アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）の食餌による差異反応が病原体感受性を調節する

2024年6月3日 20:41

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2024年5月14日
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アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）の食餌による差異反応が病原体感受性を調節する

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.15.571894v1

Mathis Wolter, Erica T Grant https://orcid.org/0000-0002-7632-4939, Marie Boudaud https://orcid.org/0000-0003-4775-0514, Nicholas A Pudlo, Gabriel V Pereira, Kathryn A Eaton, Eric C Martens, and Mahesh S Desai https://orcid.org/0000-0002-9223-2209 mahesh.desai@lih.luAUTHOR INFORMATION
Mol Syst Biol
(2024)
20: 596 - 625
https://doi.org/10.1038/s44320-024-00036-7

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第20巻｜第6号
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はじめに
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データの利用可能性
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要旨
食物繊維が不足した腸内細菌叢によって大腸粘液層が侵食されると、付着・排出病原体であるCitrobacter rodentiumに対する感受性が亢進する。それにもかかわらず、特定の粘液溶解性細菌がどのように病原体感受性の亢進を助けているのかという疑問は未解明のままである。ここでは、機能的に特性化された14種類の合成ヒト微生物叢を用い、どの細菌がどのような機能をもって病原体感受性を高めているのかを明らかにする。粘液溶解性細菌の脱落株を用いて、食物繊維の欠乏時にAkkermansia muciniphilaが粘膜病原体に対して宿主をより脆弱にすることを示した。しかしながら、A. muciniphilaが存在すると、食物繊維が十分な食事では病原体の負荷が軽減され、このムチンスペシャリストの状況に依存した有益な効果が強調された。病原体感受性の亢進は、宿主の免疫反応や病原体反応の変化によるものではなく、A. muciniphilaと他の群集メンバーの粘液透過性の向上と活性の変化の組み合わせによるものである。本研究は、同じ粘液溶解性細菌の個別の機能的応答が、どのようにして腸内病原体感受性に抵抗したり増強したりするのか、そのメカニズムに新たな知見を与えるものである。
概要
画像
ムチンのスペシャリストであるAkkermansia muciniphilaは、食物繊維のない食事では感受性を高めるが、食物繊維の豊富な食事では同じ常在菌が耐性を付与する。

ヒトの腸内細菌叢のバリエーションから、食物繊維がマイクロバイオームの特定のメンバーを通じてCitrobacter rodentium感染の重症度を決定する上で重要な役割を果たすことが示された。

食物繊維を含まない食事を与えたAkkermansia muciniphilaを含む群集における病原体感受性の上昇の背景には、粘液バリア透過性の上昇と群集ネットワークの変化が複合的に作用している。

合成微生物叢からAkkermansia muciniphilaを除外するか、食物繊維の豊富な食事を摂取することで、重篤な感染を防ぐことができる。

食物繊維が豊富な条件下では、Akkermansia muciniphilaの存在が重篤な感染症を予防する。
はじめに
腸管粘液層は、腸管上皮を覆うムチン糖タンパク質の保護および潤滑バリアであり、粘膜免疫系の不可欠な部分である（Johansson and Hansson, 2016）。腸管粘液層の数ある機能の中でも、腸内病原体に対する防御は重要である（Martens et al, 2018）。大腸粘液層は主にムチン-2（MUC2）糖タンパク質で構成されており、この糖タンパク質は杯細胞から動的に分泌され、非常に凝縮された形で上皮を覆うほぼ入り込めないネット状の構造を形成する（Johansson et al, 2008）。腸内細菌叢の一部のメンバーは、複雑なムチン糖タンパク質を分解する酵素能力を有しており（Parrish et al, 2022a; Martens et al, 2018）、常にこの構造の外縁部を食べているため、内腔のさらに奥では徐々に緩い層が形成される（Johansson et al, 2008）。したがって、粘液層は腸内細菌叢にとって重要な栄養源であり（Schroeder, 2019; Luis and Hansson, 2023）、微生物叢と免疫系との間の重要なインターフェースである（Paone and Cani, 2020; Wolter et al, 2021a）。
食物繊維を欠乏させた腸内細菌叢が大腸粘液バリアを悪化させるという観察は、複雑または単純化した微生物群集を保有するマウスの間で、研究室を超えて再現されている（Desai et al, 2016; Schroeder et al, 2018; Riva et al, 2019; Neumann et al, 2021; Parrish et al, 2023; Kuffa et al, 2023; Pereira et al, 2024）。さらに、食物繊維を欠乏させた腸内細菌叢が、ヒトの腸管病原性大腸菌や腸管出血性大腸菌の重要なモデル病原体である、付着性・排出性のげっ歯類粘膜病原体Citrobacter rodentium（Neumann et al, 2021; Desai et al, 2016）に対する感受性を高めることも以前に示した（Mullineaux-Sanders et al, 2019）。C. rodentiumのような典型的な自己制限性病原体が、微生物叢を有する繊維質欠乏マウスにおいて致死的大腸炎を引き起こすことは印象的である（Neumann et al, 2021; Desai et al, 2016）。この致死性大腸炎は、食物繊維を欠乏させた無菌マウスでは観察されなかったが、このマウスでも大腸粘液バリアが薄くなり、感受性マウスと同様に病原体が粘膜に侵入する（Desai et al, 2016）。このように、病原体だけでは致死的な表現型を引き起こすことはできず、微生物叢と病原体との相互作用が重要な役割を果たしていることは明らかである。
とはいえ、過剰な粘液分解、病原体感受性の亢進、そして特定の微生物メンバーを結びつけるメカニズムはまだ不明である。食物繊維非存在下で病原体感受性の亢進に関与する特定の細菌や機能を解明するため、ここでは、機能的に特徴付けられた14メンバーの合成ヒト腸内細菌叢を用い、gnotobioticマウスで複数株の脱落実験を行い、群集生態学的アプローチを活用した。我々は、常在微生物であるAkkermansia muciniphilaが、食餌依存的にC. rodentiumの感染動態を調節する上で重要な役割を果たしていることを明らかにした。本研究は、群集生態学の視点を取り入れることで、付着・排出する病原体の病原メカニズムをより深く理解するための貴重な教訓を提供するものである。
研究結果
菌株脱落アプローチにより、腸内感染研究に機能的に関連した群集が得られる
我々は、年齢をマッチさせた無菌のスイス・ウェブスターマウスに異なる合成微生物叢（SM）群集をコロニー形成させ、これらのマウスを標準的な実験用餌（我々は食物繊維リッチ（FR）食と呼んでいる）で飼育した（図1A）。われわれの以前の研究（Desai et al, 2016）に基づき、食物繊維欠乏時のC. rodentiumに対する感受性の亢進に、どのムチン分解細菌がどのように直接関与しているのかを明らかにしようとした。我々は、14SM群集（Desai et al, 2016）から異なる粘液溶解性細菌を除去して、4つの新しいSMをデザインした（図1B）。10SMには、14SMに存在する4種類の粘液溶解性細菌（Akkermansia muciniphila、Barnesiella intestinihominis、Bacteroides caccae、Bacteroides thetaiotaomicron）のいずれも含まれていない（図1B）。11SMは、10SMの全メンバーに加え、ムチンO-糖鎖を唯一の炭素・窒素源として利用できるムチンスペシャリスト細菌であるA. muciniphilaを含む（Derrien et al, 2004; Desai et al, 2016）。12SMは10SMにB. caccaeとB. thetaiotaomicronを加えたもので、両者ともムチン・ジェネラリスト、つまり食物繊維やムチンO-グリカンを含む多くの多糖類で増殖できる（Desai et al, 2016）（図1B）。最後に、13SMにはムチン・スペシャリストのB. intestinihominisに加えて、ムチン・ジェネラリストの両方が含まれているため、A. muciniphilaのみが群集から除外されている。

図1. 図1. Species-dropoutアプローチにより、in vivoで機能的に特徴づけられた明確な合成群集が可能になった。
(A）実験スケジュール。年齢をマッチさせた無菌のスイス・ウェブスターマウスに、異なる合成腸内細菌叢（SM）のいずれかを3日連続で経口投与した。これらのマウスを食物繊維の豊富な（FR）食餌で14日間維持した後、約半数のマウスを食物繊維のない（FF）食餌に切り替えた。マウスはそれぞれの飼料で40日間維持された。この図のすべての読み出し値は、Citrobacter rodentiumに感染する前の40日目のサンプルによるものである。感染後、マウスは最長10日間注意深く観察された。感染していない読み出しについては、両方の飼料について1回（13SM、12SM、11SM）から2回の独立した実験（14SM、10SM）を行った；感染した読み出しについては、両方の飼料についてさらに1回（13SM、11SM）から2回の独立した実験（14SM、12SM、10SM）を行った。(B）5つの異なる合成微生物組成（10SM、11SM、12SM、13SM、14SM）を表す表。あるSMに存在する細菌はプラス（+）記号で表した。(C）非感染マウスの便の16S rRNA遺伝子配列決定によって決定された腸内細菌の相対的存在量。(D）各群におけるムチン分解菌と非ムチン分解菌の相対的割合。(E)FRまたはFF飼料を40日間与えた後の未感染マウスの便の16S rRNA遺伝子配列決定によって決定された腸内細菌の相対存在量のFR/FF倍数変化（14SM FRおよび14SM FFから各4個の外れ値、13SM FFから2個、11SM FFから1個を除去した後、各群につきn = 3-9）。相対存在量の値は、Welch補正およびBenjamini-Hochberg法を用いたp値調整による多重対応のないt検定により解析した。(F）非感染マウス（n＝7-12/群、外れ値なし）の糞便リポカリン-2（LCN-2）濃度（pg/g糞便）。対数変換した濃度を、Benjamini-Hochberg法を用いて、同じ食餌のSM間（図示）および同じSMの食餌間（Source Dataを参照）の多重比較のために調整した二元配置分散分析により分析した。エラーバーはSDを示し、中央は算術平均。(G)非感染マウス（各群n = 7-10、外れ値なし）の結腸長を、Benjamini-Hochberg法を用いて、同一食餌のSM間（図示）および同一SMの食餌間（Source Data参照）で多重比較の調整を行った二元配置分散分析により解析した。エラーバーはSDを示し、中央は算術平均。(H)非感染マウス（各群n = 4、酪酸14SM FFから1つの異常値を除去）の頭皮短鎖脂肪酸（SCFA）濃度。三重測定からの濃度の中央値は、Benjamini-Hochberg法を用いて、同じ食餌のSM間（図示）および同じSMの食餌間（Source Dataを参照）の多重比較を調整した二元配置分散分析により分析した。エラーバーはSDを示し、中央は算術平均。nsは有意ではない（調整後p>0.1）。この図のソースデータはオンラインで入手可能。
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各SM群集の初期コロニー形成は、以前に記載されたように（Desai et al, 2016; Steimle et al, 2021）、14の細菌株それぞれに特異的なプライマーを用いたqPCRによって検証した。マウスをFR食で14日間維持した後、各実験群の約半数のマウスを繊維フリー（FF）食に切り替えた（図1A）；マウスをそれぞれのFR食とFF食で40日間維持した。食餌切り替えから40日後、各群のマウスの一部を犠牲にして、感染前の測定値を収集した（図1A）。16S rRNA遺伝子配列決定（図EV1）により、実験期間を通してSMの異なるメンバーの相対量を測定し、感染前の各グループの平均値を図1Cに示した。1）粘液溶解性細菌であるA. muciniphilaおよび/またはB. caccaeの拡大（SMに存在する場合）、（2）繊維分解性細菌であるEubacterium rectaleおよびBacteroides ovatusの減少（図1CおよびEV1）。これらの微生物の変化により、FF食では非ムチン分解菌の代わりに粘液分解菌の相対的な存在量が全体的に増加し（図1D）、非ムチン分解菌集団の大部分は繊維分解菌であった。

