ホメオスタシス的腸-脳インスリン拮抗薬が神経刺激による脂肪減少を抑制する

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ホメオスタシス的腸-脳インスリン拮抗薬が神経刺激による脂肪減少を抑制する

ネイチャー・コミュニケーションズ 15巻、論文番号：6869（2024）この記事を引用する

概要

線虫において、末梢臓器が神経系に内部状態の情報を伝達するメカニズムは未解明であるが、そのようなシグナルが存在することを示唆する強い証拠がある。ここで我々は、腸内分泌ペプチドとして機能し、腸の特殊な細胞から分泌されるINS-7と呼ばれる祖先インスリンスーパーファミリーのペプチドを発見したので報告する。INS-7の分泌は食物の禁断によって刺激され、絶食時には増加し、末梢で脂肪減少を促す神経ペプチドの放出を減弱させる、正真正銘の腸から脳へのペプチドとして働く。従って、INS-7は腸からの恒常性シグナルとして機能し、食物不足時に脂肪減少を刺激する神経細胞の駆動をゲートする。メカニズム的には、INS-7は正統的なDAF-2レセプターのアンタゴニストとして機能し、ASIニューロンにおいてFOXOとAMPKシグナルを介して機能する。系統学的解析から、INS-7は、従来の哺乳類のインスリンやIGFペプチドよりも、広範なインスリン／リラキシンスーパーファミリーのメンバーに類似していることが示唆された。腸内分泌機能を持つ特殊な腸細胞から分泌される内因性インスリンアンタゴニストの発見は、腸の予期せぬ重要な性質と、神経細胞機能を指令する腸の役割を示唆している。

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はじめに

中枢神経系は、種を超えて全身の脂質ホメオスタシスを制御する上で重要な役割を果たしていることが知られている1,2,3。また現在では、内分泌ホルモンが末梢の器官からシグナルを発して、神経系を含む全身4,5にわたって摂食・絶食状態の情報を伝達することも理解されている6,7。例えば、腸は卓越した感覚・代謝器官として登場し、腸ホルモンを介して体内状態の情報を脳や体内の他の重要な器官に伝達している8,9,10,11。神経系にインターオセプティブな情報を伝える内分泌シグナルは、まだ多く発見されていない。線虫C.elegansでは、神経系は、脂質が貯蔵され代謝される主要な器官である腸12における脂肪の恒常性の調節に重要な役割を果たしている13。いくつかの感覚ニューロンとその回路が、脂肪利用の速度と程度を制御していることが知られている。これらのニューロンは、環境からの異なる感覚情報源を検出し、それに反応するため、脂質の恒常性の制御において、個々の感覚様式に役割を割り当てることが可能になってきた。我々のグループによる以前の研究では、URXとBAGニューロンを介した酸素感知（正常酸素濃度域で）14、ADLニューロンを介した個体密度感知15、セロトニン作動性ADFニューロンを介したバクテリアの食物感知が、脂質の貯蔵に強く影響することが示されている16。これらの研究や他の研究17,18から、線虫は行動、生理、寿命を最適化するために、脂質代謝を感覚環境に適合させていることが明らかになっている。

線虫の神経系の興味深い特徴は、感覚ニューロンが腸を直接支配していないことである16,19。神経系からの感覚情報がどのようにして腸に伝達されるのかという疑問に取り組むため、われわれは以前に遺伝子スクリーニングを行い、哺乳類のタキキキニンファミリーの祖先オルソログであるFLP-7と呼ばれる脳から腸への神経内分泌ペプチドを発見した。FLP-7神経ペプチドはニューロンから分泌され、哺乳類のニューロキニン2受容体（NK2R）のオルソログであるGタンパク質共役型受容体NPR-22によって検出される。我々は生きた動物でFLP-7分泌を測定するアッセイ法を開発し、FLP-7がセロトニン作動性ニューロンとオクトパミン作動性ニューロンの機能の変動に比例してASIと呼ばれる神経分泌細胞から分泌されることを示した20。さらに、FLP-7の分泌は酸素を感知するURXニューロンや集団密度を感知するADLニューロンによっても調節される（補足図1a-d）。このように、FLP-7/NPR-22神経内分泌軸は、感覚神経系が脂質代謝調節のための情報を腸に伝える、脳から腸への最終的な共通経路である12。

これらの研究の過程で、私たちは腸が代謝情報を神経系に伝えている可能性を考えた。私たちや他の研究者から、線虫の腸が、病原体回避の制御21、嫌悪刺激の回避22,23、リズム行動の制御24、セロトニンの産生とシグナル伝達25、酸素感知26など、異なる器官と連絡を取り合っていることが示唆された。しかし、代謝機能を制御する明確な腸-脳間分子は見つかっておらず、線虫の腸自体が腸内分泌ペプチドを分泌しているかどうかも明らかではなかった。このような分子を同定する一つの障壁は、遺伝学的スクリーニングに適した神経細胞の機能と出力の読み出しがないことであった。FLP-7分泌アッセイがこのような制限を回避できる代謝に関連した実験ハンドルであることを証明できるかどうかを調べるために、我々はASIニューロンからのFLP-7分泌（以下FLP-7ASIと呼ぶ）が腸の脂肪貯蔵量を減少させることによって調節される程度を測定した。以前に腸の脂肪を枯渇させることが示された脂質合成経路の異なる遺伝子（pod-2,acyl CoA Carboxylase; sbp-1, Sterol Regulatory Element Binding Protein; elo-2, Fatty Acid Elongase）を不活性化すると、定常状態のFLP-7ASI分泌が増加した（補足図1e）。この観察に促されて、我々は腸から脳への情報伝達の基礎となる分子的特徴を同定し、定義するための調査を行った。

結果

腸ペプチドとしてのINS-7の発見

私たちは、脂質代謝の文脈では、内部状態の情報を伝達する分子は腸に由来するのではないかと考えた。なぜなら、線虫では腸は貯蔵脂質の主要な体性貯蔵庫だからである。そのようなシグナルを見つけるために、ASIニューロンからのFLP-7分泌の変化について、小さなペプチドをコードする遺伝子ファミリーの腸特異的RNAiを介したスクリーニングを行った（図1a）。ins-7と呼ばれるペプチドをコードする遺伝子は、スクリーニングから最も強力なヒットとして現れた（図1b, c）。Fペプチドドメインを含む遺伝子の大部分を欠損した変異対立遺伝子tm1907と、我々が新たに作製したCRISPR欠損対立遺伝子ssr1532（図1d-f）は、RNAiの効果を再現した：ins-7を欠損させると、FLP-7ASIの分泌が2倍近く増加した（図1g, h）。INS-7は広範なインスリン／リラキシンスーパーファミリーに属するペプチドで、線虫では40のメンバー（ヒトでは10）が存在し、発生段階や組織特異的な発現パターンによって区別されると考えられている29,30。線虫のins-7は成体で選択的に発現する数少ないins遺伝子の一つであることが報告されている30。成体特異的に発現するins-19と呼ばれる第二の遺伝子は、FLP-7ASI分泌アッセイでは表現型を示さなかった。

