再発性Clostridioides difficile感染症患者における多剤耐性菌のコロニー形成とレジストーム量に対する糞便微生物叢移植の長期有益効果
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公開日：2024年2月28日
再発性Clostridioides difficile感染症患者における多剤耐性菌のコロニー形成とレジストーム量に対する糞便微生物叢移植の長期有益効果
https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-024-01306-7
Sam Nooij、Karuna E. W. Vendrik、オランダ・ドナー糞便バンク研究グループを代表して著者表示
ゲノム医学第16巻、論文番号：37（2024） この論文を引用する
メトリクス詳細
要旨
背景
多剤耐性（MDR）菌は、特に医療施設において世界的な脅威となっている。糞便微生物叢移植（FMT）は、クロストリジオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）感染症の再発に対する効果的な予防戦略であり、他の微生物関連疾患にも有用である。
方法
C.difficile感染を複数回再発した患者を対象に、培養法と糞便メタゲノミクスを組み合わせて、短期（3週間）および長期（1～3年）におけるMDR菌のコロニー形成および抗生物質耐性遺伝子（ARG）に対するFMTの効果を検討した。
結果
MDR菌培養（n=87人）に基づくと、FMT後のMDR菌のコロニー形成率は11.5％減少した（FMT前20/87人=23％、FMT3週間後10/87人）。患者便サンプル（n = 63）のメタゲノムシークエンシングでは、便中のARGの相対量の減少が示されたが、患者の異なる耐性遺伝子の数は、対応する健常ドナーの便（n = 11）と比較して高いままであった。さらに、メタゲノミックデータからプラスミドを予測すると、患者は耐性プラスミドを多く保有していることが示されたが、これはFMTの影響を受けていないようであった。長期的（n = 22人）には、レシピエントのレジストムは依然としてドナーのようであり、FMTの効果が何年も続く可能性が示唆された。
結論
以上をまとめると、FMTは腸内細菌叢を健康なドナーの組成に近い状態に回復させ、潜在的な病原体は失われるか、あるいは存在量が極めて低い状態にまで減少するという仮説が成り立つ。しかし、このプロセスはFMT後の数日で終わるわけではない。腸内細菌叢が再びバランスのとれた状態になるには、数ヵ月かかることもある。耐性遺伝子のリザーバーが残り、その顕著な一部はプラスミド上に存在するにもかかわらず、FMTは耐性遺伝子の総負荷量を減少させる。
背景
抗生物質の発見は感染症の自然経過を変え、何百万人もの命を救った。抗生物質は現代医学において最も重要な開発かもしれないが、その使用には重要なトレードオフがある。標準的な治療法では効果がない抗生物質耐性菌が出現し、感染症の効果的な予防と治療が脅かされている。抗生物質耐性は現在、公衆衛生に対する大きな脅威と考えられている[1, 2]。その上、広域抗生物質療法はヒトの微生物叢を破壊し、逆説的にクロストリジオイデス・ディフィシルなどの感染症への感受性を高める結果となっている [3,4,5]。
C.difficileは無症候性で腸内に存在することがあるが、抗生物質の影響を受けた微生物叢では増殖する。C. difficileは、自己完結型の軽い下痢から生命を脅かす偽膜性大腸炎まで様々な感染症（CDI）を引き起こす [6] 。腸内細菌叢の崩壊は、CDIの再発性の維持に不可欠であり、これは、糞便微生物叢移植（FMT）によって腸内細菌叢を補充すると、CDIの再発（rCDI）が速やかに消失するという観察によって裏付けられている [7, 8]。FMTは抗生物質治療後の腸内細菌叢の多様性を回復させるため、C. difficile芽胞の増殖を防ぎ [9] 、おそらく他の感染症のリスクも低下させると考えられている。FMTは何年も前からrCDIの治療ガイドラインに記載されており [10,11,12]、rCDIは現在FMTが日常的に行われている唯一の疾患である。
抗生物質によって破壊された腸内細菌叢は、多剤耐性（MDR）菌のコロニー形成も受けやすくなり [13] 、重症患者の感染リスクを高める [14] 。MDR菌の中でも特に問題視されているのが、広域β-ラクタマーゼ（ESBL）産生菌であるEnterobacteralesである。ESBL産生Enterobacteralesによる感染症のほとんどは罹患率と死亡率が高く、腸内コロニー形成が先行している [15,16,17] 。したがって、腸管からのESBL産生Enterobacteralesの予防と除菌は世界的な関心事である。自然脱コロナイズは合併症や菌種の種類によって異なり [18, 19]、MDR菌の脱コロナイズを促進する革新的な戦略が望まれている。今のところ、推奨される脱コロナイズ法はない [20] 。しかし、Millanらは、rCDI患者に対するFMTが、糞便中の抗菌薬耐性遺伝子の数と多様性を減少させることを見出した [21] 。この観察に続いて、ESBL産生Enterobacteralesにコロニー形成された患者がFMTで治療に成功したという様々な症例報告がなされた［22,23,24,25,26,27,28,29,30,31］。非吸収性抗生物質の経口投与とFMTによるMDR Enterobacteralesの脱コロナイズを評価するために、パワー不足のランダム化比較試験（RCT）が1件実施された（n＝39人）[32]。FMTの統計学的に有意な利点は認められなかったが、コロニー形成率は未治療の対照患者と比較してFMT治療患者でわずかに低かった。その後、MDR菌に対するFMTの有効性に疑問が呈され、これをさらに評価するための実験が提案された［33］。興味深いことに、腎移植患者におけるMDR菌の除菌にFMTを用いた別のRCTのデータから、FMTを受けた患者は、FMTを受けなかった患者よりも感染症が再発するまでの期間が長いことが示された［34］。このことは、同様のFMT研究において、より長期のサンプリングの必要性を強調している。
rCDI患者におけるFMTが腸内細菌叢の抗生物質耐性に及ぼす影響をさらに検討するために、培養と糞便メタゲノミクスの両方を用いてMDR菌のコロニー形成を評価する。特に、存在するすべての抗生物質耐性遺伝子（ARG）の集合体として定義されるレジストームに注目する。さらに、一部の患者を対象として、FMT後3年までの微生物叢への長期的影響についても研究する。
研究方法
研究デザイン
このコホート研究では、オランダドナー便バンク（NDFB、オランダ、ライデン）から提供された、オランダ全土の34の異なる医療機関でFMTを受けたrCDI患者の便サンプルを用いて、MDR菌の存在とレジストームを評価する。NDFBは、前述したように、ドナー糞便懸濁液の収集、スクリーニング、調製、保管、rCDI患者の治療とフォローアップのための標準化された手順を使用している[35, 36]。つまり、患者はまずC. difficileに対する抗生物質でFMTの24時間前まで少なくとも4日間治療された。FMTの前日、患者はマクロゴール溶液による腸洗浄を受けた[8]。FMT前の検体は、抗生物質の投与中または投与後まもなく、腸洗浄の前に採取された。FMTの約3週間後に、FMT後の短期検体が要求された。2016年5月から2021年3月にかけて、rCDI患者とそれに対応するドナーのFMT前およびFMT後の短期便サンプルが採取された。さらに、2021年2月に、インフォームドコンセントを得たコホートのFMT治療患者（n＝53）に対して、その後の研究目的で連絡を取り、最新の臨床情報を聞き、長期追跡（LTFU）検便を依頼した。FMT後のCDIの再発を含む臨床データは、さらなる調査のために記録された。便サンプルは、メタゲノミクス配列決定のためのDNA抽出まで-80℃で保存するか、MDR培養検査まで終濃度10％グリセロールで保存した。
