アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）エキソグリコシダーゼは拡張型血液型抗原を標的とし、ABOユニバーサル血液を生成する

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公開日： 2024年4月29日
アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）エキソグリコシダーゼは拡張型血液型抗原を標的とし、ABOユニバーサル血液を生成する

https://www.nature.com/articles/s41564-024-01663-4

Mathias Jensen, Linn Stenfelt, ...Maher Abou Hachem 著者一覧を見る
Nature Microbiology (2024)この記事を引用する

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指標詳細

要旨
赤血球（RBC）表面のABO糖鎖と血漿中の抗体に基づいてドナーとレシピエントの血液型を一致させることは、輸血中に致命的な反応を起こす可能性を避けるために極めて重要である。赤血球の糖鎖を酵素的に普遍的なO群に変換することは、血液物流を簡素化し、ABO不一致輸血を防ぐための魅力的な解決策である。腸内共生生物Akkermansia muciniphilaは、ABOエピトープを含むムチンO-糖鎖を分解することができる。ここで我々は23のAkkermansiaグリコシルヒドロラーゼを生化学的に評価し、A抗原とB抗原の両方、およびそれらの4つの糖鎖延長を効率的に変換するエキソグリコシダーゼの組み合わせを同定した。赤血球上のカノニカルおよび拡張ABO抗原の酵素的除去は、AまたはB抗原のみの変換と比較して、O群プラズマとの適合性を有意に改善した。最後に、2つのB変換酵素の構造解析から、これまで知られていなかった推定上の糖鎖結合モジュールが同定された。この研究は、輸血用万能血液を製造するための貴重な酵素源として、ムチン分解腸内細菌が有用である可能性を示している。

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データの利用可能性
AmGH110AおよびAmGH20Aの原子座標は、それぞれAmGH110Aについては8PVS、AmGH20A-GalNAc、unliganded AmGH20AおよびAmGH20A-ラクトースについては8PXT、8PXUおよび8PXVのPDBアクセッションでProtein Data Bank（https://www.rcsb.org）に寄託されている（補足表7および11）。本研究で特徴付けられた酵素のGenPeptアクセッションは補足表1にある。その他のデータはすべて本文または補足情報にある。操作されていないTLCプレートを補足図28-31に示す。ソースデータおよびSupplementary Data（補足図のソースデータ）は本論文とともに提供される。

コードの利用可能性
本論文で示したデータの解析に使用したコードはない。

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謝辞
本研究は、M.A.H.とM.L.O.およびJ.P.M.を共同申請者とするデンマーク技術・生産科学研究基金（FTPプロジェクト2助成金番号0136-00086B）の助成を受けて実施した。M.A.H.にはデンマーク研究基金自然科学部門（FNUプロジェクト2助成金番号1026-00386B）、M.L.O.にはスウェーデン研究評議会（助成金番号2019-01683）、クヌート・アンド・アリス・ヴァレンベリ財団（助成金番号2020.234）、スウェーデン政府およびランスティング（助成金番号ALFSKANE-446521および2022-Projekt0287）から追加助成を受けた、 J.R.H.はRegion Skåneの博士課程学生のための研究開発助成金の支援を受けた。A. muciniphilaの酵素のほとんどをクローニングし、AmGH20酵素を生産し、最初の試験のためにJ.R.H.に提供したB. Shoukerに謝意を表したい。B. Shoukerは、E. Nordberg Karlssonの指導を受け、イラク高等教育・科学研究省からの奨学金を受けた博士号プロジェクトの期間中、A. muciniphilaの酵素のほとんどをクローニングし、AmGH20酵素を生産し、最初の試験のためにJ.R.H.に提供した。MAXⅣ研究所のBioMaxビームラインを利用させていただいた。A. GonzalesとU. Mullerにはビームラインの使用とデータ収集にご協力いただいた。DESYには、提案MX846のもと、ペトラIIIのP13ビームラインの利用時間を提供していただき、ビームラインの利用とデータ収集に協力していただいたI. Bento氏に感謝する。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Mathias Jensen、Linn Stenfelt。

これらの著者は共同でこの研究を監督した： Martin L. Olsson、Maher Abou Hachem。

著者および所属
デンマーク、Kongens Lyngby、デンマーク工科大学、生物工学・生物医学部

Mathias Jensen, Linn Stenfelt, Michael Jakob Pichler, Julia Weikum, Tine Sofie Nielsen, Jens Preben Morth & Maher Abou Hachem

