健康なヒト糞便微生物叢のマウスへの移植は、AMPK/SOD2経路を介してMPTP誘発神経毒性を抑制する

2023年12月3日 09:57

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加齢と疾病 '' 2023, Vol.14 '' Issue (6) : 2193-2214. ドイ：10.14336/ad.2023.0309
原著論文
健康なヒト糞便微生物叢のマウスへの移植は、AMPK/SOD2経路を介してMPTP誘発神経毒性を抑制する

https://www.aginganddisease.org/EN/10.14336/AD.2023.0309

謝振超1、張马慧1、羅玉琪1、金縢2、郭星芳1、楊婉林1、鄭嘉玲1、張宏飛3、張魯4、鄧超5、鄭文華6、譚衍欽7、金坤麟8、朱樹振1、、王青1、。
著者情報
沿革
要旨
腸内細菌異常症がパーキンソン病（PD）における神経炎症に重要な役割を果たしている可能性を示す証拠が増えてきている。しかし、腸内細菌叢とパーキンソン病とを結びつける具体的な機序については、未だ解明されていない。PDの発症において血液脳関門（BBB）の機能障害とミトコンドリアの機能障害が重要な役割を果たすことを考慮し、我々はPDにおける腸内細菌叢、BBB、ミトコンドリアの酸化および炎症に対する抵抗性の相互作用を評価することを目的とした。1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）投与マウスの生理病理に対する糞便微生物叢移植（FMT）の効果を調べた。目的は、AMPK/SOD2経路を介した神経炎症、BBB成分、ミトコンドリア抗酸化能における、PD患者と健常対照ヒトの糞便微生物叢の役割を探ることであった。対照マウスと比較して、MPTP投与マウスはDesulfovibrioの濃度が上昇したが、PD患者のFMTを投与したマウスはAkkermansiaの濃度が上昇し、健常人のFMTを投与したマウスは腸内細菌叢に有意な変化を示さなかった。驚くべきことに、MPTP投与マウスにPD患者からFMTを投与すると、運動障害、ドーパミン作動性神経変性、黒質グリア活性化、大腸炎症が有意に悪化し、AMPK/SOD2シグナル伝達経路が阻害された。しかし、健常対照ヒトのFMTは、前述のMPTPによる影響を大幅に改善した。驚くべきことに、MPTPを投与したマウスでは、黒質線条体周皮細胞が著しく減少していたが、健常人コントロールからのFMTによって回復した。この結果は、健常人からのFMTが、ミクログリオーシスとアストログリオーシスを抑制し、AMPK/SOD2経路を介してミトコンドリアの障害を改善し、黒質ペリサイトの喪失とBBBの完全性を回復させることにより、MPTP誘発PDマウスモデルにおいて、腸内細菌症を改善し、神経変性を改善できることを示している。これらの知見は、ヒトの腸内細菌叢の変化がPDの危険因子である可能性を提起し、PDの前臨床治療におけるFMTの応用の可能性を示す証拠となる。

キーワード
神経炎症 / パーキンソン病 / AMPK/SOD2 / 腸内細菌叢 / 周皮細胞 / 糞便微生物叢移植
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謝振超、張马慧、羅玉琪、金縢、郭星芳、楊婉林、鄭嘉玲、張宏飛、張魯、鄧超、鄭文華、譚衍欽、金昆林、朱樹振、王青。健康なヒト糞便微生物叢をマウスに移植すると、AMPK/SOD2経路を介してMPTP誘発神経毒性が抑制される。加齢と疾患。2023, 14(6): 2193-2214 https://doi.org/10.14336/AD.2023.0309
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パーキンソン病（PD）は、世界第2位の神経変性疾患であり、65歳以上の高齢者の1.5％以上が罹患しており、その有病率は2030年までに倍増すると予想されている[1]。PD症例の10％未満は遺伝的要素によるもので、大部分は特発性または散発性である [2]。遺伝的素因に加え、加齢や環境因子など複数の要因がPDの病因に重要な役割を果たしている [3] 。神経炎症、オートファジー-リソソーム障害、ユビキチン-プロテアソーム障害、ミトコンドリア機能障害、酸化ストレスは、PDの病態生理の根底にある主な要因として広く認識されている [4, 5]。加齢は高分子に対する酸化ストレスによって引き起こされると、当初Harmanらによって提唱され [6]、その後フリーラジカルの主要な発生源および酸化の標的としてミトコンドリアを認識するように拡大された [7]。この20年間で、ミトコンドリアの欠陥と酸化ストレスが加齢とともに増加することが確認されるようになった [8]。1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）、パラコート、ロテノン、6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）などの神経毒は、ミトコンドリアを破壊し、酸化ストレスを増加させることにより、実験的PDモデルを誘導するために一般的に使用されている［9］。さらに、SNCA、PINK1、PRKN、LRRK2、DJ-1などのPD関連遺伝子の変異も、ミトコンドリア機能障害と関連している。このように、ミトコンドリアの機能不全はドパミン作動性神経変性の重要な決定因子であると考えられるようになってきており、散発性と家族性の両方の症例の重複した危険因子として機能している [11] 。
典型的な運動障害に加えて、PD患者は便秘などの様々な非運動性の症状にも悩まされる [12, 13]。Braakらは、PDの病態は腸から始まり、徐々に脳へと進行する可能性があると説き［14］、これはその後の研究によって部分的に支持された［15］。しかし、PDにおける腸内病理の根本的な原因は依然として不明である。最近の証拠から、腸内細菌異常症がPD患者に広くみられ、運動症状と関連している可能性があることが示されており [16] 、腸内細菌叢がPDの発症に重要である可能性が示唆されている。Sampsonらは、PD患者からマウスへの糞便微生物叢移植（FMT）がミクログリアの活性化を介して運動障害を悪化させることを証明し、PDにおける腸内細菌叢の役割を示す実験的証拠を示した［17］。さらに最近の研究では、正常対照マウスから神経毒誘発PDマウスへのFMTが、TLR4炎症経路を抑制することによってドーパミン作動性ニューロンを保護することが明らかになった [18, 19]。
神経炎症はPDの主要な病態生理ではなく、ミトコンドリア機能障害はPDの特徴であることから、我々は炎症以外のミトコンドリア機能の調節を介して、腸内細菌叢が脳に及ぼす潜在的影響を調べることを目的としている。興味深いことに、最近の研究で、睡眠不足が腸内の活性酸素種（ROS）の蓄積を介してマウスやハエを死に至らしめることが示され［20］、腸内細菌叢とミトコンドリア機能との間に関連性がある可能性が示唆された。新たなデータから、腸内細菌叢はミトコンドリアと相互作用することにより、ミトコンドリア代謝 [21] や炎症 [22] を制御している可能性があることが明らかになっている。酸化ストレスはPDの神経病態と密接に関連しており、SOD2はミトコンドリアに局在する抗酸化酵素である [23] 。興味深いことに、SOD2と直接的または間接的に相互作用する腸内AMPK [24, 25] は、微生物叢によって調節されることが発見された [26] 。しかし、腸内細菌叢が脳にどのような影響を及ぼすかは、依然として不明である。血液脳関門（BBB）は、ほとんどの分子に対して厳格な不透過性を持つため、中枢神経系の微妙な恒常性を維持し、可溶性分子を選択的に輸送することで中枢神経系と末梢との対話を仲介している [27]。BBBは、グリコカリックス、内皮細胞、基底膜（周皮細胞を包含する）、アストロサイト末端フィートを含む多数の層から構成されている [28] 。さらに、BBBの機能障害はPDの発症と進行に関与している可能性がある。周皮細胞はBBBの完全性を維持するのに不可欠な役割を果たしており [30] 、周皮細胞の喪失はBBBの透過性を高め、有害な腸内物質が脳内に侵入し、神経細胞を損傷する可能性がある。
PD患者における腸症状や腸内細菌異常症の一般的な発生と、脳における炎症とミトコンドリアの相互作用に関する証拠の増加に基づき、我々は、PD患者または健常対照からのFMTが、ミトコンドリアの抗酸化能とペリサイトの喪失を調節することによって、MPTP処理マウスの特徴的な運動障害を制御する可能性があるという仮説を立てた。ここで我々は、腸内細菌異常症が疾患症状を促進するのに十分であることを見出した。具体的には、PD患者の腸内細菌叢はMPTP投与マウスの運動機能を有意に低下させるが、健常対照マウスの腸内細菌叢は、炎症、ミトコンドリア抗酸化能、ペリサイトを調節することにより、これらの影響を防ぐ可能性がある。これらの結果は、PDの前臨床治療におけるFMTの応用の可能性について重要な洞察を与えるものである。
材料と方法
動物