多剤耐性菌の定義
定義および検査方法は、以前に記載されたものを使用した[37]。MDR菌はDutch Working Group on Infection Prevention [38]の定義に従って定義した。これには、ESBL産生エンテロバクター属、フルオロキナーゼとアシネトバクターの両方に耐性を持つエンテロバクター属とアシネトバクター属が含まれる。フルオロキノロン系抗菌薬とアミノグリコシド系抗菌薬の両方に耐性を示すか、カルバペネマーゼを産生する緑膿菌；カルバペネマーゼを産生するか、以下の抗生物質クラスまたは薬剤のうち少なくとも3つに耐性を示す緑膿菌： フルオロキノロン系抗菌薬、アミノグリコシド系抗菌薬、セフタジジムまたはピペラシリン、カルバペネム系抗菌薬、ペニシリンおよびバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）、またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）。
多剤耐性菌の培養と抗菌薬感受性試験
MDR菌を同定し、FMTドナーおよびレシピエントにおける有病率を算出するために、便検体を前述のように選択的に培養した［37］。簡単に説明すると、接種用ループを用いて、凍結した糞便アリコート（10％グリセロール含有）から10μLの糞便を掻き出した。この糞便を15mLのトリプシン系大豆ブロスで濃縮し、35℃で18時間培養した後、ChromID ESBL寒天培地、ChromID OXA-48寒天培地、MacConkeyトブラマイシン（8mg/L）＋シプロフロキサシン（0.5mg/L）寒天培地、およびVRE寒天培地（bioMérieux, Marcy l'Etoile,France）にプレーティングした。MRSAの検出には、塩化ナトリウム2.5および硫酸コリスチン10 mg/Lを添加した脳心筋梗塞濃縮ブロスを別途使用し、MRSA-ID寒天平板に接種した。MDRが疑われるコロニーはすべて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF）Biotyper（Bruker Daltonik; Bremen, Germany）により菌種を同定した。抗生物質感受性は、VITEK2（Card N199, bioMérieux）により、EUCAST（European Committee of Antimicrobial Susceptibility Testing）のブレイクポイントバージョン11.0を用いて評価した[39]。ESBL産生はダブルディスク法で確認した。メロペネムの最小発育阻止濃度（ETEST、bioMérieux）が0.25 mg/Lを超える分離株は、カルバペネム不活化法（CIM）試験と、KPC、VIM、NDM、OXA-48、IMP遺伝子を検出するための社内マルチプレックスPCRを用いて、カルバペネマーゼ産生について調査した。VREはvanAおよびvanB遺伝子を標的とする社内PCRで、MRSAはMREJ、mecA/mecCおよびNuc遺伝子を標的とするBD MAXアッセイ（BD、米国ニュージャージー州）で確認した。NDFBドナースクリーニングの既知のMDR菌陽性6株とMDR菌陰性7株の解凍糞便アリコート（同じく10％グリセロールで保存）を陽性対照と陰性対照とした。少なくとも1つのMDR菌が選択培地で培養されたサンプルをMDR培養陽性と呼んだ。
多剤耐性分離株の全ゲノム配列決定
MDR分離株の抗生物質耐性遺伝子型とFMT後の持続性を評価するため、培養したMDR菌を全ゲノム配列決定（WGS；図1）に供した。QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit（Qiagen、ドイツ、ヒルデン）を用いてDNAを単離し、GenomeScan B.V.（オランダ、ライデン）に送り、Illumina NovaSeq6000プラットフォーム（Illumina, Inc： 780 k [258 k-1.64 M]（中央値[範囲]）。サンプルは2バッチ送られたが、2バッチ目は失敗した。我々は、32株中24株（FMT前の便から15/20株、FMT後の短期便から9/10株、長期フォローアップ便から0/2株）のWGSを含む利用可能なデータを継続することにした。生シーケンスリードは、Bowtie2（バージョン2.4.2、オプション「-very-sensitive-local」）[41]とsamtools（バージョン1. 11）[42]を使用し、fastp（バージョン0.20.1、パラメータ'-cut_right -cut_window_size 4 -cut_mean_quality 20 -l 50 -detect_adapter_for_pe -y'）[43]を用いてアダプターおよび低複雑度リードの除去および品質トリミングを行った。高品質リードはSPAdes（バージョン3.15.2、オプション '-isolate'）[44]を用いてアセンブルした。ABRicate（バージョン0.8.13, https://github.com/tseemann/abricate）を用いて、CARD（2021年3月25日～）[45]とResFinder（2021年3月25日～）[46]の両データベースで抗生物質耐性遺伝子をスクリーニングし、同一性が97%以上の全長遺伝子（カバレッジ100%）のヒットのみを保持した。これらのカットオフは、レジストーム解析（下記参照）と手法の一貫性を保ち、比較できるようにするために用いられた。さらに、アセンブルしたゲノムをGTDB-Tk（バージョン2.1.0）[47]を用いて分類した。これらの分類は、上述のMALDI-TOF Biotyperによる分類を検証またはさらに特定するために使用され、配列決定された分離株の種の同定として使用された。配列データは、European Nucleotide Archive (ENA)のプロジェクト番号PRJEB64622 (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB64622) [48]に寄託されている。
図1
図1
研究セットアップの概略図。データソースは青色、データ作成（ウェットラボ）技術は緑色、主要な解析（ドライラボ）方法はオレンジ色のボックスで示している。複数の再発性クロストリジオイデスディフィシル（Clostridioides difficile）感染患者が、オランダ全土の34の異なるセンターで糞便微生物叢移植による治療を受け、研究のためにサンプルが要求された。FMT前とFMT後の両方のサンプルを得た患者のみが解析に含まれている。
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ショットガンメタゲノムシーケンス
