重症マラリア患児におけるグルココルチコイド機能障害
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オリジナル研究論文
Front. 免疫学、2023年7月10日
寄生虫免疫学
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1187196
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免疫寛容とヒトマラリア
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重症マラリア患児におけるグルココルチコイド機能障害
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1187196/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FIMMU_XXXXXXXX_auto-dlvrit
Leen Vandermosten1、Fran Prenen1、Balotin Fogang2、Pauline Dagneau de Richecour1、Sofie Knoops1、Christiane Josiane Donkeu2、Cathy Doric Piemba Nguefack3、Jean-Voisin Taguebue3、Paul Koki Ndombo3、Bart Ghesquière4,5、Lawrence Ayong2、Philippe E. Van den Steen1*。
1ベルギー、ルーヴェン、ルーヴェン大学医学研究所、微生物学・免疫学・移植学部門、免疫寄生虫学研究室
2マラリア研究ユニット、パスツールセンター、ヤウンデ、カメルーン
3母子センター、シャンタル・ビヤ財団、ヤウンデ、カメルーン
4メタボロミクス専門家センター、がん生物学センター、VIBがん生物学センター、ルーヴェン、ベルギー
5メタボロミクス専門家センター、腫瘍学部門、KUルーヴェン、ルーヴェン、ベルギー
はじめに マラリアは、依然として大きな負担を伴う広範な健康問題である。重症あるいは合併症のあるマラリアは致死率が高く、免疫活性化、炎症、代謝異常など様々な病理学的過程を包含している。以前我々は、副腎皮質ホルモン、特にグルココルチコイド（GC）が、マウスのマラリア原虫感染時の耐病性を維持するために重要な役割を果たしていることを明らかにした。ここでは、カメルーンにおいて、合併症のないマラリア（UM）、重症マラリア（SM）、無症候性対照（AC）の小児を対象に、GC反応を調べた。
方法 GCシグナルに対する白血球の感受性を転写レベルで決定するため、ヒトおよびマウスの白血球において、GCによるグルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（GILZ）およびFK506結合蛋白質5（FKBP5）の生体外誘導を測定した。末梢血単核球（PBMC）を用いた標的トレーサーメタボロミクスを行い、GCによって誘導される代謝変化を検出した。
結果 コルチゾール結合グロブリン濃度は変化せず、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）濃度は不均一であった。GCによるGILZとFKBP5の誘導は、ACと比較して臨床マラリア患者において、また非感染対照と比較してマラリア感染マウスにおいて有意に減少した。ペントースリン酸経路における活性の増加が患者において認められたが、これは生理学的レベルのヒドロコルチゾンによる生体外刺激には影響されなかった。興味深いことに、ヒドロコルチゾンはACにおいてcAMPレベルの上昇を誘導したが、臨床マラリア患者では誘導しなかった。
考察： 以上より、本研究は、SM患者ではコルチゾールレベルが上昇しているが、同時にGCに対する感受性も低下していることを示している。
1 はじめに
マラリアは寄生虫病であり、2021年には2億4,700万人が発症し、61万9,000人が死亡すると推定されている(1)。マラリア原虫に感染すると、半免疫患者における無症状のものから、合併症のない重症のものまで、さまざまな結末を迎える。マラリアの合併症は主な死因であり、脳マラリア、重症マラリア性貧血、胎盤マラリア、マラリア関連急性呼吸窮迫症候群（MA-ARDS）などがある。マラリア合併症の病因は複雑で、寄生虫の隔離や炎症などの多因子性である(2)。さらに、低血糖や高乳酸血症などの代謝異常はマラリアでは一般的であり、疾患の重症化に大きく寄与するが、まだ十分に理解されていない(3)。
マラリア患者では、視床下部-下垂体-副腎（HPA）軸が刺激される結果、内因性グルココルチコイド（GC）が増加することが判明した（4-6）。GCには強力な抗炎症作用と代謝作用があり、宿主が病気に耐えるのを助けるかもしれない(7)。GCは親油性であるため、細胞膜を通過してグルココルチコイド受容体（GR）に結合する。GRは、体内のほとんどの細胞種に発現しており、リガンドがないときは、FK506結合タンパク質5（FKBP5）を含むいくつかのシャペロンと複合体となって細胞質に存在している。GCリガンドが結合すると、GRはシャペロンから解離して核に移行し、そこでゲノムの10％にも及ぶ多数の遺伝子の転写に影響を及ぼす(8, 9)。その結果、グルココルチコイド誘導性ロイシンジッパー（GILZ、Tsc22d3によってコードされる）やFKBP5のような抗炎症因子を含む多くの分子の転写がアップレギュレートされ、GRの転座が阻害されるため、負のフィードバックループが形成される。さらに、リガンドされたGRは、様々な炎症因子をダウンレギュレートし、いくつかの代謝過程を制御する(9, 10)。興味深いことに、GCはまた、転写に依存しない迅速な作用、いわゆる非ゲノム作用も持っている。このような非ゲノム作用のメカニズムには、細胞表面のとらえどころのない膜結合型レセプターが関与している可能性があり、cAMPのレベルを高めるなど、いくつかのシグナル伝達経路に影響を及ぼす可能性がある(11)。
長年にわたり、合成GCは、特にその幅広い抗炎症作用のために臨床で使用されており、最も処方されている薬剤のひとつである。しかし、慢性閉塞性肺疾患やステロイド抵抗性喘息などでよく証明されているように、GCはしばしばその活性を阻害するため、常に炎症を抑制できるとは限らない(12, 13)。脳マラリアにおけるデキサメタゾンの治療効果を評価する臨床試験が30年以上前に行われたが、成功しなかった(14, 15)。しかし、この失敗の理由やマラリアにおける内因性GCの役割については、まだよくわかっていない。
重要なことは、ある古い研究で、重症マラリア患者の限られた数において、HPA軸の反応低下が報告されたことである(4)。最近、我々のグループは、副腎皮質ホルモンがマラリアにおける疾患耐性を付与することを証明した。この保護作用は、無症状または軽度から致死的な高寄生虫血症または致死的なMA-ARDSまでの重症度を持つ4つの異なるマラリアモデルマウスで観察された。副腎を摘出したマウスに原虫を感染させると、重篤な低血糖と循環系および脳における過剰な炎症が生じたが、この表現型は合成GCであるデキサメタゾンによる治療によって救済された。代謝の変化と炎症亢進状態は、マラリアでは独立した病態と見なされることが多い。しかし、GCは代謝と免疫反応の両方を制御するマウスの中心的な役割を担っているようである。
本研究では、重症マラリア（SM）と合併症のないマラリア（UM）および無症候性対照（AC）を比較し、GC反応を調べた。血漿中のコルチゾール濃度は患者において上昇したが、コルチゾール結合グロブリン（CBG）と副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）は差がなかったか、あるいは非常に変動的であった。生理的レベルのGCによるGILZおよびFKBP5 mRNAの生体外誘導を解析したところ、UMおよびSM患者の末梢血単核球（PBMC）はACに比べて感受性が低下していた。さらに、メタボローム解析の結果、AC患者のPBMCではGC処理によりcAMPとAMPレベルが上昇したが、UM患者とSM患者のPBMCでは上昇しなかった。以上より、本研究は、SM患者ではコルチゾールレベルが上昇しているが、GCに対する転写および非転写感受性が低下していることを示している。
