インスリン様成長因子-1は制御性T細胞を刺激し、自己免疫疾患を抑制する

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EMBO Mol Med. 2014 Nov; 6(11): 1423-1435. オンライン公開 2014年11月3日. doi: 10.15252/emmm.201303376
PMCID: PMC4237469PMID: 25339185
インスリン様成長因子-1は制御性T細胞を刺激し、自己免疫疾患を抑制する

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4237469/


Daniel Bilbao,1,*§ Luisa Luciani,1,†§ Bjarki Johannesson,1 Agnieszka Piszczek,1,‡ and Nadia Rosenthal1,2,3
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補足資料
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要旨
近年の自己免疫疾患の急激な増加は、世界中の医療システムに臨床的・経済的負担を強いている。現在の治療法は中程度の効果しかなく、しばしば副作用を伴う。我々は、組換えヒトインスリン様成長因子-1（rhIGF-1）が、in vitroでヒトおよびマウスの制御性T（Treg）細胞の増殖を刺激すること、また、連続ミニポンプで全身投与すると、in vivoで1型糖尿病モデルマウス（STZおよびNOD）および多発性硬化症モデルマウス（EAE）における自己免疫疾患の進行を阻止することを示した。 rhIGF-1投与は、罹患組織においてTreg細胞を増加させ、その抑制特性を維持した。遺伝学的に、Treg細胞集団に特異的なIGF-1レセプターのアブレーションは、EAEモデルにおける多発性硬化症状の進行に対するrhIGF-1投与の有益な効果を消失させ、Treg細胞の増殖に対するIGF-1の直接的な効果を立証した。これらの結果は、全身投与されたrhIGF-1がTreg細胞作用の特異的で効果的な刺激因子であることを立証し、自己免疫疾患を抑制するために自然寛容メカニズムを操作することの臨床的実現可能性を強調するものである。

キーワード：自己免疫、糖尿病、IGF-1、多発性硬化症、T制御細胞
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はじめに
免疫系は成体哺乳類を病原体から守る一方で、宿主に害が及ばないようにその応答を制限している。この平衡と免疫学的自己寛容を維持するためには、制御性T（Treg）細胞による炎症と免疫反応の積極的な抑制が不可欠である（O'Garra & Vieira, 2004; Littman & Rudensky, 2010）。Treg細胞を用いた治療法は、自己免疫疾患における寛容の回復に大きな期待が寄せられている（Maloy & Powrie, 2001; Wing & Sakaguchi, 2010）。しかし、移植に十分な細胞数を得る努力や、内因性Treg細胞の機能を高める効果的な戦略を開発する努力は、限られた成功に終わっている。

われわれは以前、IGF-1が複数の組織タイプにおける再生反応の強力なエンハンサーであることを明らかにした（Musaro et al, 2004; Santini et al 2007, Semenova et al 2010）。しかしながら、免疫応答の制御におけるIGF-1/IGF-1Rシグナル伝達経路のさらなる役割を示す証拠が蓄積されている（van Buul-Offers & Kooijman, 1998; Smith, 2010）。自己免疫モデルを用いた以前の研究では、IGF-1は、主に罹患組織に作用し、免疫攻撃のストレスから組織を保護しながら修復を可能にする、分裂促進特性を持つ多面的因子と考えられていた（Smith et al, 1991; Yao et al, 1995; Liu et al, 1997; Agudo et al, 2008）。しかしながら、今日に至るまで、特定の自己免疫疾患に対するIGF-1ベースの治療法は有効ではなかった（Lovett-Rackeら、1998；Cannellaら、2000；Genoudら、2005）。

ここで、我々は、マウスとヒトの両方において、IGF-1作用の直接的な標的としてTreg細胞を定義し、集中的な全身的組換えヒトIGF-1放出に基づく臨床的に適切な連続投与プロトコルを用いて、自己免疫疾患モデルマウスにおける病理学的反応を制御するIGF-1の、より一般的な能力を実証した。これらの知見は、FDA承認治療薬である全身投与rhIGF-1が、局所Treg細胞のリクルートを通じて自己免疫攻撃を中和する有効性を立証するものであり、自己免疫疾患の治療におけるrhIGF-1集中療法の広範な適用可能性を強調するものである。