スウェーデン、ルンド、ルンド大学、血液学・輸血医学部門、検査医学部門

リン・ステンフェルト、ジェニファー・リッチ・ハグマン、マーティン・L・オルソン

スウェーデン、スコーネ地方、医療サービス局、臨床免疫学・輸血医学部門

Jennifer Ricci Hagman, Annika Hult & Martin L. Olsson

寄稿
M.A.H.とM.L.O.がこの研究を構想した。M.A.H.、M.L.O.、A.H.およびJ.P.M.は方法論を開発した。M.J.、L.S.、J.R.H.、T.S.N.、J.W.およびA.H.が調査を実施。M.J.、L.S.、J.R.H.、M.J.P.が分析を実施。M.J.とL.S.がビジュアライゼーションを作成。M.A.H.、J.P.M.、M.L.O.は資金を獲得した。M.A.H.とM.L.O.はプロジェクト管理を行った。M.J.、L.S.、M.L.O.、M.A.H.が原案を執筆。M.J.、L.S.、J.R.H.、M.J.P.、T.S.N.、A.H.、J.P.M.、M.L.O.、M.A.H.が最終論文の校閲と編集に携わった。

著者
Martin L. OlssonまたはMaher Abou Hachemまで。

倫理申告
競合利益
本研究のデータを基に、以下の著者を発明者として特許出願を行った： M.J.、L.S.、J.R.H.、A.H.、M.L.O.およびM.A.H.。

査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、Ashley Toye氏、およびその他の匿名の査読者に感謝する。査読者の報告書はこちら。

追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

拡張データ
図1 酵素選択戦略とA群およびB群赤血球に対する評価。
a：B抗原、b：ExtB抗原、c：AおよびAタイプ3抗原、d：Hタイプ3抗原、e：Gal-A抗原の変換のためのエキソグリコシダーゼの発見と選択の概要。発色基質に対する最初のスクリーニングは、酵素の最初の選択を導き、さらに薄層クロマトグラフィーを用いて非共役糖に対するアッセイを行った。高性能陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスアンペロメトリック検出器（HPAEC-PAD）を用いて、最も優れた酵素の正規化率（Vo/E）を決定し、フローサイトメトリーを用いて、これらの酵素を赤血球上の標的抗原に対して評価した。fクロスマッチ反応性解析は、A1、A2、Bドナーの赤血球を酵素変換して行った。AまたはB抗原を標的とした単一酵素処理、AまたはB抗原およびそれぞれの拡張型を標的とした酵素カクテルによる連続処理およびワンポット処理が行われた。セクレター/ノンセクレター背景の血液型AまたはB赤血球を単一酵素または酵素カクテルのいずれかで変換し、各処理からの変換赤血球を100個のO群プラズマとクロスマッチさせた結果、1522件のクロスマッチテストが得られたが、他のABO群のプラズマとのクロスマッチアッセイの数は少なかった。BioRender.comで作成。

Extended Data 図2 B群赤血球上のB抗原に対する酵素候補の活性。
陰性対照として、抗B（クローン9621A8）/抗RAMκ-フィコエリトリン（PE）染色した血液型B群赤血球（青で塗りつぶし）およびネイティブO群赤血球（黒で点線）の代表的フローサイトメトリーヒストグラム。a ネイティブB赤血球、およびb、c、d、e赤血球を、それぞれ1μMのAmGH110A、AmGH36A、AmGH36C、またはAmGH27で、変換バッファー（200mMグリシン、3mM NaCl、pH 6.8）中、室温（RT）で30分間処理した後。 f a-eのデータの概要。棒グラフは、3人のドナーの赤血球分画（n = 3）のPE蛍光シグナルの中央値蛍光強度（MFI）の平均値である。） h および i は、g と同じドナーの赤血球を、それぞれ変換バッファーおよび PBS（リン酸緩衝生理食塩水）中、0.12 µM AmGH110A で 60 分間、RT 処理した後のもの。j 異なるAmGH110A濃度におけるMFIの経時的変化と、単一のB群ドナーからの赤血球を用いてモニターしたB抗原の除去。 k 異なるAmGH110A濃度におけるMFIの経時的変化と、3人のドナー(n = 3)からの赤血球を用いた30分間の反応においてモニターしたB抗原の除去。jとkのy軸のMFIは対数スケールで示し、各グラフの点線は陰性対照（O群赤血球）のMFIレベルを示す。すべての反応は38%ヘマトクリット（赤血球と原血懸濁液の容積比）で行った。