2 材料と方法
2.1 倫理声明
すべての手順は、UZ Leuven Ethical Committeeの承認を得た（プロトコル番号S62395）。カメルーンでは、ヤウンデのNational Ethics Committee for Research in Human Health（CNERSH）（プロトコル番号2019/03/1150/CE/CNERSH/SP）と公衆衛生省から倫理的・管理的承認を得た。研究への登録に先立ち、ヘルシンキ宣言に従って、各子どもの法的保護者または親から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
2.2 研究対象者
この横断的研究のためのサンプルは、原虫の継続的な伝播がある地域で、伝播が高い2つの季節の間、2019年10月から2021年7月の間に6ヵ月から17歳の子どもから収集された。マラリア症例は、ヤウンデのシャンタル・ビヤ財団母子小児科紹介病院に来院した小児から募集した。無症状の小児は、地域社会と、定期検診と予防接種のためにCentre Pasteur du Camerounに通院している小児から集めた。彼らはPlasmodium falciparum histidine rich protein II（PfHRPII）と汎Plasmodium種ベースの迅速診断検査（RDT）（SD Bioline、韓国）で陰性であった。
除外基準は、サンプリング前最近1週間の抗マラリア薬、副腎皮質ステロイド薬またはワクチンの投与、直近2時間以内の食物摂取、直近48時間以内の急性髄膜炎または他のマラリア以外の重症疾患、発達遅延、慢性疾患または妊娠であった。さらに、ACは過去4日間に病気の症状があった場合は除外された。すべての検体は午前7時から午後3時の間に採取された。
マラリア症例の組み入れ基準は、マラリア原虫の存在であり、最初にRDTで検査した。組み入れ後、厚い血液塗抹標本を検査し、マラリア原虫の存在を確認し、寄生虫血症を判定した。合併症のないマラリアは、発熱があるか、または過去48時間以内に発熱の既往があり、重症マラリアの症状がないものと定義した。重症マラリアは、意識障害（Blantyre score<3またはGlasgow score<10）、衰弱、過去24時間以内に2回以上の痙攣、呼吸困難の臨床症状、重症貧血（ヘモグロビン<5 g/dl）、高寄生虫血症（>250,000無性寄生虫/μl）のうち1つ以上の症状として定義された。すべての小児は採血後、標準的な臨床治療を受けた。
2.3 臨床パラメータと検体処理
体重、身長、血圧、および体温を各個人から記録した。栄養不良のZスコアは、WHOの基準（5歳未満は身長に対する体重、5歳以上は年齢に対するBMI）に基づいて定義された(17)。血圧のZスコアは、National Heart, Lung and Blood institute (NHLBI)(18)の2004年の年齢と身長に対する血圧チャートから得られたパーセンタイルから算出した。静脈血はEDTAコートバキュテイナチューブ（BD, Franklin Lakes, NJ, USA）で採取した。乳酸値と血糖値は、Lactate Plusメーター（Cardioworld, Gärtringen, Germany）とAccu-Chek Guideメーター（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）を用いて、カテーテル内に残った血液から直ちに測定した。
全血をテュルク液（Merck, Darmstadt, Germany）で希釈し、ビュルカーチャンバーを用いて白血球（WBC）濃度を測定した。ギムザ染色した厚い血液塗抹標本を作製し、1,000個のWBCに対して顕微鏡で寄生虫の数を数えた。寄生虫密度（寄生虫数／μl）は、血液1μlあたりの白血球数の平均を仮定する代わりに、両方の数から算出した。血中ヘモグロビン濃度はMission Hb haemoglobinometer（ACON Laboratories、米国）を用いて評価した。
血漿は、サンプル採取後30分以内に2,000gで10分間遠心分離して分離し、アリコートをさらに使用するまで-80℃で保存した。ペレットは、滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS; Lonza, Verviers, Belgium）で2倍に希釈し、Ca2+とMg2+を含まず、2% Fetal Calf Serum (FCS; Gibco)を加え、最大6時間穏やかに振盪した。PBMCの密度勾配精製のために、希釈ペレットをPancoll（1.077 g/ml）（PAN-Biotech、Aidenbach、ドイツ）の上に1:3の容量比でゆっくりとピペッティングした。ブレーキをかけずに600g（20℃）で30分間遠心した後、パンコール層の上のPBMC層を新しいチューブに移し、DPBSで2回洗浄し、テュルク液でカウントした。
2.4 血漿分析
血漿中のインスリンおよびグルカゴン濃度は、ELISA（Mercodia, Uppsala, Sweden）を用いて、製造業者のプロトコールに従って測定した。コルチゾール（Beckman Coulter, CA, USA）、コルチゾール結合グロブリン（CBG）（DIAsource, Louvain-la Neuve, Belgium）および副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）（BRAHMS Diagnostics, Hennigsdorf, Germany）の総レベルは、製造業者の指示に従ってRIAを用いて測定した。アルブミンは比色法Bromocresol Purple assay（Sigma-Aldrich）で測定した。
血漿中の総コルチゾール、CBG、およびアルブミン濃度に基づき、Boonenら（19, 20）の記載に従って個々のアルブミン濃度に適合させたCoolens法により、遊離コルチゾール濃度を算出した。
遊離コルチゾール(μM)=√(0.0167 + (G-T) 12(1+N″))2 + T∗1(1+N″) ∗ K -0.0167 + (G-T) 12(1+N″)
ここで、G＝血漿中CBG濃度（μM）、T＝血漿中総コルチゾール濃度（μM）、K＝コルチゾールに対するCBGの親和性＝30μM-1、N″＝1.74/43×個体アルブミン濃度（g/l）である。
2.5 PBMCとヒドロコルチゾンとのインキュベーション
PBMCを、2g/L炭酸水素ナトリウム、2mM L-グルタミン(ギブコ)、2% FCS(ギブコ)を添加したRPMI-1640培地(Caisson Labs, Smithfield, UT, USA)に、1mlあたり1x106細胞の濃度で懸濁した。細胞を96ウェルプレートに二重にプレーティングし、1ウェルあたり250,000個の細胞を入れ、1ウェルを150 nMのヒドロコルチゾン（Sigma-Aldrich）で処理した。37℃に設定した5％CO2インキュベーターで2時間後、細胞をエッペンドルフに移した。ウェルを0.9%NaClで洗浄し、付着した細胞をβ-メルカプトエタノールを含む350μlのRLTで溶解した。懸濁細胞をスピンダウンし、細胞ペレットをプレートのRLTで溶解し、溶解液をRNA抽出まで-80℃で保存した。
2.6 コルチコステロンによるマウス脾臓細胞刺激