10週齢の雄性C57BL/6Jマウス（26±2g）をGuangdong Medical Laboratory Animal Center（中国佛山市）から入手した。すべてのマウスは同じ施設内で、12時間の明暗サイクルと制御された条件下（温度21±1℃、湿度55±5％）で飼育され、餌と水は無制限に摂取できた。すべての実験手順は、南医科大学朱江病院動物倫理委員会の承認を得た（No: LAEC-2021-045）。
対照群（コントロール、n=12）：生理食塩水を腹腔内注射（i.p.）で5日間投与後、20%滅菌グリセロール（0.2 ml）を含むPBSを10日間経口投与；MPTP投与群（MPTP、n=12）：MPTP（i.p.）（30 mg/kg）を5日間投与後、20%滅菌グリセロール（0.2 ml）を含むPBSを10日間経口投与；MPTP投与群（MPTP、n=12）：MPTP（i.p.）（30 mg/kg）を5日間投与後、20%滅菌グリセロール（0.2 ml）を含むPBSを10日間経口投与。 2ml）を10日間経口投与した。MPTP注射＋PD患者からのFMT群（MPTP＋PD FMT；n＝12）は、MPTP（i.p.）を5日間投与した後、PD患者からのFMTを10日間行った。MPTP注射＋健常人コントロールからのFMT群（MPTP＋HC FMT；n＝12）は、MPTP（i.p.）を5日間投与した後、健常人コントロールからのFMTを10日間行った。
ヒトドナーおよび基準
本研究は、1975年に改訂されたヘルシンキ宣言および1999年に発行された米国国立衛生研究所（National Institutes of Health Policy and Guidelines for Human Subjects）に従って実施され、南医科大学朱江病院倫理委員会の承認を得た。参加者全員からインフォームド・コンセントを得た上で、運動障害学会の特発性PDの臨床診断基準 [31] を満たすPD患者のみを登録した。PD参加者の除外基準は以下の通りであった：糞便の提供に消極的；糞便採取から12週間以内の抗生物質またはプロバイオティクスの使用；腸疾患；非ステロイド性抗炎症薬の使用；不安定な神経学的または精神医学的疾患；二次性または非定型パーキンソニズム。健常人対照は、身体検査および血液検査が正常で、腸疾患や神経変性疾患がなく、糞便採取の12週間前にプロバイオティクスや抗生物質を使用していないこと[17]。糞便微生物叢提供者については、6組の参加者を募集した[17]。ヒトを対象としたすべての実験手順は、南方医科大学朱江病院人間倫理委員会の承認を得た（No: 2022-KY-242-01）。
亜急性MPTP誘発PDマウスモデルとFMT治療
MPTP注射のために、90mgのMPTP（Sigma-Aldrich、ドイツ）を30mlの滅菌生理食塩水に溶解した。マウスにはMPTP（30 mg/kg）を1日1回5日間腹腔内注射し、対照マウスには生理食塩水を注射した[32]。FMTでは、PD患者または健常対照ヒトから新鮮な糞便を採取し、1gの便を15mlの細菌を含まない酸素を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解した。この懸濁液を3000g、4℃で5分間遠心し、上清12mlを3mlの無菌グリセロールに加え、最終濃度が20％になるようにした後、使用前に-80℃で1～8週間保存した。解凍はFMTの前に氷浴で行った。腸内細菌叢は、マウス1匹あたり0.2 mlを10日間毎日投与する経口投与によりマウスに移植した[33]。
行動試験
ポールテスト：各マウスを長さ55cm、直径1cmのポールの上に乗せ、下に着くまでの時間を測定した。試行は最終治療の翌日から開始した。各マウスにつき、1時間の間隔をおいて3回の試行を行い、平均時間をとった [34]。
ロータロッド試験運動協調性を評価するためにロータロッドテストを用いた。記録前に、マウスは15 rpmで回転するロッドの上で3回トレーニングを受けた。記録では、マウスをロッドの上に正面を向かせ、4～40rpmの速度で5分間回転させた。各マウスが落下するまでにロッド上にとどまった時間を測定した。このテストは1時間間隔で3回繰り返された [34]。
ウェスタンブロッティング
イソフルラン麻酔後、マウスを氷冷PBSで全身循環灌流し、新鮮な脳と消化管組織を速やかに剥離し、液体窒素で凍結した後、-80℃で保存した。ホモジナイザーを用いて組織から全タンパク質を抽出し、ホスファターゼ阻害剤混合物、1％フェニルメタンスルホニルフルオリド、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたRIPA（radioimmuno-precipitation assay）緩衝液を用いた。12,000×g、4℃で10分間遠心後、上清をとり、総タンパク質を得た。タンパク質濃度をBCA Protein Assay Kitで定量し、25μgのタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して分離し、ポリ（フッ化ビニリデン）メンブレンに転写した。各メンブレンを5%ウシ血清アルブミンで室温で1時間ブロッキングし、続いてウサギ抗チロシン水酸化酵素（TH）抗体を含む一次抗体と4℃で一晩インキュベートした（1： 1000、#58844、CST）、ウサギ抗インターロイキン-1β（IL-1β）抗体（1:1000、#12703、CST）、ウサギ抗リン酸化-AMPK（p-AMPK）抗体（1:1000、#2537、CST）、ウサギ抗SOD2（SOD2）抗体（1:1000、#13141、CST）、ウサギ抗β-アクチン抗体（1:1000、#4967、CST）などの一次抗体と一晩4℃でインキュベートした。その後、膜をHRP標識抗ウサギIgG二次抗体（1:10000, #7074 , CST）と室温で1時間インキュベートした。Bio-Rad chemiluminescence system (Bio-Rad, USA)を用いてブロットを検出し、Fiji ImageJソフトウェアを用いてバンド密度を測定した。
ヘマトキシリン・エオジン染色と組織学的スコアリング
簡単に説明すると、氷冷PBSによる全身循環灌流後、氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）でマウスの脳と内蔵を回収し、4％PFAで24時間以内に固定した。その後、サンプルをサクラファインテック組織プロセッサー（Tissue-Tek® VIP™ 5Jr）を用いて以下のように処理した： (1) 50%エタノール30分、(2) 75%エタノール40分、(3) 85%エタノール50分、(4) 95%エタノール60分、(5) 100%エタノール60分、(6) 100%エタノールI 50分； (7) 100%エタノールIIを40分間； (8) キシレンIを40分間； (9) キシレンIIを50分間； (10) キシレンIIIを60分間； (11) パラフィンIを40分間； (12) パラフィンIIを50分間； (13) パラフィンIIIを60分間。その後、組織をパラフィンに包埋し、回転式ミクロトーム（Leica, German）を用いて6μm厚の横断切片にスライスした[35]。65℃で1時間焼成した後、切片をキシレンI、II、IIIでそれぞれ10分間脱パラフィンし、次いで段階的なエタノール溶液（100％、95％、85％、75％エタノール）でそれぞれ5分間再水和した。ヘマトキシリン染色を3分間行った後、切片をエオシンに30秒間浸し、一連のエタノール溶液（75％、85％、95％、100％エタノール）でそれぞれ30秒、1分、3分、3分間脱水し、最後にキシレンで透明にし、中性樹脂でマウントした[36]。画像は顕微鏡（Leica, German）で撮影した。組織学的スコアリングは以下の基準で行った： 0、固有層に散在する炎症細胞；1、固有層への炎症細胞の浸潤の増大；2、粘膜下層にまで及ぶ炎症細胞の合流；3、経粘膜的な炎症細胞の浸潤である［37］。
免疫組織化学染色および免疫蛍光染色
免疫組織化学的染色は、焼成、脱パラフィン、再水和の後、切片を熱によるエピトープ回収を行い、電子レンジで10mMクエン酸Na緩衝液（pH6.0）に浸した。内因性ペルオキシダーゼ活性は、3％過酸化水素水溶液で室温15分間インキュベートすることによりブロックし、切片は次に、二次抗体と同種の正常血清で室温15分間ブロックした。ウサギ抗チロシン水酸化酵素（TH）抗体（1:300、#58844、CST）、ウサギ抗Iba-1抗体（1:300、#17198、CST）、ウサギ抗GFAP抗体（1:300、#80788、CST）、ウサギ抗リン酸化-AMPK（p-AMPK）抗体（1:200、#2537、CST）。ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG二次抗体（1:1000、ab97049、Abcam）を室温で30分間適用した。切片をPBSで3分間ずつ3回洗浄し、ストレプトアビジン標識HRPで室温で15分間インキュベートした。3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩を室温で3分間インキュベートした。最後に、切片を75％、85％、95％、100％エタノールでそれぞれ3分間脱水し、キシレンI、II、IIIでそれぞれ10分間洗浄し、中性樹脂でマウントした。一次抗体の特異性を調べるため、陰性コントロールとして一次抗体のアイソタイプコントロールを用いた。アイソタイプコントロール抗体は、一次抗体の宿主種、Igクラス、Igサブクラスに一致するものを選択した。これらの抗体（ウサギIgG, #3900 , CST, USA; ヤギIgG, B900630, Proteintech, China）は、他の一次抗体と同じ希釈率、インキュベーション時間、溶媒で適用した。組織切片による潜在的な非特異的染色をさらに同定するために、二次抗体のみを用いたコントロールも利用した。画像は顕微鏡（Leica、ドイツ）で撮影し、定量解析にはFiji ImageJソフトウェアを用いた。