合計63セットのドナー-患者FMTトライアドをショットガンメタゲノミクスを用いて配列決定した。2021年以前に採取されたサンプルは、以前に記載されたように配列決定のために準備された[49]。その結果、FMT前およびFMT後短期間の患者49人のメタゲノムと、8人のドナー56検体のメタゲノムが得られ、プロジェクト番号PRJEB44737（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB44737）のENAに寄託された[50]。さらに、FMT前、FMT後短期、および現在ではFMT後長期を含む21セットの患者サンプル（テトラッド）、および8人のドナーからの14のドナーサンプルが、Illumina NovaSeq6000プラットフォームを使用してGenomeScan B.V.（オランダ、ライデン）でシーケンスされ、サンプルあたり中央値42.6 M 150 bpペアエンドリードが生成された。ヒト由来のリード（下記参照）を除いた生のリードは、プロジェクト番号PRJEB64621（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB64621）としてENAに寄託されている[51]。DNAは、未処理の患者およびドナーの糞便100 mgから、Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit (ZymoResearch, Irvine, California, USA)を用いて抽出し、Precellys 24 tissue homogeniser (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France)を用いて、5.5 m/sの速度で、短いインターバルを挟んで1分間×3回、ビーズビーティングを行った[52]。ライブラリーは、NEBNext Ultra II FS DNA kitとNEBNext Ultra II Ligation kit（New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA）を用いて構築し、約500-700 bpのDNA断片を作製した。また、DNAの単離と塩基配列決定が成功したことを確認するために、コントロールサンプルも加えた。これらには、ブランク（水）コントロールとZymoBiomics Community Standard（ZymoResearch社製）が含まれる。ネガティブコントロールはシーケンスリードを返さなかったが、ポジティブコントロールはコミュニティ内に存在するすべての生物種のリードを含んでいた。
メタゲノム前処理
ヒト由来のリードは、bowtie2（バージョン2.4.2、オプション「-very-sensitive-local」）およびsamtools（バージョン1.11）を用いて、リードをヒト参照ゲノム（GRCh38、NCBIアクセッションID GCF_000001405.26）にマッピングすることで、メタゲノム生リードから除去した。残りの非ヒトリードをfastp（バージョン0.20.1）で処理し、低品質な3'末端のトリミング（パラメータ：'-cut_right -cut_window_size 4 -cut_mean_quality 20'）、低複雑度配列の除去（パラメータ：'-y'）、残存アダプター配列の除去（パラメータ：'-detect_adapter_for_pe'）、50塩基より短いリードの除去（パラメータ：'-l 50'）を行った。得られた高品質なメタゲノムリードは、リードベースの分類学的プロファイリングとアセンブリベースのARGプロファイリングに使用した。
メタゲノム中の多剤耐性分離株の定量化
メタゲノム中の全ゲノム配列が決定されたMDR菌を同定および定量化するために、BWA-MEM（バージョン0.7.17）[53]を用いて、同じ便サンプル由来のメタゲノミックリードをそれぞれのアセンブルゲノムにマッピングした。マッピングしたリードをカウントし、samtools coverage (version 1.10)を用いてカバレッジを定量化した。カバレッジは、カバレッジの深さ（メタゲノムリードの総数で正規化した、各位置がカバーされた平均回数）とカバレッジの広さ（少なくとも1つのリードでカバーされたゲノムの割合）の両方として計算した。すべての場合において、MDR表現型に関連するARGを含むスキャフォールドのカバレッジにより、MDR株の存在が確認された。さらに、各培養分離株の全ゲノム配列データから検出された抗生物質耐性遺伝子の有無を、同じ便サンプルから得られたレジストームデータと手作業で比較し、培養とメタゲノミクスの感度を評価した。
分類学的プロファイリング
分類学的微生物叢プロファイルは、リードをカスタムマーカーデータベースにマッピングするMetaPhlAn（バージョン4.0.3）[54]を用いて決定した。微生物叢全体のパーセンテージとして定量化された分類学的プロファイルは、R phyloseqオブジェクトとしてインポートされ、視覚化と統計的比較が容易になった[55]。Enterobacteralesを定量化するために、我々はMetaPhlAnの出力からEnterobacteralesの順序を抽出し、他のすべての分類群を「その他」とラベル付けした。Enterobacteralesの存在は、相対存在量＞0％と定義した。種濃度と均等性はRパッケージの'microbiome'を用いて計算し、シャノン多様性は'vegan'パッケージを用いて計算した。
レジストーム解析
ARGはアセンブリーベースのアプローチで検出した。品質トリミングしたリードをmetaSPAdes（バージョン3.15.4、デフォルトパラメータ）[56]を用いてスキャフォールドにアセンブルした。次に、ABRicate（バージョン0.8.13）を用いて、CARD（2021年3月25日～）とResFinder（2021年3月25日～）の両方のデータベースを用いて耐性遺伝子を同定し、少なくとも97％の同一性を持つ全長遺伝子（100％カバレッジ）のヒットのみを保持した。これらの基準は、高い特異性と適切な感度のバランスをとるために、BLASTヒットの目視検査に基づいて選択された。対照として、部分的な遺伝子を含めるために50%のカバレッジカットを用いて解析を繰り返したが、同等の結果が得られた。ARGは、それぞれのデータベースのアノテーションファイルを使用して、それぞれの標的抗生物質と抗生物質クラスでアノテーションされた。スキャフォールドは、BWA-MEM（バージョン0.7.17）とsamtools（バージョン1.10）を用いて、メタゲノムリードをスキャフォールドにマッピングして定量した。定量値は、各コンティグにマッピングされたリード数をコンティグの長さとアセンブルに使用された高品質リード数で割り、1000 * 1,000,000を乗じることで、100万塩基あたりのリード数（RPKM）に正規化した。スキャフォールドに追加情報を付与するために、Genome Taxonomy Database Toolkit (GTDB-Tk; version 2.1.0)とContig Annotation Tool (CAT, version 5.2.3, parameters: '-r 10 -f 0. 5', [57])を用いてスキャフォールドを分類した。 5', [57] - Prodigalバージョン2.6.3 [58]; DIAMONDバージョン2.0.6 [59]; および2021年1月7日からのNCBI BLAST nrデータベース, https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/]を使用）、CATを一次アノテーションとして使用し、GTDB-Tkの結果を使用して分類のギャップを埋める。ARGを有するスキャフォールドのゲノム起源（染色体またはプラスミド）は、viralVerify（バージョン1.1、オプション「-p」、https://github.com/ablab/viralVerify）を使用して予測し、viralVerifyが確実であると報告した予測のみを使用した。すべてのスキャフォールドアノテーションデータをR（バージョン4.0.2; https://www.R-project.org/）にロードし、さらなる解析を行った。レジストームの豊かさは、サンプルあたりの異なる遺伝子の数をカウントすることによって計算し、総存在量はサンプルあたりのすべての耐性遺伝子の存在量値（RPKMとして）の合計として計算し、レジストームのシャノン多様性は'vegan'Rパッケージを使用して計算し、Simpson均等性は'microbiome'パッケージを使用して計算した。