C57BL/6JマウスはKUルーヴェンのRega Institute for Medical Researchの動物舎で飼育した。マウスは、Edinburgh株のPlasmodium berghei NK65（PbNK65）に感染させた104個の赤血球を腹腔内注射（i.p.）して感染させた（21）。各実験には、同性・同年齢の非感染コントロールも含まれた。すべての実験は、欧州連合の規制（指令2010/63/EU）および2013年5月29日のベルギー王令に従って行われ、KUルーヴェンの動物倫理委員会（ライセンスLA1210186、プロジェクトP123/2022、ベルギー）の承認を得た。100μlのDolethal（Veítoquinol, Aartselaar, Belgium; 200 mg/ml）をi.p.注射してマウスを安楽死させた。脾臓を摘出し、氷冷PBS＋2％FCSで回収し、70μmのナイロン製セルストレーナーでつぶして単一細胞を得た。赤血球溶解は、0.83% NH4Cl（Acros Organics, Geel, Belgium）、10 mM Tris（Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium）、pH7.2溶液中で、37℃で3分間インキュベートした。その後、細胞をPBS＋2％FCSで3回洗浄し、トリパンブルーで死細胞を排除したビュルカーチャンバーで計数した。細胞を10%FCSを含むRPMI-1640培地（Biowest, Nuaillé, France）に2x106細胞/mlで再懸濁し、24ウェルプレートに3x106細胞/ウェルでプレーティングした。マウス1サンプルにつき1ウェルは未処理のまま、もう1ウェルは400nMのコルチコステロン（Sigma-Aldrich）で処理した。37℃に設定した5％CO2インキュベーターで2時間後、懸濁細胞をエッペンドルフに移し、付着細胞をRNeasyキット（Qiagen, Hilden, Germany）の350μl RLTでβ-メルカプトエタノールとともに溶解した。懸濁細胞をスピンダウンし、細胞ペレットをプレートのRLTで溶解し、溶解液はRNA抽出まで-80℃で保存した。
2.7 RNA抽出と定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
RNeasy Micro Kit（Qiagen）およびRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて、PBMCおよび脾臓細胞からそれぞれRNAを抽出した。RNA濃度を評価し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems, Waltham, USA）を用いてRNAをcDNAに変換した。定量的RT-PCRは、ABI Prism 7,500 Sequence Detection System（Applied Biosystems社製）を用いて、あらかじめ設計およびカスタマイズしたプライマー（IDT社製、Leuven、ベルギー、補足表1）とTaqMan Fast Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社製）を用いて行った。相対的 mRNA 発現は、健常/無症状コントロールの平均 2-CT 値および 18S ハウスキーピング遺伝子の 2-CT 値に対して正規化した 2-ΔΔCt として決定した。
2.8 13C-グルコースの追跡
250,000個のPBMCを、2g/L炭酸水素ナトリウム、2mM L-グルタミン（ギブコ）、2%透析FCS（ギブコ）および1g/L [U-13C]-グルコース（Cambridge isotope laboratories, Inc. 1ウェルに150 nMのヒドロコルチゾン（Sigma-Aldrich）を添加した。5％CO2、37℃で24時間培養した後、代謝13C標識の定常状態に達し（予備実験で決定）、細胞をエッペンドルフチューブに移した。25μlの氷冷抽出バッファー（80％メタノール）をウェルに加え、付着細胞を溶解し、プレートを氷上に保った。細胞ペレットを再懸濁せずに氷冷0.9%NaClで洗浄し、氷冷抽出バッファー50 µlで溶解した。抽出液をプールし、-80℃で保存した。抽出液を20,000 g、4℃で15分間遠心した。上清を代謝物分析に使用した。ペレットを真空濃縮機で乾燥し、95℃で20分間加熱して200 mM NaOHに溶解した。2,650gで10分間遠心した後、Bradford assay（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）により上清中のタンパク質濃度を測定した。
メタノール-水上清中の代謝物は、Dionex UltiMate 3,000 LC System（Thermo Scientific社製）とQ Exactive Orbitrap質量分析計（Thermo Scientific社製）をネガティブモードで接続して質量分析した。抽出液 10 μl を Poroshell 120 HILIC-Z PEEK カラム (Agilent InfinityLab) に注入しました。90%溶媒A(アセトニトリル)と10%溶媒B(mqH2O中10 mM Na-acetate、pH 9,3)から開始する直線グラジエントを行った。2～12分後、グラジエントは60%溶媒Bに変化した。60%溶媒Bで3分間保持した後、10%溶媒Bに減少させた。フローは0.25ml/分で一定に保った。カラム温度は25℃で一定に保った。質量分析計はフルスキャン（m/z範囲[70.0000-1050.0000]）およびネガティブモードで、スプレー電圧2.8kV、キャピラリー温度320℃、シースガス45ユニット、補助ガス10ユニットで動作させた。AGCターゲットは70,000の分解能で3.0E+006に設定。データ収集はXcaliburソフトウェア（Thermo Scientific）を用いて行った。データ解析はピーク面積を積分することで行いました（El-Maven - Polly - Elucidata）。
全サンプル (n=109) の 20% 以上のアバンダンシーが検出限界 (平均ブランク + 3SD) 以上である代謝物のみが、さらなる解析の対象となりました。代謝物量はタンパク質濃度で正規化し、ACビヒクル群の平均値に対する相対値で表した。13C取り込みについては、分画寄与率の中央値が2％未満の代謝物を除外し、中央値が2％未満の補正アイソトポログは除外した。
2.9 グルコース取り込みアッセイとフローサイトメトリー
まずPBMCを、2g/L炭酸水素ナトリウム、2mM L-グルタミン（ギブコ）、2％透析済みFCS（ギブコ）を添加したグルコースフリーのRPMI-1640（カイソンラボ）中で、1mlあたり1x106細胞の濃度で、室温で30分間飢餓状態にし、1ウェルあたり50万個の細胞を48ウェルプレートに入れた。次に、50μMの2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBDG; Thermo Fisher Scientific, Eugene, Oregon, US)を加え、さらに30分間取り込ませた。その後、懸濁細胞をFACSチューブに移し、ウェルを1mlの冷FACSバッファー（2％FCSと2mM EDTAを含むDPBS）で洗浄した。残った細胞は、氷上で15分間インキュベートして剥離し、その後穏やかに掻き取った。すべての細胞を洗浄した後、細胞を室温でDPBS中のFc-受容体ブロッキング試薬（Miltenyi Biotec, Leiden, The Netherlands）とインキュベートした。細胞を洗浄し、2パネルのモノクローナル抗体とともに氷上で25分間インキュベートした。どちらのパネルにも抗CD69（BV421、FN50、BD Biosciences）と抗GLUT1（Alexa Fluor 647、202915、BD Biosciences）が含まれていた。一方のパネルには、抗CD56（BV510、NCAM16.2、BD Biosciences）、抗CD16（PE-Cy7、eBioCB16、eBioscience）、抗CD14（APC-Cy7、MφP9、BD Biosciences）を加えた。もう一方のパネルには、さらに抗CD4（PE-Cy7, A161A1, Biolegend）と抗CD8（APC-Cy7, RPA-T8, BD Biosciences）が含まれていた。細胞は2回洗浄し、直ちに3-laser FACS Canto II（BD Biosciences）で解析した。データはFlowJo v10 software（FlowJo LLC, Ashland, OR, USA）で解析した。リンパ球集団と骨髄球集団のゲーティング戦略を補足図1に示す。