図1：FLP-7制御遺伝子としてのins-7の発見。

b ASI::FLP-7mCherryと CLM::GFPを導入したsid-1;Pvha-6::sid-1動物をベクターまたはins-7RNAiで処理した代表的な画像。左側はGFP発現、中央は分泌されたFLP-7mCherry。スケールバー、5μm。c単一の骨髄球内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。データはベクターRNAiで処理した動物のFLP-7mCherry蛍光強度を正規化した割合±SEMで表した。**p= 0.0064（両側検定）。dCRISPR-Cas9を介したゲノム編集の戦略。ins-7のゲノム領域とins-7(ssr1532)のCas9切断部位を示す。導入されたEcoRI制限部位（緑）と切断・修復後の二重停止コドン（赤）の位置は示した通りである。ins - 7 (tm1907)対立遺伝子の欠失領域には印をつけた。汎アクチン（アクチン-1 、-3 、-4）mRNAをコントロールとして用いた。野生型とins-7(ssr1532)の n= 3生物学的複製。**野生型またはins-7(ssr1532)動物におけるINS-7ペプチドのAlphaFold(DeepMind)による構造予測89,90 。ins-7 ( ssr 1532)ヌル対立遺伝子はins-7遺伝子の切断で、116個のアミノ酸のうち最初の18個だけが発現する。左のパネルは骨膜細胞におけるGFPの発現、中央のパネルは骨膜細胞におけるFLP-7mCherryの分泌、右のパネルはマージ。スケールバー、5μm。h各遺伝子型のCLM::GFP発現面積に対して、1つの骨髄球内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、正規化した。データは野生型動物のFLP-7mCherry蛍光強度を正規化したものに対するパーセンテージ±SEMで表した。p値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とTukeyのポストホック検定を用いて算出した。野生型 vs.ins-7(tm1907);***p< 0.0001. 野生型 vs.ins-7(ssr1532);***p< 0.0001. ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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染色体外ins-7::GFPレポーター株とわれわれが作製した内在性転写GFPレポーターは、腸細胞の最初の四つ組に限定された強固な発現を示した（図2aおよび補足図2）。INT1と呼ばれるこれらの解剖学的に特殊な細胞は、上部腸管の最前部、咽頭の終球のすぐ後方に位置する31。この興味深い制限された発現パターンは、腸の全細胞（INT1-9、20細胞）16,27,28,32で広く発現している、私たちや他の研究者によって報告された多くの代謝遺伝子とは対照的である。腸特異的RNAi実験はINT1細胞におけるins-7発現の必要性を示唆したが、INT1細胞におけるins-7発現がFLP-7ASI分泌異常亢進をレスキューするのに十分であるかどうかを調べるために、ins-7内在性プロモーター、汎腸管プロモーターPvha-6、および新たに開発したINT1特異的プロモーターPges-1ΔBの下でins-7遺伝子の発現を回復させたins-7(ssr1532)欠損変異体のトランスジェニックレスキュー株を作製した（図2b-e）。INT1細胞における異種ins-7発現だけで、腸全体により広くins-7発現を回復させるのと同程度に、FLP-7ASI分泌を完全にレスキューするのに十分であることがわかった（図2b-e）。

図2：FLP-7ASIの分泌を制御するために、INS-7は腸細胞の最初のペアから機能する。

a Pins-7::GFPトランスジーンを導入したトランスジェニック動物の蛍光像。白矢印はINT1細胞でのGFP発現を示す。下パネル、DICマージ；スケールバー、100μm。ASI::FLP-7mCherryおよびCLM::GFP導入遺伝子を組み込んだ野生型およびins-7(ssr1532)動物の代表画像。NTは非トランスジェニック、TGはトランスジェニック。上段は骨膜細胞におけるGFP発現、中段は分泌されたFLP-7mCherry。スケールバー、5μm。c -e各遺伝子型について、1個の骨髄球内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。データは野生型動物のFLP-7mCherry蛍光強度を正規化したものに対するパーセンテージ±SEMで表した。p値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とSidakのpost hoc testを用いて算出した。n= (c)の左から21, 22, 28, 21。野生型 vs.ins-7(ssr1532);*p= 0.0174。野生型 vs.Pins-7::ins-7 NT;*p= 0.0183.ins-7(ssr1532)vs.Pins-7::ins-7 TG;**p= 0.0039. Pins-7::ins-7 NTvs.Pins-7::ins-7 TG;**p= 0.0037. n = (d)の左から14, 15, 16, 13. 野生型 vs.ins-7(ssr1532);*p= 0.0346。野生型 vs.Pvha-6::ins-7 NT;**p= 0.0084。Pvha-6::ins-7 NTvs.Pvha-6::ins-7 TG;*p= 0.0205.n= (e)の左から25, 25, 26, 21。野生型 vs.ins-7(ssr1532);*p= 0.0156. 野生型 vs.INT1::ins-7 NT;***p= 0.0006. INT1::ins-7 NTvs.INT1::ins-7 TG;*p= 0.0213.f単一の腔細胞内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。データはベクターRNAiで処理した動物の正規化FLP-7mCherry蛍光強度±SEMに対するパーセンテージで表した。***g野生型とINT1::ins-7 TGの両動物について、1個の腔細胞内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。データは野生型動物の正規化FLP-7mCherry蛍光強度±SEMに対するパーセンテージで表した。***p< 0.0001（両側検定）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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さらに、INT1特異的ins-7RNAiはFLP-7ASIの分泌を増加させ（図2fおよび補足図1f）、INT1細胞でins-7を過剰発現させるとFLP-7ASIの分泌が抑制された（図2g）。このことから、INS-7は神経細胞からのFLP-7ASI分泌を抑制するのに必要かつ十分な、腸からの指示的手がかりとして機能していることが示唆された。INT1細胞は線虫の腸の発生生物学的観点から最初に定義された。哺乳類の腸上皮の腸内分泌細胞、杯細胞、免疫M細胞31,33,34とは異なり、INT2-9の従来の腸上皮細胞よりも短い微絨毛を持つ。腸の最前部に位置するこの細胞はまた、入ってくる栄養素に解剖学的にアクセスしやすいことを示唆している。

われわれはins-7のさらなる表現型を明らかにしたいと考えた。以前の研究で、我々はASIニューロンからのFLP-7分泌を刺激すると、その同族レセプターであるNPR-22が腸で活性化されることを示した。従って、FLP-7ASIの分泌を増加させるような条件下では、ATGL-1を介して腸内に蓄積された脂肪の加水分解が誘発され、それに伴ってエネルギー消費も増加すると予測される。従って、FLP-7ASI分泌を増加させるins-7欠損変異体（図1g, h）では、脂肪蓄積量が有意に減少することがわかった（図3aおよび補足図3a）。この脂肪蓄積の減少はflp-7遺伝子の存在に完全に依存していた。なぜならins-7;flp-7変異体は腸内脂肪減少に対するins-7の効果を抑制するからである（図3a）。次に、アンチセンス阻害によってASIニューロンのflp-7を選択的に不活性化したところ、ins-7変異体の脂肪表現型はASIニューロンのflp-7の存在を必要とすることがわかった（図3b）。さらに、ins-7;flp-7二重変異体におけるASI特異的flp-7レスキューは、ins-7変異体の程度まで脂肪減少を促進するのに十分であった（図3c）。従って、ins-7突然変異体の脂肪表現型はASIニューロンからのflp-7に完全に依存している。腸における脂肪蓄積の減少は、酸素消費量から判断したins-7突然変異体の最大エネルギー消費量の予想された増加によって裏付けられたが、これもflp-7に依存していた（図3d、e）。予測されたように、ins-7ヌルの腸内脂肪貯蔵量の減少はatgl-1誘導に依存しており（図3f, g）、このatgl-1発現の増加はflp-7遺伝子の存在に完全に依存していた（図3h）。さらに、atgl-1をRNAiで不活化すると、ins-7の脂肪表現型は消失した（図3i）。腸内脂肪蓄積に対するins-7の影響は、摂食量や運動量には依存せず、ins-7変異体では変化しなかった（補足図3b-d）。INS-7を介した脂肪減少におけるINT1細胞の役割を確証するために、図2に記述したプロモーターを用いてins-7遺伝子導入レスキュー株を独立に作製し、腸内脂肪を測定した。その結果、すべてのケースでins-7欠損変異体の腸内脂肪蓄積量の減少が完全に回復することが観察され、やはりins-7がINT1細胞から広範な腸にわたって脂肪蓄積量を調節する機能を持つことが示唆された（図3j-l）。最後に、INT1細胞でins-7を過剰発現させると、腸全体の脂肪蓄積量がわずかではあるが有意に増加した（図3m）。