統計解析
患者におけるMDR菌のコロニー形成率は、ペアデータに対するMcNemarのカイ二乗検定（非正確、連続性補正なし）を用いて、FMT前とFMT後短期間、およびFMT後短期間とFMT後長期間で比較した。メタゲノムデータにおけるMDR菌のカバー率の深さは、対数変換したカバー率の値について対のt検定を用いてFMT前後で比較した。
患者におけるEnterobacteralesのコロニー形成率に対するFMTの効果は、補正なしのMcNemarの検定を用いて検定した。総存在量は反復測定ANOVAを用いて比較し、その後Holmの補正法を用いて一対のt検定を行った。
メタゲノムおよびレジストームの分類学的組成をドナーと患者で比較するため、代表値として各ドナーの値を1つずつ選択した。主成分分析（PCA）については、各ドナーについて、提供日に基づいて真ん中のサンプルを選んだ（サンプル数÷2、切り上げ）。微生物叢またはレジストーム組成間の距離を計算するためにAitchison距離を使用した。Aitchisonは対数変換した値を使用するが、ゼロでは不可能なので、擬似カウントを加えた。PCAでは、ドナーと患者をPERMANOVA検定とPERMDISP検定で比較し、患者のIDを層として反復測定を考慮した。Aitchison距離はWilcoxon順位和検定を用いて比較した。箱ひげ図を用いたアルファ多様性指標の比較では、各ドナーの代表値として中央値を選択した。豊かさ、総存在量、Shannon指数、Simpson均等性は、Holmの補正法を用いたt検定を用いて、ドナーと患者の間で比較した。存在量の値は対数変換した。患者内では、FMT前とFMT後の短期的な測定値をすべて対のt検定を用いて比較し、FMT後の長期的なサンプルを収集した22人の患者のサブグループ内では、まず反復測定ANOVAを用いて値を比較した。p＜0.05の場合は、FMT前とFMT後、FMT後とFMT後の短期間と長期間の差を調べるために、事後検定として対のt検定を用いた。ここでもホルムの補正法が用いられた。
FMT前の抗生物質（バンコマイシン）投与期間がレジストームに影響を及ぼすかどうかを評価するために、Spearman相関を用いて、患者（n = 52）の治療前の期間とレジストームの豊富さ（異なるARGの数）、総存在量、シャノン多様性、およびシンプソン均等性を比較した。統計検定はすべてRバージョン4.0.2で行い、base、rstatix、vegan、pairwiseAdonisパッケージを使用した。p値が0.05未満を有意とみなした。解析スクリプトはZenodo (https://zenodo.org/doi/https://doi.org/10.5281/zenodo.10276220) [60]で入手できる。
結果
ドナーおよび患者の選択と集団の特徴
サンプル収集期間中、NDFBは187人のrCDI患者のFMT治療208回分の糞便懸濁液を提供した。87人の患者（年齢中央値73歳、四分位範囲（IQR）64-81歳、女性56人（64％））から、培養によるMDR菌の検査を行うために、FMT前とFMT後の短期間の両方から便検体を採取した（図1）。22人の患者（年齢中央値73、IQR64-78歳、女性14人（64％））が、培養検査を行ったFMT後の長期検体を提供した。患者のサンプリング時間の中央値は、FMT前1日（IQR 1-3日）、FMT後27日（IQR 20-48日；短期）、FMT後801日（IQR 447-1114日；長期）である。15人の異なるドナー（年齢中央値27歳、IQR24-37.5、女性9人（60％））の76検体を培養してMDR菌のスクリーニングを行った。ショットガン・メタゲノミック・ディープシーケンスには、63組の患者便サンプル（患者年齢中央値73歳、四分位範囲（IQR）65-81歳、女性40人（63％））、LTFU21人（1人はFMT前サンプルを提供できなかった）、および11人の異なるドナーからの70人のドナー便サンプル（年齢中央値31歳、IQR27-42歳、女性6人（55％）、図1）を使用した。レジストーム解析には、完全な3検体（ドナー、FMT前、FMT後）、およびFMT前とFMT後の短期検体の両方が入手可能な場合は、FMT後の長期検体を含む4検体のみが含まれる。
多剤耐性菌の有病率はFMT後に減少する
MDR菌に対するFMTの効果の研究は、選択培養から開始した。FMT前後の15人のドナーと87人の患者の便サンプル培養について、MDR菌の保有率を評価した（図1）。1人のドナーにMDR菌陽性検体（1/15＝6.7％）があったが、そのうちFMTに使用されたものはなかった。FMT前には20/87例（23.0%）で少なくとも1つのMDR菌が検出された（図2A、表1）。FMTの3週間後、コロニー形成率は10/87（11.5％；p = 0.0075）に減少し、そのうち7つのMDR菌がFMT前にも検出された。長期的には、コロニー形成は2/22（9.1％；図2B；FMT後短期と比較してp＝0.16）と同程度であった。LTFUに存在したMDR菌はいずれも、FMT後の短期サンプルでも検出されたESBL産生大腸菌であった。従って、これらの菌は長期持続性であると考えられる。長期サンプルを提供した患者のサブグループ内では、コホート全体で見られたようなFMT後のコロニー形成の減少は見られなかった（図2B；FMT前5/22＝22.7％、FMT後4/22＝18.2％、p＝0.56）。包括的な解析のためにMDR菌のコロニー形成とCDIの再発のデータを比較したが、統計的に意味のある結果を得るには数が少なすぎることがわかった。
図2
図2
培養多剤耐性菌の有病率および存在量に対する糞便微生物叢移植の効果。再発性C. difficile感染（rCDI）患者の便サンプルを選択的に培養し、糞便微生物叢移植（FMT）前後の多剤耐性（MDR）菌の有病率を評価した。少なくとも1つのMDR菌が検出された検体をMDR陽性と呼んだ。培養分離株を全ゲノムシークエンシングに供し、同じ便サンプルからのメタゲノムシークエンシングデータをアセンブルされたゲノムにマッピングし、メタゲノム中のMDR菌を定量化した。A 87例のrCDI患者におけるMDR菌の有病率。B 長期フォローアップ（～FMT後1～3年）検体が採取された22人の患者におけるコロニー形成率。C メタゲノムデータに基づくMDR菌の存在量。D 種ごとのメタゲノムシーケンスデータにおけるMDR菌のカバー範囲の広さと相対的存在量。アスタリスクは統計的に有意な差を示す、*：p＜0.05、**：p＜0.01、n.s.：有意ではない、MDR：多剤耐性、FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期フォローアップ。
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表1 培養した多剤耐性菌の遺伝子型と表現型の概要
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多剤耐性菌の全ゲノムシークエンシングとメタゲノミクスとの比較から、rCDI患者ではFMT前がFMT後よりもMDR菌の存在量が多いことが明らかになった