2.10 統計解析
データ点数は各図の凡例に示されている。ほとんどの解析にGraphPad Prism Software（GraphPad Software, San Diego, CA）を使用した。UM群対AC群、SM群対AC群、SM群対UM群の差のP値は、定量的変数についてはノンパラメトリック両側Mann-Whitney U検定により、カテゴリー的患者特性についてはノンパラメトリック両側カイ二乗検定により、表1に示すように算出した。ヒドロコルチゾンとビヒクル条件を比較したペアデータの解析のP値は、ノンパラメトリックWilcoxon符号順位検定により算出した。すべての検定で多重比較のためのボンフェローニ・ホルム補正を行った。ノンパラメトリック両側スピアマン相関が計算された。
表1
表1 患者の特徴。
メタボロミクスデータについては、AC群、UM群、SM群のビヒクル条件間の代謝物量および13C標識量の差を、MetaboAnalyst v5.0を用いた偏最小二乗法-判別分析（PLS-DA）および投影における変数重要度（VIP）値、Microsoft Excelを用いたスチューデントのt検定によりスクリーニングした。対のGC効果は、log2倍変化として表され、MetaboAnalystによるPLS-DAで分析され、Microsoft Excelの対Studentのt検定で分析された。さらに、特定の代謝物のヒドロコルチゾンによるlog2倍変化を、GraphPad Prismのノンパラメトリック両側Mann-Whitney U検定を用いて、AC、UMおよびSM群間で比較した。Bonferroni Holm補正は、非対t検定、対t検定、Mann-Whitney U検定による3つの比較に対して行った。メタボロミクスデータのドーナツプロットとヒストグラムプロットはPythonで作成した。すべての図において、有意差のみを * p< 0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001, **** p< 0.0001 で示した。
3 結果
3.1 集団集団の特徴
合計70人の小児が研究に組み入れられ、そのうち23人が2019年に、47人が2021年に組み入れられた。3つの研究グループの特徴を表1にまとめた。図1は、いくつかの血液および血漿分析物のレベルを示している。寄生虫血症はACと比較してUMとSMで同様に増加していた（図1A）。SM患者の35％が高寄生虫血症であった（表1）。ACでは症状を示した者はいなかったが、70％が無症状の寄生虫キャリアであった（顕微鏡検査による）。
図1
図1 血液と血漿の分析値。(A）寄生虫レベルは厚い塗抹標本で顕微鏡的に決定され、決定された血液中の白血球濃度を用いて計算された。点線は高寄生虫血症閾値250,000パー/μlを示す。 (B, C)グルコースと乳酸値を全血で測定。点線は低寄生虫血症および/または高寄生虫血症の閾値を示す。(D, E）血漿中のグルカゴンおよびインスリンレベル。点線は検出限界。(F, G) インスリンまたはグルカゴン値と血糖値との相関。Spearman r-値とp-値を示す。(A, G)各記号は個体のデータを表す。(A, E）データ点間の横線はグループの中央値を表し、分析はMann-Whitney U-検定による。個々のデータセットの上のアスタリスクは、AC群と比較した統計的差異を示す。有意差のみを示す。 p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001。AC n=23（A-C）n=18（D-G）；UM n=21；SM n=26。
3.2 臨床的マラリア患者では、グルカゴンの増加とともにグルコースおよび乳酸値が高い
乳酸アシドーシスや低血糖などの代謝障害はマラリアでは一般的であり、疾患の重症化に寄与する。我々の患者集団では、マラリア感染後にも起こりうる高血糖（>125mg/dl）をUM患者の29％、SM患者の35％が示し、低血糖（<40mg/dl）は観察されなかった（図1B）。さらに、高乳酸血症が4例検出され、UMとSMではACに比べて乳酸値が上昇した（図1C）。
血糖値は膵臓ホルモンであるインスリンとグルカゴンによって厳密に調節されている。血漿中のグルカゴン濃度（図1D）は、AC群と比較してUM群とSM群で上昇したが、インスリン濃度（図1E）は両群間で同程度であった。全児童において、インスリン値は血糖値と相関し（図1F）、特にSM群で最も強い相関がみられた。対照的に、グルカゴン値は血糖値と相関しなかった（図1G）。実際、グルカゴン濃度が高い（10 pM以上）患者はほとんどすべて正常血糖であったが、グルカゴン濃度があまり高くない（10 pM以下）患者は高血糖であった。
3.3 UMおよびSM患者のPBMCは活性化されるが、グルコース取り込みは増加しない
PBMCを単離し、フローサイトメトリーで分析した。UMとSMでは、CD4+とCD8+ T細胞を犠牲にして、単球の割合がACに比べて増加した（図2A）。患者において、単球はより炎症性であり、その集団は主に古典的単球から構成され、非古典的単球の割合の減少とともに中間的単球の割合が増加した（図2B-D）。さらに、中間型や古典型単球ではなく、SM患者の非古典型単球は、ACと比較して活性化マーカーCD69を高レベルで発現していた。また、CD8+ T細胞とNK細胞は、AC細胞に比べてより多くのCD69を発現していた（図2E-I）。ユビキタスに発現するグルコーストランスポーターであるGLUT1は、免疫細胞の活性化に伴って増加することが知られている(22)。しかし、臨床マラリア患者では、ACと比較して免疫細胞が活性化されているにもかかわらず、GLUT1の表面発現は異なる細胞サブセットで同等か、あるいは減少していた（補足図2A）。さらに、蛍光標識されたグルコース誘導体である2-NBDGの取り込みは、GLUT1発現の低下と一致して、ACと比較して患者のCD4+およびCD8+ T細胞で減少した。すべての細胞型の中で、中間単球のみがACと比較して患者で2-NBDGの高い取り込みを示した（補足図2B）。
図2
図2 マラリア患者における単球の増加とPBMCサブセットの活性化。PBMCを単離し、新鮮細胞でフローサイトメトリーを行った。(A）AC、UMおよびSM群における異なる細胞サブセットの割合。(B-D）単球総数に対する単球サブセットの割合。(E-I）それぞれの細胞サブセットにおけるCD69の蛍光強度（MFI）の中央値。(B-I)各記号は個体のデータを表す。データポイント間の横線はグループの中央値を表し、解析はMann-Whitney U-検定による。個々のデータセットの上のアスタリスクは、AC群と比較した統計的差異を示す。* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001。NK, ナチュラルキラー; CL mono, 古典的単球; Int mono, 中間単球; NC mono, 非古典的単球。有意差のみを示す。AC n=13; UM n=16; SM n=14。CD4+T細胞（A）についてはUM n=15; SM n=13、CD8+T細胞（A、G）についてはUM n=15 SM n=11。
3.4 ACTH値は不均一であったが、臨床的マラリア患者ではグルココルチコイドが増加した。