図3：腸内脂肪代謝におけるINS-7の役割。

a野生型、ins-7(ssr1532)、flp-7(ok2625)、およびins-7(ssr1532);flp-7(ok2625)動物を固定し、オイルレッドOで染色した。脂肪含量を遺伝子型ごとに定量し、野生型動物に対するパーセンテージ±SEMで表した。野生型対ins-7(ssr1532);***p< 0.0001.ins-7(ssr1532)対ins-7(ssr1532);flp-7(ok2625);***p< 0.0001.b,c野生型、ins-7(ssr1532)およびins-7(ssr1532);flp-7(ok2625)動物を固定し、オイルレッドOで染色した。脂肪含量は各遺伝子型について定量し、野生型動物に対するパーセンテージ±SEMで表した。p値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックのポストホック検定を用いて計算した。野生型 vs.ins-7(ssr1532); 野生型 vs.ins-7(ssr1532);ASI::flp-7 アンチセンスNT;ins-7(ssr1532)vs.ins-7(ssr1532);ASI::flp-7 アンチセンスTG;ins-7(ssr1532);ASI::flp-7 アンチセンスNTvs. ins-7(ssr1532);ASI::flp-7アンチセンスTG; ***p<0.0001、それぞれ(c)の左からn= 20, 20, 20, 20。野生型対ins-7(ssr1532); 野生型対ins-7(ssr1532);flp-7(ok2625);ASI::flp-7 TG;ins-7(ssr1532)対ins-7(ssr1532);flp-7(ok2625);ASI::flp-7 NT;ins-7(ssr1532);flp-7(ok2625);ASI::flp-7 NT対. d,e野生型、ins-7(ssr1532)、flp-7(ok2625)、ins-7(ssr1532);flp-7(ok2625)動物の酸素消費率(OCR)。基礎OCRはFCCP（50mM）添加前に定量し、最大OCRはFCCP刺激後に測定した。データはpmol/min/worm±SEMで示した。(d)の各時点における各遺伝子型のn数は、Source Dataファイルに記載されている。(e)のベースでは左から36, 21, 24, 36。(e)のマックスでは左から38, 27, 19, 19。p値は一元配置分散分析およびSidakのpost hoc検定を用いて算出した。野生型対ins-7(ssr1532);*p= 0.0197.ins-7(ssr1532)対ins-7(ssr1532);flp-7(ok2625);**p= 0.0014.f Patgl-1::GFP導入遺伝子を組み込んだ野生型およびins-7(ssr1532)動物の代表画像。g Patgl-1::GFP蛍光を測定し、野生型動物に対する割合±SEMで表した。***p< 0.0001 by unpairedt-test(two-tailed).hqPCRによるatgl-1mRNAの測定。コントロールとしてact-1mRNAを用いた。野生型、ins-7( ssr 1532)、flp-7(ok2625)およびins-7(ssr1532);flp-7(ok2625)についてn= 3生物学的複製。p値は一元配置分散分析およびSidakのポストホック検定を用いて計算した。野生型とins-7(ssr1532);flp-7(ok2625);***p< 0.0001.i野生型とins-7(ssr1532)をベクターまたはatgl-1RNAiで処理した動物を固定し、オイルレッドOで染色した。脂肪含量を各遺伝子型と条件について定量し、ベクターRNAiで処理した野生型動物に対する割合±SEMで表した。p値は二元配置ANOVAとSidakのpost hoc testを用いて計算した。ベクターRNAiの野生型 vs. ベクターRNAiのins-7( ssr 1532);***p< 0.0001. 0482.ins-7(ssr1532)on vector RNAi vs.ins-7(ssr1532)onatgl-1RNAi;***p< 0.0001.j-l野生型およびins-7(ssr1532)動物に指示したレスキュー導入遺伝子を固定し、オイルレッドOで染色した。脂肪含量は各遺伝子型について定量し、野生型動物に対するパーセンテージ±SEMで表した。p値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とTukeyのポストホック検定を用いて計算した。野生型 vs.ins-7(ssr1532); 野生型 vs.Pins-7::ins-7 NT;ins-7(ssr1532)vs.Pins-7::ins-7 TG;Pins-7::ins-7 NTvs.Pins-7::ins-7 TG;***p< 0.0001, respectively.n= 23, 20, 13, 7 from left to right in (k). 野生型 vs.ins-7(ssr1532); 野生型 vs.Pvha-6::ins-7 NT;ins-7(ssr1532)vs.Pvha-6::ins-7 TG;Pvha-6::ins-7 NTvs.Pvha-6::ins-7 TG;***p< 0.0001、それぞれ(l)の左からn= 23, 20, 10, 9。野生型対ins-7(ssr1532); 野生型対INT1::ins-7 NT;ins-7(ssr1532)対INT1::ins-7 TG;INT1::ins-7 NT対INT1::ins-7 TG;***p< 0.0001、それぞれ。m脂肪含量は野生型とINT1:: ins -7OX動物の両方で定量し、野生型動物±SEMの割合で表した。***p= 0.0002（両側検定）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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INS-7の作用機序

我々のデータは、ins-7が腸のINT1細胞で機能し、ニューロンからのFLP-7ASI分泌を負に制御し、腸全体の脂肪蓄積を制御するというモデルを支持する（図4a）。この臓器間情報伝達のモデルから、INS-7の作用機序を考えることになった。ins-7遺伝子の系統学的解析から、この遺伝子は従来の哺乳類のインスリン遺伝子であるIGF1や IGF2とは全く異なるクレードに属していることが示唆された36。ins-7の作用機序を調べるため、線虫の唯一のインスリン受容体であり37、単細胞RNAseqの結果、ASIニューロンで明らかに発現していることが明らかになった38、daf-2との関係を調べた。正統的なe1370対立遺伝子を用いると、daf-2変異体はFLP-7ASIの分泌が劇的に減少し、ins-7とは反対の表現型を示し、ins-7;daf-2変異体はdaf-2を表現することがわかった（図4c, d）。インスリンシグナルの主要な下流標的であるDAF-16/FOXOの欠失はFLP-7ASIの分泌に顕著な変化を与えなかったが、daf-2突然変異の効果は完全に抑制された（図4c, d）。FLP-7ASI分泌の減少というdaf-2の表現型は、神経系の他の場所でのdaf-2の発現に起因している可能性があった。この懸念に対処するため、ASIニューロン単独でdaf-2のアンチセンス阻害を行ったところ、グローバルなdaf-2変異が表現された（図4e, f）。RNAiが他のニューロンに広がるのを防ぐため39、sid-1(qt9)バックグラウンドでもdaf-2アンチセンス実験を行ったところ、野生型バックグラウンドで観察されたのと同様の表現型が見られた（図4g）。このように、daf-2ASIの欠損はFLP-7ASIの分泌を減少させた。さらに、daf-2のASI特異的トランスジェニックレスキューはFLP-7の分泌を野生型レベルまで回復させた（図4h, i）。これらのデータを総合すると、ins-7は daf-2に対抗して、つまりASIニューロンにおけるDAF-2レセプターに対する内因性アンタゴニストとして機能していることが最も一致した。神経系におけるINS-7の局所作用に関するこれまでの研究でも、DAF-2におけるINS-7の作用は拮抗的であると定義されている40が、末梢ではアゴニストとして機能する可能性がある41,42（「考察」の項を参照）。