図EV1. コロニー形成、摂食期間、およびCitrobacter rodentium感染による合成微生物叢プロファイル。
繊維リッチ（FR、左パネル）または繊維フリー（FF、右パネル）の餌を与えたマウスにおける14SM、13SM、12SM、11SM、および10SM細菌の相対的存在量。量は、初期コロニー形成後（6～8日目、n=0～9）、飼料変更前（10～13日目、n=4～13）、40日間の給餌期間中（15～53日目、n=3～14）、またはCitrobacter rodentium感染中（54～64日目、n=4～13）の16S rRNA遺伝子配列決定結果から算出した。サンプリング点の数はSMによって異なり、14SMでは31-39点、13SMでは4点、12SMでは33-34点、11SMでは15-16点、10SMでは16-18点であった。
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粘液溶解性細菌がいなくとも、SMはかなり安定した群集を形成しており（図EV1；データセットEV1）、このことは、感染直前の各菌株の飼料間での倍数変化を調べることでさらに強調される（図1E）。異なるSMの組み合わせでも、飼料間で同様の変化が観察された。微生物量のデータから、2つのムチン分解菌のうち、A. muciniphilaとB. caccaeはFF条件下で好まれるか、少なくとも悪影響を受けないようである（図1E）。対照的に、B. thetaiotaomicronとB. intestinihominisは、FF条件下では他のムチン分解菌に駆逐され、相対的に存在量が低下するようである（図1E）。非ムチン分解菌では、Desulfovibrio piger、Clostridium symbiosum、Collinsella aerofaciensもFF条件下で増殖した（図1E）。aerofaciensの場合は、遊離アミノ酸やその他の遊離代謝産物が一次ムチン分解酵素で利用されなかった結果であるか（Fischbach and Sonnenburg, 2011）、D. pigerの場合はムチンの末端硫酸基が遊離した結果である可能性がある（Rey et al, 2013）。これらのうち、C. aerofaciensは多くの炎症性疾患、特に関節リウマチと関連している（Chen et al, 2016a）。また、乳酸、H2、ギ酸を産生することから、D. pigerとの関連も知られており、これらはD. pigerの増殖をサポートし（Rey et al, 2013）、高濃度で粘膜を損傷する可能性のある管腔H2Sの一因となる（Blachier et al, 2021）。
食餌シフトによって誘発される可能性のあるベースラインの炎症の有無を評価するため、低グレードの炎症のマーカーである感染前の糞便中リポカリン-2（LCN-2）濃度を測定した（図1F）（Chassaing et al, 2012）。14SM群、および11SM群と10SM群は、FF食で統計的に意味のあるLCN-2の増加を示した（図1F）。一方、14SM、13SM、12SM群だけが、FF食で有意な結腸短縮を示し、これは炎症のもう一つの肉眼的指標であった（図1G）。このことは、ムチンを分解する微生物が、食物繊維を十分に摂取することによって、炎症を抑制し、上皮バリアーの完全性を促進する可能性があることを強調している。すべてのマウスを直接観察した結果、明らかな疾患の徴候は認められなかったが、これらの結果は、食物繊維の欠乏が低悪性度の炎症を誘発する可能性を示唆しており、その炎症はさらに群集組成に依存しているようである。
腸の恒常性維持（van der Hee and Wells, 2021）およびC. rodentiumに対する感受性（Osbelt et al, 2020; An et al, 2021）の促進における短鎖脂肪酸（SCFA）の重要な役割を考慮すると、微生物SCFA産生のシフトが、感染後のC. rodentiumに対する応答を変化させる可能性があると考えられた。すべてのSM群において、2つの飼料間で酢酸に差は認められなかったが、酪酸濃度は10SMを除くすべての飼料群で有意差が認められた（図1H）。興味深いことに、A. muciniphilaを含む2群（14SMおよび11SM）では、A. muciniphilaが産生する代謝物（Derrien et al, 2004）である糞便中プロピオン酸濃度がFF群で減少した（図1H）。この観察は、A. muciniphilaを欠失させた完全群集（13SM）の結果とは対照的である。これらの結果は、FFマウスではFRマウスに比べて、このムチンスペシャリストの代謝が変化していることを示唆している。重要なことは、我々の株脱落アプローチにより、機能的に関連した安定した群集を得ることに成功したことであり、食物繊維欠乏マウスにおけるC. rodentium感受性の亢進を助ける可能性のある原因ムチン分解微生物を同定できる可能性がある。
A.muciniphilaは繊維質欠乏時のC. rodentium感受性の上昇に関与している。
残りのマウス（感染前測定のために犠牲にしたマウスの後）に、C. rodentiumを109 CFUまで感染させた（図1A）。C.rodentiumに感染したマウスは、感染後10日間（DPI）までモニターした後、最終的な測定値を得るために犠牲にした（図1A）。全体として、FF飼料で40日間飼育した後、14SMコロニー化マウスで以前に報告された病原体感受性の高い表現型を再現することができた（Desai et al, 2016）。同じ食餌でコロニー形成状態間のC. rodentium負荷を比較すると、A. muciniphilaは感染に対する抵抗性を付与する傾向があるが、食物繊維が豊富な条件下で、かつコミュニティ内に他のムチン分解物質が存在しない場合、すなわち11SM条件下でのみ抵抗性を付与するという興味深い結論に達した（図2A,B）。しかし、FF飼料を与えた場合、11SMにコロニー形成されたマウスは、14SM群で観察されたように、C. rodentiumレベルの上昇を示した（図2C,D）。A.muciniphilaを欠く13SM、12SMおよび10SM群も、AUCによるとFF食で病原体負荷量の増加を示し（図2C）、感受性に対する食餌の一般的な影響を反映している可能性がある。

図2. A. muciniphilaは食物繊維欠乏時にC. rodentium感受性を増加させる。
(A)標準的な食物繊維の豊富な(FR)餌を与えたマウスの感染1-10日後(DPI)のgnotobiotic Swiss Websterマウスの糞便中のC. rodentium負荷量をSM組成間で比較した。両飼料について、1 回（13SM および 11SM）から 2 回（14SM、12SM および 10SM）の独立した実験を行った。対数変換 CFU/g は、14SM を多重比較の対照として、マウス ID のマッチング、Geiger-Greenhouse 補正、Benjamini-Hochberg 法による p 値調整を用いた混合効果モデルを用いて解析した。データポイントの数はパネル(D)に示されている；6つの外れ値は除外された。エラーバーはSEM、曲線は算術平均を示す。nsは有意ではない；*は調整後p<0.1；**は調整後p<0.01（正確な値は出典データを参照）。アスタリスクの色は、14SMと比較して有意差を示した群を示す。(B,C）感染後10日間にわたる糞便中のC. rodentium負荷量の曲線下面積（AUC）を、（B）11SMおよび10SM FRマウス、（C）各SMと食餌の組み合わせについて示した。エラーバーはSD、中央は算術平均を示す。(B)SMまたは(C)食餌間でBenjamini-Hochberg法を用いて多重比較の調整を行った二元配置分散分析。欠測値は、隣接する時点の幾何平均を計算するか、欠測値が一連の開始時に発生した場合は隣接する時点の値を仮定することによりインプットされた。サンプリング期間の終わりから≧2の値が欠落している場合、そのマウスはAUC解析から除外した。(n＝6～13/群、異常値除外後：14SM FF、2匹除外；11SM FF、1匹除外；10SM FF、1匹除外）。(D) 感染後1～10日目（DPI）のgnotobiotic Swiss Websterマウスの糞便中C. rodentium負荷量をSMコロニー形成に従ってプロットに分割し、飼料間で比較した。対数変換した CFU/g を、マウス ID によるマッチング、Geiger-Greenhouse 補正、Benjamini-Hochberg 法による p 値調整を用いた混合効果モデルを用いて解析した。各グラフにデータポイント数を示す。6つの外れ値は除外した。エラーバーはSEM、曲線は算術平均を示す。nsは有意でない；*は調整後p<0.1；**は調整後p<0.01；***は調整後p<0.001（正確な値は出典データを参照）。(E) C. rodentium感染時の最大体重減少（n = 4-10/群、外れ値なし）。Benjamini-Hochberg法を用いて、同一食餌のSM間（図示）および同一SMの食餌間（出典データ参照）の多重比較の調整を行った二元配置分散分析により解析。エラーバーはSDを表し、中央は算術平均。(F）10DPIにおける感染マウスの糞便LCN-2濃度（pg/g糞便）（n＝7-8/群、外れ値なし）。対数変換した濃度を、Benjamini-Hochberg法を用いて、同じ食餌のSM間（図示）および同じSMの食餌間（Source Dataを参照）の多重比較のために調整した二元配置分散分析により分析した。エラーバーはSDを示し、中央は算術平均である。(G)10DPIにおける感染マウスの結腸長（n = 10-16/群、外れ値なし）。Benjamini-Hochberg法を用いて、同じ食餌のSM間（表示）および同じSMの食餌間（Source Data参照）で多重比較の調整を行った二元配置分散分析により解析した。エラーバーはSDを示し、中央は算術平均。(H）感染マウスの10DPI（各群n = 8-12）の糞便組織から組織学的に決定された疾患スコアを、Benjamini-Hochberg法を用いてp値を調整した二元配置回帰で解析した。バーは中央値を表す。この図のソースデータはオンラインで入手可能。
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感染後の最大体重減少および感染終了時の糞便中LCN-2は、病原体負荷とほぼ一致しており、14SMおよび11SM群はFF食で有意な体重減少とLCN-2レベルの上昇を示した（図2E,F）。感染後、10SMコロニーマウスは繊維質欠乏時に高いLCN-2レベルを示した（図2F）。これは、感染前のLCN-2レベル（図1F）および食餌に依存した病原体負荷の違い（図2C,D）と一致していることから、これらのデータは、ムチン分解菌の完全な不在もまた、食物繊維欠乏食の状況下で病原体誘発性炎症を増加させる前兆であることを示唆している。感染後の結腸の長さは感染前の状態を反映しており、14SM、13SM、12SM群はFF食で有意な短縮を示した（図2G）。糞便組織の組織学的分析は、14SMおよび11SM群における繊維質欠乏時の最大体重減少を裏付けるものであった；しかしながら、我々はまた、FF食を与えた全群において、FR食に比べて組織学的に疾患スコアの上昇を観察した（図2H）。全体として、我々のデータは、繊維質欠乏の間、粘液溶解性細菌の存在下でC. rodentiumに対する感受性の増加は、単一のムチンスペシャリストであるA. muciniphilaによって悪化することを示している。さらに、他のすべてのムチン分解菌が存在すると、A. muciniphilaの生理的影響が増幅されるようである一方、A. muciniphilaが存在しない場合は、FF食で観察されたC. rodentiumに対する過度の脆弱性を回避するのに十分である。
A.muciniphilaの存在量は食物繊維の存在によって間接的に調節されるため、FF飼料に精製植物多糖であるアセチル化ガラクトグルコマンナン（AcGGM）を7.5％添加した（図EV2A）。AcGGMは、SM群集に存在する酪酸性常在菌であるRoseburia intestinalis（La Rosa et al, 2019b）によって主に分解されるが、これらの細菌の相対的な存在量の増加は検出されず、むしろBacteroides uniformisの拡大が見られた（図EV2A）。前述の酪酸性常在菌の増殖と代謝活性をサポートすることで、脆弱な14SM表現型を救済することを目指したが、AcGGM補充群は14SM FF群と同様のC. rodentium負荷量（図EV2B）、LCN-2レベル（図EV2C）、結腸長（図EV2D）を示した。精製繊維は過剰な微生物ムチンの採食を緩和しないことを示唆する我々の以前の研究（Desai et al, 2016）と一致して、今回の結果は、精製プレバイオティクスの補充は、FF給餌マウスの間で観察されたより高い病原体感受性を防ぐには不十分であるという結論を裏付けるものである。したがって、プレバイオティクスサプリメントが意図した効果を検証するためには、複雑な群集や定義されたコンソーシアムを用いてin vivoで試験することが極めて重要である。

