成した。Faecalibacterium (DADA2 feature ID: 59777186ad2e0947e97615b5d6225136) assayでは、このASV特異的ddPCR assayのForward, Reverse, Probe配列はそれぞれ ACTGGTGTAAAGGAGCGC, GAATTCCGCCTACCTGCAC and AAGACAAGTTGGAAGTGAAATCCATGGCであった。Clostridium sensu stricto 9 (DADA2 feature ID: 82a260faafef55efd1b8176ecb781ecf) assayについて、このASV特異的ddPCRアッセイのForward、Reverse、Probe配列はそれぞれAGCTTAACTTGGTGCTGCATTTG、CTGTTTGCTCCACGCTTTCATとTTCCACTTACCTCCTGCACTCTAGATATであった。このアッセイは、以前に発表されたユニバーサル16SrRNA TaqMan定量PCRアッセイからのプライマーとプローブを用いて設計したHEX標識蛍光体レポーターddPCRアッセイとマルチプレックスした[51]。このアッセイは、サンプルタイプおよび DENC 全体における微生物 DNA の絶対量を測定するためにも使用されました。

ddPCR 分析は Bio-Rad Droplet Digital PCR システムを使用し、製造者のプロトコールに従って実施した。ddPCR 反応は、最終濃度の 1x ddPCR supermix for probes (without dUTP) (Bio-Rad), 0.9 μM each primer and 0.25 μM probe を含む 25 μL aqueous volumeであった。サーマルサイクリング条件は、95℃：10分、95℃：15秒、65℃：1分のアニーリングを40サイクル行った。各サンプルは、少なくとも1万回の反応からなる少なくとも2つのテクニカルレプリケートによって分析された。増幅可能な分子の数を決定するためにポアソン補正を適用し、さらに血漿1ミリリットルあたりの特定のASVを持つDNAのコピー数を導き出すために使用された。データ解析は、QuantaSoft Software, version 1.7 (Bio-Rad) を用いて実施された。ASVは、重複した反応で2コピー以上検出された場合、検出可能と定義された。血漿と血漿DENCの遺伝子コピー濃度の差を検定するために、α多様性の差を検定するのに用いたのと同じ関数と回帰モデルを用いて、GEEを適用した。

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補足情報
追加ファイル1: 図S1. 大腸菌ゲノムDNA希釈系列の16S rRNA遺伝子配列決定。図 S2. サンプルタイプ別に得られた16S rRNA遺伝子品質フィルタリングリードの数。図 S3. 研究サンプルと同時にシーケンスされた20株均一混合モックコミュニティの分類学的プロファイル。図S4. 患者と一致する血漿、便、唾液サンプルとそれぞれのDENCの分類学的プロファイル。図S5. 血漿サンプルのDNA抽出日によるバッチ効果（Bray-Curtis非類似度分析に基づく）。図S6. DEBs C-Eの血漿サンプルと対応するDENCの分類学的プロファイル。図S7. Aitchison距離解析に基づく、シーケンシングランとDEBによるバッチ効果。図S8. DEB A〜Dにおける血漿中のASVの有病率 vs DENC。健常者とメラノーマ患者のエクステンションコホートのシーケンシングとin silico除染の結果。表S1. 初期研究コホートからのメラノーマ患者の臨床的特徴。表S2. 患者ごとの血漿ASVと便および唾液サンプルと共有されるリード。表S4. 延長コホートからのメラノーマ患者の臨床的特徴。表S5. 拡張コホートから得られたアルファおよびベータ多様性推定値に対する仮説検定の結果得られたP値。表S6. 各除染基準を個別に、または組み合わせて満たした拡張コホートの血漿ASVの数(5.7M、docx)。
追加ファイル2：表S3. 初期コホートの血漿サンプルに適用されたインシリコ除染戦略を通過したASVの除染基準結果(102K, xlsx)
追加ファイル3：表S7. 拡張コホートの血漿サンプルに適用されたインシリコ除染戦略に合格したASVの除染基準結果(96K, xlsx)。
追加ファイル4. 審査履歴(16K, docx)
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謝辞
Alexandra J. Roth Schulzeには、バイオインフォマティクスと統計解析を含む原稿の評価と助言をいただいた。また、Peter MacCallum Cancer CentreのBioinformatics and Molecular Genomics Core Facilitiesは、オーストラリア癌研究財団の支援を受けていることをここに記しておく。