免疫蛍光染色では、10 mM Tris-EDTA（pH9.0）中で熱誘発エピトープ回収を行った。以下の一次抗体を用いた：ウサギ抗GFAP（1:100、#80788、CST）、ウサギ抗Iba-1（1:300、#17198、CST）、ウサギ抗ZO-1（1： 1000、ab221547、Abcam）、ウサギ抗CD13（1:100、#32720、CST）、ヤギ抗PDGFRβ（1:200、AF1042、R&D）、ヤギ抗CD31（1:200、GB13063、Servicebio）。サンプルを二次抗体（ロバ抗ウサギAlexa-488 IgG、1:500、ab150073、Abcam；ロバ抗ヤギAlexa-555 IgG、1:500、ab150130、Abcam）とともに暗所、室温で1時間インキュベートした後、Aqueous Mounting Medium（Abcam, UK）を用いてマウントした。倒立蛍光顕微鏡（ニコン、日本）を用いて画像を撮影した。陽性細胞の数は手で数えた。Fiji ImageJソフトウェアを用いて陽性シグナル光学密度を算出した。
糞便サンプルの16SリボソームDNA（rDNA）配列決定
マウス（各群 n = 7）の新鮮糞便サンプルを、糞便微生物群またはグリセリンの経口投与から 10 日後に採取した。E.Z.N.A. ®Stool DNA Kit（D4015, Omega, Inc. バーコード配列でタグ付けされたプライマー341 F（5′- CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）および805 R（5′- GACTACHVGGGTAT CTAATCC-3′）は、16S rDNAのV3-V4領域を増幅するために使用された[38]。PCR増幅混合液は、25 ngの鋳型DNA、12.5 mLのPCR Premix、2.5 mLの各プライマー、および総量を調節するためのDEPC水を含み、全反応液が25 mLになるように混合した。2%アガロースゲル電気泳動で同定した後、精製したPCR産物をQubit蛍光光度計（Invitrogen, USA）を用いて定量した。アンプリコンプールは配列解析に供し、アンプリコンライブラリーのサイズと量はAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, USA)とIllumina Library Quantification Kit (Kapa Biosciences, Woburn, MA, USA)を用いて定義した。LC-BioTechnology Co. (Ltd.（中国浙江省杭州市）が、製造元の推奨に従って、Illumina NovaSeqプラットフォームでサンプルをシーケンスした。異なる分類レベルでの微生物叢の相対的存在量だけでなく、QIIME2プロセスによるαおよびβ多様性も解析し、特徴配列はSILVAデータベース[39]でアノテーションした。
統計解析
統計解析はGraph Pad Prismソフトウェアを用いて行った。正規分布のデータには一元配置分散分析（One-way ANOVA）と多重比較のためのTukey検定を用い、正規分布に従わないデータにはKruskal-Wallis検定と多重比較のためのDunn検定を用いた。結果は、正規分布のデータについては平均値±SEM（平均値の標準誤差）で、正規分布でないデータについては中央値（IQR）（四分位範囲）で示した。統計的有意閾値はP < 0.05とし、有意水準は*P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001とした。グラフはGraph Pad Prism version 8.0 (Graph Pad, Inc., La Jolla, USA)を用いて作成したが、16S rDNAシーケンスに関するグラフはRパッケージ(v3.5.2)を用いて作成した。

図1. 健常人コントロールのFMTはMPTP投与マウスの運動障害を軽減した。この研究の実験スケジュールを（A）に示す。運動機能を評価するため、すべてのマウスにロータロッド試験（B）とポール試験（C）を最終FMTの翌日に行った。MPTPを投与したマウスでは運動障害が認められたが、PD患者からのFMTはその障害を有意に悪化させた。しかし、健常人コントロールからのFMTは運動障害を有意に改善した。統計解析は一元配置分散分析（one-way ANOVA）、多重比較のためのTukey検定を用い、n=10、エラーバーは平均値±SEMを示した。有意水準は***P < 0.01、***P < 0.0001であった（P値は6検定で調整）。使用した略語は、i.p.は腹腔内、i.g.は胃内、sは秒。
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図2. 健常人の糞便微生物叢はMPTP誘発ドーパミン神経変性を遅らせた。線条体のTH+線維（A）とSNcのTH+ニューロン（C）を免疫組織化学的に解析した。線条体のTH+線維面積（B）およびSNcのTH+ニューロン数（D）の定量的解析から、PD患者からのFMTはMPTP処理マウスのドーパミン作動性ニューロンと線維の減少を加速させたが、健常ヒト対照からのFMTはドーパミン作動性神経変性を救済したことが示された。線条体とSNcの両方におけるTH発現のウェスタンブロット分析（E）により、免疫組織化学の結果が確認された。MPTP＋PDのFMT群では、線条体（F）とSNc（G）の両方で、MPTP群と比較して有意に低いTH発現が観察された。逆に、MPTP＋HC FMT群では、MPTP群およびMPTP＋PD群のいずれよりも高いTH発現が認められた。多重比較は一元配置分散分析（one-way ANOVA）後にTukey検定を用いて行い、n＝4、エラーバーは平均値±SEMを示す。統計的有意性は、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、***P < 0.0001で示した（P値は6検定で調整）。
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結果
健常人コントロールからのFMTはMPTP誘発PDマウスの運動障害を軽減した
FMTの前に、対照群マウスには生理食塩水を5日間投与し、他のマウスにはMPTPを5日間投与した。その後、MPTP＋PD FMT群およびMPTP＋HC FMT群のマウスに、それぞれPD患者または健常人コントロールからのFMTを10日間行った。対照群およびMPTP群マウスには、PBS＋20％グリセロールを10日間経口投与した。すべてのマウスは最終投与の翌日に行動検査を受け、その後安楽死させた（図1A）。運動障害はPDモデルマウスによくみられる。PD患者由来の腸内細菌叢あるいは健常対照ヒト由来の腸内細菌叢がMPTP誘発PDマウスの運動機能に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ロータロッド試験とポール試験でそれぞれ運動協調性と徐脈を評価した。コントロールマウスと比較して、MPTP投与マウスは回転棒から落ちるまでの待ち時間が有意に短く（P < 0.0001、図1B）、ポールから降りるまでの時間が顕著に長かった（P < 0.0001、図1C）。興味深いことに、MPTP群と比較して、MPTP＋PD FMT群では、回転杆体試験での潜伏時間が短く（P＜0.001、図1B）、ポール試験での降下時間が長かった（P＜0.0001、図1C）。一方、MPTP＋HC FMT群では、転倒までの潜伏時間が長く（P＜0.0001、図1B）、降下時間が短かった（P＜0.0001、図1C）。これらの結果から、PD患者由来の腸内細菌叢はMPTP誘発PDマウスの運動障害を悪化させる可能性がある一方で、健常対照ヒト由来のFMTはMPTP投与マウスの運動能力を向上させる可能性があることが示された。
健常人からのFMTはMPTPによるドーパミン作動性神経変性を遅らせた