図EV2. アセチル化ガラクトグルコマンナンの補給は、FR飼育マウスの抵抗性表現型を救済するには不十分であり、一方、FF食の短期給餌は感受性表現型を発達させるのに十分である。
(A）7.5％アセチル化ガラクトグルコマンナン（AcGGM）を添加した無繊維（FF）食を与えたマウスにおける14SM細菌の相対的存在量。初回コロニー形成後（8日目）、飼料変更前（13日目）、摂食期間中（15～54日目）、またはC. rodentium感染中の16S rRNA遺伝子配列決定結果から菌量を算出した。10サンプリングポイント、1サンプリングポイントあたりn = 1-5。(B）感染10日間における14SM FR-、FF-およびAcGGM給餌スイス・ウェブスター・マウスの糞便中C. rodentium負荷量（3匹の外れ値を除外した後、各群n = 5-11）。エラーバーはSEM、曲線は算術平均を示す。FFとAcGGM（上部の有意差ラベル、黄色のテキスト）間、またはFFとFR（下部の有意差ラベル、緑色のテキスト）グループ間の多重比較についてBenjamini-Hochberg法を用いて調整した一元配置分散分析。(C）感染最終日の14SM FR-、FF-、AcGGM飼育マウスの糞便中LCN-2濃度（各群n = 4-7、外れ値なし）。エラーバーはSDと算術平均の中心を示す；Benjamini-Hochberg法を用いて多重比較を調整した一元配置分散分析（one-way ANOVA）。(D) 感染最終日の14SM FR-、FF-、AcGGM投与マウスの結腸長（各群n = 10-16、外れ値なし）。エラーバーはSDと算術平均の中心を示す；Benjamini-Hochberg法を用いて多重比較を調整した一元配置分散分析（one-way ANOVA）。(E）短期摂食実験のタイムライン。年齢をマッチさせた無菌のスイス・ウェブスターマウスに、異なる合成腸内細菌叢（SM）のいずれかを3日間連続で与えた。これらのマウスは、食物繊維が豊富な（FR）飼料で少なくとも14日間維持され、その後、マウスはCitrobacter rodentiumに感染させる前に、20日間（FF、n＝3）または5日間（FF、n＝4）のいずれかで食物繊維を含まない（FF）に切り替えられた。感染後、マウスは最長10日間注意深く観察された。(F)感染20日前（左）と5日前（右）に無繊維食を与えたマウスにおける14SM菌の相対的存在量。存在量は16S rRNA遺伝子の塩基配列決定結果から算出した。サンプリングポイントの数は給餌レジメンによって異なり、20日間の給餌期間のFF食では16、5日間の給餌期間のFF食では10であり、1サンプリングポイントあたりn＝1～4匹のマウスを用いた。(G)感染前に5、20、40日間FF飼料を与えた14SMマウスの糞便中C. rodentium負荷量。5日間飼育n=4、20日間飼育n=3、40日間飼育n=12。特定のマウスからは糞便を回収できない日もあった。エラーバーはSEMを、曲線は算術平均を示す；5日間摂食群と40日間摂食群（上の有意性ラベル、青字）間、または20日間摂食群と40日間摂食群（下の有意性ラベル、オリーブグリーン字）間の多重比較をBenjamini-Hochberg法を用いて調整した一元配置ANOVA。N/A、1群ではn = 1のため統計量なし、nsは有意ではない、、調整後p < 0.1、、調整後p < 0.01、、調整後p < 0.001。
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次に、14SMマウスのC. rodentium負荷量を増加させるFF食が、給餌時間を短くした場合にも見られるかどうかを検討した。そこで、5日間または20日間の繊維質欠乏食で、同様の病原体負荷が誘発されるかどうかを試験した。全体として、短いFF食群（5日および20日）のC. rodentium負荷量は、40日間のFF食摂取期間と同等であった（図EV2E-G）。病原体量のわずかな差は、5日群および20日群のサンプリング数が少なかった（それぞれn = 4およびn = 3）ことに起因する可能性が高い。これらの結果は、40日という長い摂食期間による宿主への有害な影響よりも、粘液と微生物の相互作用を含む局所的な微生物叢の影響が、病原体感受性の上昇に決定的な役割を果たしている可能性を示唆している。
A.muciniphilaの感受性増加の背景には、宿主の免疫と病原体の転写産物による反応の違いがあることが示唆された。
A.muciniphilaはその潜在的な免疫調節特性について研究されていることから（Luo et al, 2021; Ansaldo et al, 2019; Ashrafian et al, 2021; Xie et al, 2023; Zhang et al, 2023; Grant et al, 2023; Parrish et al, 2023）、FF飼料上でのA. C. rodentiumの初期増殖は食物繊維の欠乏に大きく影響されるため、我々は3DPIで蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて免疫細胞集団を評価することにした。我々は以前、4DPIまでに病原体が腸組織に侵入することを観察している（Desai et al, 2016）。したがって、3DPIであれば、病原体が完全に侵入する前に、C. rodentiumによって駆動されることが知られている初期の自然免疫応答（Mullineaux-Sanders et al, 2019）を捉えることができると推測した。また、同じ時点（3 DPI）を用いて、宿主の大腸と微生物の両方のトランスクリプトームを研究した。我々の以前の研究（Desai et al, 2016）との比較を容易にするため、本研究でも引き続き40日間のFF摂食期間を本研究以降の実験に用いた。
全体として、食物繊維欠乏下ではさまざまな免疫細胞集団が同様の傾向を示したが、多重比較で補正した結果、ほぼすべての比較は統計的に有意ではなかった（図EV3A,B）。特に、RORγt陽性Tヘルパー細胞集団（CD4+RORγt+）は、FF食群ではFR食群に比べて有意に減少していた（図3A）。Th17細胞はC. rodentiumのクリアランスに不可欠な役割を果たしていることから（Atarashi et al, 2015）、これらのデータは、14SM FR群と比較して14SM FF食群で観察された病原体感受性の上昇の一因として、Th17誘導の欠如が考えられることを指摘している。しかし、14SMと13SMを同じ食餌で比較したところ、今回評価した免疫細胞集団の割合に統計的に有意な変化は見られなかった。