次に、WGSを用いて分離株の耐性遺伝子型を確認し、分離株データと糞便メタゲノミクスを組み合わせて、腸内細菌叢におけるMDR菌の存在量を定量した。多剤耐性菌の培養分離株24株をWGSに供した。1つのゲノムを除くすべてのゲノムで、耐性表現型に関連するARGを検出することができた。例えば、ESBL産生菌に分類された分離株ではESBL遺伝子が検出された（表1；追加ファイル1：図S1-3）。さらに、エッセイ感受性を比較し、微生物叢における相対的な存在量を決定するために、メタゲノミックリードをアセンブルした分離株ゲノムにマッピングした。抗生物質で前処置された患者において予想されたように、rCDI患者ではFMT後よりもFMT前の方がMDR菌の存在量が多いことがわかった（図2C；p＝0.0159）。様々な深さのメタゲノムから、MDR分離株のほぼ完全なゲノムが検出された（図2D）。メタゲノムで半分以下（43％）しかカバーされていないCitrobacter freundiiゲノムは1株だけであった。次に、WGSデータで検出された耐性遺伝子とメタゲノムデータで検出された耐性遺伝子を比較し、培養と比較したメタゲノムシーケンスの感度を推定した。培養分離株のこれらの耐性遺伝子は、それぞれのメタゲノムでも検出された（表1）。さらに、患者P44のメタゲノムデータは、FMT前のサンプルではESBL産生大腸菌の存在を示唆したが、培養ではFMT後の糞便でのみ検出された。これらのデータから、細菌培養とメタゲノムシークエンシングを組み合わせることで、相乗的に利用でき、どちらか一方のみの方法よりも詳細な結果が得られることが示唆された。まとめると、FMT後にMDR菌の有病率と存在量の両方が減少することがわかった。
FMTは腸内細菌叢をよりドナー的にし、長期的にも腸内細菌叢を減少させる
FMTがこのコホートの腸内細菌叢にどのような影響を与えたかをより深く理解するために、MetaPhlAn4を用いてドナーとレシピエントの糞便メタゲノムをプロファイリングした。ドナーは、Bacillota属（旧Firmicutes属）、Bacteroidota属（旧Bacteroidetes属）、Actinomycetota属（旧Actinobacteria属）が優勢な微生物叢を有していた。Enterobacteralesはドナー便26/70例（37％）に0.01％程度存在した（図3A、B）。FMTの前に抗CDI治療（53×バンコマイシン、6×フィダキソマイシン、1×メトロニダゾール、1×メトロニダゾール＋バンコマイシン、2不明）を受けたrCDI患者では、放線菌門とバクテロイーダ門の存在はかなり少なく、一方、プロテオバクテリア（主にEscherichia coliまたはKlebsiella pneumoniae）が優勢であることが多かった（31/63人＝49％で50％を超える存在率；Additional file 1: 図S4B）。腸内細菌は、FMT前のすべての患者の便に存在した（図3A）。FMT後まもなく、Enterobacteralesの有病率は58/63人（92％；p＝0.0253）に低下し、存在量も同様に減少した（図3B；調整後p＜0.0001）。FMT後の長期的な観察では、Enterobacteralesの有病率は変化しなかったが（18/21 = 86%; p = 0.655、FMT後3週間と比較）、存在量はさらに減少し（調整後p = 0.025）、ドナーのものと区別できなくなった（p = 0.09）。
図3
図3
糞便ドナーと糞便微生物移植レシピエントにおけるEnterobacteralesの有病率と存在量。A MetaPhlAn4によって決定されたメタゲノムにおけるEnterobacteralesの相対的存在量。B FMTの1日前（Pre）、FMTの3週間後（Post）、およびFMTの1～3年後（長期フォローアップ、LTFU）に採取した便ドナーとFMTを受けたrCDI患者におけるEnterobacteralesの総存在量。：p＜0.05、**：p＜0.0001。FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期追跡調査
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さらに、PCAを用いてドナーと患者のメタゲノムの種構成を調べた（図4A）。患者の種組成は、すべての時点でドナーのものと異なっていた（PERMANOVA: overall p = 0.001, pre-FMT p = 0.003, post-FMT p = 0.014, LTFU p = 0.014; PERMDISP: p < 0.0001）。しかし、FMT後、患者の微生物叢はドナーの微生物叢とより類似していた（図4B；p＜0.0001）。この微生物叢の変化は、少なくとも部分的にはFMTに起因するものであり、抗生物質使用後の回復のみに起因するものではないようである。このことは、FMT後の患者の微生物叢の種組成を、血縁関係のないドナーのサンプルに対して使用したドナーの微生物叢の種組成と比較することで示されている（Additional file 1: Fig.） 長期的には、FMTレシピエントの種組成はドナーのものから離れたが（FMT後対LTFU調整後p = 0.0008）、それでもFMT前よりはドナーに近かった（調整後p = 0.002）。
図4
図4
腸内細菌叢の組成と多様性の比較。メタゲノムの種組成はMetaPhlAn4によって決定された。A主成分分析（PCA）におけるAitchison距離で表したβ多様性。X軸とY軸のパーセンテージは、最初の2成分で説明される分散を表す。B 患者の種プロフィールから対応するドナーまでのAitchison距離。C-E 種の豊かさ、シャノン指数、シンプソン均等性をそれぞれドナーとレシピエント間で比較。アスタリスクは統計的に有意な差、****：p＜0.0001、FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期追跡調査。
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次に、ドナーと患者のメタゲノムの種プロファイル間のアルファ多様性を比較した。種の豊富さとシャノン多様性は、FMT前はrCDI患者よりもドナーの方が高く（図4C、D；調整後p＜0.0001）、FMT後は患者において劇的に増加し（調整後p＜0.0001）、ドナーと同じレベルまで上昇した（調整後p＞0.1）。リッチネスとシャノン指数は長期的に高いままであった。逆シンプソン指数またはシンプソン優性としても知られるシンプソン均等性は、ドナーと患者で差がなかった（図4E；調整後p＞0.3）。全体として、今回のデータは、rCDI患者では多様性が低く、FMTドナーでは多様性が高く、FMT後の患者では多様性が高まるという予想されたパターンを示している。FMT後、患者におけるEnterobacteralesの有病率と存在量の両方が減少した。
FMTは耐性遺伝子の存在量を減少させるが、その多様性は減少させない
同じメタゲノムシーケンスデータを用いて、カスタムアセンブリーベースのアプローチでレジストームを決定した。PCAを用いて、ドナーと患者のレジストーム組成の違いを定量化した（図5A）。ドナーのレジストームは類似しており、アミノグリコシド耐性、ジアミノピリミジン耐性、テトラサイクリン耐性のARGが同じであることが多かった（Additional file 1: 図S6）。一方、rCDI患者のレジストームは大きく異なっており（PERMANOVA, p = 0.003; PERMDISP, p < 0.0001）、β-ラクタム耐性、フルオロキノロン耐性、多剤排出ポンプのARGが異なっていた（Additional file 1: 図S6-7）。FMT後、患者のレジストームは、ドナーのレジストームとは異なるままであったが（p = 0.003）、ドナーのような組成へのシフトが見られた（図5B；調整後p < 0.0001）。長期経過観察では、レジストームはFMT後3週間の時点よりもドナー様でもドナー様でもなく（図5B；調整後p＝0.123）、依然としてドナーのものとは統計的に異なっていた（p＝0.012）。このようなレジストームの構成におけるドナーと患者の違いや、FMT後のシフトは、レジストームを抗生物質クラスごとの相対存在量として見た場合にも見られる（Additional file 1: 図S8）。