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結果
rhIGF-1はex vivoでヒトとマウスのTreg細胞の増殖を刺激する
Treg細胞集団に対するrhIGF-1の潜在的効果を評価するために、Treg（CD4+ CD25+ CD127low）細胞をヒト末梢血からFACS選別し、Treg細胞のマーカーである転写因子フォークヘッドボックスP3（Foxp3）について分析したところ、選別された集団の98％以上が発現していた（図1A、補足図S1A）。市販のrhIGF-1で処理すると、ヒトTreg細胞は未処理の細胞に比べて増殖とFOXP3発現の増加を示し（図1BとC）、生体外でのTreg細胞増殖を促進するこのシンプルなプロトコルの治療的妥当性が強調された。

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図1
rhIGFはin vitroでヒトTreg細胞の増殖を刺激する
in vitro増殖アッセイに使用したTreg細胞の純度（98％以上）を示すアイソタイプ標識細胞（青）と比較した、in vitroアッセイに使用した選別ヒトTreg集団（赤）のFOXP3発現レベル。
in vitro培養6日後、Foxp3抗体とKi67抗体で染色した処理（rhIGF-1）およびコントロール（未処理）ヒトTreg細胞の代表的フローサイトメトリー解析。コントロールと処理細胞は抗CD3抗体とCD28抗体で刺激した。
rhIGF-1で6日間培養した後のTreg細胞数の増加を示す、刺激されたヒトTreg細胞とコントロールのヒトTreg細胞のフローサイトメトリー解析。[P(FOXP3+Ki67-) = 0.0273; P(FOXP3+Ki67+) = 0.0492; P(FOXP3+) = 0.0393; n = 2]。
ヒトの細胞実験と同様に、rhIGF-1で処理したFACS精製Treg細胞における強固な増殖とFoxP3の活性化によって、マウスのTreg細胞機能におけるrhIGF-1の刺激的役割がin vitroで証明された（図2Aおよび補足図S1B）。ヒトでは、Foxp3はT細胞を介した抑制とは直接相関しないが（Wang et al, 2007）、マウスではTregの発生と機能には必要かつ十分である（Sakaguchi et al, 2007）。重要なことに、rhIGF-1で刺激したマウスTreg細胞は、Tエフェクター細胞の増殖を抑制する能力を保持していた（図2Bおよび補足図S1C）が、rhIGF-1の抗アポトーシス効果（Liu et al, 1997）は観察されなかった（補足図S1D）。

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図2
rhIGF-1はin vitroでマウスTreg細胞の増殖を刺激する
精製マウスCD25+脾臓細胞のFoxP3およびKi67フローサイトメトリー解析は、rhIGF-1で2日間刺激した後のTreg細胞の増加を示している。すべてのin vitro実験において、細胞は抗CD3抗体とCD28抗体で刺激された。
ナイーブなマウスTreg細胞は、rhIGF-1処理後もin vitroでTエフェクター（Teff）細胞の増殖を抑制する能力を保持している（Treg：Teffの比、左から1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64；P＝0.869；n＝3）。(補足図S1Cも参照）。
IGF受容体阻害剤（2μM）は、in vitroでマウスTreg細胞のIGF-1媒介性増殖を阻害する（*P = 0.0011; n = 3）。
指示された時間のrhIGF-1刺激後に選別されたマウスCD4+CD25+細胞のFoxp3 qRT-PCR解析は、未処理のコントロールと比較してFoxp3転写物の増加を示す（*Pday1 = 0.0379; *Pday2 = 0.0132; n = 2）。
マウスTreg細胞の活性化を反映するTreg含有（CD4+CD25+）サブセット上でrhIGF-1により誘導された表面発現マーカー（CD44とCD62L）の代表的フローサイトメトリー解析。
AKT（Deguelin、1μM；Deg）、PI3-キナーゼ（Ly-294,002、10μM；LY）およびMAPK（PD.98,059、10μM；PD）の阻害剤が、rhIGF-1で2日間処理した後のマウスTreg細胞の増殖に及ぼす影響を示すフローサイトメトリー分析（*P = 0.0059; n = 2）。
rhIGF-1は、Treg細胞サブセット（FoxP3+）を拡大するが、CD4+CD25-（Th0）や炎症性マウスサブセットTh1（IFN-γ+）およびTh17（IL-17+）は拡大せず、rhIGF-1による2日間の極性化および3日間のインキュベーション後も変化しなかった（*P = 0.0268; n = 3）。
rhIGF-1はTregの増殖を特異的に刺激するが、他のT細胞サブタイプは刺激しない
試験管内でのIGF-1シグナル伝達とTreg活性化の直接的な関連は、IGF-1R阻害によるrhIGF-1媒介Treg増殖の阻害（図2C）およびrhIGF-1刺激後のFoxp3 mRNA誘導（図2D）によって支持された。rhIGF-1処理は、増殖と関連したTreg細胞活性化の特徴的な表面マーカーに影響を与え（Fisson et al, 2003）、CD71（補足図S1EおよびS2A）と活性化マーカーCD44を中程度だが有意にアップレギュレートし、ホーミングレセプターCD62Lを抑制した（図2Eおよび補足図S2A）。