図3. 宿主の免疫応答と病原体のトランスクリプトームから病原体感受性の増加の要因を探る。
(A）蛍光活性化セルソーティング（FACS）により測定した、3DPI時点のマウス（各群n = 5-6、外れ値なし）の親個体群に対する選択免疫細胞集団の割合。ゲーティング戦略については図EV3Bを参照。母集団のパーセンテージは、Benjamini-Hochberg法を用いて、同じ食餌のSM間（図示）および同じSMの食餌間（Source Dataを参照）の多重比較を調整した二元配置分散分析（主効果のみ）により分析した。エラーバーはSDを示し、中央は算術平均。(B) 3DPIにおけるマウスの大腸組織転写産物を実験グループごとに分けた主成分分析（PCA）プロット。(C）3DPIにおけるC. rodentium転写産物の実験グループ別PCAプロット。(D) 3DPIにおけるマウス宿主遺伝子の大腸組織における転写のボルケーノプロット。DESeq2のBenjamini-Hochberg法を用いて調整したWald検定に基づく調整p値<0.05に基づく有意性。全結果はデータセットEV3を参照。(E)3DPIにおける糞便内容物のC. rodentium遺伝子転写のボルケーノプロット。DESeq2のBenjamini-Hochberg法を用いて調整したWald検定に基づく調整p値<0.05に基づく有意性。全結果はデータセットEV5を参照。全結果はデータセットEV5を参照。
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図EV3. C. rodentium感染後、宿主免疫細胞集団は食餌群間でほとんど変化しない。
(A）蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって決定された、3DPIにおけるマウスの親個体群に対するパーセンテージとして、有意に変化しなかった免疫細胞集団。母集団パーセンテージは、Benjamini-Hochberg法を用いて、同じ食餌のSM間（図示）および同じSMの食餌間（Source Data参照）の多重比較を調整した二元配置分散分析（主効果のみ）により分析した（13SM FF CD + GATA3+群の外れ値1個を除外した後、群あたりn = 4-6）。エラーバーはSDと算術平均の中心を示す；nsは有意ではない（調整後p>0.1）。(B）FACS解析のゲーティング戦略。
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病原体感受性の調節におけるA. muciniphilaの役割をさらに調べるために、13SMおよび14SMマウスの両食餌群において、マウスの大腸組織（3DPI）とC. rodentiumの転写産物（3DPI、微生物メタトランスクリプトミクスデータより）の両方を解析した。FACSデータと同様に、宿主のトランスクリプトームデータにはかなりのばらつきがあった。そのため、主成分分析（PCA）プロットでは、グループによる明確なクラスタリングは観察されなかった（図3B）。対照的に、C. rodentiumの転写産物は食性に基づく明確なクラスタリングを示した（図3C）。宿主転写産物数の解析（データセットEV2）では、4つのグループ間で転写が異なる遺伝子は限られていた（データセットEV3）。13SM群では、FR群で19個、FF群で8個の宿主遺伝子が発現上昇した（図3D；データセットEV3）。一方、14SM群では、9個の宿主遺伝子がFR食で、13個の宿主遺伝子がFF食で発現上昇した（図3D；データセットEV3）。FF食マウスで上昇した自然免疫応答に関与する補体因子C4bと、FR食マウスで上昇した病原性骨髄細胞活性化の主要な制御因子Klf6の2つの転写産物だけが、13および14SM群の両方で有意に変化した（Dataset EV3）。同じ食物繊維欠乏条件下でA. muciniphilaの存在による影響を評価したところ、14SM FF群では免疫グロブリン産生（Igkv12-89、Igkv1-110）と亜鉛恒常性（Slc39a4）に関与する転写産物が濃縮された。全体として、宿主のトランスクリプトーム・プロファイルから、FF飼育の14SMマウスがC. rodentiumに感染しやすくなった理由については、限定的な説明にとどまった。
宿主のトランスクリプトームデータから感染感受性が変化している証拠が得られなかったので、次にC. rodentiumのトランスクリプトームプロファイルの変化（データセットEV4）から、より深い洞察が得られるかどうかを検討した。その結果、C. rodentiumの遺伝子発現に食餌特異的な変化が多数確認された。しかし、同じFF食餌背景（13SM FF vs 14SM FF）において、A. muciniphilaの存在はC. rodentiumの転写に影響を与えなかった（図3E；データセットEV5）。C. rodentiumの転写産物データには、特に13SM FR群における多数のファージ型遺伝子の転写など、興味深い観察結果もあるが、腸管細胞排出遺伝子座（LEE）病原性アイランドにコードされる遺伝子の転写産物は、どの条件下でもC. rodentiumのトランスクリプトームでは変化しなかった（データセットEV5）。
まとめると、宿主の免疫系とトランスクリプトーム、および病原体のトランスクリプトームは、A. muciniphilaがFF食の状況下でC. rodentiumに対する感受性をどのように変化させるかについて、明確な手がかりを得ることはできなかった。しかしながら、13SM FFマウスと14SM FFマウスでは、病原体に対する感受性が著しく異なるにもかかわらず、病原体と宿主の反応は同じであることが明らかになった。したがって、これらの結果は、A. muciniphila自身の応答の変化と、それに伴う他の群集メンバーの応答の変化が、FF飼育マウスにおけるC. rodentiumに対する感受性を高める上で重要な役割を果たしている可能性が高いことを示唆している。
食物繊維を除去されたA. muciniphilaは粘液の浸透性を高め、群集の活動を変化させる。
我々は以前、食物繊維欠乏時には14SM群集の粘液層が薄くなるという特徴を示した（Desai et al, 2016）。40日間FF飼育した非感染マウスにおいて、本研究ではこの表現型を検証し、さらに13SM FR飼育マウスでは粘液の厚さが一般的に高いため、その差はより顕著であるが、13SM群でも同様の傾向があることを示した（図4A）。粘液層の厚さに加えて、その完全性も重要である（Schroeder et al, 2018）。そこで、細菌サイズのビーズ（1μm）を用いて粘液の浸透性を測定した（図4B）。その結果、14SM FF群ではFR群に比べて大腸粘液層の浸透性が上昇していることが観察され、これは一対比較で有意であった（p = 0.046）が、調整後のp値は従来のカットオフ値である0.05を超えていた（図4B）。しかし、多重比較の補正前でも補正後でも、13SM群間に差はなかった（図4B）。このことは、A. muciniphilaがFF条件下でC. rodentiumの感受性を高める可能性のあるメカニズムを示唆している。したがって、特定の微生物組成（13SMまたは14SM）のFR群とFF群の粘液透過性の直接比較における有意な傾向（p = 0.046）を無視すべきではない。この結果は、宿主のムチン分泌や糖鎖形成の変化、あるいは常在細菌叢による分解の変化に起因する粘液の完全性の変化を示唆している。粘液層の厚さと比較した粘液層の完全性の重要性は、無菌マウスにおける我々の先行研究によってさらに強調されている。無菌マウスは、粘液層が薄いにもかかわらず、14SM FR飼育マウスに匹敵するC. rodentium感染に対する食餌非依存性抵抗性を示す（Desai et al, 2016）。

図4. 食物繊維の欠乏が誘発する腸粘液層の侵食は、C. rodentium感受性の増加を部分的に説明する。
(A) Muc2抗体染色に基づく、繊維リッチ（FR）および繊維フリー（FF）食の非感染13SMおよび14SMマウスの粘液厚（各群n = 4-8）。エラーバーはSDと算術平均の中心を表す；Benjamini-Hochberg法を用いて、同じ食餌のSM間（表示）および同じSMの食餌間（出典データ参照）の多重比較を調整した二元配置分散分析（主効果のみ）。(B）非感染マウスでの生体外粘液層浸透性評価。正規化したビーズ浸透性の曲線下面積（AUC）を、各マウス（14SM FRから外れ値を1つ除去した後、各群につきn＝7〜9）について決定した。エラーバーはSDと算術平均の中心を表す；Benjamini-Hochberg法を用いて、同じ食餌のSM間（表示）および同じSMの食餌間（ソースデータ参照）の多重比較を調整した二元配置分散分析（主効果のみ）。nsは有意ではない（調整p＞0.1）。(C）14SMおよびC. rodentiumゲノムへの糞便RNAリードのマッピング率（食餌およびSM群ごとの平均値）。(D)HUMANn3を用いたUniRef90によるムチン標的酵素（シアリダーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、スルファターゼ、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ、α-l-フコシダーゼ）の遺伝子にマッピングされた転写産物の正規化数（100万リードあたり）（n = 4/群、外れ値なし）。エラーバーはSDと算術平均の中心を表す；Benjamini-Hochberg法を用いて同一食餌のSM間および同一SMの食餌間の多重比較を調整した二元配置分散分析（主効果のみ）。この図のソースデータはオンラインで入手可能。
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FF食とA. muciniphilaの存在が、C. rodentiumの感受性に間接的に関係しているかどうか、すなわち他の群集メンバーへの影響を通して関係しているかどうかを評価するために、FR食またはFF食を与えた13SMマウスと14SMマウスの各細菌の存在量について一対相関分析を行った（図EV4）。その結果、2つの食餌の間、あるいは13SMマウスと14SMマウスの間で変化した、統計的に有意な細菌量の共相関が多数同定されたが、A. muciniphilaとC. rodentiumの両方に共通する正の相関を同定することはできず、14SM FF食マウスにのみ存在し、それによって感染感受性の増加を説明する可能性があった。しかし、Marvinbryantia formatexigensとA. muciniphila（r = -0.171、調整後p = 0.03）およびC. rodentium（r = -0.232、調整後p < 0.01）の間には有意な負の相関が認められ、これは14SM FFマウスでのみ観察されたことから、アセトジェンであるM. formatexigensがFRおよび13SM条件下で感染に対する何らかの防御をもたらす可能性が示唆された。

図EV4. 共存量相関に対する食餌と群集組成の異なる影響。
全タイムポイント（14 FR、n = 177; 14SM FF、n = 200; 13SM FR、n = 20; 13SM FF、n = 19）におけるデータセットEV1の相対存在量の相関行列とネットワーク。マトリックス（左下）には、すべての相関が示されている。相関はピアソン法を用いて計算した。ネットワークプロット（右上）では、｜r｜＞0.2の相関のみを示す。
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A.muciniphilaの役割をさらに調べるために、感染マウスの微生物メタトランスクリプトームデータを解析した（図3でC. rodentiumの転写産物を解析したデータと同じ）。FF食では、FR食に比べてA. muciniphilaにマップされる転写産物の割合が12倍高かった（図4C）。特にムチン標的酵素に注目すると、シアリダーゼとα-N-アセチルガラクトサミニダーゼの発現は、FFマウスではFRマウスに比べて有意に高かった（図4D）。しかしながら、14SMと13SMのFFマウスを比較すると、ムチン標的酵素にマッピングされた転写産物の全体的なレベルは、A. muciniphilaの存在下では変わらなかった。これらの結果は、感染に抵抗性を示すグループ（13SM FF）でも観察されることから、粘液層の微生物の過剰採食だけではC. rodentiumの感受性の違いを説明するには不十分であるという結論を支持する上で重要である。
グループ間の明確な違いはA. muciniphilaの有無だけであったため、この分類群内の転写における有意な変化を同定するためにメタトランススクリプトームに戻った。FRマウスとFFマウスの間でA. muciniphilaにマップされる97の転写産物のうち、21は仮説的タンパク質、すなわち機能未知タンパク質であった（図5A）。より標的を絞ったアプローチをとると、FF飼育マウスでは、IL-10の誘導を介して抗炎症特性を持つことが報告されている転写産物、すなわちピリ様タンパク質をコードするUniRef90_B2UR41またはAmuc_1100（Ottman et al, 2017）と、スレオニン-tRNAリガーゼをコードするUniRef90_A0A139TV36（Kim et al, 2023）が増加していた（図5B）。これらは自己免疫疾患の治療において有望な微生物由来因子であるが、腸管病原体感染の文脈では免疫抑制作用が有害である可能性がある。