図5
図5
糞便ドナーと糞便微生物叢移植レシピエントのレジストームの概要。Aitchison距離に基づくレジストームの主成分分析（PCA）。X軸とY軸のパーセンテージは、最初の2成分で説明される分散を表す。B 患者の抗生物質耐性遺伝子プロファイルと対応するドナーのAitchison距離。C-F 抗生物質遺伝子の豊かさ、総存在量、Shannon指数、Simpson均等性をそれぞれグループ間およびレシピエントタイムポイント間で比較。アスタリスクは統計的に有意な差を示し、*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001。FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期追跡調査
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FMT前の患者の糞便メタゲノムには、ドナーよりも多くの異なる耐性遺伝子（高いレジストームリッチネス）が認められた（調整後p＜0.0001；図5C）。バンコマイシンの前治療期間はレジストームに有意な影響を及ぼさなかった（Additional file 1: Fig.） FMT後、患者のレジストームの豊富さは変化せず（調整後p＞0.1）、ドナーよりも高いままであった（FMT後短期：調整後p＜0.0001；長期：調整後p＝0.0002）。耐性遺伝子の総存在量も、FMT前の患者ではドナーよりも高かったが（図5D；調整後p＜0.0001）、レジストームの豊富さとは対照的に、患者ではFMT後まもなく存在量が減少した（p＝0.0003）。長期的には、存在量はさらに低下したが（調整後p = 0.02）、ドナーよりも高い値を維持していた（調整後p = 0.02）。シャノン指数は豊かさと存在量を組み合わせたもので、同様にレジストームの多様性はドナーと比較してrCDI患者で高く、FMT後は減少することが示された（図5E）。シンプソン均等性（Simpson evenness）は、ドナーと患者の間に統計的な差は見られなかったが（図5F；調整後p＞0.1）、FMT後の患者ではレジストームの多様性が減少することが示された（p＝0.017）。要約すると、FMTはARGの相対的存在量を低下させることにより、レシピエントのレジストームの多様性を変化させるようである。
我々は、異なる抗生物質クラスからのARGの異なる有病率と存在量のパターンを観察した（追加ファイル1：図S6-8）。このことをさらに調べるために、ドナーと患者の両方に遺伝子が存在するクラスを選択し、2つのグループに分けた。1つのグループ（β-ラクタマーゼ、フルオロキノロン、多剤排出ポンプ）は、ドナーではまれで、患者では一般的で豊富な遺伝子で構成されている（Additional file 1: Figure S10 A-C and G-I）。このグループの遺伝子の存在量はFMT後すぐに減少したが、レジストームの豊富さは長期的にのみ減少した。番目のグループ（アミノグリコシド、ジアミノピリミジン、テトラサイクリン）はドナーに多い（Additional file 1: Figure S10D-F and J-L）。このドナーに関連するグループの遺伝子がレシピエントに移行した結果、FMT後にレジストームの濃度が高くなった可能性があり、その存在量はFMT後も減少しなかった。これらの結果から、FMTがレジストームに及ぼす影響は、抗生物質の種類や遺伝子を保有する分類群によって異なることが明らかになった。
驚くべき耐性
レジストームデータから、またドナーの糞便からも、多くのESBL遺伝子が検出された。さらに、カルバペナマーゼ遺伝子と1つのコリスチン耐性遺伝子（mrc-10_1、プラスミド上にあると予測される）は、FMT前のrCDI患者でのみ検出された。バンコマイシン遺伝子は、メタゲノミクスによってFMT前の患者63人中7人（11.1％）とFMT後の患者63人中11人（17.5％）で検出された。さらに、FMT後の便からバンコマイシン耐性のEnterococcus faecalisが検出されたが、これはペニシリン感受性であったため、MDROには指定されなかった。これらの耐性およびプラスミド上にあると予測される耐性については、補足結果および図S11、S12、S13（追加ファイル2；追加ファイル1：図S11-13）で詳述する。
プラスミドを介した抗生物質耐性は依然として高いと予測される
我々は、FMT後のレジストームの相対的な持続性はプラスミドに関連している可能性があると仮定した。これを検証するため、viralVerifyのプラスミド予測アルゴリズムを使用し、耐性遺伝子を持つコンティグが染色体に由来し、プラスミドに由来する可能性が高いかを評価した。耐性遺伝子の大部分（4567 / 6662、68.6％）は染色体に由来すると予測され、400（6％）はプラスミドに由来すると考えられた。残りの1695個（25.4%）のARGを持つコンティグは、プラスミドと染色体のどちらにも確実に分類できなかった。一般的なレジストームパターンに従ってFMT後に減少する染色体レジストとは異なり（図6A-C）、プラスミド由来のARGのレジストームリッチネス、存在量、多様性はrCDI患者でドナーより高く、FMT後も高いままであった（調整p≦0.01；図6D-F）。この効果はFMT後3年まで持続したことから、FMTはプラスミドを介した抗生物質耐性に有意な影響を与えない可能性が示唆された。
図6
図6
染色体耐性遺伝子とプラスミド関連耐性遺伝子のレジストーム比較。viralVerifyを用いて、抗生物質遺伝子を持つスキャフォールドが染色体またはプラスミドに由来すると予測された。A 染色体と予測されたスキャフォールドのレジストームリッチネス、B 総存在量、C シャノン指数。D-F プラスミド由来と予測されたスキャフォールドの同じパラメータ。統計的に有意な差はアスタリスクで示す、*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001. FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期追跡調査
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考察
我々の今回の研究は、細菌培養技術とメタゲノム配列決定の長所を活用し、FMT後の数週間から数年間の腸管における抗生物質耐性菌の包括的な見解を提供するものである。我々は、FMTによりMDR菌の有病率と存在量が減少し、より多様でドナーに近い微生物叢とARG組成になったことを見出した。しかし、患者のレジストームは、1-3年の追跡調査においてもドナーのものと異なるままであった。本研究は、FMT後の追跡調査において、奏効者の数が限定され、かつ時間が変動するものであるが、rCDI患者のレジストームに対するFMTの長期的効果についてユニークな知見を提供するものである。抗生物質耐性の持続とCDI再発との相関があるかどうかは、我々のコホートにおける再発数が限られていることから評価できなかった。