ACTH値は患者とAC間で差はなかったが、SM群ではAC群と比較してACTH値が高いものと比較的低いものがあり、高い広がりを示した（図3A）。総コルチゾール値は、AC群と比較してSM群で増加し、UM群と比較してSM群で高かった（図3B）。血漿中のコルチゾールの生物学的利用能は、CBGへの飽和結合とアルブミンへの非飽和結合によって決定される。非結合または「遊離」コルチゾール画分のみが、細胞膜を横切って拡散し、GRに結合することができる。そこで、血漿中のCBGとアルブミン濃度を測定した。CBG濃度は群間で同程度であり（図3C）、アルブミン濃度はACと比較してUMおよびSM患者で低下していた（図3D）。算出された遊離コルチゾール濃度は、AC患者よりもSM患者で高かった（図3E）。このように、総コルチゾールと遊離コルチゾールの両方がマラリア罹患時に上昇し、総コルチゾール値はUMと比較してSMで高かった。すべてのマラリア患者において、総コルチゾール値は寄生虫血症（Spearman r = 0.41、p = 0.004）、グルカゴン（Spearman r = 0.30、p = 0.038）および乳酸値（Spearman r = 0.3140、p = 0.0316）と相関しており、コルチゾール反応と他のマラリア関連障害との関連が示唆された。コルチゾールは、コルチゾール産生および放出の主な誘導物質であるACTHと必ずしも相関しなかった。遊離コルチゾール値が上昇し、ACTH値が抑制された患者もいた（図3F）。一部の患者におけるACTHとコルチゾールのこのような解離は、ACTH産生に対するコルチゾールによる効果的なフィードバック阻害とコルチゾールの分解低下との組み合わせによって説明できるかもしれない。
図3
図3 HPA軸ホルモンとタンパク質の変化。ACTH（A）、総コルチゾール（B）、CBG（C）、アルブミン（D）および遊離コルチゾール（E）の血漿中濃度。(A）点線はACTH低値の閾値10pg/mlを示す。(A-F）各記号は一人一人のデータを表す。(A-E）データ点間の横線はグループの中央値を表し、分析はMann-Whitney U-検定による。個々のデータセットの上のアスタリスクは、AC群と比較した統計的差異を示す。p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001。(F）遊離コルチゾールとACTHの相関。Spearman r-値とp-値を示す。有意差のみを示す。AC n=23; UM n=21; SM n=26。
3.5 臨床マラリア患者のPBMCはGC誘導遺伝子発現に対して感受性が低い
GCが細胞質でGRに結合すると、GC-GR複合体はシャペロンから解離し、核に移動し、そこで広範な遺伝子を活性化または抑制する。GCに対するPBMCの感受性がマラリアによって影響を受けるかどうかを評価するために、GCによって古典的に誘導される2つの遺伝子のmRNA発現を、150nMのヒドロコルチゾンで処理した細胞と非刺激細胞で測定した。Tsc22d3はグルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（GILZ）をコードし、様々な抗炎症作用や免疫抑制作用を持つタンパク質である。マラリアに罹患していても、PBMCにおけるGILZの基底mRNA発現は変化しなかった（図4A）。GILZの転写産物は、3つのグループにおいてヒドロコルチゾンによって効率的に誘導されたが（図4A）、SM患者における増加倍率は明らかに減少した（図4B）。FK506結合タンパク質5（FKBP5）は、GCに対するGRの結合親和性を低下させるコシャペロンタンパク質である。Tsc22d3の結果と同様に、ヒドロコルチゾンはすべての群でFKBP5 mRNAを誘導することができたが、UMおよびSM群では誘導に異常がみられ（図4C）、UMおよびSMの両患者ではACと比較して増加倍率が著しく減少した（図4D）。FKBP5の基底mRNAレベルには群間で差はなかったにもかかわらず（図4C）、患者ではより多くの変動が観察された。重要なことに、FKBP5とGILZの基礎発現は、生体外ヒドロコルチゾン添加によるそれぞれの発現の倍数増加と負の相関を示した（図4E、F）。ヒドロコルチゾンによるFKBP5の倍数誘導は、GILZの倍数誘導とも強く相関していた（図4G）。SM患者のPBMCだけが、GRαをコードするNr3c1の軽度の減少を示した（図4H）。FKBP5倍体誘導によって反映されるGC応答性は、GRαの発現と相関しなかった（図4I）。このことは、GRα発現の低下が、臨床マラリア患者のPBMCにおけるGC不感受性の原因ではないことを示唆している。これらのデータを総合すると、臨床的マラリア患者、特にSMのPBMCは、GCに対する反応が低いことが示される。
図4
図4 ヒドロコルチゾンによるGILZおよびFKBP5転写物の誘導は、患者のPBMCでは減少している。mRNAを抽出し、Tsc22d3（GILZ）、Fkbp5およびNr3c1α（GRα）のレベルをqRT-PCRで測定した。(A, C）mRNAの増加倍率をACビヒクル群の平均と比較して計算し、コントロールと患者についてヒドロコルチゾン対ビヒクル条件のペア効果を解析した。(B、D）ヒドロコルチゾンによる増加倍率は、ビヒクル条件に対するヒドロコルチゾン条件のmRNA増加倍率の比で定義した。(E-G、I）スピアマン検定による相関分析。(H）ACビヒクル群と比較したmRNA倍数増加。(A-I）各記号は個体からのデータを表す。解析はMann-Whitney U-testまたはWilcoxon検定で行った。有意差のみを示す。* p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001. AC n=20; UM n=19; SM n=24.
3.6 マウスにおけるマラリア感染は、脾臓細胞のコルチコステロン感受性を低下させる。
マラリアのマウスモデルは、マラリア合併症の病態生理学を研究するための優れたツールであり、ここでは患者のPBMCで観察されたGC不感受性を確認するために使用した。C57BL/6JマウスにPbNK65寄生虫を感染させ、実験的にMA-ARDSを発症させた。コルチコステロンで脾臓細胞を刺激した後、GILZとFKBP5のmRNA発現誘導を測定することにより、GC感受性を非感染対照マウスと重症のPbNK65感染マウスとで比較した（図5）。GILZの発現は感染マウスで強力に抑制された。感染マウスの脾臓細胞では、ベースラインおよびコルチコステロン誘導性のGILZのmRNA発現の両方が、コルチコステロン刺激により同様の倍率で増加したにもかかわらず（図5B）、対照マウスと比較して減少した（図5A）。FKBP5レベルはコントロールマウスと比較して感染マウスの脾臓細胞で有意に増加した（図5C）。さらに、我々の患者データ（図4D）と同様に、感染マウスの脾臓細胞のコルチコステロン刺激後のFKBP5 mRNA発現は、対照マウスと比較して低かった（図5C）。その結果、コルチコステロン刺激後のFKBP5レベルの増加倍率は劇的に減少した（図5D）。従って、マウスにおけるSMは、GCによる免疫細胞の標的遺伝子転写能を低下させる。
図5
図5 マウスのマラリア感染は脾臓細胞のコルチコステロン感受性を低下させる。非感染コントロール（Con）C57Bl/6JマウスとPlasmodium berghei NK65（PbNK65）感染C57Bl/6Jマウス（感染後9日目）の脾臓から脾細胞を単離し、コルチコステロン（GC）無添加または400nMで2時間刺激した。Tsc22d3（GILZ）とFkbp5のmRNAレベルをqRT-PCRで測定した。(A、C）Con群と比較したmRNAの倍数増加。(B, D) 未処置条件に対するGC条件のmRNA倍数増加の比によって定義されるGCによる倍数増加。データは2つの別々の実験に由来する。各記号は個々のマウスのデータを表す。データ点間の横線は群中央値を表す。分析はMann-Whitney U-検定による。上にアスタリスクをつけた横線は、示された群間の統計的有意水準を示す。個々のデータセットの上のアスタリスクは、非刺激群と比較した統計的有意水準を示す。有意差のみを示す。*** p<0.001. Con n=7; PbNK65 n=9.