図5. セカルメタトランスクリプトームは、変化したコミュニティ活動と持続的な機能的知識のギャップを浮き彫りにする。
(A）14SMファイバーリッチ（FR）マウス（Citrobacter rodentium耐性）と14SMファイバーフリー（FF）マウス（C. rodentium感受性）の感染3日後（DPI）の糞便内容物におけるAkkermansia muciniphila転写のボルケーノプロット。DESeq2のBenjamini-Hochberg法を用いて調整したWald検定に基づく調整p値<0.05に基づく有意性。 (B) HUMANn3のUniRef90識別子に基づく3DPIにおける14SM FRマウスおよび14SM FFマウスの糞便内容物中のA. muciniphilaによって転写された既知の免疫調節遺伝子産物のドットプロット。左：Pili様膜タンパク質Amuc_1100。右：スレオニン-tRNAリガーゼ。エラーバーはSD、中央は算術平均。各転写物に帰属する100万リードあたりのコピー数、p値はWelchのt検定を用いて計算。(C)14SMコミュニティの各メンバーとC. rodentiumのグループごとの比較において、DESeq2を用いて差次的に発現した遺伝子の数を示す棒グラフ。(D)左：DESeq2のBenjamini-Hochberg法で調整したWald検定に基づく調整p値<0.05で有意な上位25遺伝子のヒートマップ（DESeq2のBenjamini-Hochberg法で調整したWald検定に基づく調整p値が低い順にソート、すべて<0. 05)、感受性条件(14SM FF)と比較したすべてのC. rodentium耐性グループ(14SM FR、13SM FR、13SM FF)について、HUMANn3のUniRef IDから再グループ化したPfam識別子に従って差次的に発現した遺伝子。アバンダンスはオートスケール（平均を中心にし、標準偏差で割った）。右：各食餌およびSMグループにおける、各Pfamに帰属する100万リードあたりのコピー数。基礎データはデータセットEV6を参照。すべてのパネルで、n = 4/グループ、外れ値はなし。この図のソースデータはオンラインで入手可能。
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最後に、Weissら（Weiss et al, 2023）によってエレガントに実証されたように、細菌群集の動態は、栄養条件と他の主要なコンソーシアムメンバーの存在の有無の両方に大きく依存する。全体として、差次発現遺伝子（DEG）の総数は、FF食を与えた13SMマウスと14SMマウスでは、FR食を与えた同じSMマウスよりも少なく、群集全体の活性に食餌が強く影響していることが浮き彫りになった（図5C）。FF飼料を与えたマウスのうち、Bacteroides属、C. symbiosum、C. aerofaciens、大腸菌は、図EV5に詳述したように、A. muciniphilaの不在に最も反応するように見えた。この解析の限界は、たとえ同じ産物をコードしていても、ゲノム中の各遺伝子座が独立して扱われていることである。例えば、TonB依存性レセプターに対応する転写産物は、B. ovatusゲノムの異なる遺伝子座に対応するため、13SM FFと14SM FFで同時に差次発現する（図EV5）。そこで、ユニークな遺伝子産物による差分発現を計算するために、HUMANn3を用いてリードを14SM plus C. rodentiumのカスタムデータベースにマッピングし、一貫した命名法のために、非階層化出力をPfamデータベース（Mistry et al, 2021）に再グループ化した（Dataset EV6）。再度、非感受性表現型と感受性（14SM FF）表現型の間で発現が異なる遺伝子産物を、層別化されていないデータに基づいて同定し、層別化された出力に従って可視化した（図5D）。ここでは、変化した転写プロファイルをより詳細に見ることができ、特にA. muciniphila由来の転写産物の寄与が大きい。また、タンパク質ファミリーの多くが、酸化ストレスに対抗する機能（PF00667、PF00724、PF10417）、糖新生（PF00821、PF17297）、またはタンパク質分泌に関与する機能（PF12951、PF00482）に対応していることに注目されたい（図5D）。

図EV5. 繊維枯渇マウスにおけるA. muciniphilaの存在によって変化した細菌トランスクリプトーム。
13SM FFと14SM FFの対比で10以上のDEGを持つ合成微生物叢メンバー（B. caccae、B. ovatus、B. thetaiotaomicron、B. uniformis、C. symbiosum、C. aerofaciens、およびE. coli）のボルケーノプロット。13SMのFFマウス（C. rodentium耐性）と14SMのFFマウス（C. rodentium感受性）の3DPIの糞便内容物からRNAを抽出し、Salmonで指定されたゲノムに個々にマッピングした。4検体で2.5cpm未満のフィーチャーはフィルタリングで除外した。有意性はDESeq2のBenjamini-Hochberg法で調整したWald検定による調整p値<0.05に基づく。GH glycoside hydrolase、OMP outer membrane protein、RT reverse transcriptase。
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14SM FF飼育マウスで観察されたC. rodentium感染感受性の増加は、食事やマイクロバイオームだけに起因するものではなく、むしろ感染を支持する局所環境を作り出す両方の要因に依存している（図6）。宿主と病原体は、食餌やSMに関係なく、それぞれ感染に対する自然免疫反応を起こしたり、病原性因子を発現して感染を成立させたりと、予想通りの行動をとる。この戦いの勝敗を決める決定的な要因はマイクロバイオームにあり、マイクロバイオームは宿主や病原体とは異なり、食餌やマイクロバイオームに依存した形で遺伝子発現を変化させる。最終的に、我々は菌株の脱落を利用することで、単一のムチン分解細菌であるA. muciniphilaが、食餌依存的に病原体の感受性を調節する上で極めて重要な役割を果たしていることを発見した（図6）。