FMT後のレシピエントのレジストームの解釈には、移植前のレシピエントのレジストームとドナーのレジストームの特徴を考慮する必要がある。われわれの患者コホートはほとんどが高齢者で、合併症が大きく、再発性C. difficile感染症に対する複数コースの抗生物質治療によって腸内細菌叢が乱れている。これにより腸内レジストームが変化することが報告されている [61] 。対照的に、健常人の腸内には主に嫌気性常在菌が生息しており、これらの常在菌はアミノグリコシドやテトラサイクリンの耐性遺伝子を持っていることが多い [62] 。われわれの結果は、これらの抗生物質耐性菌が便提供者にもrCDI患者にも共通して存在することを示している。FMT後に観察されたレシピエントのレジストーム組成の変化は、おそらく嫌気性常在菌の導入の反映であり、その結果、様々な抗生物質クラスに対するFMTの効果が異なっている [63]。一部のARGや予測されるプラスミドはFMT後もレシピエントに残存しており、したがってレジストーム組成はドナーのものとは異なるままであった。
FMT後のMDR菌による感染症の有病率に対するFMTの効果に関するデータはないが、他の患者群では、FMTが感染症のリスクを低下させたり［64、65］、MDR感染症の発症を遅らせたりすることが判明している［34］。FMT後にMDR菌が根絶されないと仮定すると、例えば抗生物質により腸内環境がMDR菌の増殖に適した環境になった場合、依然として感染のリスクが存在する可能性がある[14,15,16]。それにもかかわらず、FMTは、患者の腸内がMDR菌で脱コロニーされていなくても、MDR菌による感染数を減少させる可能性がある[66]。そのメカニズムとしては、FMTによって腸内細菌叢が、例えば栄養競合 [67, 68]、短鎖脂肪酸産生の回復 [69, 70]、バクテリオシンの産生 [71] などによって、MDR保菌菌 [64] に強いバランスのとれた状態に回復されるという仮説がある。このような状況は、感染感受性の低下または感染抵抗性と表現されるかもしれない。我々のデータは、微生物叢の分類学的構成がどのようにしてMDR感染の減少をもたらすかについて、新たな詳細を示している。
抗生物質治療は細菌に影響を与えるだけでなく、真菌の増殖も引き起こす可能性がある [72,73,74]。我々は最近、ITS2配列決定法を用いて、CDI患者は対照群と比較してカンジダ属菌の存在量が増加し、アスペルギルス属菌とペニシリウム属菌の存在量が減少することを見出したが[75]、本研究のショットガンメタゲノムアプローチでは、5検体で検出された相対存在量の中央値が0.003％と、真菌を検出するには不十分であった。したがって、FMTに関連するマイコバイオーム、および真菌レジストームの役割をさらに解明するためには、より的を絞った実験が必要である。
我々のレジストーム研究は、公開されているデータベースにおけるARGのアノテーションや、細胞内局在の予測ツール（染色体またはプラスミドベース）により制限されており、ARGを特定の菌種に明確に結びつけることはできない。さらに、我々が使用した方法では、抗生物質に対する耐性を付与する染色体点突然変異は含まれておらず、これはしばしば生物種に関連付けることができる。今後のハイスループットな細菌培養の取り組みによって、これまで解明されていなかったARG、どのような種がARGを保有しているのか、そしてどのような遺伝的要素なのかが明らかになるだろう[76]。多様な環境から得られたこのような改良された培養法は、エンテロバクター属のようなグラム陰性病原体が相対的に過剰に発現しているゲノムデータベースの偏りを緩和するのに役立つだろう。最近の大規模な解析では、臨床的に最も関連性の高いARGは特定の分類群に限定されていることが指摘されており、特にエンテロバクター属とバクテロイデス属が顕著である[77]。抗生物質耐性菌の置換には感受性株の導入が必要な場合があり [34]、このことは、われわれのデータと合わせて、抗生物質感受性Enterobacteralesを保有するFMTドナーの役割を示唆しているのかもしれない。FMTは特定の細菌の数を減少させたり除去したりする可能性があるが、水平的遺伝子導入は、ARGが存続する細菌または新たに獲得された細菌に導入された場合、ARGの存続につながる可能性がある。プラスミドは、細菌間でのDNAの移動を促進する潜在的な可動性遺伝要素である。プラスミドを介した抗生物質耐性は世界的に増加している問題であり、特にEnterobacteralesに関連している[78, 79]。しかしながら、腸内細菌叢における抗生物質耐性遺伝子のほとんどは染色体上にコードされていると予測されるが、これらのARGが移動性遺伝要素上に存在する可能性を排除することはできない。耐性遺伝子の移動性を評価するためには、Meta-HiC [62]やOIL-PCR [80]のような、ARGと宿主生物を結びつけることのできる技術が必要である。
結論
我々の研究は、腸内のMDR菌の除菌にFMTを用いることの可能性と限界について指摘している。FMT前後のレジストーム解析（1～3年のLTFUを含む）に基づき、FMTはレシピエントのレジストームに有意な変化をもたらし、それはEnterobacteralesの存在量の減少と関連している可能性があることがわかった。しかしながら、特定のレシピエントARGが持続することもわかった。この持続性の臨床的影響は本研究には含まれておらず、FMT治療を受けた患者の大規模コホートにおけるさらなる解析が必要である。MDR除菌の可能性をよりよく評価するためには、ARGを細菌分類群や宿主の腸内生態系に関連付けることができる古典的な微生物学的手法と組み合わせた、より大規模な（無作為化対照）試験やマルチオミクス研究が必要である。さらに、FMTに関する地域、国内、国際的な登録の利用は、さまざまな患者集団における感染リスクを評価するための長期的データの収集に役立つ[81, 82]。このような登録は、MDR関連の転帰を追跡する以外にも、CDIの再発や発がん性細菌など、他の長期的な微生物関連リスクの評価を容易にする [49, 83, 84]。最後に、レジストームの違いを説明し、より一般化可能な結果を得るためには、対照患者やより多様な患者を対象とした研究が必要である。これにより、感染感受性患者における抗生物質耐性を制御するためのFMTの実行可能性を評価する道が開かれるであろう。
データおよび資料の入手可能性
本研究のために作成されたシーケンスリードは、European Nucleotide Archiveのプロジェクト番号PRJEB64622（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB64622）[48]、PRJEB44737（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB44737）[50]、PRJEB64621（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB64621）[51]で入手可能である。解析結果の再現と図の生成のためのコードは、Zenodo (https://doi.org/https://doi.org/10.5281/zenodo.10276220) [60]で入手できる。
略語
CDI：
クロストリジオイデス・ディフィシル感染症
FMT：
糞便微生物叢移植
rCDI：
多発性再発性C. difficile感染症
MDR：
多剤耐性
ESBL
Extended-spectrum β-ラクタマーゼ
RCT
無作為化比較試験
ARG
抗生物質耐性遺伝子
NDFB
オランダドナー糞バンク
LTFU：
長期フォローアップ
VRE
バンコマイシン耐性腸球菌
MRSA