3.7 GCを介したcAMPおよびAMPの誘導は、臨床的マラリア患者のPBMCで減少している
マラリア患者のPMBCが、転写以外にもGCに対する代謝反応の変化を示すかどうかを評価するために、ヒドロコルチゾンを添加または無添加でインキュベートしたPBMCに対して、[U-13C]-グルコーストレーサーのメタボローム解析を行った。グルコースがPMBCによってどのように代謝されるかを調べるために、解糖、クレブスサイクル、ヌクレオチド合成、酸化還元代謝、ペントースリン酸経路（PPP）を含む40以上の異なる代謝経路の中間体における代謝物量と13C取り込みを分析した。
まず、ヒドロコルチゾンなしで培養したAC、UM、SMのPBMC間の違いを調べた。グルコ代謝経路における有意な変化（t検定p<0.05およびfold change >2）は、図6Aにアスタリスクで強調表示し、補足図3に個々の代謝産物に関するそれぞれのグラフを示した。SM患者のPBMCはメチオニンスルホキシドの存在量が多く、酸化ストレスの増加を示唆した。さらに、ペントースリン酸の存在量は、ACに比べてUMおよびSM患者で増加した。特異的同位体の割合は、様々な代謝経路を介した特定の代謝物に対するグルコースの相対的寄与に関する情報を提供する。1,2,3...の標識炭素を持つ特異的同位体は、それぞれm1,m2,m3と命名される。41の補正されたアイソトポログを用いたPLS-DA分析では、13Cの取り込みがACとUMおよびSM患者のPBMCで明らかに異なることが示され、最も特徴的なアイソトポログは図6Bに列挙された。ペントースリン酸レベルの上昇に加え、マラリアを発症したUMおよび/またはSM患者におけるPPP代謝の亢進は、プリンヌクレオチドATPおよびGMPにおけるm5（またはリボース）標識の増加と、PPPの非酸化部分からの最終産物である補酵素NAD+におけるm10およびm11標識の増加によって示された（図6A；補足図3）。このことは、臨床マラリアが発症すると、生体外で培養したPBMC中のヌクレオチドと補因子の炭素が、グルコースからますます派生することを示している。PPPがグリセルアルデヒド-3-リン酸を介して解糖と融合すると、m3標識の代わりにm2標識が予想される。ピルビン酸を経由して生成されるL-アラニンでは、SM患者のPBMCでm2標識が増加する傾向が観察された（補正p = 0.05114）。さらに、グリセロール3-リン酸では、臨床マラリア患者とAC患者でm3標識の増加が認められた。ほとんどのクレブスサイクル中間体は、存在量が少ないか、または分画寄与率が低いため、解析から除外した。
図6
図6 マラリア患者のPBMCではペントースリン酸経路が亢進している。PBMCを単離し、[U-13C]-グルコーストレーサーおよびビヒクル（VEH）または150 nMヒドロコルチゾン（GC）と24時間インキュベートした。代謝抽出物は質量分析によって分析された。(A）選択した代謝物のドーナツプロットによるペントースリン酸経路の模式的視覚化。ドーナツの大きさは、AC VEH条件と比較した平均相対量を表す。同位体の平均相対寄与率は、凡例で定義されているように、異なる色で表されている。残りの画分には、非標識および希少同位体（2％未満）の画分が含まれる。分析は、VEHの行のドーナツの横にアスタリスクで示したように、UMとSM対ACのt検定によって行われた。AC、UM、SMのGC効果については、GCの行のドーナツの横にアスタリスクを付けた。ハイライトされていないアスタリスクは、存在量における効果を表す。ハイライトされたアスタリスクは、特定の同位体における効果を表す。有意差のみを示す。(B) VEHインキュベートPBMCから得られた41の補正された同位体に基づいて、AC、UM、SMを分離するためにPLS-DAを実行した。PLS-DA： Partial Least Squares Method-Discriminant Analysis; PPP, ペントースリン酸経路; VIP, Variable Importance in Projection。* p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001。存在量： AC n=20; UM n=14 (12 paired); SM n=22 veh (21 paired)。同位体比： 同位体比：AC n=20；UM n=13（11 対）；SM n=20（18 対）。
GCに対する代謝反応を調べるため、代謝物の存在量と標識量を、非刺激細胞（ビヒクル）と生理的濃度のヒドロコルチゾンで刺激した細胞との間で比較した。47代謝産物の存在量のlog2倍変化に基づくPLS-DA分析により、AC、UMおよびSM患者は、GC刺激に対するいくつかのヌクレオチドレベルの応答において主に異なることが示された（図7A）。実際、ヒドロコルチゾンは、ACではAMP、cAMPおよびUMPの量を増加させたが、マラリア患者のPMBCでは増加させなかった（図7B）。AMPとUMPの増加倍率は、ACと比較してUM患者では低く、cAMPの増加倍率は、ACと比較してUM患者とSM患者の両方で減少した（図7C）。このヌクレオチド応答は、UMと比較してSMでは減少しなかった。cAMPの増加は、UM患者と比較してSMではさらに高い。さらに、GCはSMにおいてUTPのm5標識を増加させた（図6A；補足図3）。
図7
図7 マラリア患者のPBMCでは、GCを介したcAMPおよびAMPの誘導が減少している。PBMCを単離し、[U-13C]-グルコーストレーサーおよびビヒクル（VEH）または150 nMヒドロコルチゾン（GC）とともに24時間インキュベートした。代謝抽出物は質量分析により分析した。(A)GCにより誘導された47代謝物の存在量のLog2倍変化をPLS-DAにより解析した。(B)AMP、cAMPおよびUMPの相対存在量について、GCとVEHの条件を対にしたt検定で解析した。(C）ヒドロコルチゾンによる存在量の対数2倍増加。Mann-Whitney U-testによる群間比較。各記号は1個体からのデータを表す。(B)の棒は平均値、(C)の線は中央値を表す。個々のデータセットの上のアスタリスクは、AC群と比較した統計的差異を示す。有意差のみを示す。PLS-DA, Partial Least Squares Method-Discriminant Analysis; VIP, Variable Importance in Projection. AC n=20; UM n=11-12; SM n=20-21。* p<0.05, *** p<0.001。
以上より、臨床マラリア患者のPBMCはPPP活性の上昇を示し、これはGC刺激には影響されなかった。重要なことは、ACと比較して、GC刺激後のcAMP誘導の減少が観察されたことである。このように、マラリア患者のPBMCでは、非ゲノムのGCシグナル伝達が障害されている可能性がある。これらのデータは、マラリア罹患時に、転写およびシグナル伝達の両レベルで多面的に測定されるように、GC不感受性が発症することをさらに強調している。
4 考察
カメルーンに住む小児において、コルチゾールレベルとヒドロコルチゾンに対するPBMCの感受性をAC、UM、SM間で比較した。グルカゴンおよびコルチゾールレベルは、乳酸およびグルコースレベルの上昇とともに、臨床的マラリア患者においてかなり上昇していた。これは他の研究（23-26）でも認められた。ACTH値は非常に変動が大きく、患者によっては低値と高値の両極端がみられた。臨床マラリア患者から分離されたPBMCは、単球と活性化細胞をより多く含み、ペントースリン酸経路活性の亢進を示し、その結果、グルコースからヌクレオチドと補因子をより多くde novo産生した。重要なことは、ヒドロコルチゾンによるGILZとFKBP5の発現誘導は、ACに比べて疾患患者のPBMCでは効率が低かったことである。同様に、ヒドロコルチゾンは、臨床マラリア患者のPBMCにおいてcAMPレベルを増加させる能力も低かった。このことは、GCのゲノムおよび非ゲノム効果に対するPBMCの感受性が、臨床マラリア時には低下することを示している。