Tregの増殖（図2Fと補足図S2B）と細胞表面マーカーの変化（補足図S2A）は、PI3-キナーゼ-Akt軸を含む正準シグナル伝達経路の活性化に依存していた（Smith, 2010）。注目すべきことに、rhIGF-1は、CD4+CD25-細胞（Th0）にも、in vitroで極性化したIL-17（Th17）およびIFN-γ-分泌（Th1）炎症性サブセット（図2G）にも刺激作用を示さず、制御性／炎症性細胞サブセットのバランスを変化させ、より免疫抑制的な環境に導く可能性を強調した。これらのデータを総合すると、Treg細胞を介した免疫抑制を積極的に制御するIGF-1の特異的な役割が支持される。

rhIGF-1は、Treg細胞の増殖に関連する新しい遺伝子発現パターンを誘導する。
Treg細胞サブセットに対するIGF-1の効果をさらに特徴づけるために、FACSで選別したマウスFoxP3+細胞とrhIGF-1で刺激した細胞の遺伝子発現プロファイリングを比較した（補足表S1）。Treg細胞シグネチャー（Hill et al, 2007）内で高度に共制御される遺伝子の7つの正規クラスターのうち、2つのクラスター（4と6、図3B）がrhIGF-1処理によって有意に影響を受けた。クラスター4には、TCRとIL-2の合図に直接反応する遺伝子が含まれており、Treg細胞増殖の誘導と一致している。しかしながら、クラスター6には、細胞活性化、TGF-βまたはFoxP3の影響を受けないオーファン遺伝子が含まれている（補足表S2）。クラスター6の転写標的濃縮解析により、細胞周期と増殖の制御に関与するE2F転写因子（補足表S3）に関連する様々な遺伝子セットが同定された（Johnson et al, 1993）。これらの結果を総合すると、IGF-1はTreg細胞の増殖に関与する遺伝子の新規発現パターンを調節することが確認された。

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図3
rhIGF-1はTreg細胞の転写様式を調節する
Hillら（2007）が定義したTregシグネチャー（Treg）と重なる、rhIGF-I刺激（IGF）によりTreg細胞で差次的に発現（＞2倍）した23遺伝子のマイクロアレイ解析。下段は、この遺伝子セットがIGF-I刺激により大きく発現上昇することを示すヒートマップである（P = 0.025）。
rhIGF-1処置は、Tregシグネチャー遺伝子（左上のサブパネル；P = 0.004）および異なる機能クラスター（Hillら（2007）によって定義された）の発現に影響を及ぼす。Hillらによって定義された異なるクラスターのうち、クラスター4（TCRとIL-2の合図に直接反応する；P = 0.0004）とクラスター6（活性化、TGF-βシグナル伝達またはFoxP3の影響を受けない；P = 0.001）に属する遺伝子だけが、rhIGF-I処理によって有意に発現上昇する。各グレーの水平線は、y軸の任意単位（AU）スケールに沿った遺伝子発現レベルを表す。各クラスター内の各レーンの平均発現は、水平の黒線で示されている。サブパネル「Treg」およびクラスター4と6のアスタリスクは、CTR（コントロール）とIGF（rhIGF-I）処理間の有意な発現差を示す。*P < 0.05.
IGF-1の全身投与は薬物誘発性および遺伝的糖尿病から保護する
1型糖尿病（T1D）は、T細胞による膵臓のインスリン産生β細胞の破壊によって引き起こされる自己免疫疾患である（Atkinson & Leiter, 1999）。自己攻撃性細胞とTreg細胞のホメオスタシスバランスの崩壊は、T1Dを促進する（Waid et al, 2008）。T1DにおけるrhIGF-1の全身投与の治療可能性を調べるために、野生型C57/Bl6J雌マウスにrhIGF-1を含む浸透圧ミニポンプを皮下に移植し、低用量のストレプトゾトシン（STZ）を複数回注射して糖尿病を誘発した（Like & Rosini, 1976； Rossiniら、1978；Paikら、1980；Nakamuraら、1984；Linnら、1987；Cockfieldら、1989；Yanagawaら、1989；Papaccioら、1994；Lukićら、1998；Stosić-Grujicićら、2009；Wenら、2009；Zdravkovicら、2009）。ミニポンプは、3週間にわたって全身rhIGF-1レベルを安定的に上昇させた（補足図S2C）。ヒトIGF-1タンパク質に対する副作用は見られなかったが、これはおそらくマウスとの高い配列保存性のためであろう。