図4：INS-7はDAF-2に対抗して機能する。

aASIニューロンからのFLP-7分泌を調節するINT1発現INS-7の役割を描いたモデル。INS-7はINT1細胞から分泌され、FLP-7ASIの分泌を阻害する。FLP-7は脂肪の大部分が貯蔵されるINT2-9に作用する。bINS-7とヒトのインスリン／リラキシンスーパーファミリーのメンバーのClustalOmega91による系統樹。c野生型、ins- 7 (ssr1532)、duf-2(e1370)、ins-7(ssr1532);duf-2(e1370)、duf-16(mu86)、およびduf-2(e1370) ; duf-16(mu86)動物の代表画像。上段は骨膜細胞におけるGFP発現、中段は分泌されたFLP-7mCherry。スケールバー、5μm。d各遺伝子型について、単一の骨髄球内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。n= 30, 24, 35, 24, 18, 23。p値は一元配置分散分析およびDunnettのT3ポストホックテストを用いて算出した。野生型 vs.ins-7(ssr1532); 野生型 vs.daf-2(e1370); 野生型 vs.ins-7(ssr1532);daf-2(e1370);ins-7(ssr1532)vs.daf-2( e1370 );ins-7(ssr1532)vs.ins-7(ssr1532);daf-2(e1370);daf-2(e1370)vs.daf-16(mu86);daf-2(e1370)vs.daf-16 (mu86);daf-16 (mu86) vs.daf-2(e1370)vs. daf-2(e1370) vs. daf-16(mu86);***p< 0.0001, respectively.e str-3プロモーターを用いてASIニューロンにおけるdaf-2の発現をアンチセンスにより不活化した野生型FLP-7ASI動物の代表的な画像。NTは非トランスジェニック、TGはトランスジェニック。f,g1個の腔細胞内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、各遺伝子型についてCLM::GFP発現面積に対して正規化した。データは野生型またはsid-1(qt9)動物のFLP-7mCherry蛍光強度を正規化したものに対するパーセンテージ±SEMで表した。p値は一元配置分散分析およびDunnettのT3ポストホック検定を用いて計算した。野生型対ASI::daf-2アンチセンスTG;*p= 0.0136。ASI::daf-2 アンチセンスNT対ASI::daf-2アンチセンスTG;**p= 0.0026.n= 16, 16, (g)の左から右へ10.sid-1(qt9)対sid-1(qt9);ASI::daf-2 アンチセンスTG;***p= 0.0003. sid-1(qt9);ASI::daf-2 antisense TG;***p< 0.0001.h ASI::FLP-7mCherryとCLM::GFPを組み込んだ野生型とdaf-2(e1370)動物の代表画像。NTは非トランスジェニック、TGはトランスジェニック。スケールバー、5μm。i各遺伝子型について、単一の腔細胞内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。n= 27, 28, 28, 28 左から右へ。p値は一元配置分散分析およびDunnettのT3ポストホックテストを用いて算出した。野生型 vs.daf-2(e1370);***p< 0.0001. 野生型 vs.daf-2(e1370);ASI::daf-2 NT;***p< 0.0001.daf-2(e1370)vs.daf-2(e1370);ASI::daf-2 TG;***p= 0.0008.daf-2(e1370);ASI::daf-2 NTvs.daf-2(e1370);ASI::daf-2 TG;***p= 0.0002. ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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我々のデータから示唆されるように、我々は、DAF-2の機能を直接調べることによって、INS-7が神経細胞DAF-2のアンタゴニストとして働くという仮説を検証した：様々な遺伝的背景におけるASIニューロン内のDAF-16局在を調べた。DAF-16の細胞質局在と核局在の比（C:N比と略される）によって測定されるDAF-16活性は、DAF-2機能の正確で高感度な特徴として長い間確立されてきた43,44,45。野生型のよく肥えた動物（ins-7と daf-2が存在する）では、DAF-16は主に細胞質に存在し、DAF-16のC:N比はおよそ1.2である（図5a, b）。インスリンシグナルが減少したdaf-2(e1370)変異体では、予想通りDAF-16/FOXOは核に移動し、C:N比は0.5に低下する（図5a, b）。しかしながら、ins-7(ssr1532)とins -7OXワムシでは、野生型動物に対するDAF-16局在のC:N比の逸脱も観察されなかった（図5a, b）。

図5：細胞内DAF-16局在化から、INS-7が絶食誘導拮抗薬としての役割を果たすことが明らかになった。

a,c DAF-16::GFP遺伝子を組み込んだコントロール、daf-2(e1370)、ins-7(ssr1532)、およびINT1::ins-7OX動物を摂食および3時間絶食条件下でDiI染色した代表的な画像。上段はDiI染色、中段はDAF-16::GFP、下段はマージ。神経細胞は閉じた矢頭（ASI）と開いた矢頭（ASKとADL）で示す。b,dコントロール、daf-2(e1370)、ins-7(ssr1532)、INT1::ins-7OX動物について、細胞質におけるDAF-16::GFPの平均強度を核におけるDAF-16::GFPの平均強度で割った。データは比率±SEMで表した。p値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とダネットのポストホック検定を用いて計算した。コントロール vs.daf-2(e1370);***p< 0.0001. コントロール対ins-7(ssr1532);nsp= 0.8409。コントロール対INT1::ins-7OX;nsp> 0.9999.n= (d)の左から6, 7, 6, 6。コントロール対daf-2(e1370);***p< 0.0001. コントロール対ins-7(ssr1532);nsp= 0.9851。コントロール対INT1::ins-7OX;***p< 0.0001.e3時間の絶食条件下でDiDで染色した内在性GFPタグ付きDAF-2を持つINT1::ins-7OX動物の代表的な画像。最初のパネル、DiD染色；2番目のパネル、DAF-2::GFP；3番目のパネル、INS-7mCherry；最後のパネル、DIC。スケールバー、10μm。DAF-2::GFP、INS-7mCherry、DiDの蛍光は3つの独立した実験で調べられ、同様の結果が得られた。f挿入図：(e)の破線で囲まれた領域の拡大図。神経細胞を閉じた矢頭（ASI）と開いた矢頭（ASKとADL）で示す。DAF-2::GFPとINS-7mCherryシグナルの共局在を矢印で示す。gDiD標識膜領域におけるDAF-2::GFPとINS-7mCherryシグナルの共局在。左パネル、DiD、DAF-2::GFP、INS-7mCherryチャネルのマージ。右パネル、DAF-2::GFPとINS-7mCherryチャネルのマージ。破線で示した領域が強度プロファイルの作成に使用された。下パネル、Fijiで作成した強度プロファイル。GFPとmCherryのピークが同じ位置で重なっていることに注意。DAF-2::GFPとINS-7mCherryシグナルの共局在を3つの独立した実験で調べたが、同様の結果が得られた。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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この結果は、ins-7が正常に機能する条件についてより深い検討を促した。従来のインスリン、IGF1およびIGF2は、豊富な食物の入手が可能な時や成長・発育期に分泌されるペプチドである。系統樹の結果、INS-7は異なるクレードに属することが示唆され（図4b）、INS-7の機能的役割はDAF-2と対立していたことから、インスリン受容体に対する生理的なアンタゴニストとして、INS-7は絶食状態で優先的に機能し、その時間的機能は十分に摂食された動物では完全には明らかにされないのではないかと推測した。そこで、3時間の絶食（腸内の脂肪蓄積の約80％を枯渇させるのに十分な時間である26）がDAF-16の局在に及ぼす影響を調べた。興味深いことに、絶食状態では、ASIニューロンにおけるDAF-16の局在は、野生型、daf-2(e1370)、ins-7(ssr1532)変異体において、以前に指摘された摂食状態の細胞質と核の間の比率からシフトしなかった。しかし、絶食状態では、INT1細胞からins-7をトランスジェニックに過剰発現させたワーム（INS-7OX）では、DAF-16の核への局在が有意にシフトした（C:N比0.8；図5c, d）。この結果は、daf-2(e1370)によってDAF-16の局在がC:Nで減少した効果（0.5）と似ている。さらに、3時間絶食させた野生型動物では、ASIニューロンの細胞表面に内因性DAF-2GFPとINT1発現INS-7mCherryの共局在が見られ、この条件下でリガンドと受容体が直接相互作用していることが示唆された（図5e-g）。これらの実験を総合すると、INS-7はDAF-2を介してASIの機能と出力を調節するという文脈において、絶食状態で優先的に拮抗的に機能することが示された。