PDは、ドーパミン生合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素（TH）の高発現によって特徴づけられるドーパミン作動性ニューロンの著しい喪失によって特徴づけられる[40]。MPTPを投与したマウスの黒質（SNc）におけるドーパミン作動性ニューロンの生存に、PD患者または健常対照ヒトの腸内細菌叢が及ぼす影響を調べるため、次に、免疫組織化学とウェスタンブロッティングにより、SNcと線条体におけるTHの発現を同時に解析した。免疫組織化学の結果、MPTP投与マウスは対照マウスに比べて、線条体のTH+線維（P < 0.0001、図2B）とSNcのTH+体節（P < 0.0001、図2D）を有意に減少させた。行動学的結果と一致して、PD患者からのFMTでは、線条体のTH+線維（MPTP+PD FMT群対MPTP群、P < 0.05、図2B）とSNcのTH+体節（MPTP+PD FMT群対MPTP群、P < 0.0001、図2D）がさらに消失した。対照的に、健常人コントロールからのFMTは、線条体のTH+線維（MPTP＋HC FMT群対MPTP群、P＜0.0001、図2B）とSNcのTH+ソーマ（MPTP＋PD FMT群対MPTP群、P＜0.0001、図2D）を部分的に救済した。ウェスタンブロッティングでも同様の結果が得られ、4群のマウスでTH発現の変化が平行傾向であった（図2E-G）。これらの所見から、PD患者由来の糞便微生物叢はMPTP処理マウスにおけるドーパミン作動性神経変性を引き起こす可能性があるが、健常対照ヒト由来の糞便微生物叢はMPTP誘発PDマウスにおけるドーパミン作動性神経変性を防御する可能性があることが示された。
MPTP誘発PDマウスにおいて、健常対照ヒト由来のFMTは線条体とSNcの両方におけるグリア活性化を改善した。
PDにおける神経炎症は、ミクログリオーシスとアストロサイトーシスを含む黒質線条体グリオーシスによって特徴付けられ［41］、これらはそれぞれグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）［42］とイオン化カルシウム結合アダプター分子1（Iba-1）［43］の免疫染色によって評価されることが多い。グリアが介在する神経炎症に対するPD患者のFMTの寄与の可能性を評価するため、SNcと線条体の両方でGFAPとIba-1の免疫染色を行い、グリアの活性化を評価した。図3に示すように、MPTPを投与したマウスでは、対照マウスと比較して、SNc（P < 0.0001、図3B）と線条体（P < 0.0001、図3D）の両方でGFAP陽性細胞の顕著な増加が認められた。興味深いことに、MPTP + PD FMTマウスは、MPTP群と比較して、SNc（P < 0.0001、図3B）と線条体（P < 0.0001、図3D）の両方でGFAP陽性細胞の有意な増加を示した。逆に、MPTP + HC FMT群のマウスは、MPTP群と比較して、SNc（P < 0.0001、図3B）および線条体（P < 0.001、図3D）の両方でGFAP+細胞の有意な減少を示した。同様に、図3E-Hに見られるように、4群すべてのマウスの黒質線条体領域におけるIba-1+細胞は、GFAP+細胞と同様の傾向を示した。これらの結果から、PD患者由来の腸内細菌叢はミクログリアとアストロサイトの活性化を亢進させることによってドーパミン作動性神経変性を増悪させる可能性がある一方、健常人コントロール由来の腸内細菌叢はMPTP投与マウスにおけるグリア活性化を抑制することによってドーパミン作動性ニューロンを救済する可能性があることが示された。

図3. 健常人由来のFMTは、MPTP投与マウスの線条体とSNcの両方でグリア活性化を緩和した。免疫蛍光法で検出したSNcのGFAP+細胞（赤色）の代表的な画像（A）。SNcにおけるGFAP+細胞の定量的解析（B）。線条体のGFAP+細胞（C）と線条体のIba-1+細胞（E）の代表的な免疫組織化学染色像。線条体におけるGFAP発現の定量化（D）。線条体のIba-1+細胞の定量化（F）。SNcにおけるIba-1+（赤）細胞の代表的な画像（G）。SNcにおけるIba-1+細胞の定量分析（H）。スケールバーはすべて50μm。統計解析は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）と多重比較のためのテューキー検定（Tukey test）を用い、n=4で行った。統計的有意性は** P < 0.01、*** P < 0.001、*** P < 0.0001で示した（P値は6検定で調整）。
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図4. 健常人のFMTはMPTPによる大腸の炎症を緩和した。H&E染色による結腸への炎症細胞浸潤の代表的画像（A）。結腸への炎症細胞浸潤の組織学的スコア（B）。大腸における免疫蛍光法で可視化したZO-1（緑）の代表的画像（C）。赤矢印は腸上皮バリアの破壊を示す。結腸におけるIL-1β発現を示す代表的なウェスタンブロット画像（D）。結腸におけるIL-1β発現を示すウェスタンブロットバンドの定量化（E）。結腸におけるIba-1+（赤）細胞の代表的画像（F）。結腸内のIba-1+細胞の定量（G）。スケールバーはすべて50μm。統計解析は、正規分布のデータ（n＝4、エラーバーは平均値±SEMを示す）については、一元配置分散分析（one-way ANOVA）および多重比較のためのTukey検定を用いて行ったが、炎症細胞浸潤の組織学的スコアについては、正規分布でないデータ（n＝4、データは中央値（IQR）で表示）のため、Kruskal-Wallis検定およびDunn検定を用いて解析した。統計的有意性は、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、*** P < 0.0001で示した（P値は6回の検定で調整）。nsは有意でないことを表す。
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表1 OTUとアルファ多様性
グループ P値
Con vs. M vs. M+PF Con vs. M+PF Con vs. M+PF Con vs. M+HF
OTUs 657.1 ± 45.9 501.3 ± 59.4 380.7 ± 60.4 608 ± 34.5 0.1651 0.3626 0.0043** 0.9040
チャオ1 662.7 ± 47.2 507.1 ± 61.1 383.6 ± 61.3 616.5 ± 36.0 1833 0.3644 0.0050** 0.9239
シャノン 7.01 ± 0.17 6.01 ± 0.21 4.79 ± 0.38 6.20 ± 0.18 0.0462* 0.0109* <0.0001**** 0.1316
シンプソン 0.98 (0.02) 0.95 (0.05) 0.85 (0.20) 0.95 (0.07) 0.1442 0.3470 0.0002*** 0.1112
ピエルー 0.75 ± 0.01 0.68 ± 0.01 0.56 ± 0.03 0.67 ± 0.02 0.0668 0.0033** <0.0001**** 0.0541
商品
0.99 ± 0.00 >0.99 ± 0.00 >0.99 ± 0.00 >0.99 ± 0.00 0.9593 0.6594 0.3703 0.8006
統計解析は、OTU、Chao1、Shannon、Pielou、Goodsのカバレッジ（n = 7、平均±SEM）を評価するために、一元配置分散分析（one-way ANOVA）、多重比較のためのTukey検定を用いて行った。Simpsonについては、Kruskal-Wallis検定に続いて、多重比較のためのDunn検定が用いられた（n = 7、中央値（IQR））。統計的有意性は、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、*** P < 0.0001で示した（P値は、Tukey検定では6検定、Dunn検定では5検定で調整）。Conはコントロール、MはMPTP、M+PFはMPTP+PD FMT、M+HFはMPTP+HC FMTを表す。
健常人コントロールのFMTはMPTPによって大腸で誘発された炎症を緩和した
消化管障害と炎症は、PD患者によくみられる [44] 。MPTP投与マウスの大腸に対するPD患者および健常人コントロールからのFMTの効果を示すために、H&E染色、免疫蛍光およびウェスタンブロッティングにより腸の炎症を検査した。大腸の炎症細胞浸潤を評価するため、マウスの組織学的スコアを分析した。MPTP群と対照群のスコアに統計学的有意差は認められなかったが、MPTP群の全マウスのスコアが対照群よりも明らかに高かったことは注目に値する（図4B）。さらに、PD患者から採取したFMTを投与したマウスでは、対照群に比べてスコアが有意に上昇した（P < 0.01、図4B）。統計学的に有意な差はなかったが、健康なヒト対照群からのFMTはMPTP群と比較してスコアを顕著に減少させた（図4B）。タイトジャンクションタンパク質zonula occludens protein 1（ZO-1）は、腸粘膜バリアの完全性の維持に重要である[24]。大腸粘膜バリアの完全性を評価するために、我々は免疫蛍光染色を用いてマウスの大腸におけるZO-1を調べた。興味深いことに、MPTP投与マウスおよびMPTP + PD FMT群のマウスでは、腸粘膜バリアが明らかに崩壊していた（図4C、赤矢印は腸粘膜バリアの崩壊を示す）のに対し、MPTP + HC FMT群のマウスおよびコントロール群のマウスでは、腸粘膜バリアは無傷のままであった。さらに、IL-1βの発現は、コントロール群と比較して、MPTP投与マウスの結腸で明らかに増加した（P < 0.01, Fig. さらに、MPTP＋PD FMT群マウスでは、MPTP投与マウスに比べてIL-1βの発現がさらに上昇した（P＜0.01、図4E）。しかし、MPTP＋HC FMT群マウスでは、MPTP投与マウスに比べてIL-1βの発現が有意に抑制された（P＜0.05、図4E）。Iba-1+細胞の量は、大腸におけるIL-1βの発現量と同程度のパターンを示した（図4G）。これらの結果から、MPTPは腸粘膜バリアを破壊し、腸の炎症を引き起こすことが示唆された。PD患者の糞便微生物叢は障害を促進する可能性があるが、健常対照者の糞便微生物叢は障害と炎症を抑制する可能性がある。