図6. Citrobacter rodentium感染に対する微生物叢と食餌依存性の感受性の背景には、粘膜の完全性の低下と群集動態の変化がある。
ムチン分解細菌A. muciniphilaが食物繊維欠乏食を与えたマウスのC. rodentium感受性の影響を視覚的に示した図。これらの条件下では宿主の免疫応答と病原体活性は変化しないが、粘膜バリアーの低下（14SMでは食物繊維のない条件下で大腸粘液バリアーが薄くなり、粘液透過性が増加したことで図示）、常在腸内細菌間の相互作用の変化を反映したメタ転写プロファイルの変化（食物繊維のない14SMでは細菌間の赤破線で図示）により、これらの因子の組み合わせが観察された疾患表現型に寄与していることが示唆される。14SM 14メンバーの合成微生物叢、13SM 13メンバーの合成微生物叢（Akkermansia muciniphilaを欠く）。BioRender.comを用いて作成。
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考察
食物繊維の摂取は、無数の健康上の利益をもたらすことがよく知られている（Sonnenburg and Sonnenburg, 2014; Makki et al, 2018; Gill et al, 2021; Wolter et al, 2021a）。さらに、食物繊維の摂取は、腸粘液層を侵食し病原体感受性を高めるムチン分解への腸内細菌叢の機能的シフトを回避するために不可欠である（Desai et al, 2016; Neumann et al, 2021）。微生物叢の機能的に関連するメンバーの存在を操作することによって、我々の研究は、腸内病原体感染に対する感受性の多因子性および生態学的性質についての洞察を提供する。重要なことは、A. muciniphilaを唯一のムチン分解菌として合成微生物叢に加えることで、食物繊維が十分な食餌条件下でC. rodentiumのコロニー形成を防御できることである。しかし、我々はまた、食物繊維が不足した食餌でも、A. muciniphilaを除去することで感染に対する抵抗性が得られることも示した。A. muciniphilaは腸粘液層の劣化に寄与し（図4B）、他の腸内コミュニティメンバーの活動を変化させる（図4C,D）。我々の研究は、微生物叢-病原体-宿主の軸における可能性のあるメカニズム的つながりを解明するために、定義されたコンソーシアム内での菌株脱落アプローチが威力を発揮することを強調している。
興味深いことに、食物繊維の欠乏した微生物叢による粘液バリアーの低下だけでは、腸内病原体に対する感受性を高めるには不十分である。本研究では、A. muciniphilaをバイオマーカー種とみなすことができる。なぜなら、食物繊維が欠乏した食餌条件下でのA. muciniphilaの有無が、C. rodentium感染の経過を決定するからである。A. muciniphilaを保有する食物繊維不足の社会では、粘液バリアへの侵入性が高まるため、感受性の亢進を助長する微生物抗原の流入が増加すると考えられる。さらに、粘液溶解性細菌の有益な側面も明らかである。4つの粘液溶解性細菌がすべて存在しない場合、病原体感受性のマーカーが増加することに気づいたが、これはおそらく粘液溶解性細菌が完全に存在しない場合、粘液バリア機能が未熟なためであろう。
A.muciniphilaは潜在的なプロバイオティクス細菌とみなされており（Zhai et al, 2019; Ashrafian et al, 2021; Cani et al, 2022; Daniel et al, 2023）、腸管外自己免疫疾患にも関連している（Miyauchi et al, 2023）ため、この微生物を用いたプロバイオティクス療法を設計する際には、腸内微生物群集の他のメンバーの活性に対するこの細菌の影響や、異なる食事療法下での影響を考慮する必要がある。実際Maoらは、マウスにグリコサミノグリカンポリマーのヒアルロン酸を通常の食事で与えると、マイクロバイオームの様々なメンバーの存在量に影響を与え、特にA. muciniphilaが濃縮され、それがC. rodentium感染に対する防御をもたらすことを示している（Maoら、2021）。A.muciniphilaは、食物繊維が十分な食事では病原体の量を減らし、食物繊維がない場合には病原体の感受性を悪化させるという、相反する興味深い観察結果は、食事の状況によって、この細菌が有益にも有害にもなり得るという、微妙で広く見過ごされている概念を強調している。この観察は、A. muciniphilaの健康への影響を合理的に考慮する必要があるという他の研究者たちの見解と呼応している（Cirstea et al, 2018; Luo et al, 2022）。我々の微生物トランスクリプトーム解析は、A. muciniphilaが2つの食餌で異なる挙動を示し、仮説的タンパク質をコードする多くの転写遺伝子が異なることを強調している。未解決の重要な問題は、これらの異なる発現遺伝子産物のどれが病原体感受性を変化させる上で重要な役割を果たしているかということである。
今後の研究課題としては、粘液透過性の向上とA. muciniphilaの異なる転写遺伝子との関連を理解することである。考えられる説明の一つは、繊維不足の条件下でA. muciniphilaがピリ様タンパク質（Ottman et al, 2017）とスレオニンtRNAリガーゼ（Kim et al, 2023）の発現を増加させることで、病原体に対する脆弱性を増加させるように免疫系を調整する可能性があるということである。前述の成分の場合、IL-10の誘導は、最終的に病原体感受性の悪化に寄与する有害な免疫反応を表しているのかもしれない。実験用マウスの微生物組成の違いは、SCFAの産生量の変化を通じて、C. rodentium感染に対する感受性に影響を与える可能性がある（Osbelt et al, 2020）。A.muciniphilaが産生するSCFAであるプロピオン酸の減少（Derrien et al, 2004）が、A.muciniphila含有FF飼育マウスで観察されたことから、食物繊維を欠乏させたA.muciniphilaの代謝の変化が病原体感受性の上昇に寄与している可能性がある。総合すると、食物繊維を欠乏させたA. muciniphilaがC. rodentiumに対する感受性を変化させる分子メカニズムには、複数の独立した要因が関与している可能性がある。
A.muciniphilaがどのようにして食餌依存的に疾患感受性を変化させるのか、個々の分子メカニズムの寄与を正確に解読するための次のステップは、例えばDaveyら（Davey et al, 2023）によって紹介されたようなトランスポゾン変異体を用いた遺伝学的システムの導入である。特に、粘液溶解性細菌による腸粘液の分解は、粘液溶解性細菌自身または腸内細菌叢の他のメンバーによって代謝されうる糖鎖残基を放出することを考慮すると（Belzer et al, 2017; Crost et al, 2018; Raimondi et al, 2021）。最近、ムチン糖タンパク質に存在する糖であるシアル酸が、C. rodentiumの管腔から粘膜への移行を助けるのに重要な役割を果たしていることが示された（Liang et al, 2023）。遊離シアル酸を直接測定したわけではないが、FF飼料を与えたマウスではシアル酸分解酵素の転写産物が増加していることから（図4D）、食物繊維が欠乏した条件下で微生物の活動が変化した結果、より多くのシアル酸が利用可能になった可能性が示唆される。さらに、A. muciniphilaはムチンを分解する際にシアル酸を放出することができるが、シアル酸だけでは生息できないことから、A. muciniphilaはこの化合物を増殖には利用しないことが示唆される（Shuoker et al, 2023）。従って、FF食とA. muciniphilaの存在が組み合わさることで、シアル酸の利用可能性が最も高くなり、その結果C. rodentiumの侵入が促進されるという説が有力である。別の最近の研究では、L-セリンの食事制限によってA. muciniphilaによるムチン分解が促進され、付着性侵入性大腸菌（AIEC）の上皮ニッチへの侵入が促進され、そこで病原体が上皮から宿主のL-セリンを獲得して増殖することが示された（Sugihara et al, 2022）。A. muciniphilaとC. rodentiumの代謝的相互作用の可能性を検証するためには、今後の研究が必要である。
高脂肪食がC. rodentiumに対する感受性にどのように影響するかを示した以前の研究（An et al, 2021）と同様に、本研究は、食習慣の変化によって微生物の生態や特定の重要な分類群の有無が疾患感受性にどのように影響するかを明らかにした。先進工業国の多くで食物繊維の摂取量が成人の推奨摂取量である25g/日を下回っていることから（欧州食品安全機関、2010年）、この動態における食生活の役割は特に重要である。A. muciniphilaは、腸内病原体感染に対する感受性を予測するために使用できる可能性のあるバイオマーカーのひとつに過ぎない可能性が高い。このようなバイオマーカー種をさらに特定し、疾患感受性におけるその役割を食事によってどのように変化させることができるかを理解することは、食品供給システムの変化と抗菌剤耐性という二重の脅威に直面して迫り来る課題である、ヒトの食品由来腸病原体感染症の負担を軽減するのに役立つ重要なツールであることが証明される可能性がある（Willett et al, 2019）。
方法
試薬とツールの表
試薬／リソース
参考文献または出典
識別子またはカタログ番号
実験モデル
スイス・ウェブスター（Musculus）雌雄、6-8週齢
タコニックバイオサイエンス
Tac:SW
アッカーマンシア・ムチニフィラ DSM 22959, タイプ株
DSMZ
カタログ番号 DSM 22959
バクテロイデス・カッカエ DSM 19024、タイプ株
DSMZ
カタログ番号 DSM 19024
バクテロイデス・オバタス DSM 1896、タイプ株
DSMZ
カタログ番号 DSM 1896
バクテロイデステタイオタミクロン： DSM 2079、タイプ株
DSMZ
カタログ番号 DSM 2079
バクテロイデス・ユニフォーミス ATCC 8492、タイプ株
ATCC
カタログ番号 ATCC 8492
バルネシエラ・インテスティニホミニス YIT11860
DSMZ
カタログ番号 DSM 21032
クロストリジウム・シンビオサム DSM 934、タイプ株、2
DSMZ
カタログ番号 DSM 934
Collinsella aerofaciens: DSM 3979, タイプ株
DSMZ
カタログ番号 DSM 3979
デスルホビブリオ・ピガー ATCC 29098、タイプ株
ATCC
Cat # ATCC 29098
大腸菌 HS
ATCC
該当なし
Eubacterium rectale： DSM 17629、A1-86
DSMZ
カタログ番号 DSM 17629
フェカリバクテリウム・プラウスニッツィー： DSM 17677、A2-165
DSMZ
カタログ番号 DSM 17677
Marvinbryantia formatexigens： DSM 14469, タイプ株, I-52
DSMZ
カタログ番号 DSM 14469
Roseburia intestinalis： DSM 14610、タイプ株、L1-82
DSMZ
Cat # DSM 14610
抗体
ラット抗マウス CD16/CD32 (マウス BD Fc Block™)
BD バイオサイエンス
Cat # 553141 RRID: AB_394656
BV605 標識ラット抗マウス CD4、モノクローナル RM4-5, 1:700
バイオレジェンド
Cat # 100548 RRID: AB_2563054
BV650標識ラット抗マウス CD45R/B220、モノクローナル RA3-6B2、1:88
BD バイオサイエンス
Cat # 563893 RRID: AB_2738471
BV711 標識ラット抗マウス CD3、モノクローナル 17A2, 1:88
バイオレジェンド
Cat # 100241 RRID: AB_2563945
BV780 標識ラット抗マウス CD45、モノクローナル 30-F11, 1:88
BD バイオサイエンス
Cat # 564225 RRID: AB_2716861
FITC標識ラット抗マウス CD335/NKp46、モノクローナル 29A1.4, 1:100
バイオレジェンド
Cat # 137606 RRID: AB_2298210
PE-Cy5 標識ラット抗マウス CD8、モノクローナル 53-6.7, 1:700
バイオレジェンド
Cat # 100710 RRID: AB_312749
eFluor™ 450 標識ラット抗マウス FoxP3, モノクローナル FJK-16s, 1:200
インビトロジェン eBioscience™
Cat # 48-5773-82 RRID: AB_1518812
PE 標識マウス抗マウス GATA3, モノクローナル 16E10A23, 1:44
バイオレジェンド
Cat # 653804 RRID: AB_2562723
PE-eFluor™ 610 標識ラット抗マウス EOMES モノクローナル Dan11mag, 1:100
インビトロジェン eBioscience™
Cat # 61-4875-82 RRID: AB_2574614
PE-Cy7 標識マウス抗マウス Tbet、モノクローナル 4B10、1:44
バイオレジェンド
Cat # 644824 RRID: AB_2561761
APC 標識ラット抗マウス RORγt、モノクローナル AFKJS-9, 1:22
インビトロジェン eBioscience™ 社
Cat # 17-6988-82 RRID: AB_10609207
オリゴヌクレオチドおよび配列ベースの試薬
合成微生物種プライマー
Desai et al, 2016
該当なし
V4 16S rRNA遺伝子プライマー
Kozichら、2013
該当なし
化学物質、酵素、その他の試薬
ゾンビ NIR ™ 固定可能生菌キット
バイオレジェンド
カタログ番号 423106
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNaseフリー蒸留水