ソースデータ

Extended Data 図3 B群赤血球上のExtB抗原に対する酵素候補の活性。
a 11種類のGH20候補を、2人のドナー（n = 2）から採取したExtBを有するB群赤血球の処理で評価した（各酵素1 µM、30分間、転換バッファー中38%ヘマトクリット、室温）。転換は、酵素処理した赤血球と抗ExtB染色した赤血球の、本来の赤血球に対する平均蛍光強度中央値（MFI）の変化でモニターした。 b 抗ExtB染色した血液B群赤血球（青色塗りつぶし）と、陰性染色コントロールとしてのO群赤血球（黒色点線）の代表的フローサイトメトリーヒストグラム。c-e bの同じドナーの赤血球をそれぞれAmGH20A、AmGH20C、AmGH20Iで処理した後のもの。 f パネルc-eに示した例を含む、3人のB群ドナー（n = 3）の概要データ。パネルaおよびfのグラフの点線は、陰性染色対照であるO群赤血球のMFIレベルである。データは開丸で示した3人のドナー（n＝3）の平均MFI（青棒）。

出典データ

Extended Data 図4 血液型B群赤血球のExtB抗原除去における酵素濃度と反応バッファーの影響。
a-c B抗原除去AmGH110Aを用いたワンポット30分反応における、AmGH20A、AmGH20CおよびAmGH20Iの濃度の関数としてのExtB抗原の変換。f,g AmGH20A（0.2μM）またはAmGH20C（0.1μM）を用いて、それぞれ変換バッファーおよびPBS中でB群赤血球上のExtB抗原を除去した。棒グラフfとgは平均MFI値で、点線は陰性染色コントロールであるO赤血球のMFIレベルを示す。各散布図は1人の匿名ドナーのデータを示し、ドナー番号で示す。

出典データ

Extended Data 図5 血液型A赤血球上のA抗原に対するA. muciniphila酵素の活性。
a,b それぞれA1およびA2ドナーの免疫Aで染色した赤血球の代表的ヒストグラム（青色）、または1μMのc,d AmGH109A、e,f AmGH109B、またはg,h AmGH36Aと室温で30分間インキュベートした後の同じ赤血球の代表的ヒストグラム（点線ヒストグラム）。i,j 蛍光強度中央値（MFI）に基づく、それぞれA1およびA2表現型の3人のドナー（n = 3）からのデータの概要。k A染色赤血球（青）および陰性染色コントロール（点線ヒストグラム）、l-o kと同じドナーの赤血球を、それぞれPBSまたは変換バッファー中AmGH109B（8μM）またはAmGH36A（1.1μM）で60分間処理した後のヒストグラム。p 異なるインキュベーション時間と濃度の AmGH36A で処理した後の A1 赤血球の A 抗原レベル。 q 異なる濃度の AmGH36A で 30 分間インキュベートした後の、さらに 3 人のドナーの A1 赤血球の A 抗原レベル。各グラフの点線の横線は陰性対照として O 型赤血球の MFI レベル。A抗原レベルは、抗Aモノクローナル抗体（ES-15）と、抗Aタイプ3についてはモノクローナル抗体TH1で染色した後、フローサイトメトリーで測定した。両者とも、フィコエリトリン（PE）を結合させたラット抗マウス-κ二次抗体を用いた。

出典データ

Extended Data 図6 赤血球上のH抗原に対するα-1,2-フコシダーゼ活性の緩衝液および酵素濃度依存性。
a 抗H（BRIC231）およびRAMκ-Phycoerytrhin（PE）で染色したネイティブO群赤血球の代表的ヒストグラム。b-dは、それぞれRTで60分間インキュベートする間、変換バッファー中のRiGH95、AmGH95AおよびAmGH95B（それぞれ1.2 µM）で処理した後の同じドナーの赤血球である。f, g, h b, c, d と同じ反応であるが、PBS中で行った。 j AmGH36A 存在下、異なる濃度の H 抗原に対する 60 分インキュベーション後の AmGH95B の活性。

出典データ

Extended Data 図7 拡張Gal-A抗原に対するGH35 β-ガラクトシダーゼの評価。
a 抗T/Gal-A（クローン3C9）で染色後、RAMκ-フィコエリトリン（PE）で染色した単一ドナーのA1赤血球のGal-A抗原の代表的ヒストグラム（青）。b および c 同じドナーの RBC を、それぞれ AmGH35A（5.8 µM）および AmGH35B（7.2 µM）で処理した後、コンバージョンバッファー中、RT で 60 分間インキュベートしたもの。 d 蛍光強度の中央値（MFI）を示す b および c のデータの概要。e 30分間のインキュベーション後、AmGH36AおよびAmGH95Bの存在下での異なる濃度のAmGH35Aの活性。比較のため、AmGH36Aのみを添加した赤血球、およびAmGH36AとAmGH95Bを添加したワンポット処理も含む。Y軸には100から始まる対数目盛りが使用されている。