表2 動物門レベルでの微生物叢の相対的存在量。
分類学的レベル相対存在量 (%) P値
Con vs. M vs. M+PF Con vs. M+PF Con vs. M+PF Con vs. M+HF
バクテロイドータ類 57.22 ± 5.00 38.03 ± 5.10 27.28 ± 4.22 44.11 ± 7.13 0.0887 0.5177 0.0038** 0.3481
ファーミキューテス 33.60 ± 4.31 38.31 ± 5.04 31.40 ± 4.82 42.30 ± 6.38 0.9174 0.7833 0.9904 0.6420
疣贅菌叢 2.57 (5.73) 0.88 (7.05) 36.59 (33.30) 7.51 (11.97) >0.9999 0.0006*** 0.0101* >0.9999
0.27 (1.52) 13.91 (19.12) 1.79 (4.9) 0.36 (0.75) 0.0005*** 0.1997 0.4126 >0.9999
放線菌 1.66 ± 0.37 2.44 ± 0.71 1.63 ± 0.34 1.72 ± 0.13 0.5993 0.5740 >0.9999 0.9997
統計解析は、バクテロイーダ、ファーミキューテス、デスルフォバクター、およびアクチノバクテリオータ（n = 7、平均±SEM）を評価するために、一元配置分散分析（one-way ANOVA）および多重比較のための Tukey 検定を用いて行った。Verrucomicrobiota については、Kruskal-Wallis検定に続いて、多重比較のためのDunn検定が用いられた（n = 7、中央値（IQR））。統計的有意性は、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001で示した（P値は、Verrucomicrobiotaにおける5つの検定を除き、6つの検定で調整した）。ConはControl、MはMPTP、M+PFはMPTP+PD FMT、M+HFはMPTP+HC FMTを表す。

図5. 健常人のFMTはMPTP誘発腸内細菌症を逆転させた。Chao1（A）、Shannon（B）、Simpson（C）指標を含む腸内細菌叢のα多様性の定量化。重み付けUniFrac解析（ANOSIM、R = 0.4275、P = 0.0010）（D）およびPCoA解析（重み付けUniFrac、P = 0.0010）（E）を含む腸内細菌叢のβ多様性の定量化。門レベルでの腸内細菌叢の相対存在量（F）。Bacteroidota、Verrucomicrobioata、Desulfobacterotaを含む門レベルでの相対存在量の定量化（G）。属レベルでの腸内細菌叢の相対存在量（H）。Muribaculaceae_unclassified、Akkermansia、Desulfovibrioを含む属レベルでの相対的存在量の定量化（I）。Lachnospiraceae_unclassified、[Eubacterium]_xylanophilum_group、Odoribacterを含む属レベルでの相対存在量の定量化（J）。統計解析は、正規分布のデータ（n = 7、エラーバーは平均±SEMを表す）に対して、一元配置分散分析（one-way ANOVA）後にTukey検定を用いて行った。ただし、α多様性指標Simpson、Verrucomicrobiota門、Akkermansia属、Desulfovibrio属、Odoribacter属は、正規分布でないデータのため、Kruskal-Wallis検定後にDunn検定を用いて解析した（n = 7、データは中央値（IQR）で表示）。統計的有意性は、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、*** P < 0.0001で示した（P値は、Verrucomicrobiota、Akkermansia、[Eubacterium]_xylanophilum_groupの5つの検定を除き、6つの検定で調整した）。
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健常人のFMTによりMPTPによる腸内細菌異常症が改善された
4群のマウスにおける腸内細菌叢の変化を調べるため、マウスの糞便について16S rDNA配列決定を行った。4群のOTU、Chao1、Shannon、Simpson、Pielou、Goodsの各カバレッジ指標を含むα多様性指標の全範囲に関する詳細データを、多重比較のP値とともに表1に示した。図5 A-Cに示すように、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数を含むα多様性指数は、対照群と比較してMPTP + PD FMT群で有意に減少した（それぞれP < 0.01, P < 0.0001, P < 0.001）。また、MPTP群では対照群に比べ、シャノン指数が明らかに低下していた。しかし、Chao1（P < 0.05）およびShannon（P < 0.01）を含む高い指標は、MPTP + HC FMT群でMPTP + PD FMT群よりも存在した。次に、加重UniFrac距離に基づく主座標分析（PCoA）を用いて微生物叢のβ多様性を分析し（P = 0.001、図5E）、ANOSIM分析によって4群間で異なる微生物叢群集を図示した（R = 0.4275、P = 0.001、図5D）。MPTP＋PD FMT群の微生物叢構造は対照群と比較して有意差を示したが、対照群とMPTP＋HC FMT群との間には有意差は認められなかった。表2および表3に、門レベル（存在量上位5種）および属レベル（主要9種）の微生物について、相対的存在量および多重比較のP値を含む詳細な情報を示した。門レベルでは、MPTP + PD FMT群は対照群に比べ、バクテロイデータの存在量が有意に低く（P < 0.01、図5G）、Verrucomicrobiotaの存在量が顕著に高い（P < 0.05、図5G）という特徴を示した。さらに、MPTP群マウスは対照群に比べ、Desulfobacterotaの存在量が有意に高かった（P < 0.001、図5G）。属レベルでは、MPTP＋PD FMT群では、Akkermansiaの存在量が顕著に増加し（MPTP＋PD FMT群対対照群、P＜0.05、Fig. 5I）、未分類のMuribaculaceae（MPTP＋PD FMT群対対照群、P＜0.01、図5I）とOdoribacter（MPTP＋PD FMT群対MPTP＋HC FMT群、P＜0.01、図5J）の両方が明らかに減少した。一方、MPTP群では、Desulfovibrioの存在量が有意に増加し（MPTP群対対照群、P < 0.001、図5I）、[Eubacterium]_xylanophilum_group（MPTP群対MPTP + PD FMT群、P < 0.01、図5J）と分類されていないLachnospiraceae（MPTP群対対照群、P < 0.05、図5J）の両方で明らかな増加を示した。腸内細菌叢の潜在的バイオマーカーを同定するため、線形判別分析効果量（LEfse）分析を行ったところ、図5E-Jに示した結果と一致する結果（補足図1C）が得られた。補足図1Cは、各群における特徴的な濃縮微生物叢を示した。4群間の微生物群集構造の関係を、アンプリコン配列変異（ASV）量のベン図と、Bray-Curtis距離に基づく属レベルの相関ヒートマップを構築して調べた（補足図1A、B）。対照群では最も特徴的なASVが多く（1296個）、MPTP + PD FMT群では最も少なかった（640個）。さらに、対照群はMPTP＋HC FMT群と最も多くのASVを共有し（42.34％）、MPTP＋PD FMT群と最も少ないASVを共有した（29.18％）。属レベルでは、MPTP＋HC FMT群がコントロール群に最も類似しており、MPTP＋PD FMT群がコントロール群から最も離れていた（補足図1）。
健常人コントロールからのFMTは、MPTP投与マウスの大腸とSNcの両方でAMPK/SOD2シグナル伝達経路を改善した