フィッシャーサイエンティフィック
Cat # 10358742
LB 寒天（ルリア/ミラー）
カール・ロート
Cat # X969.1
トリプトン酵母エキスグルコース（TYG）
Desai et al, 2016
該当なし
硫酸還元菌用改変バール培地
Desai et al, 2016
該当なし
カスタムチョップドミートブロス
Desaiら、2016
該当なし
改良酵母エキス・カシトン・脂肪酸（YCFA）培地（USAバージョン）
Desai et al, 2016
該当なし
改変酵母エキス・カシトン・脂肪酸（mYCFA）培地（ルクセンブルグバージョン）
Steimle et al, 2021
該当なし
ハンクス緩衝生理食塩水（HBSS）、フェノールレッド入り、カルシウム・マグネシウムなし
Lonza
カタログ番号 10-543F
メタノール
カール・ロート
カタログ番号 4627.6
酢酸100
カール・ロス
カタログ番号 6755.1
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1) pH 8.0
フィッシャーサイエンティフィック
カタログ番号 10535691
ガラスビーズ、酸洗浄
Sigma Aldrich
カタログ番号 G1277
ドデシル硫酸ナトリウム
フィッシャーサイエンティフィック
カタログ番号 BP166
クロロホルム
フィッシャーサイエンティフィック
Cat # 10122190
イソプロパノール
フィッシャーサイエンティフィック
Cat # 10477070
エタノール
VWR
Cat#1.08543.0250
DNeasy 血液・組織キット
QIAGEN
Cat # 69506
RNAprotect™ 組織試薬
QIAGEN
カタログ番号 76104
TRIzol™ 試薬
インビトロジェン
Cat # 15596018
DNase I、RNaseフリー
サーモサイエンティフィック
カタログ番号 EN0521
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (125:24:1) pH 4.3
フィッシャーバイオ試薬
Cat # 10699543
RNAProtect™ バクテリア試薬
QIAGEN
カタログ番号 76506
RNeasy ミニキット
QIAGEN
カタログ番号 74104
SYBR™ Green I 核酸ゲル染色、DMSO 中 10,000 倍濃縮溶液
インビトロジェン
Cat # 10710004
dNTPセット（100 mM）溶液
インビトロジェン
Cat # 10083252
SYTO-9 緑色蛍光核酸染色液
インビトロジェン
カタログ番号 S34854
FluoSpheres™ カルボン酸ビーズ（1 µm、赤 580/605）
インビトロジェン
Cat # F8821
ソフトウェア
イメージJ
https://imagej.net
該当なし
SoftMax Pro 7 ソフトウェア
モレキュラーデバイス
該当なし
CFX Maestro 1.1 v4.1.2433.1219
バイオラッド
該当なし
NovoExpress v1.6.2
アジレント
該当なし
FlowJo v10.8.1
BDバイオサイエンス
該当なし
プリズム v10.1.2
GraphPad Software, Inc.
該当なし
モサー v1.44.1
Schlossら、2009
該当なし
サーモン v1.6.0
Patroら、2017
該当なし
DESeq2 v1.30.1
Love et al, 2014
該当なし
humann v3.1.1
Beghiniら、2021
該当なし
ニーダデータ
https://github.com/biobakery/kneaddata
該当なし
ゼン3.0
カールツァイスマイクロスコピー社
該当なし
イマリス
オックスフォード・インストゥルメンツイマリス
該当なし
バックスペース
アールら、2015
該当なし
その他
標準的な実験食（食物繊維豊富、FR）
ラボダイエット
Cat # 5013
アセチル化ガラクトグルコマンナン（AcGGM）飼料
エンビゴテクラド
該当なし
Harlan.TD08810（ルクセンブルク版）に基づくファイバーフリー（FF）食
セーフダイエット
該当なし
Harlan.TD08810（米国版）に基づく食物繊維フリー（FF）食
Envigo-Teklad
Cat # TD.130343
嫌気チャンバー
コイ製造
ビニールタイプA + タイプB
ステンレスビーズ、5 mm
QIAGEN
カタログ番号 69989
レッチ MM 400
フィッシャーサイエンティフィック
カタログ番号 10573034
PTFE アダプターラック
フィッシャーサイエンティフィック
Cat # 10122852
インプレンナノフォトメーター N60 マイクロボリューム UV-VIS 分光光度計
フィッシャーサイエンティフィック
Cat # 15442203
CFX96TM リアルタイムシステム（C1000 サーマルサイクラー）
Biorad
Cat # 1855195
Quick-16S™ NGSライブラリー調製キット
ベースクリア
Cat # D6400
MiSeq試薬キットv2
イルミナ
カタログ番号 MS-102-2003
イルミナMiSeq
イルミナ
Cat # SY-410-1003
アジレント 2100 バイオアナライザ
アジレント
Cat # AG-2100
アジレント RNA 6000 ナノキット
アジレント
Cat # 5067-1511
リボゼロプラスキットによるイルミナ鎖状トータルRNAプレップ
イルミナ
Cat # 20040529
NovaSeq 6000 SP試薬キットv1.5
イルミナ
カタログ番号 20028402
イルミナ NovaSeq 6000
イルミナ
カタログ番号 20012850
ビーズアッセイ用灌流チャンバー
Gustafssonら、2012年
該当なし
SpectraMax ABS Plus UV/Visシングルモード
分子デバイス
Cat#5055292
DuoSet マウスリポカリン-2/NGAL ELISA キット
R&D Biosystems
Cat # DY1857
マウス固有層解離キット
Miltenyi Biotec
Cat # 130-097-410
gentleMACS 解離剤
Miltenyi Biotec
Cat # 130-093-235
FOXP3/転写因子染色バッファーキット
インビトロジェン eBioscience™
Cat # 00-5523-00
NovoCyte Quanteon フローサイトメーター
アジレント / ACEA バイオサイエンス
Cat # 2010097
ツァイスアポトーム
カールツァイスマイクロスコピー社
該当なし
Axio Observer Z1
カールツァイス
カタログ番号 491406-9880-010
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倫理声明
米国での動物実験は、ミシガン大学のInstitutional Animal Care & Use Committeeの承認を得た。ルクセンブルクでの動物実験は、ルクセンブルク大学動物実験倫理委員会およびルクセンブルク農業・ブドウ栽培・農村開発省（認可番号LUPA 2019/52）の両者によって承認され、科学的目的に使用される動物の保護に関する指令2010/63/EUによる「Règlement Grand-Ducal du 11 janvier 2013 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques」に従って実施された。
動物用飼料
いずれの動物施設でも、繊維が豊富な（FR）飼料はオートクレーブ滅菌したげっ歯類用チャウ（LabDiet #5013 、St.Louis、MO、USA）を用いた。米国での実験では、ファイバーフリー（FF）飼料はEnvigo社（TD.130343, Indianapolis, IN, USA）が製造・照射したもので、Harlan.TD08810飼料（Envigo, Indianapolis, IN, USA）をベースとしている（Desai et al, 2016）。ルクセンブルクの施設で使用されたファイバーフリー食餌は、米国で使用されているTD.130343食餌製剤に基づき、SAFE Diets社（Augy、フランス）によって製造され、照射された。FF飼料には食物繊維が不足しているが、これはグルコースの増加によって補われている。FF食はまた、SMのどのメンバーによっても分解されない多糖類である結晶セルロースを含んでいる。AcGGM飼料は、Envigo社（米国インディアナポリス）が製造・照射したTD.130343飼料を改良したもので、食物繊維アセチル化ガラクトグルコマンナン（AcGGM）を7.5％添加した。
実験デザイン
無胚芽（GF）、6～8週齢、年齢をマッチさせた雄および雌のスイス・ウェブスター・マウスを等ケージに収容し、1ケージあたり同性5匹までとした。光サイクルは12時間の照明と滅菌水で、飼料は自由摂取とした。実験はルクセンブルグと米国の2つの異なる施設で行った。結果は施設の所在地に関係なく再現された。研究者は、組織学的疾患スコアリング、SCFA定量化、FACS解析において、治療群について盲検化された。初回投与前および投与後14日間は、すべてのマウスをFR飼料で飼育した。投与2週間後、SM群ごとに半数のマウスをFF飼料に切り替えた。マウスはそれぞれの飼料で最大40日間維持され、図1Aに表したように糞便サンプルが採取された。感受性の表現型が発現するまでの期間を調べるため、1群のマウスをそれぞれ5日間（n=4）または20日間（n=3）FF飼料で飼育した（図EV2E）。給餌期間が短縮された以外は、これらのマウスは40日間の給餌レジメンのマウスと同じように扱われた。給餌期間終了後、マウスは感染前測定のために安楽死させるか、または前述（Desai et al, 2016）のようにC. rodentiumの〜109 CFUを感染させた。感染後、マウスを毎日観察した。FACSおよび宿主／微生物トランスクリプトミクス解析専用のマウスは感染3日後（DPI）に安楽死させ、残りのマウスは安楽死させる前に最大10DPIまで観察した。米国では、マウスはCO2 窒息後に頸椎脱臼により安楽死させたが、ルクセンブルグでは直接頸椎脱臼により安楽死させた。大腸は摘出され、ビーズ浸透性測定用に処理されるか、組織学的評価用にメタカルン固定液に保存された。FACS解析のために、マウスのサブセットの大腸を摘出し、「大腸固有層の免疫細胞プロファイリング」のセクションで説明したように処理した。RNA抽出のため、腸間膜リンパ節と大腸組織の2mm切片を1mlのRNAprotect Tissue Reagentに最長2週間保存した後、RNAprotectを除去し、その後の処理まで組織を-80℃で保存した。RNA抽出またはSCFA測定のため、-80℃で保存する前に頭蓋内容物を急速冷凍した。AcGGM食を与えたマウスは、FF食を与えたマウスと同じプロトコールに従った。
SMの培養と投与
すべてのSM構成株を培養し、以前に記載されたように、無菌マウスに胃内投与した（Steimle et al, 2021; Desai et al, 2016）。米国での実験では、14種類のSM菌を、改良酵母エキス・カシトン・脂肪酸（YCFA）培地（Roseburia intestinalis、Faecalibacterium prausnitzii、Marvinbryantia formatexigens）、トリプトン酵母エキス・グルコース（TYG）培地（Collinsella aerofaciens）で個別に培養した、硫酸還元菌用改変バール培地（Desulfovibrio piger）、またはカスタム刻み肉ブロス（Bacteroides caccae、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides ovatus、Bacteroides uniformis、Barnesiella intestinihominis、Eubacterium rectale、Clostridium symbiosum、Escherichia coli、Akkermansia muciniphila）（Desai et al, 2016）。ルクセンブルグでの実験では、すべての14SM細菌培養を、さらに改良した酵母エキス、カジトン、脂肪酸培地（mYCFA）で個別に培養した（Steimle et al, 2021）。マウスには、5種類の合成ヒト腸内細菌叢（SM）の組み合わせのうち1種類を、3日連続で最大0.2mlまで胃内投与した。細菌混合物は、各菌株をほぼ等量ずつ新鮮な状態で調製した（個々の培養液のOD600は0.5～1.0）。特定のSMによっては、選択された菌株は経口投与用混合物に含まれなかった（図1B）。
大腸長および粘液厚の測定
大腸の長さは、組織学的カセットに入れた大腸の写真を撮り、カセットのサイズを基準として ImageJ（https://imagej.net/）を用いて長さを測定した。粘液層の染色は前述のように行った（Parrishら、2023）。大腸粘液層の厚さの測定は、BacSpace（Earle et al, 2015）で解析した断面画像を用いて、既述のように行った。
組織学的疾患スコアリング
組織学的疾患スコアリングは、ミシガン大学医学部のKathryn A. Eaton教授が、Meiraら（Meira et al, 2008）のプロトコールを修正したものに従って盲検下で行った。簡単に言えば、炎症、上皮損傷、過形成／異形成、粘膜下浮腫に基づいてスコアが割り当てられた。
生体外粘液層透過性評価