複数の証拠が、DAF-16のシス結合部位を含む数百の遺伝子がインスリンシグナル伝達経路のエフェクターとして機能していることを示している42,46,47,48,49,50。これらのうち、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）は中心的な役割を担っており51,52、単細胞RNAseq研究38によると、ASIニューロンでも発現している。FLP-7分泌調節におけるASIニューロンの役割に関する我々の以前の研究20で述べたように、AMPKαサブユニットaak-2(ok524)変異体ではFLP-7ASI分泌が有意に増加していた（図6a, b）。aak-2変異体におけるFLP-7ASI分泌の増加が、神経系の他の場所にaak-2が存在しないことに起因する可能性を排除するため、ASIニューロンにおいてのみaak-2のアンチセンス阻害を行った。ASI特異的なaak-2のアンチセンス阻害は、グローバルなaak-2突然変異と似ていた（図6c, d）、すなわち、aak-2ASIの欠損はグローバルなaak-2の欠損と区別できない方法でFLP-7ASI分泌を増加させた。さらに、aak-2のASI特異的アンチセンス阻害は、daf-2(e1370)変異体のFLP-7ASI分泌を野生型動物と同程度に増加させた（図6c, d）ことから、ASIニューロンにおけるDAF-2、DAF-16、AMPKがFLP-7ASI分泌を調節するメカニズム的な関連性が確立された（図6e）。これらの結果を総合すると、INT1という特殊な腸細胞からのINS-7は、ASIニューロンの機能的出力を阻害してFLP-7の分泌を抑制し、腸全体（INT2-9）の脂肪減少を促進することが示された。この効果はINS-7が介在するDAF-2の拮抗作用と、ASIニューロンにおけるDAF-16/FOXOとAMPKシグナルを介したその下流の作用を介して起こる。

図6：絶食時と再栄養時のFLP-7ASI分泌動態はins-7によって制御されている。

a ASI::FLP-7mCherryおよびCLM::GFPを導入した野生型およびaak-2(ok524)動物の代表的な画像。上段は骨膜細胞におけるGFP発現、中段は骨膜細胞における分泌FLP-7mCherry、下段はマージ。スケールバー、5μm。b各遺伝子型について、単一の腔細胞内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。データは野生型動物のFLP-7mCherry蛍光強度を正規化したものに対するパーセンテージ±SEMで表した。n= 25野生型、n= 23aak-2(ok524)。***野生型と daf-2(e1370)FLP-7ASI動物の代表的な画像で、str-3プロモーターを用いてASIニューロンのaak-2発現をアンチセンスで不活化した。NTは非トランスジェニック、TGはトランスジェニック。スケールバー、5μm。d各遺伝子型について、単一の腔細胞内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。n= 42, 27, 23, 21, 46（左から順に）。p値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とSidakのpost hoc testを用いて算出した。野生型 vs.ASI::aak-2 アンチセンスTG;***p< 0.0001. 野生型対daf-2(e1370);ASI::aak-2アンチセンスNT;**p= 0.0017. 野生型対daf-2(e1370);ASI::aak-2アンチセンスTG;***p< 0.0001. ASI::aak-2アンチセンスNT対ASI::aak-2アンチセンスTG;***p< 0.0001.daf-2(e1370);ASI::aak-2アンチセンスNT対daf-2(e1370);ASI::aak-2アンチセンスTG;***p< 0.0001. eDAF-16/FOXOおよびAMPKシグナルを介したASIニューロンからのFLP-7分泌調節におけるDAF-2アンタゴニストとしてのINS-7の役割を描いたモデル。f-i絶食および再食時のFLP-7分泌動態を指示した時点で測定した。野生型およびins-7(ssr1532)動物について、各時点で、単一の腔細胞内のFLP-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。n= 22, 18, 15, 20 (f)の左から右へ。p値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とDunnettのポストホックテストを用いて算出した。p値は、一元配置分散分析およびTukeyのポストホック検定を用いて算出した。それぞれ***p < 0.0001。n= (h)の左から20, 17, 23, 24。p値は一元配置分散分析およびDunnettのポストホックテストを用いて計算した。絶食vs絶食30分；nsp=0.264。絶食vs絶食90分；nsp=0.4779。n=(i)の左から24、22、16。p値は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とTukeyのポストホック検定を用いて算出した。摂食 vs. 180分絶食；nsp= 0.8814。180分絶食 vs 30分絶食；nsp= 0.8771。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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INS-7機能の動態

腸由来のシグナルとしてのINS-7の役割を明らかにする実験は、十分に栄養を与えられた動物における恒常性維持機構の定常状態の違いを明らかにするためにデザインされた。しかしながら、DAF-16局在実験の結果から、INS-7INT1は摂食状態と絶食状態でFLP-7ASIを異なって制御している可能性が示唆された。さらに、INS-7の拮抗薬としての役割は、食後状態で分泌されるペプチドであるカノニカルインスリンに対抗する機能を示すかもしれない53。INS-7がFLP-7の分泌を摂食時と空腹時で異なって制御しているという考えを検証するために、我々はINS-7の存在下と非存在下でFLP-7の分泌動態を測定した。野生型動物が食物欠乏を受けると、FLP-7分泌の増加は180分（3時間；図6fと補足図4b）まで識別できないが、これは動物の腸内脂肪貯蔵量の80％以上が枯渇した時点である26。3時間の絶食後、再び餌を与えるとFLP-7分泌はベースラインレベルに戻る（図6g）ことから、絶食中のFLP-7分泌上昇は再給餌によってリセットされることが示唆される。注目すべきことに、ins-7欠損動物（図6h）では、FLP-7の摂食状態依存的な制御が阻害され、ins-7欠損動物（図1）の当初の観察と同様に、FLP-7分泌レベルは摂食や絶食の状態に関係なく、慢性的に高くなる（図6h,i）。従って、腸由来のINS-7はFLP-7ASIの分泌にブレーキをかけ、食物不足時の脂肪減少を誘発する神経細胞駆動を抑制する。

我々は、INS-7自体が分泌ペプチドであるかどうかを、INT1のみからINS-7mCherry融合タンパク質を発現するトランスジェニック系統を作製して調べた（仮に黄色に着色；図7a, b）。興味あることに、INT1発現INS-7は、線虫における分泌ペプチドの特徴である骨髄細胞にも蓄積することがわかった20,54,55。重要なことは、INS-7の骨髄細胞への集積はGFP強度とは相関がなく、この2つのパラメータは互いに独立していることを示唆していることである（図7c）。私たちや他の研究者20,54によって行われた腹腔細胞分泌アッセイの広範な検証から、このアッセイは幅広い遺伝的・生理的条件下で、ある分泌ペプチドの定常状態レベルを忠実に表現することが示された。小胞タンパク質の分泌に必要な腸SNAREタンパク質56であるaex-4の腸特異的RNAiは、インスリン分泌を特異的に制御することが知られているATPヒドロラーゼ57であるasna-1と同様に、INS-7の分泌を大きく減少させた（図7d, e）。次に、INS-7が拮抗薬として、正規のインスリンとは反対の条件下で分泌されるかどうかを調べるために、野生型動物に食物欠乏を与えてINS-7分泌の動態を測定した。INS-7分泌は30分以内に食餌を絶つと増加し、さらに3時間食餌を絶つまで増加した（図7f）。再投与するとINS-7分泌はベースラインレベルに戻る（図7g）。従って、INS-7は腸のINT1細胞から分泌される正真正銘の腸ペプチドであり、食物欠乏時にFLP-7ASIの分泌を制限する恒常性シグナルとして働く。この結果は、急性の食物欠乏時に腸の状態情報を伝達する新しい腸-脳経路を明らかにするものである。