本研究の限界にもかかわらず、明らかな所見は、マラリア疾患の重症化の一因としてのGC調節異常に関する新たな研究を正当化するものである。制限事項としては、サンプル数が少ないこと、年齢のばらつきが比較的大きいこと、性差があること、対照群の小児に無症候性寄生虫保菌者の割合が高いことである。また、CM症例や重症低血糖症患者は含まれていなかった。これらのマラリアの重篤な合併症では、GCの感度がさらに低下する可能性があると考えられるが、これについてはさらなる調査が必要である。全体として、SMは一般的に非常に不均一な病態であり、このことも本研究のデータのばらつきの一部を説明しているかもしれない。異なる合併症にグルココルチコイド不感受性が存在するかどうかを決定するためには、さらなる調査が必要である。
発症時期は登録されていないが、おそらく我々のコホート内の患者間でばらつきがあると思われる。このことは、重症時に記述されているように、ACTH値とコルチゾール値の関係に影響を及ぼすかもしれない(27)。重症の初期急性期には、ACTHによるコルチゾールの上昇が始まる。その後の段階では、視床下部と下垂体前葉に対する負のフィードバックが起こり、コルチゾールレベルが高く、ACTHレベルが抑制される。後者は、われわれの研究でSM患者の一部に観察された。重要なことに、いくつかの古い研究では、P.falciparum感染後のHPA軸の反応性について、抑制試験と活性化試験により検討されている(7)。UMではHPA軸は無傷であったが、SMではACTHの下垂体分泌は最適ではなかった(28, 29)。ACTHによるコルチゾールの放出に加えて、肝臓と腎臓におけるコルチゾールの酵素的分解の減少が、コルチゾールの循環レベルを上昇させる可能性がある。Davisらは、重症マラリアの成人ではコルチゾールの排泄率が低いことを発見した(4)。重症の小児では、11β-ヒドロキシステロイド-デヒドロゲナーゼ-2、A-リング還元酵素である5α-レダクターゼと5β-レダクターゼの活性低下により、コルチゾールの分解が低下する(30)。マラリア患者の尿中のコルチゾール代謝産物を検査することは、コルチゾール代謝酵素活性の低下がマラリア感染時のコルチゾール濃度の上昇に寄与しているかどうかを推定するのに有用であろう。われわれの結果はまた、臨床的マラリア患者におけるコルチゾールレベルの高いばらつきを示しており、患者の一部は重症化に対処するためにコルチゾールレベルが不十分である可能性を示唆している。
感染時に放出されるコルチゾールは、免疫反応、血管機能、代謝など、さまざまな重要なプロセスにとって決定的な役割を果たすと考えられており、これらはすべてマラリアにおいて極めて重要である(7)。グルカゴンとコルチゾールは、グルコース対抗調節ホルモンとして相乗的に作用し、ストレスや空腹条件下で、糖新生を増加させたり、末梢のグルコース取り込みを減少させたりするなど、さまざまな方法で循環グルコースを増加させる(31)。我々の患者コホートでは、グルカゴンおよびコルチゾールの誘導レベルは、実際にグルコースレベルの上昇と並行している。Van Thienらは、成人の脳マラリアではコルチゾールレベルと血糖値が高く、糖新生を介したグルコース産生が増加していることを報告している(24)。高血糖は、低血糖に比べマラリアでは報告される頻度が低く、急性に問題となることも少ないと推測されるが、SM、特に脳マラリアとの関連が指摘されている(32-36)。また、入院中のマラリア患児における連続血液モニタリングでは、低血糖と高血糖の両方のエピソードが頻繁に確認されており(37)、全体として、マラリア感染時にはグルコースホメオスタシスが不安定であり、GCによる調節が重要である可能性が示唆されている。
マラリアに対する防御は、免疫による寄生虫の排除に大きく依存しており、これには広範な貪食活性、Tリンパ球の活性化、抗体産生が関与している(2)。白血球の活性化と増殖は、好気性解糖とグルコース消費の亢進を含む劇的な代謝変化と並行して起こるからである(38, 39)。患者のPBMCはより多くの活性化細胞を含んでいたが、2-NBDGの取り込みとグルコーストランスポーターGLUT-1の表面発現は増加していなかった。しかし、メタボロミクス解析の結果、患者における免疫細胞の活性化には、メチオニンスルホキシドとグリセロール-3-リン酸の高レベル化と、ヌクレオチドと補因子を生成するためのペントースリン酸経路の利用増加が伴っていることが同定された。これらの知見は、Tナイーブ細胞に比べてin vivoマウスTエフェクター細胞のUMP、AMP、GMPのm5標識が増加したこと(40)や、活性化ヒトT細胞のPD-L1阻害後にヌクレオシドリン酸のm5標識が減少したこと(41)を説明する先行研究と一致している。総じて、臨床マラリア患者のPBMCにおけるこれらの代謝反応は、活性化された免疫細胞が、抗酸化反応を起こし、グルコースからヌクレオチドやグリセロール-3-リン酸などのビルディングブロックを産生することにより、生存し増殖するための必要条件を示している。
GCは、その抗炎症作用と免疫抑制作用でよく知られているが、マラリアにも関与しているようである。Abdrabouらは、小児のP.falciparum感染時に、副腎皮質ステロイドを含む血清ステロイドがアップレギュレートされ、免疫抑制と関連することを報告している(42)。われわれの結果は、臨床的マラリア患者では循環コルチゾールレベルが実際に上昇するが、GILZおよびFKBP5のmRNA誘導とcAMP応答が損なわれるため、生体外ヒドロコルチゾンに対する患者PBMCの感受性が低下することを示している。GC感受性は、in vivoでのデキサメタゾン抑制試験以外に、GRの数と親和性、デキサメタゾンを介した増殖阻害、およびデキサメタゾンを介した遺伝子の転写活性化とトランス抑制を評価することによって、しばしばPBMCで評価される(43-45)。本研究では、GC感受性を推定するために、合成コルチコステロイドの超生理学的レベルではなく、生理的コルチゾール／コルチコステロンレベルを、細胞を事前に活性化することなく適用し、GCの2つの典型的な標的遺伝子であるGILZとFKBP5の両方のトランス活性化を読み取り値として用いた。限られたサンプル数にもかかわらず、我々の結果は、我々の患者コホートにおいて、マラリア発症時にGC感受性が低下することを示唆している。GILZはGCの抗炎症作用に不可欠なメディエーターであり、FKBP5はGRの立体構造に影響を与え、結合親和性を低下させ、GCの負のフィードバックループに対応する(46, 47)。cAMPはプロテインキナーゼA（PKA）を活性化し、PKAとGRの相互作用は、GRが介在するNF-kBの抑制に関与している（48）。さらに、GCで観察されたAMPの増加は、ホスホジエステラーゼによるcAMPのAMPへの変換の結果である可能性が高い。GILZ、FKBP5およびcAMPレベルの誘導を分析することにより、我々の結果は、GCのゲノムおよび非ゲノム効果に対する感受性が、UMおよびSM患者において、無症状の対照群と比較して低下していることを示している。本研究は、無症候性寄生虫キャリアを含むAC群から、寄生虫血症レベルの高いUM群およびSM群までのマラリア重症度勾配に沿ってGC反応を捉えた。さらに、CMや重症低血糖症を含むさまざまなマラリア合併症におけるGC感受性を比較することで、これらの特定の合併症においてGC耐性がさらに悪化するかどうかを示すことができるかもしれない。