ソースデータ

Extended Data 図8 酵素変換したB赤血球に対するO群プラズマのクロスマッチ反応性。
AmGH110A（0.5μM）、またはAmGH110A（0.5μM）とAmGH20AまたはAmGH20C（いずれも0.4μM）によるワンポット処理前後のクロスマッチ。カラースケール（赤-ピンク-白）は、O群血漿サンプル（n = 100、a-j、1-10）に対するクロスマッチ反応性の強さに対応し、赤は最も強い反応（4 + ）、3色のピンクは徐々に弱い反応（3 + 、2 + 、1 + ）を表す。マイナスはマイナスのクロスマッチを表す。括弧内のマイナスは、陰性とごく弱い陽性の中間の反応を示すが、陽性（1 + ）反応の基準は満たさない。酵素処理した細胞との比較のために、反応性のベースラインレベルを得るために、セクレター／ノンセクレターバックグラウンドの未処理赤血球を、Oプラズマのサブセット（n = 10, 1a-1j）のみとクロスマッチさせた。この図から、単一酵素処理とワンポット酵素処理による個々のプラズマのクロスマッチ反応性の変化を追跡することができる。

ソースデータ

Extended Data 図9 酵素処理したA1赤血球に対するO群プラズマのクロスマッチ反応性。
クロスマッチは、AmGH36A（1μM）による処理、またはAmGH36A（1μM）、AmGH95B（0.02μM）、AmGH35A（0.2μM）によるワンポット処理の前後に行った。カラースケール（赤-ピンク-白）は、O群血漿サンプル（n = 100、a-j、1-10）に対するクロスマッチ反応性の強さに対応し、赤は最も強い反応（4 + ）、ピンクの濃淡は徐々に弱い反応（3 + 、2 + 、1 + ）を表す。マイナスはマイナスのクロスマッチを表す。括弧内のマイナスは、陰性とごく弱い陽性の中間の反応を示すが、陽性（1 + ）反応の基準は満たさない。酵素処理した細胞との比較のために、反応性のベースラインレベルを得るために、セクレター／ノンセクレターバックグラウンドの未処理赤血球を、Oプラズマのサブセット（n = 10, 1a-1j）のみとクロスマッチさせた。この図から、単一酵素処理とワンポット酵素処理による個々のプラズマのクロスマッチ反応性の変化を追跡することができる。

出典データ

Extended Data 図10 AmGH20A CBM様ドメインの系統解析。
a AmGH20AのC末端CBM様ドメイン（aa 555-665）をクエリーとして、配列同一性が20-95 %、配列カバー率が90-100 %の配列に対してDelta-Blast（Domain enhanced lookup time accelerated blast）アルゴリズムを用いて非冗長データベースを検索して作成した系統樹。検索の結果、549の配列が検索され、そのほとんどが他の推定HexNAcase由来であったが、推定M14ペプチダーゼやGfo/Idh/MocA-like oxidoreductaseも検索された。配列は最初にMAFFTを用いてアラインメントされ、次にAmGH20AのCBM様ドメインに対応するセグメントのみを含むようにトリミングされた。その後、同一性95%カットオフのCD-HITとデフォルト設定のMaxAlignを用いて配列の冗長性を減らした。残りの253配列から系統樹を作成し、所属門に基づいて注釈を付けた。b 3つのループで示されるN-アセチルガラクトサミン結合残基を示し、極性相互作用を黄色の点線で示す。GalNAc結合部位を形成するループの配列ロゴは、AmGH20A CBMクラスターにおける保存性を、ツリー中の全ての配列における保存性と比較して、それぞれ示している。漫画に示した残基の位置は黒い矢印で示した。

補足情報
補足情報
補足的考察、図1-31および表1-17。

報告概要
査読ファイル
補足データ
補足図のソースデータ。

ソースデータ
ソースデータ Fig.
統計的なソースデータ。

出典データ Fig.
統計的ソースデータ。

ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。

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統計的ソースデータ。

ソースデータ 拡張データ 図3
統計的ソースデータ。

ソースデータ拡張データ Fig.
統計的ソースデータ。

ソースデータ拡張データ Fig.
統計的ソースデータ。

ソースデータ拡張データ Fig.
統計的ソースデータ。

ソースデータ拡張データ Fig.
統計元データ。

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この記事の引用
Jensen, M., Stenfelt, L., Ricci Hagman, J. et al. Akkermansia muciniphila exoglycosidase target extended blood group antigens to generate ABO-universal blood. Nat Microbiol (2024). https://doi.org/10.1038/s41564-024-01663-4

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受領
2023年7月26日

受理
2024年03月04日

出版
2024年4月29日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41564-024-01663-4

テーマ
応用免疫学
生体触媒作用
この論文の引用元
腸内微生物の酵素が万能血液を解き放つ
ティモシー・J・サッチウェルナタリー・ディ・バルトロアシュリーM・トーイ
ネイチャー微生物学（2024）

ネイチャー・マイクロバイオロジー (Nat Microbiol) ISSN 2058-5276 (オンライン)

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