PD患者または健常対照ヒト由来の糞便微生物叢が、AMPK/SOD2シグナル伝達経路を介してドーパミン作動性神経変性を制御している可能性があるという仮説を検証するため、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学分析を用いて、マウスの大腸およびSNcにおけるリン酸化AMPK（p-AMPK）およびSOD2タンパク質の発現を検出した。図6に示すように、MPTPを投与したマウスは、対照群と比較して、大腸のp-AMPK（P < 0.001、図6B）およびSOD2（P < 0.0001、図6C）の両方で明らかな減少を示した。MPTP + PD FMTマウスは、MPTP群と比較して、結腸におけるp-AMPK（P < 0.05、図6B）およびSOD2（P < 0.05、図6C）の発現がさらに低かった。対照的に、健康なヒト対照群からFMTを受けたマウスは、MPTP群と比較して、結腸のp-AMPK（P < 0.01、図6B）とSOD2（P < 0.01、図6C）の両方で有意な上昇を示した。大腸におけるp-AMPKとSOD2の変化と同時に、SNcにおけるp-AMPKとSOD2の変化も観察された（図6D-F）。SNcにおけるp-AMPKとSOD2の免疫組織化学染色は、これらの所見をさらに支持した（図6G-J）。

図6. 健常人のFMTは、結腸とSNcの両方におけるMPTP誘発性のp-AMPK/SOD2経路の障害を回復させた。結腸（A）とSNc（D）におけるp-AMPKとSOD2の発現を示す代表的なウェスタンブロット画像。結腸（B）およびSNc（E）におけるp-AMPK発現を示すウェスタンブロットバンドの定量。結腸（C）およびSNc（F）におけるSOD2発現を示すウェスタンブロットバンドの定量。SNcにおけるp-AMPK（G）およびSOD2（I）を免疫組織化学的に測定した代表的画像。SNcにおけるp-AMPK+細胞の定量（H）。SNcにおけるSOD2発現の定量化（J）。スケールバーは50μm。統計解析は一元配置分散分析（one-way ANOVA）と多重比較のためのテューキー検定（Tukey test）を用いて行い、n = 5、エラーバーは平均値±SEMを示す。有意差は* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、*** P < 0.0001で示す（P値は6回の検定で調整）。
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図7. 健常人コントロールのFMTは、MPTPによって減少したペリサイトの生存を回復させた。線条体におけるCD13（緑）とCD31（赤）の代表的な免疫蛍光染色像（A）。線条体におけるCD13+細胞の定量化（B）。SNcにおけるCD13（緑）とCD31（赤）の代表的な免疫蛍光染色像（C）。SNcにおけるCD13+細胞の定量化（D）。SNcにおけるCD13（緑）とPDGFRβ（赤）の代表的な免疫蛍光染色像（E）。SNcにおけるCD13+細胞とPDGFRβ+細胞の定量（F）。白矢印は周皮細胞を示す。スケールバーは50μm。統計解析は一元配置分散分析（one-way ANOVA）と多重比較のためのテューキー検定（Tukey test）を用いて行い、n = 4、エラーバーは平均値±SEMを示す。統計的有意性は* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、*** P < 0.0001で示した（P値は6回の検定で調整）。nsは有意でないことを表す。
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表3 属レベルでの微生物叢の相対存在量
分類学的レベル相対存在量 (%) P値
Con vs. M vs. M+PF Con vs. M+PF Con vs. M+PF Con vs. M+HF
ムリバキュラ科
分類不能 48.22 ± 5.70 29.68 ± 3.60 21.47 ± 3.25 32.68 ± 7.80 0.0987 0.7088 0.0093** 0.2037
アッカーマンシア 2.57 (5.73) 0.87 (7.05) 36.59 (33.31) 7.51 (11.96) >0.9999 0.0006*** 0.0101* >0.9999
乳酸菌 4.92 (9.66) 5.34 (9.70) 3.60 (17.50) 0.52 (8.42) >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999
NK4A136_グループ
NK4A136_group 4.79 (8.56) 3.01 (4.14) 2.83 (2.82) 4.53 (5.26) >0.9999 >0.9999 >0.9999 >0.9999
ムリバクラム 2.85 ± 0.42 3.61 ± 1.13 2.70 ± 0.67 2.57 ± 0.40 0.8773 0.8097 0.9989 0.9926
デスルホビブリオ 2.07 ± 0.43 15.39 ± 3.56 2.76 ± 0.99 0.91 ± 0.44 0.0002*** 0.0004*** 0.9936 0.9709
[キシラノフィラム
xylanophilum_group 0.78 ± 0.32 2.36 ± 0.64 0.38 ± 0.17 1.04 ± 0.31 0.0491 0.0089** 0.9623 0.9946
ラクノスピラケア
未分類 0.93 ± 0.23 2.07 ± 0.43 0.68 ± 0.15 1.13 ± 0.23 0.0398* 0.0095** 0.9226 0.9574
オドリバクター 0.53 (1.78) 0.30 (0.43) 0.00 (0.22) 1.23 (1.22) >0.9999 >0.9999 0.2477 >0.9999
Akkermansia、Desulfovibrio、Odoribacterを除く属レベルの微生物相は、一元配置分散分析（One-way ANOVA）と多重比較のためのTukey検定によって分析した（n = 7、平均±SEM）。後者3分類群については、Kruskal-Wallis検定に続いて、多重比較のためのDunn検定が用いられた（n = 7、中央値（IQR））。統計的有意性は、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001と表記した（P値は6回の検定で調整、ただしAkkermansiaと[Eubacterium]_ xylanophilum_群では5回の検定）。ConはControl、MはMPTP、M+PFはMPTP+PD FMT、M+HFはMPTP+HC FMTを表す。
これらのデータから、MPTP投与はマウスの結腸とSNcの両方でAMPK/SOD2シグナル伝達経路を阻害し、PD患者からのFMTはこの経路をさらに抑制することが示唆された。対照的に、健常人コントロールからのFMTは経路を回復させた。
健常人からのFMTは、MPTPによって傷害されたペリサイトの生存を改善した。
BBBの破壊は、PDを含む神経変性疾患の発症に関与している[45]。特異的なマーカーを持たないペリサイトは、BBBの重要な構成要素である。CD13やPDGFRβのような複数のマーカーが、周皮細胞の標識に一般的に用いられている [46] 。MPTPを投与したマウスにおけるペリサイトの変化を調べ、健常対照マウスやPD患者の腸内細菌叢がペリサイトに及ぼす影響を調べるため、免疫蛍光法を用いて、血管内皮細胞マーカーCD31とともにCD13、PDGFRβを調べた（図7）。コントロールマウスと比較して、MPTP投与マウスは線条体（P < 0.0001、図7B）とSNc（P < 0.0001、図7D）の両方でCD13+細胞数の有意な減少を示した。しかし、MPTP + HC FMT群のマウスは、MPTP群と比較して、線条体（P < 0.001、図7B）およびSNc（P < 0.001、図7D）において周皮細胞の有意な増加を示した。さらに、MPTPを投与したマウスでは、対照群と比較して、CD13+細胞とPDGFRβ+細胞が明らかに減少した（P < 0.001、図7F）。MPTP + PD FMTマウスでは、線条体（図7B）およびSNc（図7D、F）のいずれにおいても、MPTP投与マウスと比較して周皮細胞マーカーに有意な変化は認められなかったが、MPTP + HC FMTマウスでは、SNcにおいてCD13+およびPDGFRβ+細胞が有意に増加した（MPTP + HC FMT群 vs MPTP群、P < 0.01、図7F）。これらの結果から、MPTPはペリサイトを損傷する可能性があるが、健常対照の腸内細菌叢はMPTP注射マウスのペリサイトを保護する役割を果たす可能性があることが示された。
考察