STZ投与は、3週間後にグルコースホメオスタシスの調節異常の最初の徴候を誘発した（図4Aおよび補足図S2D）。以前に糖尿病患者で観察された効果（LeRoith & Yakar, 2007）と同様に、rhIGF-1の全身投与はこれらの動物の血糖コントロールを改善した（図4Aおよび補足図S2D）。注目すべきことに、rhIGF-1の投与は、直接的な血糖降下作用（LeRoith & Yakar, 2007）をはるかに超えて、グルコースホメオスタシスの改善をもたらし（図4A）、グルコース応答性インスリン産生膵島の細胞量と構造を長期にわたって保護した（図4Bおよび補足図S2E）。rhIGF-1による治療は、非糖尿病対照のグルコースコントロールには影響を及ぼさなかった（補足図S2F）。

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図4
IGF-Iの全身投与は、低用量STZ誘発および自然発症糖尿病から保護し、膵臓Treg細胞数を増加させる
A グルコース負荷試験（GTT）は、最初のSTZ注射から指示された時間ごとに実施し、曲線下面積（AUC）を算出した。 28日間のrhIGF-1送達（灰色の枠；PUMP）は、グルコースホメオスタシスを改善した（P22d = 0.143, P37d = 0.016, P89d = 0.036; n = 13）。

B 97日目の膵臓のインスリン染色から、rhIGF-1投与マウス（IGF-1）では、STZ投与マウス（CTRL）および無処置マウス（UNT）と比較して、膵臓細胞量および膵臓構造に対するrhIGF-1投与の保護効果が長期間持続することが明らかになった。バー = 0.1 mm。

C rhIGF-1ミニポンプの移植1週間後の末梢血のフローサイトメトリー解析では、STZ処置動物においてFoxP3+（Treg；P = 0.011、n = 13）およびKI67+（Treg Ki67；P=0.007）Treg細胞が増加した。*P < 0.05.

D, E rhIGF-1投与マウス（*P = 0.015、n = 12）の膵臓組織では、STZ投与マウス（CTRL）および無処置マウス（UNT）と比較して、FoxP3+細胞の浸潤が増加していることを示す免疫組織化学的解析。バーは0.1 mmに相当する。

Fグルコース負荷試験（GTT）を指示された時間に行い、曲線下面積を計算した（AUC）。28日間（9-12週目）のrhIGF-1全身投与は、コントロールマウス（CTRL）と比較して、NODマウス（IGF-1; P33w = 0.007, P39w = 0.053; n = 14）の糖尿病進行を改善した。*P < 0.05.