査読履歴
査読履歴は、Additional file 4に掲載されています。

査読情報
Andrew Cosgroveは本論文の主編集者であり、他の編集チームと協力して編集過程と査読を管理した。

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著者による寄稿
E. Z-V.、S.Q.W.、S.J.D.がプロジェクトの設計、データの解釈、原稿執筆を行い、J.R.、A.H.、S.Sが研究参加者の募集を行った。S.Q.W.、J.R.、S.F.は患者からの試料採取を確立した。E. Z-V.、S.Q.W.、S.F.が実験作業を実施した。E. Z-V.は、バイオインフォマティクスコードと解析ワークフローを作成した。E. Z-V.とS.Q.W.はA.T.P.、M.A.D、S.J.D.の助言を受けてデータを分析し、すべての著者が最終版の原稿を承認した。

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著者情報
ツイッターハンドル ezozayav (Enrique Zozaya-Valdés); @stephenqwong (Stephen Q. Wong); @TonyPapenfuss (Anthony T. Papenfuss); @MAFD110 (Mark A. Dawson); @TheDawsonLab (Sarah-Jane Dawson).

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資金調達
NHMRC プロジェクト助成金 1107126 号により、この研究の一部を助成した。S.J.DはCSL Centenary FellowshipとNHMRC investigator grant(#1196755)の支援を受けています。M.A.D.はCancer Council of VictoriaからSir Edward Dunlop Fellowship、NHMRC investigator grant (#1196749)、HHMI IRS (#55008729)の支援を受けている。S.Q.W.はVictorian Cancer Agency Mid-Career FellowshipとNHMRC investigator grant(#1194783)の支援を受けている。A.T.P.は、National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Research Fellowship (1116955) とLorenzo and Pamela Galli Charitable Trustによる支援を受けている。

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データおよび材料の利用可能性
本研究で生成されたすべての配列データは、バイオプロジェクト番号 PRJNA666045 [52]の下、National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) で入手可能である。主な結果を再現するためのデータおよびソースRコードは、https://github.com/ezozayav/Detection_of_cfmDNA [53]で入手可能である。

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宣言文
倫理的承認と参加への同意
Peter MacCallum Cancer Centre（PMCC：11/105）から承認されたHuman Research Ethics Committeeのプロトコルに基づいて、ヘルシンキ宣言およびオーストラリア国立保健医療研究評議会の関連倫理指針および規則に従ってすべての方法を実施し、すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。

論文発表の同意
該当なし

利害関係
S.J.DはAstra ZenecaとInivataの諮問委員会のメンバーである。S.J.DはGenentech社から研究資金を受けています。S.J.DとM.A.Dは、CTx CRCから研究資金を受け取っています。M.A.D. は CTx CRC、Storm Therapeutics、Celgene、Cambridge Epigenetix の諮問委員会のメンバーとなっています。

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脚注
出版社からのコメント

シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図および所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。

Enrique Zozaya-ValdésとStephen Q. Wongの筆頭著者は同一人物です。

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寄稿者情報
Enrique Zozaya-Valdés、電子メール：gro.camretep@sedlav-ayazoz.euqirne.

Stephen Q. Wong, Email: gro.camretep@gnow.nehpets.

Jeanette Raleigh、電子メール：moc.liamg@nahtanarahtek.ettenaej.

Athena Hatzimihalis、電子メール： gro.camretep@silahimiztah.anehta.

Sarah Ftouni、電子メール： gro.camretep@inuotf.haras.

Anthony T. Papenfuss、電子メール： gro.camretep@ssufnepap.ynohtna.

Shahneen Sandhu、電子メール： gro.camretep@uhdnas.neenhahs.

Mark A. Dawson、電子メール： gro.camretep@noswad.kram.

Sarah-Jane Dawson、電子メール： gro.camretep@noswad.enaj-haras.

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    ゲノムバイオロジーからの記事は、BioMed Centralの提供でここに提供されています。

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