腸粘液層透過性は、以前に記載されたように、蛍光ビーズを用いて測定した（Gustafsson et al, 2012; Schroeder et al, 2018）。簡単に説明すると、安楽死させたマウスから大腸を摘出し、酸素添加した氷冷クレブス緩衝液（116mM NaCl、1.3mM CaCl2 × 2H2O、3.6mM KCl、1.4mM KH2PO4、23mM NaHCO3、および1.2mM MgSO4 × 7H2O）を用いて穏やかに洗浄した。大腸組織を酸素添加した氷冷クレブス緩衝液に懸濁したまま、鈍的マイクロダイセクションで筋層を除去した。次に、遠位粘膜を灌流チャンバーに取り付けた。先端側チャンバーには、酸素添加した氷冷Krebs-mannitol緩衝液（10mMマンニトール、5.7mMピルビン酸ナトリウム、5.1mM-l-グルタミン酸ナトリウムを含むKrebs緩衝液）を入れ、基底側チャンバーには、酸素添加した氷冷Krebs-glucose緩衝液（10mMグルコース、5.7mMピルビン酸ナトリウム、5.1mM-l-グルタミン酸ナトリウムを含むKrebs緩衝液）に0.6μg/mlのSYTO-9を入れた。暗所、室温で10分間インキュベートした後、FluoSpheres™カルボン酸ビーズ（1 µm、赤色580/605、Invitrogen社製）をアピカルに加え、組織上で5分間沈降させた。次に、アピカルチャンバーをKrebs-mannitolバッファーで静かに流して余分なビーズを除去し、組織をさらに10分間インキュベートした後、顕微鏡で可視化した。各組織について、上皮からビーズまで、5 µm間隔のXYスタックとして4～7枚の共焦点画像を撮影した。各ビーズの上皮までの距離に応じて、粘液透過性を算出した。
核酸抽出
細菌DNAは、前述（Steimle et al, 2021）のように、フェノール-クロロホルム抽出により糞便ペレットから抽出した。宿主腸間膜リンパ節、結腸組織、または糞便内容物から、前述（Parrishら、2022b；Grantら、2023）のように3DPIで全RNAを抽出した。RNAの完全性はAgilent 2100 Bioanalyzerシステムを用いて測定し、RNAはさらに解析するまで-80℃で保存した。
RNA配列決定と解析
RNAシーケンスライブラリーは、Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus kit (San Diego, CA, USA)を用いて調製し、LuxGen Platform (Dudelange, Luxembourg)のIllumina NovaSeq 6000システム (San Diego, CA, USA)で2×75 bp構成のNovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5を用いてシーケンスした。生データファイルはkneaddata（https://github.com/biobakery/kneaddata）を用いて、アダプター除去、期待される長さの半分以下のリードの破棄、コンタミデータベース（宿主転写産物がターゲットでない場合はリボソームRNAおよびマウスゲノム）にマッピングされたリードの除去などのクリーニングを行った。大腸組織転写産物はMus musculusゲノムにマッピングし、一方、糞便内容物転写産物はSalmon（Patro et al, 2017）を用いて14SM株の各ゲノム（表EV1）に個別にマッピングした。全サンプルにわたって平均して少なくとも1回見つからなかった宿主転写産物はフィルターで除外した。メタトランスクリプトーム解析では、Chenら（Chen et al, 2016b）が記述したように、サンプルライブラリーの少なくとも50%で2.5cpmのカットオフ値を使用した。差次的発現解析はDESeq2 1.30.1を用い、Benjamini-Hochberg法（Love et al, 2014）を用いて多重比較の補正を行った。HUMANn3におけるメタトランススクリプトーム解析では、フォワードおよびリバースfastqファイルを連結し、14SMメンバーおよびC. rodentiumのカスタム分類学的プロファイルにアライメントし、UniRef90識別子をPfam識別子に再マッピングすることで解析した（Beghini et al, 2021）。
細菌の相対存在量の定量
SMの初期コロニー形成は、系統型特異的qPCRプライマーを用いて確認した（Steimle et al, 2021）。最終的な相対量の解析は、Kozichら（Kozich et al, 2013）記載のプライマーを用いたV4領域の16S rRNA遺伝子配列決定後に行った。Quick-16S™ NGS Library Prep Kit（BaseClear, Leiden, NL）を用いてアンプリコンライブラリーを調製し、Integrated BioBank of Luxembourg（IBBL、Dudelange, Luxembourg）のMiSeq Reagent Kit v2（500サイクル）を用いてIllumina MiSeq（San Diego, CA, USA）で実行した。mothurバージョン1.41.3 (Schloss et al, 2009)を使用して、生の非多重化配列を処理および解析した。14SM菌とC. rodentiumの配列を含むカスタムデータベースをもとに、k-Nearest Neighbor法を用いてリードの分類を行った。14SM FR, 14SM FF, 13SM FR, 13SM FFマウスの相対存在量（Dataset EV1）について、psych v2.4.1のcorr.test()関数を用いて共存量相関解析を行い、corrrパッケージv0.4.4を用いて可視化した（EV Fig.4）。
C. rodentiumの培養と菌数測定
C. rodentiumは、LB培地で37℃、振盪しながら好気的に培養し、カナマイシンを含むLB-寒天プレートを用いて、前述（Desai et al, 2016）のようにCFUを計数した。
腸内短鎖脂肪酸分析
未感染マウスから採取した30〜100mgの瞬間凍結した糞便内容物を、以前に記載したように、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）による脂肪酸分析に用いた（Greenhalgh et al, 2019; Wolter et al, 2021b）。
大腸固有層の免疫細胞プロファイリング
感染マウスの大腸を縦に開き、氷冷した1X PBSで穏やかに洗浄した後、氷上でフェノールレッドを含みカルシウムとマグネシウムを含まないハンクス緩衝生理食塩水（HBSS）（Lonza, Basel, Switzerland）に入れた。全組織を回収した後、Lamina Propria Dissociation Kit for miceとgentleMACS dissociator（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を用い、製造者の指示に従って大腸固有層から免疫細胞を抽出した。動物あたり約1.5×106個の細胞を染色し、NovoCyte Quanteonフローサイトメーター（ACEA Biosciences Inc. ゲーティング戦略は図EV3Bにある。
統計解析
特に断りのない限り、統計解析はPrism 10.1.2（GraphPad Software, Inc.）外れ値除去は、係数Q = 1%のROUT法を用いて行った（Motulsky and Brown, 2006）。データはKolmogorov-Smirnov検定を用いて正規性を評価した。特に断りのない限り、二元配置分散分析の後に、Benjamini-Hochberg法を用いてp値を調整した多重一対比較（同じSM内の食餌間および同じ食餌のSM間）を行った。順序データについては、emmeans v1.8.8を用いたBenjamini-Hochberg法による一対の多重比較とp値調整後に、ordinal v2023.12-4パッケージを用いた二元順序回帰検定をRで実施した。各実験で使用した具体的な検定と動物数については、図の凡例に詳述している。
データの利用可能性
本研究で得られたデータセットは以下のデータベースで利用可能である： - 16S rDNAおよびRNA-Seqデータ： 16S rDNAおよびRNA-Seqデータ：EMBL-EBI PRJEB51371のEuropean Nucleotide Archive（ENA）。- フローサイトメトリーデータ： FlowRepository FR-FCM-Z7A7 (http://flowrepository.org)。
本論文のソースデータは以下のデータベースレコードに収集されている：biostudies:S-SCDT-10_1038-S44320-024-00036-7。
著者の貢献
Mathis Wolter：概念化、データキュレーション、形式分析、検証、調査、可視化、方法論、執筆（初稿）、執筆（査読・編集）。エリカ・T・グラントデータキュレーション、形式分析、調査、視覚化、方法論、執筆-レビューおよび編集。マリー・ブドーデータキュレーション、形式分析、調査、視覚化、方法論、執筆-校閲・編集。Nicholas A Pudlo：調査、方法論、執筆-校閲-編集。Gabriel V Pereira：調査、執筆-校閲、編集。Kathryn A Eaton: 調査、方法論、執筆-校閲、編集。エリック・C・マーテンス概念化、資源、監督、方法論、執筆-校閲-編集。Mahesh S Desai: 概念化、資源、監督、資金獲得、調査、視覚化、方法論、原案執筆、プロジェクト管理、執筆-査読-編集。
本論文の図パネルの基礎となるソースデータには、個人の著者が割り当てられている場合がある。利用可能な場合、図パネル/ソースデータの著者名は以下のデータベースレコードに記載されている：biostudies:S-SCDT-10_1038-S44320-024-00036-7。
開示および競合利益に関する声明
Mahesh S. DesaiはTheralution GmbH（ドイツ）のコンサルタントおよび諮問委員会委員を務める。Eric C. Martensは、January, Inc.（米国）でコンサルタントおよび諮問委員会委員を務める。
謝辞
ルクセンブルク国立研究基金（FNR）のCORE助成金（C15/BM/10318186およびC18/BM/12585940）およびMSDへのBRIDGES助成金（22/17426243）の支援に深く感謝する。ECMには米国国立衛生研究所から助成金（DK118024およびDK125445）をいただいた。MWは、米国・ベルギー・ルクセンブルグ教育交流委員会からフルブライト客員研究員助成金の支援を受けた。ETGは、FNR PRIDE (17/11823097)およびルクセンブルク財団の庇護の下、Fondation du Pélican de Mie et Pierre Hippert-Faberの支援を受けた。MBは欧州委員会のHorizon 2020 Marie Skłodowska-Curie Actions individual fellowship (897408)の支援を受けた。MEDICE Arzneimittel Pütter GmbH & Co. KG（ドイツ）およびTheralution GmbH（ドイツ）の官民パートナーシップFNR BRIDGES助成金（22/17426243）による資金提供に感謝する。また、Gunnar HanssonとGeorge Birchenough（スウェーデン、ヨーテボリ大学）には、粘液透過性測定アッセイのセットアップを手伝っていただいた。最後に、ミシガン大学のGermfree CoreとMicrobiome Coreの専門家による技術支援、MSDの研究室で技術的貢献をしてくれたSophie Craig、RNAライブラリーの調製と配列決定をサポートしてくれたLuxembourg Institute of HealthとLaboratoire national de santéのLuxGen PlatformのNathalie Nicotに感謝する；また、Luxembourg Centre for Systems Biomedicine Metabolomics PlatformのChristian Jäger氏、Xiangyi Dong氏、Floriane Gavotto氏にはSCFA解析のサポートをいただいた。また、Markus Ollertの励ましと助言にも感謝する。オープンアクセスを目的とし、助成金契約から生じる義務を果たすため、著者は本投稿から生じるすべてのAuthor Accepted ManuscriptバージョンにCreative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0)ライセンスを適用した。
補足資料
表EV1（PDF文書、40.43 KB）
データセットEV1（Excel 2007スプレッドシート、11.05 MB）
DATASET EV2 (Excel 2007 スプレッドシート、4.79 MB)
DATASET EV3 (Excel 2007 スプレッドシート、4.91 MB)
DATASET EV4 (Excel 2007 スプレッドシート、40.25 MB)
DATASET EV5 (Excel 2007 スプレッドシート、254.12 KB)
DATASET EV6 (Excel 2007 スプレッドシート、4.08 MB)
拡大図 (PDFドキュメント、 6.06 MB)
参考文献
An J, Zhao X, Wang Y, Noriega J, Gewirtz AT, and Zou J 西洋風食事はCitrobacter rodentiumのコロニー形成とクリアランスを阻害する PLoS Pathog 2021 17 e1009497

クロスレフ
PubMed
CAS
グーグル奨学生
アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）は恒常性維持過程において腸管適応免疫応答を誘導する Science 2019 364 1179-1184
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アシュラフィアンF、Keshavarz Azizi Raftar S、Shahryari A、Behrouzi A、Yaghoubfar R、Lari A、Moradi HR、Khatami S、Omrani MD、Vaziri F、他。正常食を与えたマウスに対する生きたままおよび低温殺菌したAkkermansia muciniphilaの比較効果 Sci Rep 2021 11 17898

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腸管上皮細胞への微生物の接着によるTh17細胞の誘導 Cell 2015 163 367-380
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