図7：INS-7INT1分泌レベルは絶食によって誘導される。

aINS-7分泌のための骨髄球取り込みアッセイのモデル。INS-7mCherry融合タンパク質（黄色で表示）は腸のINT1細胞で発現し、GFPは腹腔細胞（緑色で表示）で発現する。bINT1特異的プロモーターの制御下でins-7mCherryを発現するトランスジェニック動物の蛍光画像。INS-7mCherryシグナルはINT1（黄色仮色；閉じた矢頭）と骨髄細胞（開いた矢頭）で観察された。上段は骨膜細胞におけるGFP発現、中段は骨膜細胞における分泌型INS-7mCherry（黄色で擬似着色）、下段はDIC。スケールバー、50μm。INS-7mCherryの分泌は3つの独立した実験で調べられ、同様の結果が得られた。cmCherry蛍光強度値は、代表的な実験条件（n= 341）における各動物のGFP蛍光強度値に対してプロットされている。スケールバー、5μm。dベクター、aex-4またはasna-1RNAiで処理した、INT1::INS-7mCherryと CLM::GFPの導入遺伝子を組み込んだsid-1;INT1::sid-1動物の代表的な画像。スケールバー、5μm。e各RNAi処理について、単一の腔細胞内のINS-7mCherry蛍光強度を定量し、CLM::GFP発現面積に対して正規化した。データはベクターRNAiで処理した動物のINS-7mCherry蛍光強度を正規化したものに対するパーセンテージ±SEMで表した。p値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とDunnettのT3ポストホックテストを用いて算出した。ベクターRNAi vs.aex-4RNAi;***p< 0.0001。ベクターRNAi対asna-1RNAi;**p= 0.0019.f,g絶食時および再食時のINS-7分泌動態を指示した時点で測定した。INS-7mCherry蛍光の強度を定量し、各時点のCLM::GFP発現面積に対して正規化した。データは、野生型摂食動物のINS-7mCherry蛍光強度を正規化したものに対するパーセンテージ±SEMで表した。p値は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とDunnettのT3ポストホックテストを用いて算出した。 n = (f)の左から23, 23, 25, 25, 23。摂食vs.30分絶食；摂食vs.60分絶食；摂食vs.90分絶食；摂食vs.180分絶食；***p<0.0001。摂食vs.180分絶食；180分絶食vs.180分絶食；***p < 0.0001、それぞれ。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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考察

ここで我々は、INS-7と呼ばれるインスリンスーパーファミリーのペプチドが線虫の腸の特殊なINT1腸内分泌細胞から放出されることを報告した。INS-7はASIニューロンにある正準DAF-2レセプターのアンタゴニストとして機能し、FLP-7の分泌を阻害する。FLP-7ASI分泌は神経細胞情報を統合して脂肪減少を促進するシグナルであるので、我々の結果は、INS-7腸-脳間抑制ペプチドが、腸に食物が入ってこない場合にこのシグナルを制限する役割を果たしていることを示している。ここで発表された研究は、腸の脂肪減少を刺激する神経シグナルが、脂肪の蓄積が十分な場合にのみ展開されるように、恒常性維持メカニズムが存在するはずだという、われわれが以前に提唱した仮説の分子的特徴を説明するものである26。これらの発見は、線虫の脂質代謝が外部からの感覚的合図と体内の代謝状態の間でバランスをとるという、これまで知られていなかった腸から脳への恒常性維持コミュニケーションのメカニズムを明らかにするものである。

腸の特殊な分泌細胞としてINT1細胞が同定されたことは興味深い。消化管で咽頭に隣接する腸の最前部に位置する細胞であることから31、食物の吸収が始まる前に、入ってくる栄養情報にアクセスできる特権を持っている。Sulstonらは、INT1細胞は他の腸管細胞（INT2-9）31よりも短い微絨毛を持ち、腸管前方で折りたたみ可能な円錐状の貯留部を形成することを示した。このことは、INT1細胞が腸内分泌INS-7分泌において、まだ発見されていないユニークな性質を持っている可能性を示唆している。この結果から、INT1カルテットは、内腔からだけでなく、おそらく腸の他の部分からも情報を受け取る腸内分泌細胞として機能していると考えられる。

腸から脳へのシグナルについてスクリーニングした多くのペプチドの中で、INS-7がFLP-7ASI分泌の主要な抑制因子として浮上した。長寿調節におけるINS-7の役割について述べた最初の報告では、DAF-2レセプターにおけるアゴニスト機能が示唆されていた41,42が、その後の報告では嗅覚学習におけるアンタゴニスト機能が示唆されていた40,58。様々なDAF-2アイソフォームの発現の特徴から説明がつく可能性がある。線虫の神経系では、DAF-2aとDAF-2cアイソフォームの相互排他的発現が指摘されている。複数の証拠が、ASIニューロンを含む感覚ニューロンにおけるニューロンDAF-2c発現が、絶食によってさらに誘導され、神経系におけるDAF-2シグナル伝達の拮抗作用を促進することを示している59,60,61。我々の結果は、ASIニューロンにおけるDAF-2に対するアンタゴニストとしてのINS-7の明確な役割を示している。我々は、DAF-2レセプターにおけるインスリンペプチドのアゴニズムとアンタゴニズムは、細胞タイプ特異的に決定されると仮定している。腸由来のINS-7とは対照的に、ニューロン由来のINS-7は自然免疫と病原体回避に関与している62。

急性食欲低下や絶食時にINS-7の分泌が増加することは、非常に興味深い。すなわち、ASIニューロンにおけるINS-7mCherryとDAF-2GFPの共局在化と、ASIニューロンにおけるDAF-16GFPの核内移行である。これらの観察から、ASIのDAF-2に対するINS-7の作用は短期絶食状態で優先的に起こることが示唆される。このように、腸からのINS-7分泌が、文献に記載されている魅力的なFOXO-to-FOXOシグナル伝達パラダイムの起源である可能性がある41,63,64。このシナリオでは、シグナル伝達ループの起源は、食物欠乏時のINT1細胞からのINS-7の分泌イベントであろうと推測される。特にDAF-16とPQM-1、そしてそれらの主要な標的遺伝子65の相反する作用に関して、また時間スケール66を越えて、神経系と体の他の部分にわたるINS-7分泌の影響を掘り下げるためには、さらなる実験が必要である。

系統学的解析によると、INS-7は哺乳類のインスリン様ペプチドやレラキシンスーパーファミリーにオーソログである可能性がある。しかし、インスリン様ペプチドINSL5は大腸のL細胞から分泌され、食事の脂肪摂取に反応して分泌されると考えられている腸内ホルモンであり、視床下部を介して食物摂取を調節している67,68,69。哺乳類では、エネルギー代謝や糖代謝の調節、あるいは腸-脳軸を介した摂食調節に重要な役割を果たす腸内ホルモンが同定されている70,71。例えば、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）とコレシストキニン（CCK）は腸の腸内分泌細胞で産生され、栄養摂取後に放出される72。