GC不感受性または抵抗性は、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、喘息、関節リウマチおよび敗血症を含むいくつかの疾患において生じる。この耐性は、これらの疾患の治療や、おそらくは病態に影響を及ぼす(13, 49)。過去数十年にわたり、GC耐性のさまざまな分子メカニズムが提唱されてきた。その中には、GRの突然変異、GRβのスプライス交互変異体の発現増加、GRの結合および転座の欠陥、クロマチンリモデリング、サイトカインシグナル伝達（IL-2、TNF-aなど）などが含まれる(49)。この研究では、基礎FKBP5発現レベルは、GCに対する反応性、すなわち外因性ヒドロコルチゾンによるFKBP5の倍数変化と逆相関することが観察された。他の疾患においても、FKBP5はGCに対する反応性と抵抗性に関連していた。クッシング症候群の患者では、コルチゾールに過剰にさらされると、血液細胞でFKBP5のmRNA発現が高くなるが、手術が成功するとベースラインに戻った(50)。喘息患者では、気道上皮細胞におけるFKBP5の高発現が副腎皮質ステロイド治療に対する反応性の低さと関連し、リスザルのリンパ球におけるFKBP5の過剰発現が先天性GC抵抗性を媒介した(51, 52)。したがって、GRによるFKBP5の誘導は、臨床マラリア患者におけるGC感受性を低下させる可能性がある。それでもなお、マラリア患者におけるGC不感受性には、他のさまざまな機序が関与している可能性があり、これについてはさらなる調査が必要である。
重要なことは、副腎ホルモンの欠乏が致死的な低血糖と高炎症につながるマラリアのさまざまなマウスモデルで示されているように、GC感受性の低下やGC抵抗性がマラリア疾患の重症化に全体的に寄与している可能性があることである(16)。マラリア感染時のGC耐性は、1980年代に行われた2つの臨床試験で、脳マラリアに対するデキサメタゾン治療の有用性が示されず、その後マラリアにおけるGCへの関心がなくなった理由も明らかにするかもしれない(14, 15)。この研究により、さまざまなマラリア患者集団におけるGC耐性と重症化への寄与について、より詳細な調査が必要であることを強調したい。重篤な疾患に関連した副腎皮質ステロイド不全に対するGC治療は複雑であり、非常に議論のあるところである(27)。しかし、マラリアにおけるGCの詳細な生物学を調査し、特定のSM患者サブグループがGC治療から利益を得られるかどうかを明らかにすることは、マラリアの合併症が依然として世界中で毎年多くの死亡者を出していることから、意義のあることである。
データの利用可能性に関する声明
本研究で発表された原著論文は、論文／補足資料に含まれている。その他のお問い合わせは、対応する著者にお願いします。
倫理声明
ヒトを対象とした本研究は、UZルーヴェン倫理委員会（プロトコル番号S62395）およびカメルーン、ヤウンデの国立ヒト健康研究倫理委員会（CNERSH）（プロトコル番号2019/03/1150/CE/CNERSH/SP）の審査および承認を得た。本研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントは、参加者の法定後見人／近親者から提供された。動物実験はKUルーヴェンの動物倫理委員会の審査および承認を得た。
著者貢献
LV、FP、BF、PD、SK、CDが実験を行った。CN、JT、PNは臨床試験を実施、監督した。LVはデータを分析した。PV、LV、LAは本研究の構想を練った。BGはメタボロミクスの設定と解釈を手伝った。LVとPVは原稿の初稿を執筆した。著者全員が原稿を批判的に読み、編集した。著者全員が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。
資金提供
本研究は、Research Foundation-Flanders (F.W.O.-Vlaanderen, project G0C9720N and G066723N)およびKU Leuven Research Fund (C1 project C16/17/010)の助成を受けた。LVはF.W.O.-Vlaanderenのジュニア・ポスドク研究員である。
謝辞
この研究に患者を登録し、臨床データとサンプルを収集したシャンタル・ビヤ小児科病院の看護師と医師の働きに感謝する。特に、共同研究を成功に導き、サポートしてくれたTracey Lambに感謝する。また、Karolien De Bosscher氏、Ilse Vanhorebeek氏、Noël Knops氏には、有益なフィードバックと解釈をいただいた。Inge DereseにはRIAを手伝ってもらい、Emilie Pollenusにはフローサイトメトリーパネルのデザインについて助言してもらった。マウス脾臓細胞を提供してくれたHendrik Possemiersに感謝する。Camilla Takeno ColognaとSam De Craemerにはメタボロミクスデータの取得と解析にご協力いただいた。Maarten Van Loo氏には、図6、7および補足図3のプロット作成にご協力いただいた。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1187196/full#supplementary-material に掲載されている。
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キーワード：マラリア、グルココルチコイド、原虫、メタボロミクス、コルチゾール
引用 Vandermosten L, Prenen F, Fogang B, Dagneau de Richecour P, Knoops S, Donkeu CJ, Nguefack CDP, Taguebue J-V, Ndombo PK, Ghesquière B, Ayong L and Van den Steen PE (2023) 重症マラリア患児におけるグルココルチコイド機能障害。Front. Immunol. doi: 10.3389/fimmu.2023.1187196.
受理された： 2023年3月15日；受理：2023年6月23日；
発行：2023年7月10日
編集者
セリア・デシャヴァンヌ、IRD、フランス
査読者
Agnes Aubouy, Institut de Recherche Pour le Développement (IRD), フランス
Soumita Ghosh, 米国ペンシルバニア大学
Copyright © 2023 Vandermosten, Prenen, Fogang, Dagneau de Richecour, Knoops, Donkeu, Nguefack, Taguebue, Ndombo, Ghesquière, Ayong and Van den Steen. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
*文責：フィリップ・E・ヴァン・デン・スティーン フィリップ・E・ヴァン・デン・スティーン philippe.vandensteen@kuleuven.be
免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。
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