最近のいくつかの研究から、腸内細菌叢の変化がPDにおける神経炎症の調節に関与していることが示唆されている [17, 18, 47]。さらに、ミトコンドリアが免疫反応の調節に重要な役割を果たし、神経変性と神経炎症を結びつけている可能性が報告されている [48] 。ここで我々は、ミトコンドリアの抗酸化能が腸内細菌叢によって制御される炎症に関与しているかどうかを調べた。我々の研究では、PD患者または健常対照マウスからMPTP投与マウスへのFMTが、MPTPの神経毒性作用を制御できることを示した。われわれは主に4つの知見を得た。第一に、PD患者からMPTP投与マウスへのFMTはMPTPの神経毒性作用を悪化させたが、これはアッカーマンシアの増加に起因すると考えられた。第二に、健常対照ヒトからマウスへのFMTはMPTPによる神経毒性を緩和したが、これは腸内細菌異常症の是正によるものと考えられた。第三に、健常ヒトからMPTP処理マウスへのFMTは、AMPK/SOD2シグナル伝達経路をアップレギュレートすることによって神経毒性を減弱させた。最後に、MPTPは黒質線条体周皮細胞の消失を誘導したが、これは健常人対照の糞便微生物叢をMPTP投与マウスに移植することによって部分的に阻止された。

図8. 基礎となるメカニズムの模式図。健康なヒトコントロールからのFMTは、腸内細菌症を逆転させ、大腸のタイトジャンクションの完全性を改善し、大腸の炎症を緩和し、ドーパミン作動性神経変性を救い、黒質グリアの活性化を抑制し、黒質ペリサイトの損失を防ぎ、MPTP処置マウスにおけるAMPK/SOD2経路を回復させた。
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本研究において、PD患者からマウスへのFMTは、MPTP投与マウスの運動障害を有意に悪化させたが、健常ヒトコントロールからのFMTは運動機能障害を顕著に予防した（図1および図2）。これまでの研究でも、健常対照マウスからのFMTがMPTP/ロテノン誘発PDマウスの運動機能障害を軽減することが示されている[18, 19]。我々の研究では、MPTP投与後に線条体のTH+線維とSNcのTH+ソーマが有意に消失したことから、PDマウスモデルの確立に成功した。しかし、MPTPを投与したマウスと比較して、健康なヒトコントロールの糞便微生物叢を投与したマウスでは、TH+ニューロンの損失が少なかった。注目すべきは、PD患者由来の糞便微生物叢を投与したマウスでは、TH+ニューロンの損失がさらに悪化したことである。まとめると、PD患者由来の糞便微生物叢は、TH+ニューロンの損失を増加させることにより、MPTP処理マウスの運動障害を悪化させる可能性があり、一方、健常ヒト対照由来の糞便微生物叢は、マウスのTH+ニューロンの損失を減少させることにより、これらの障害を緩和する可能性がある。
ミトコンドリア機能障害、酸化的損傷、グリア活性化を介した神経炎症は、PDにおけるドーパミン作動性神経変性の主要な要因である [9, 50]。本研究では、MPTPによって誘発された線条体およびSNcにおけるグリア活性化は、健常対照ヒト由来のFMTによって有意に抑制されたことから、健常対照ヒト由来の腸内細菌叢が、MPTP投与マウスにおける腸-脳軸を介して炎症を抑制する可能性が示された。興味深いことに、PD患者由来の糞便微生物叢を経口投与すると、MPTP投与マウスにおいて黒質グリアの活性化が有意に増加した。このことは、PD患者の糞便に含まれる細菌やその代謝産物の一部がグリアの活性化を刺激している可能性、あるいはPD患者由来のFMTが腸内細菌症を増幅させることによって炎症反応を亢進させている可能性を示唆している。腸内細菌異常症はPDおよびPD動物モデルでよくみられ、腸内の炎症に関連している [51, 52]。さらに、腸の炎症に対するFMTの影響を調べたところ、MPTPを投与したマウスは、対照マウスと比較して、炎症細胞の浸潤が多く、腸粘膜バリアが著しく破壊され、大腸のIL-1βの発現が高いことがわかった。興味深いことに、PD患者からマウスへのFMTはこれらの影響を増幅させたが、健常人コントロールからのFMTはこれらを防いだ（図4）。これらの結果を総合すると、ヒトからマウスへのFMTは脳と腸の両方における炎症を制御できることが示され、腸内細菌叢の変化がMPTP処理マウスにおけるドーパミン作動性神経変性の制御に関与している可能性が示唆された。
4群のマウスで観察された表現型に腸内細菌叢の変化が関与している可能性をさらに調べるため、16S rDNA配列決定法を用いて糞便中の細菌叢を検査した。その結果、PD糞便微生物叢レシピエントマウスでは腸内細菌叢異常の状態が確認され、そのα多様性指数はコントロールマウスに比べて有意に低かった（図5および表1）。さらに、MPTP + PD FMTマウスのβ多様性指標は対照マウスと有意に異なり、MPTP + PD FMT群の腸内細菌叢の組成と構造が明瞭であることが示された（図5）。さらに、コントロール群は属レベルでMPTP + PD FMT群と最も遠い距離を示し、MPTP + PD FMT群と最も少ないASVを共有した（補足図1）。いくつかの研究で、健常対照と比較してPD患者ではアッカーマンシアの存在量が多いことが報告されているが [16, 53]、アッカーマンシアは一般に、腸管バリア機能に対する保護作用と抗炎症特性によりプロバイオティック細菌であると考えられている [54] 。とはいえ、アッカーマンシアの増加は、マウスにおける粘液の減少や特定の病原体に対する抵抗性の低下にも関連している [55]。ここで、我々はPD糞便微生物叢レシピエントマウスにおいて、コントロールマウスおよびMPTP処理マウスと比較して、アッカーマンシアが有意に増加していることを観察した。このような結果は、毒素誘発PD動物モデルを用いた先行研究 [19, 47, 53] と一致している。まとめると、腸内細菌叢異常症、特に異常に濃縮されたアッカーマンシアは、MPTP＋PD FMT群のマウスの腸および脳の両方において、腸内バリアの破壊を増強し、炎症を促進する可能性がある。しかし、いくつかの研究では、PDマウスにおけるアッカーマンシアの存在量に異なる傾向が認められたが [49, 56]、これは介入、サンプリング時間、動物の年齢および種の違いに起因している可能性がある。
硫化水素（H2S）を気道に急性投与すると、動物の脳でチトクローム酸化酵素の阻害が起こり、ミトコンドリア機能が損なわれる [57] 。しかし、H2Sは低濃度では細胞保護作用を示すが、高濃度では毒性を示すという二重の作用を示す [58] 。H2Sを産生する主な腸内細菌の1つであるデスルホビブリオ（Desulfovibrio） [59]は、その存在量が増加していることから、PDと関連していることが知られている [60]。驚くべきことに、MPTP投与マウスではDesulfovibrioが有意に濃縮されていた。これは、ロテノン誘発PDマウスでもDesulfovibrioの存在量が有意に高かったという以前の知見と一致している [19]。さらに、PD動物モデル [61] ではMuribaculaceaeの減少が報告されており、これはPD患者 [62] とPD動物モデル [63] の両方でMuribaculaceae属を含む門であるBacteroidotaが有意に減少していることと一致している。興味深いことに、Bacteroidotaと未分類のMuribaculaceaeの存在量が顕著に減少していることが観察された（図5、表2、表3）。Eubacterium]_xylanophilum_groupの増加は自閉症動物モデルと関連しているが[64]、PDとの関連は報告されていない。重要なことは、MPTPを投与したマウスでは、糞便微生物叢全体の約2％しか占めていないにもかかわらず、[Eubacterium]_xylanophilum_groupの存在量が顕著に増加していたことである（図5、表2、表3）。PD患者におけるOdoribacterの存在量の変化に関する報告は一貫していない [65] 。ここで我々は、FMTを受けたマウスにおいて、健康なヒトコントロールよりもオドリバクター存在量が有意に増加していることに気づいた。さらに、MPTPを投与したマウスでは、コントロールマウスよりも未分類のLachnospiraceaeの存在量が多いことがわかった。さらに、MPTP投与マウスとPD糞便微生物叢レシピエントマウスの両方で腸内細菌異常症の存在を確認したが、これは健常対照ヒトからのFMTによって回復した（図5、表1、表2、表3、補足図1）。MPTP投与マウスにおける最も顕著な変化はDesulfovibrioの濃縮であり、PD患者糞便微生物叢レシピエントマウスにおける最も顕著な変化はAkkermansiaの増加であったことは注目に値する。これらを総合すると、これらの腸内細菌叢の変化が、4群のマウスの表現型の違いの背景にある可能性がある。とはいえ、DesulfovibrioやAkkermansiaが単独でPDの炎症誘発作用に重要な役割を果たしているのかどうかについては、さらなる研究が必要である。
