16SリボソームRNAアンプリコンシークエンスと拡大定量尿培養により検出された尿中微生物叢の一致性
リサーチレター|227巻5号P773-775, 2022年11月01日号
16SリボソームRNAアンプリコンシークエンスと拡大定量尿培養により検出された尿中微生物叢の一致性
モニーク・H・ヴォーン（MD
グレゴリー・E・ゼムツォフ（MD
エリン・M・ダール（BS
Lisa Karstens, PhD
リー・マ（Li Ma）博士
ナゼマ・Y・シディキ（MD、MHSc） 発行：2022年6月25日DOI:https://doi.org/10.1016/j.ajog.2022.06.031
PlumX メトリクス
目的
尿中マイクロバイオームを特徴付けるための技術は複数存在する。一般的に使用される2つの方法は、拡張定量尿培養（EQUC）と16SリボソームRNAアンプリコンシーケンシング（16Sシーケンシング）である。また、シーケンシング法にも限界があり、細胞壁が厚い生物（例えば、グラム陽性菌）は細胞溶解が効率的でないために同定できないことがある3。そこで、尿バイオームの調査方法ごとに特定の生物を検出するための固有のバイアスがあることから、同じサンプルを用いてEQUC法と16Sシーケンシング法の結果を比較することを目的としている。
研究デザイン
2017年12月から2019年3月にかけて、1施設で膣エストロゲンを使用している健康な更年期女性から、施設審査委員会の承認を得てカテーテル尿サンプルを採取した。活動性尿路感染症（UTI）のある女性は除外した。活動性UTIは、疑わしい尿検査（＋白血球、血液、亜硝酸塩）で最終的に尿培養が陽性となり、古典的なUTI症状（尿意切迫感または頻度の増加、排尿困難、恥骨上部の痛み、粗血尿、脇腹痛、発熱、吐き気、嘔吐）を伴うものと定義された。尿培養陽性は，尿培養で優占菌のコロニー形成単位が104個以上検出されたものと定義した。尿サンプルは直ちに分割され、一部は臨床微生物学研究室で公表されているプロトコルに従ってEQUCに送られた5。別の一部は、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN, Germantown, MD）によるDNA抽出前に核酸保護剤（AssayAssure, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）へ入れられた。DNAは、Illumina MiSeq（Illumina, Inc, San Diego, CA）を用いたV4超可変領域のポリメラーゼ連鎖反応増幅によるライブラリー調製および16S配列決定に供された。配列はDADA2パイプライン（バージョン1.14.0）でアンプリコン配列バリアント（ASV）に処理し、RDP Classifier（Ribosomal Database Project, Michigan State University, East Lansing, MI）を用いてSILVA参照データベース（バージョン132）にマッピングした。さらに，R（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）でphyloseq（バージョン 1.26.1）を用いてデータの処理と可視化を行った．家族レベルでは、EQUCと16S配列決定から同定された微生物叢の一致を評価した。
結果
合計59検体を両手法で解析し、全検体で403の生物を同定し、ファミリーレベルで分類を割り出した（図）。EQUCと16S配列決定では、403検体中61検体（15.1%）で同一検体から一致した菌が同定された。また、各サンプルにおいて、EQUCでは同定できなかった322個体（79.9%）を16S配列決定で同定し、EQUCでは同定できなかった20個体（5.0%）が検出され、手法間で不一致が見られた。LactobacillaceaeとStreptococcaceaeは、EQUCと16Sシーケンシングの一致率が最も高く、約50％であった。一般に、16S シークエンシングは培養で観察されたよりも多くの生物を同定した。しかし、いくつかの科は培養でのみ同定された。この中には、グラム陰性菌（Morganellaceae）1種とグラム陽性菌（Peptoniphilaceae, Leuconostoc, Enterococcaceae, Corynebacteriaceae）複数種が含まれていた。また、酵母1種（Saccharomycetaceae）と真菌1種（Trichocomaceae）は、EQUCを介してのみ同定された（図）。
図 サムネイル gr1
図EQUCと16S rRNAアンプリコンシーケンス結果の一致率
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まとめ
同一検体から得られたEQUCと16Sシークエンスデータを比較した解析を紹介しました。細菌を検出する16Sシーケンシングは、ほとんどのサンプルではるかに多くの生物を同定し、この方法の感度が高いことが知られていることと一致した5。観察された一致度の最高度は約50％で、尿中微生物相の同定における培養ベースの方法の限界の可能性を浮き彫りにした。一方、EQUC法でのみ同定された細菌、酵母、真菌のファミリーは少数であった。科学者は、適用された同定方法に基づいて、ウロバイオーム中の特定の生物を検出するためのバイアスを考慮するための追加の方法を検討する必要があるかもしれません。最後に、これらの高度な方法の臨床的有用性はまだ十分に確立されていないため、臨床医が日常診療の一環としてこれらの検査をオーダーする際には注意が必要であることを指摘しておく。
謝辞
Duke Urogynecology and Reconstructive Pelvic Surgery 部門の以下の研究コーディネーターの貴重な貢献に感謝したい。Akira Hayes, MS, Acacia Harris, MS, Shantae McLean, MPH, Robin Gilliam, MSW, Claire McLaughlin, BA, Yasmeen Bruton, MA, and Nortorious Coleman-Taylor, MSCR.各氏に感謝する。また、Duke University Murphy Laboratory のリサーチアナリストである Carole Grenier には、サンプル処理と DNA 抽出において専門家としての貢献をしていただいたことに感謝したい。ライブラリー調製とDNA配列決定は、Duke Microbiome Center Core Facilityとの共同作業で行われた。Duke Clinical Microbiology LaboratoryのDr Kevin C. Hazenは、EQUCの運用に貢献し、スタッフの支援をしてくれた。
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記事情報
出版年譜
オンラインで公開。2022年6月25日
脚注
N.Y.S. は Ethicon, Inc および Medtronic plc から研究助成を受け、UpToDate, Inc からロイヤリティを受け取っている。これらの企業はいずれも本試験に財政的支援を行っていない。他の著者は利益相反を報告しない。
本研究は，Duke Department of Obstetrics and Gynecology Charles B. Hammond Research Fund（M.H.V.），Duke Claude D. Pepper Older Americans Independence Center（P30 AG028716；K. E.S.，N.Y.S.）から資金提供を受けた． E.S.とN.Y.S.）、そしてNational Institutes of Health awards R03AG060082 (NIA) to N.Y.S.; K01DK116706 ( NIDDK ) to L.K.; and R01GM135440 ( NIGMS ) to L.M. が授与された。
本研究は、2022年の米国泌尿器科学会および国際泌尿器科学会学術集会（テキサス州オースティン、6月14日～18日）で発表された。
すべての配列は、Sequence Read Archiveのアクセッション番号PRJNA685466 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/685466)でダウンロード可能である。
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