ショウジョウバエでは、腸から分泌されるペプチドCCHa1がドーパミン作動性ニューロンの活性を調節し、睡眠中の振動に対する反応を抑制する78。また、腸から分泌されるヘッジホッグ（Hh）は味覚ニューロンを標的とし、甘味の感覚と嗜好性を抑制する79。興味深いことに、これまでの腸ペプチドのほとんどは、末梢での脂肪酸化を直接標的とするのではなく、食物摂取などの動物行動を制御し、間接的に脂肪代謝に影響を与える。その代わりに、我々はINS-7が摂食行動を調節することなく、FLP-7ペプチドの分泌を阻害することにより、神経刺激による脂肪減少を抑制する腸から脳へのシグナルとして働くことを報告した。脂肪代謝を直接制御するニューロンを標的とするインスリン拮抗薬としての腸管INS-7の発見は、インスリンシグナルによって制御される臓器間コミュニケーションの新しい様式を定義するものである。

種を越えて多くの未解決のインスリンファミリーペプチドが存在することは、インスリンシグナルによって制御される臓器間コミュニケーションの新たな特徴がまだ発見されていないことを示唆している。例えば、INS-7のオルソログであるインスリン拮抗薬は、空腹時に分泌され、主に機能するかもしれない。このような腸からの "食物不在 "シグナルは、動物が短期間の絶食や食間にエネルギーを蓄えながら、生理機能を最適化するのに役立つのではないかと推測している。最後に、腸内分泌機能を持つ特殊な腸細胞が発見されたことは、線虫の腸と神経細胞機能を制御するその役割について、まだ多くのことが解明されていないことを示唆している。

研究方法

線虫の維持と系統

線虫は線虫増殖培地（NGM）寒天培地上で、大腸菌OP50株を用いて20℃で培養した80。N2ブリストル株はCaenorhabditisGenetic Center (CGC)から入手し、野生型として使用した。本研究で用いたすべての変異株と遺伝子組換え株を補足表1に示す。ワムシは、次亜塩素酸塩処理によってオイルレッドO染色と酸素消費に同期させた後、孵化したL1幼虫を適切なバクテリアを入れたプレートに播種した。絶食実験では、若い妊娠成虫を細菌を含まない白金線で、まず中間の播種していないNGMプレートに移した後、絶食条件用の新しい播種していないNGMプレートに移した。すべての実験は1日目の成虫で行った。線虫の研究では、スクリプス研究所ではIRBやIACUCの承認は必要なかった。

クローニングとトランスジェニック株の構築

N2ゲノムDNAまたはcDNAから標準的なPCR技術を用いてプロモーターおよびcDNAを増幅し、Gateway Cloning Technology（Life Technologies）を用いて発現ベクターにサブクローニングした。この研究でクローニングに用いたプライマーを補足表2に示す。すべてのトランスジェニックレスキュー構築物はポリシストロンGFPを用いて作製した。トランスジェニック株は、プラスミドを野生型または変異型ワームの生殖細胞系列に注入した後、蛍光顕微鏡下で共注マーカー（Punc-122::GFPまたはPlin-44::GFP）を視覚的に選択することで作製した。ASIニューロンにおけるdaf-2またはaak-2の発現を特異的に阻害するために、str-3プロモーターを用いてアンチセンスを介した阻害81用のプラスミドを作製した。daf-2またはaak-2を標的とするセンス配列とアンチセンス配列をN2ライセートから増幅し、ゲートウェイ・クローニング・テクノロジー（Life Technologies社）を用いてドナーベクターにサブクローニングした。str-3プロモーター下でのdaf-2またはaak-2のセンスおよびアンチセンス発現のための最終プラスミドを、Gateway Cloning Technology（Life Technologies）を用いて作製し、FLP-7分泌株（SSR1164）にそれぞれ5ng/μL（daf-2）または1ng/μL（aak-2）注入した。FLP-7分泌株は以前に開発され、検証されている20。

INS-7分泌株については、N2ワームにINT1::ins-7mCherryプラスミドを10ng/μL、Punc-122::GFPプラスミドを15ng/μL、空ベクターを75ng/μL注入し、注入ミックスの最終濃度を100ng/μLとした。高い伝達率と一貫した発現を持つトランスジェニック系統を、Stratalinker UV Crosslinker 2400（Stratagene）を用いて統合し、実験の前に6回戻し交配を行った。その他のマイクロインジェクションについては、最終インジェクションミックス濃度が100ng/μLになるように、目的のプラスミドを5-25ng/μL、Punc-122::GFPを25ng/μL、またはPlin-44::GFPと空ベクターを10ng/μL注入した。伝達速度と発現の一貫性に基づいて、2つの系統を実験用に選択した。

RNAiとqPCR

RNAi実験は82,83の記述に従って行った。カルベニシリン-IPTGプレートに、空のベクターまたは関連するRNAiクローンを含むHT115細菌を播種し、幼虫を播種する前に4日間増殖させた。日目の成虫からTRIzol試薬（Invitrogen）を用いて全RNAを抽出した。cDNAはiScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR kit（Bio-Rad）を用い、メーカーの指示に従って調製した。定量的RT-PCRは、SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad社製）を用いて、製造業者の指示に従って行った。データはアクチン mRNA で正規化した。本研究で使用したプライマー配列を補足表2に示す。

CRISPR-Cas9遺伝子編集

ins-7ヌル対立遺伝子を作製するためのガイドRNAは、CRISPRガイドRNA選択ツール84を用いて設計した。dpy-10ガイドRNAと修復テンプレートは報告されているものを用いた85。本研究で使用したガイドRNAと修復テンプレートの全配列を補足表2に示す。CRISPR-Cas9遺伝子編集の手順を簡単に説明すると以下のようになる： 0.88μLのtracrRNA（200μM、IDT）、0.82μLのins-7ガイドRNA（100μM、IDT）、および0.12μLのdpy-10ガイドRNA（100μM、IDT）を混合し、95℃で5分間インキュベートした。2.52μLのCas9タンパク質（IDT、カタログ番号1081058）を混合物に添加し、25℃で5分間インキュベートした。0.6μLのins-7修復テンプレート（100μM、IDT）、0.5μLのdpy-10修復テンプレート（10μM、IDT）、および3.74μLのヌクレオフリー水をミックスに添加し、25℃で60分間インキュベートした。プルキャピラリー針（1B100F-4、World Precision Instruments）を用いて最終注入ミックスをロードし、N2若年成体の生殖細胞系列に注入した。ins-7ヌル変異体を単離するためのスクリーニング戦略は、線虫のCRISPRアレル単離について以前に記述した通りに行った86。実験に用いた最終的なins-7欠損変異体（ins-7(ssr1532)）は、実験前に4回戻し交配を行った。

ins-7内因性転写GFPレポーター（ins-7(ssr1732)）を作製するためのガイドRNAは、CRISPRガイドRNA選択ツール84を用いて設計した。ins-7の2番目と3番目のエクソンは、1番目のエクソンとインフレームしたGFPで置換した。CRISPR-Cas9遺伝子編集の手順を簡単に説明すると以下のようになる： 0.88μLのtracrRNA（200μM、IDT）、0.82μLのins-7ガイドRNA（100μM、IDT）、および0.12μLのdpy-10ガイドRNA（100μM、IDT）を混合し、95℃で5分間インキュベートした。2.52μLのCas9タンパク質（IDT、カタログ番号1081058）を混合物に添加し、25℃で5分間インキュベートした。2.5 μLのGFP修復テンプレート（1 μM、IDT）、0.5 μLのdpy-10修復テンプレート（10 μM、IDT）、および1.84 μLのヌクレオフリー水をミックスに加え、25℃で60分間インキュベートした。プルキャピラリーニードル（1B100F-4、World Precision Instruments）を用いて最終注入ミックスをロードし、N2若年成体の生殖細胞に注入した。