腸内細菌叢と脳とのコミュニケーションを支える正確なメカニズムは、まだ解明されていない。それにもかかわらず、新たな研究から、微生物叢由来の代謝産物が微生物叢-腸-脳軸のメディエーターとして働く可能性が示唆されている。例えば、糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）の減少はPDの発症に関与しており [66]、SCFAを投与するとミクログリア様細胞が活性化されて炎症性サイトカインの分泌が抑制されることが示されている [67]。逆に、トリメチルアミン-N-オキシドは炎症や酸化ストレスを増強する可能性がある [68]。さらに、N6-カルボキシメチルリジンはミクログリアにおけるミトコンドリアの障害と酸化ストレスを促進する可能性がある [69]。リポ多糖（LPS）は、顕著な炎症促進作用を持つことから、腸と脳のコミュニケーションにおいて重要な役割を果たしているようである [70]。興味深いことに、L. plantarum DP189は、酸化ストレスの抑制、炎症反応の抑制、マウスにおける腸内細菌叢の改変を介して、神経変性を遅らせることが判明した [71]。全体として、この証拠は、腸内細菌叢がミトコンドリアの酸化感受性を調節することによって炎症を調節している可能性が高いことを示している。我々の研究では、MPTPを投与したマウスの結腸と黒質領域では、対照マウスと比較してp-AMPKとSOD2の発現が低いことが観察された。一方、健康なヒト対照マウスの糞便微生物叢を投与したマウスの同じ組織では、MPTP投与マウスと比較してp-AMPKとSOD2の発現が高いことが検出された。驚くべきことに、同じ組織におけるp-AMPKとSOD2の発現レベルは、MPTP投与マウスと比較して、PD患者由来の糞便微生物叢を与えられたマウスではさらに低く検出された（図6）。これらの結果から、PD患者由来のFMTはMPTPによるAMPK/SOD2シグナル伝達経路の阻害を増強し、一方、健常対照ヒト由来のFMTはこの経路をアップレギュレートすることでその影響を部分的に逆転させたことが示された。しかし、DesulfovibrioやAkkermansiaがAMPK/SOD2シグナル伝達経路を直接的または間接的に制御しているかどうかを明らかにするには、さらなる研究が必要である。
ペリサイトの欠乏は、BBBの透過性を著しく増加させ、神経細胞に損傷を与えるのに十分であることが報告されている [72]。さらに、MPTPを投与したマウスでは、黒質血管漏出が報告されている [73]。我々の知る限りでは、MPTP誘発PDマウスモデルにおける黒質細胞周皮細胞の変化はまだ報告されていない。注目すべきは、MPTP投与マウスにおいて、黒質線条体周皮細胞が大幅に減少していることである（図7）。加えて、ペリサイトの減少は健康なヒトコントロールの糞便微生物叢によって部分的に回復した。このことは、腸内細菌異常症の是正がMPTP誘発ペリサイトの減少を抑える可能性を示している。ペリサイトの生存は、MPTPを投与したマウスと比較して、PD患者の糞便微生物叢の影響を受けなかった。われわれの所見とは対照的に、6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）誘発PDマウスの病変線条体では、周皮細胞の顕著な増加が観察された［74］；しかしながら、6-OHDAマウスのSNcにおける周皮細胞の変化は調査されていない。6-OHDAは、BBBが化合物に対して不透過性であるため、定位注射によって線条体に投与されるのが一般的である[75]。この注射法では、注射針が脳組織を通過するため、出血などの不可避な傷害が生じる。出血の結果、一部のペリサイト応答性物質が脳組織に入り、ペリサイトの増殖につながる可能性がある。Padelの研究とは対照的に、われわれは脳組織に直接傷害を与えることなくMPTPを腹腔内注射することによって、PDマウスモデルを確立した。6-OHDAはBBBや細胞膜を自由に通過することができないため、主に注射部位周辺に分布し [76]、定位6-OHDA注射がPD動物モデルにおいて腸内細菌叢に重大な変化をもたらすことを示唆する証拠はほとんどない。6-OHDAとは異なり、MPTPの腹腔内注射は顕著な腸内細菌異常症を引き起こす可能性がある [33, 49, 71]。驚くべきことに、脊髄損傷モデルマウスでは、コントロールマウスのFMTがペリサイトの被覆率を向上させた [77]。したがって、腸内細菌異常症の存在も、われわれの研究とPadel [74]の研究との間のペリサイト関連の所見の相違の一因かもしれない。したがって、MPTP誘発性の腸内細菌異常症は、有害な微生物叢由来物質の脳内への侵入を促進し、その結果、ペリサイト損傷、BBBの破壊、神経細胞ミトコンドリア抗酸化能の低下、神経炎症およびドーパミン作動性神経変性の増大をもたらすのではないかという仮説を立てた。これらの有害物質には、SCFAsのような特定の微生物叢由来の代謝産物や、LPSのような細菌が放出する毒性物質が含まれる可能性がある。この仮説は、腸内細菌異常症がPDの病因に関与する可能性のあるメカニズムを示唆している（図8）。したがって、PDにおける腸内細菌叢に由来する特定の有害物質と、それらが神経細胞だけでなく周皮細胞に及ぼす影響をよりよく理解するためには、さらなる研究が必要である。
今回の知見は、3つの重要な点で先行研究とは異なっている。第一に、このテーマに関する先行研究［17-19］とは異なる動物モデルを用いたことである。PD患者からのFMTは、健康なヒトコントロールからのFMTを受けた遺伝子型が一致したレシピエントマウスと比較して、α-シヌクレイン過剰発現（ASO）マウスの運動機能障害を有意に悪化させることが報告されている[17]が、これらの知見は遺伝性PD症例のごく一部にしか当てはまらない。一方、我々の研究では、散発性PDをある程度模倣することができる最も一般的なPD動物モデルであるMPTP投与マウスにおいて、PD患者の腸内細菌叢が運動障害に対して増幅効果を示すことを見出した。従って、今回の結果は、PDの糞便微生物叢がPDの進行に寄与している可能性を提起するものである。第二に、我々は過去の類似研究［18, 19］で行われたようなマウスからマウスへのFMTではなく、ヒトからマウスへのFMTを用いた。先行研究では、健常対照マウスのFMTが神経毒誘発PDマウスにおいて神経保護効果を発揮することが示されている[18, 19]。今回の研究により、PD患者の糞便微生物叢がPD発症に及ぼす潜在的な影響が明らかになっただけでなく、健常対照ヒトの糞便微生物叢がPD発症に及ぼす有益な影響もさらに検証された。最後に、腸内細菌叢とMPTP誘発炎症とのクロストークにおけるミトコンドリア抗酸化能の役割を調べた。神経毒誘発PDマウスにおけるミトコンドリアと糞便微生物叢の関係については、まだ不明な点が多い。しかし、SCFAの一種である酪酸は、ミトコンドリア内膜のプロトン漏出を増加させ、活性酸素を減少させることができることから [78] 、腸内細菌叢は細菌の代謝産物を介してミトコンドリアの抗酸化活性を調節できることが示唆される。最近、プロバイオティクスの投与が、PDラットのミトコンドリア機能を増強することにより、6-OHDA誘発運動障害の修復を助けることが報告された [79]。ドーパミン作動性ニューロンが高いエネルギーを必要とすることから、そのミトコンドリアは大量の活性酸素を産生するが、この活性酸素はSOD2などの抗酸化防御によって常に除去されている [80]。さらに、MPTPの神経毒性は、野生型マウスと比較して、SOD2過剰発現マウスでは有意に減少した [81]。AMPKの活性化は、糖尿病動物モデルにおいて、SOD2をアップレギュレートすることによってミトコンドリア活性酸素を減少させることが報告されている［82］。興味深いことに、我々の知見によると、PD患者からのFMTはMPTP処理マウスにおいてp-AMPKとSOD2のタンパク質発現レベルをさらに低下させたが、健常人コントロールからのFMTはこの効果を部分的に逆転させた。これまでの研究と今回の研究を総合すると、PDマウスにおける腸内細菌叢とミトコンドリア抗酸化能の間には密接な関係があることが示された。
結論
本研究の結果、PD患者由来のFMTは、AMPK/SOD2経路を阻害し、腸内細菌症を悪化させることによって、おそらくマウスのMPTPの神経毒性を増幅させたが、健常人対照由来のFMTは、AMPK/SOD2経路をアップレギュレートし、腸内細菌症を調整することによって、この神経毒性を緩和した。重要なことは、MPTPは黒質線条体周皮細胞の顕著な喪失を誘導するのに対し、健常対照ヒトからのFMTはこの周皮細胞の喪失を部分的に阻止することがわかったことである。この結果は、健常対照ヒトの腸内細菌叢が神経炎症に対するミトコンドリア酸化耐性を制御し、PDマウスのMPTPによる黒質細胞周皮細胞喪失とBBB障害を軽減する可能性を示唆している。全体として、我々の研究は、PDの病因における腸内細菌叢の重要な役割を強調し、腸内細菌叢を操作することを目的とした介入は、この衰弱性疾患を治療するための効果的な治療アプローチとして大きな可能性を秘めている可能性を提唱している。とはいえ、神経変性に寄与する特定の細菌や代謝産物についてさらに理解を深め、PDにおけるそれらの機能を解明するためには、さらなる研究が必要である。
補足資料
補足データは、www.aginganddisease.org/EN/10.14336/AD.2023.0309。

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