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
MALDI-TOF：
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間法
WGS：
全ゲノムシーケンス
RPKM
100万塩基あたりのリード数
ENA：
ヨーロピアンヌクレオチドアーカイブ
PCA：
主成分分析
ANOVA：分散分析
分散分析
IQR：
四分位範囲
PERMANOVA：
順序分散分析
PERMDISP：
多変量分散のパーミュテーショナル分析
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参考文献ダウンロード
謝辞
MDR菌の培養にはLUMCのExperimental BacteriologyグループのEric K.L. BerssenbruggeとIngrid M.G.J. Sandersに感謝する。オランダ・ドナー糞バンクのHein W. Verspaget教授には、継続的な支援と監督をいただいた。また、DNA塩基配列決定を提供してくれたGenomeScan B.V.にも感謝する。最後に、LUMCのExperimental Bacteriology groupとCenter for Microbiome Analyses and Therapeuticsには有意義な議論を、特にWiep Klaas Smits博士には原稿へのフィードバックをいただいた。
資金提供
The Netherlands Donor Feces Bankは、Vedanta Biosciences社から無制限の研究助成を受けている。
著者情報
著者および所属
オランダ・ドナー糞便バンク、ライデン大学感染症センター（LUCID）医療微生物学・感染予防、ライデン大学医療センター、私書箱9600、ポストゾーンE4-P、ライデン、2300RC、オランダ
Sam Nooij、Karuna E. W. Vendrik、Josbert J. Keller、Elisabeth M. Terveer
ライデン大学医療センター、マイクロバイオーム解析・治療センター、LUCIDリサーチ、ライデン、オランダ
Sam Nooij、Karuna E. W. Vendrik、Romy D. Zwittink、Quinten R. Ducarmon、Ed J. Kuijper & Elisabeth M. Terveer
オランダ、ハーググランデン医療センター、消化器科
ヨスバート・J・ケラー
現住所 オランダ公衆衛生環境研究所感染症管理センター（オランダ、ビルホーフェン
カルナ・E・W・ヴェンドリック、ロミー・D・ズウィッティンク
コンソーシアム
オランダ・ドナー糞便バンク研究グループを代表して
貢献
SN、KEWV、RDZ、EJK、EMTが研究のコンセプト立案と設計を行った。QRD、EJK、EMTが研究を監督した。KEWV、JJK、EJK、EMTが患者の治療を監督した。KEWVは臨床データおよび微生物学的データの収集と解析を行った。SNはゲノム解析、メタゲノム解析、統計解析を行い、原稿を作成した。著者全員が最終原稿を読み、承認した。
責任著者
Sam Nooijまで。
倫理申告
倫理承認と参加同意
すべての患者とドナーから、糞便サンプルの使用と追跡調査データについて、書面によるインフォームド・コンセントを得た。ライデン大学医療センターの地元の医療倫理委員会により、NDFBのプロトコールと実施について倫理的承認を得た（参考文献：P15.145、長期追跡：B21.49）。本研究はヘルシンキ宣言の原則に準拠している。
論文発表の同意
該当なし。
競合利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保つ。
補足情報
追加ファイル1： 図S1.
アミノグリコシド系およびフルオロキノロン系抗菌薬に耐性を示す大腸菌5株から検出された抗生物質耐性遺伝子。図S2. Extended-spectrum β-ラクタマーゼ産生大腸菌およびCitrobacter freundii分離株で検出された抗生物質耐性遺伝子。図S3. Enterobacter hormaechei_A株、Klebsielle pneumoniae株、Morganella morganii株およびProteus mirabilis株から検出された耐性遺伝子。図S4. FMTドナーとレシピエントの糞便メタゲノムの分類学的組成。図S5. 63人のFMT後レシピエントの種組成と8人の使用済みドナーおよび無関係なドナーの種組成とのAitchison距離。図S6. FMTドナーとレシピエントの糞便メタゲノムにおける抗生物質耐性遺伝子の出現率と存在量。図S7. FMTドナーとレシピエントの糞便メタゲノムにおける他のクラスの抗生物質耐性遺伝子の出現率と存在量。図S8. 抗生物質クラスの相対的な存在量としてのレジストーム構成。図S9. レジストームパラメーターとバンコマイシン前処理期間（日単位）との比較。図S10. 選択したクラスの抗生物質遺伝子の豊富さと存在量。図S11. 臨床的に重要性の高い抗生物質耐性遺伝子。図S12. プラスミド上に存在すると予測される抗生物質耐性遺伝子の概要（パート1/2）。図S13. プラスミド上に存在すると予測される抗生物質耐性遺伝子の概要（その2/2）。
追加ファイル2：補足結果
. カルバペネマーゼ、ESBL、コリスチンおよびバンコマイシン耐性をコードする抗生物質耐性遺伝子の検出に関する追加情報。
権利と許可
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にはその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても使用、共有、翻案、配布、複製を許可する。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを閲覧するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記に別段の記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用される。
転載と許可
この記事について
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この記事の引用
Nooij,S.、Vendrik,K.E.W.、Zwittink,R.D.他、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile）感染症再発患者における多剤耐性菌のコロニー形成とレジストーム量に対する糞便微生物叢移植の長期的有益効果。Genome Med 16, 37 (2024). https://doi.org/10.1186/s13073-024-01306-7
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受領
2023年8月23日
受理
2024年2月13日
掲載
2024年2月28日
DOI
https://doi.org/10.1186/s13073-024-01306-7
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キーワード
C.ディフ
抗生物質耐性
MDRO
糞便微生物叢移植
ゲノム医学
ISSN: 1756-994X
お問い合わせ
投稿に関するお問い合わせ: editorial@genomemedicine.com
一般的なお問い合わせ: info@biomedcentral.com
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