オイルレッドO染色

オイルレッドO染色は記載16の方法で行った。簡単に説明すると、ワムシをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で採取し、氷上で10分間インキュベートしてから固定した。その後、ワムシをろ過したOil Red O（Thermo Scientific）の作業溶液（イソプロパノール60%：水40%）で一晩染色した。1回の実験で、すべての遺伝子型について約2000匹のワムシを固定・染色した。各実験条件について、スライド上で約100匹のワムシを目視で観察し、その後15～20匹のワムシを無作為に選んで画像化した。すべての実験を少なくとも3回繰り返した。

脂質抽出と定量

脂質抽出は記述14 に従って行った。各群について、10cmプレートあたり2000匹のワムシを25℃でヤングアダルト期になるまで増殖させた。PBSで2回洗浄した後、ワムシを液体窒素で急速冷凍した。ワムシを5% TritonX-100とプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含むPBS中でホモジナイズし、TissueLyser II（QIAGEN）またはDounceホモジナイザーを用いて脂質を抽出した。トリグリセリド含量はEnzyChrom Triglyceride Assay Kit（BioAssay Systems）を用いて測定し、トリグリセリドレベルはPierce BCA Protein Assay（Thermo Scientific）によって決定された総タンパク質レベルに対して正規化した。

酸素消費

酸素消費率（OCR）は、Seahorse XFe96 Analyzer（Agilent）を用いて、記載14と同様に測定した。成虫を M9 バッファーで洗浄し、1 ウェルあたり約 10 匹の成虫を 96 ウェルプレートに移した。基礎測定を5回行った後、FCCP（50 mM）を各ウェルに注入し、OCRの最大値を測定した。最後にアジ化ナトリウム（40 mM）を注入し、残存OCRを測定した。値はウェルあたりのワムシ数で正規化した。基礎OCRはFCCP（50 mM）添加前の全測定値の平均；最大OCRはFCCP注入後の最初の2つの測定値の平均とした。

食物摂取

食餌摂取量は記述83 のとおり、咽頭ポンピングをカウントすることで測定した。各ワームについて、咽頭球のリズミカルな収縮を Zeiss M2 Bio Discovery 顕微鏡で 10 秒間カウントした。各遺伝子型について25匹のワムシを評価し、実験を少なくとも3回繰り返した。

増強性緩徐反応

亢進性緩徐反応は記載87の方法で測定した。1日目の成虫をPBSでOP50プレートから洗い落とし、5回洗浄してバクテリアを除去し、OP50を含まないNGM寒天プレートに置いた。30 分間餌を与えた後、ワムシを PBS で回収し、OP50 を添加した NGM プレートに播種した。ワムシを 5 分間馴化させた後、20 秒間の体曲げ回数を数えた。

破砕アッセイ

スラッシング率は記述88 に従って測定した。各ワームについて、頭部および／または尾部が反対側に振られ、元の位置に戻る動きを1回と数えた。各表現型について15～20匹の1日目成虫を評価した。

DiIおよびDiD染色

2mg/mLのDiIまたはDiDを含むストック溶液をジメチルホルムアミドで調製した。L4動物を、OP50細菌芝生上のDiIまたはDiDストック溶液の1：200希釈液中で一晩インキュベートした。翌日、1日目の成虫をイメージング用に選択した。

画像取得と定量

オイルレッドOで染色したワムシを、Zeiss Axio Imager顕微鏡の10×対物レンズを用いて画像化した。画像はソフトウェアAxioVision（Zeiss）で取得した。各ワームの体全体にわたる脂質滴染色を、ImageJ ソフトウェア（NIH）を用いて定量した。報告された結果はすべて、生物学的複製間で一貫していた。FLP-7およびINS-7分泌のレポーターの蛍光画像は、Zeiss Axio Imager顕微鏡の20×対物レンズを用い、ソフトウェアAxioVision（Zeiss）を用いて取得した。最初の1対の骨膜細胞を撮像し、撮像した2つの骨膜細胞のうちの1つにおけるmCherry蛍光強度を定量し、骨膜細胞の表面積（unc-122::GFP）に対して正規化した20。各実験において、各条件から少なくとも15匹のワムシをImageJソフトウェア（NIH）を用いて定量した。ins-7発現パターン（Pins-7::GFP）の蛍光画像は、Zeiss Axio Imager顕微鏡の10×対物レンズを用い、ソフトウェアAxioVision（Zeiss）を用いて収集した。DAF-16::GFPとDiIで染色したニューロンの蛍光画像は、Nikon A1共焦点顕微鏡で60倍の対物レンズを用い、NIS-Elements（Nikon）というソフトウェアを用いて収集した。DAF-2::GFP、INS-7mCherry、DiD染色ニューロンの蛍光画像は、Nikon Crest X-Lightスピニングディスク共焦点顕微鏡で40×対物レンズを用い、ソフトウェアNIS-Elements（Nikon）を用いて収集した。

統計

すべての実験において、対照として野生型動物を用いた。エラーバーは平均値の標準誤差（SEM）を表す。Studentのt検定、一元配置分散分析、および二元配置分散分析が、図の凡例に示されるように用いられた。すべての統計解析は、GraphPad Prism 10（GraphPad Software）を用いて行った。ANOVAには適切な多重比較補正を用いた。p＜0.05、***p＜0.01、***p＜0.001、ns：有意ではない。

報告の要約

研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性

本原稿および補足情報の全データはSource data fileに記載されている。ソースデータは本論文とともに提供される。

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参考文献のダウンロード

謝辞

この研究は、NIH/NIDDK (R01 DK124706)およびNIH/NIA (R01 AG056648)からのS.S.への研究助成金により行われた。また、NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)の助成を受けたNational Bioresource Project (日本)およびCaenorhabditisGenetics Centerから菌株の提供を受けた。Srinivasan研究室のAnthony Perez博士の原稿に対する批判的コメントに感謝する。C.L.は、スクリプス研究所のドリス神経科学センターからドリス奨学生賞の支援を受けた。図1a、7aおよび補足図1aの各要素はBioRender.comで作成した。

著者情報

著者および所属

  1. スクリプス研究所神経科学部門およびドリス神経科学センター（米国カリフォルニア州サンディエゴ
    Chung-Chih Liu、Ayub Khan、Nicolas Seban、Nicole Littlejohn、Aayushi Shah & Supriya Srinivasan

  2. 米国カリフォルニア州サンディエゴ、スクリプス研究所、スカッグス化学・生物科学大学院
    リウ・チュンチー

貢献

C.L.、概念化、資源、データ管理、正式解析、調査、方法論、執筆-原案、執筆-校閲・編集、A.K.、正式解析、調査、N.S.、資源、N.L.、正式解析、調査、方法論、A.S.、正式解析、調査、S.S.、概念化、資源、監督、資金獲得、方法論、執筆-原案、執筆-校閲・編集、プロジェクト管理。著者全員が原稿を読み、承認した。

責任著者

Supriya Srinivasanまで。

倫理申告

競合利益

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

査読

査読情報

本論文の査読にご協力いただいたYu Xue氏、およびその他の匿名の査読者に感謝いたします。査読ファイルはこちら。

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出版社からの注記Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

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転載と許可

この記事について

この記事の引用

Liu, CC., Khan, A., Seban, N.et al.A homeostatic gut-to-brain insulin antagonist restrains neuronally stimulated fat loss. Nat Commun 15, 6869 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-51077-3

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  • 2023年9月29日受領

  • 受理2024年7月29日

  • 2024年8月11日発行

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