G rhIGF-1の全身投与はNODの生存率を増加させた（P = 0.015; n = 14）。

自己免疫性糖尿病の発症には、Treg細胞と自己攻撃性細胞の恒常的バランスが重要であるため（Waidら、2008；Feuererら、2009；Bluestoneら、2010）、末梢血と脾臓のTreg細胞数を調べた。FoxP3発現を測定したところ、rhIGF-1ミニポンプの皮下埋め込み後、Treg細胞の絶対数およびCD4に対する相対数の増加が確認された（図4Cおよび補足図S2G-J）。一方、CD4+細胞は末梢血または脾臓において、それぞれ変化しないか減少したままであった（補足図S2KおよびL）。糖尿病マウスまたは未治療マウスのFoxP3に対する免疫染色で明らかになったように、rhIGF-1で処置したSTZ糖尿病マウスの膵臓でもTreg細胞の増加が観察された（図4DおよびE）。このように、比較的短時間だが一定のrhIGF-I投与は、末梢のTreg細胞数を増加させ、損傷した膵臓組織に安定的に動員して膵島の変性を防ぐことにより、疾患の発症と進行を予防する。

T1DのSTZモデルは、膵β細胞への直接的な毒性によって引き起こされるため（Lenzen, 2008）、T1Dの別の遺伝子モデルである非肥満性糖尿病（NOD）マウスも試験した。NODマウスは、10週目に自己免疫性糖尿病を自然発症する（Anderson & Bluestone, 2005）。NODマウスは糖尿病発症前（9週目から12週目まで）にrhIGF-1を含む浸透圧ミニポンプを皮下に移植された。以前、糖尿病予備軍NODマウスにrhIGF-1を毎日皮下注射したところ（Bergerotら、1995；Kainoら、1996）、糖尿病の発症が遅れたことが示されたように、rhIGF-1投与はグルコースホメオスタシスを改善しただけでなく（図4Fおよび補足図S2M）、死亡率も減少させた（図4G）。このように、rhIGF-1の持続的な全身投与は、環境的に誘導されたT1Dと自然発症のT1Dの両方から保護することができた。

rhIGF-1投与後のEAE改善はTreg細胞機能に依存する
免疫寛容の回復におけるIGF-1の広範な役割を確立するために、原因不明の慢性自己免疫性脱髄疾患である多発性硬化症のマウスモデルを利用した。rhIGF-1ミニポンプを皮下に移植した後、ペプチドMOG35-55免疫原を用いて実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）をマウスに誘導した（材料と方法を参照）。rhIGF-1は、疾患誘導後3週目以降に一貫して有益な効果を示し、疾患の臨床転帰を改善した（図5A）。疾患の初期段階で、rhIGF-1を投与した動物の脊髄ではTreg細胞数が増加した（図5BおよびC）。発病直後のrhIGF-1投与に伴う臨床的改善とTreg細胞数の増加は、Treg細胞の機能を阻害するCTLA-4遮断（補足図S3A-C）によっても消失した（Hermanら、2004年）ことから、疾患の改善にはT調節サブセットに対するrhIGF-1の効果が必要であることが示唆される。

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図5
rhIGF-1治療後のEAE改善はTreg細胞の機能に依存している
MOG35-55ペプチドによる免疫の3日前（0日目）に開始したrhIGF-1治療後、4週間にわたって判定した臨床的評点（1：臨床症状なし；4：前肢麻痺）（P = 0.01；n = 13）。
(A)と同様にMOG35-55ペプチド+/- rhIGF-1で処置したマウスは、rhIGF-1処置によって誘導された脊髄のFoxP3浸潤細胞の増加を示した（P = 0.014; n = 15）。
rhIGF-1ミニポンプは、EAE誘導後、疾患の最初の徴候が現れたとき（11日目、矢印参照）に移植され、臨床的重症度を58％減少させた（例えば26日目；P = 0.0296；n = 18）。
rhIGF-1は、EAEの誘発前後に投与した場合、生存率を増加させた（n＝34、P＝0.028、傾向に関するログランク検定）。
rhIGF-1の有益な作用は、EAE誘発麻痺の最初の徴候が出現した後に投与された場合、より治療的に適切な介入へと拡大した。臨床的重症度の軽減は、MOG35-55免疫後11日目にrhIGF-1治療を開始した直後に観察され（図5E）、予防的に投与した場合と同様に死亡率の減少に有効であった（図5F）。糖尿病モデルと同様に、rhIGF-1は罹患組織のTreg細胞数を増加させ、臨床転帰を改善した。

IGF-1/IGF-1レセプター軸は、in vivoでTreg細胞の増殖と機能を直接制御する。
上述したrhIGF-1の効果は、Tregサブセットの増殖に対する直接的な刺激作用、Treg細胞の活性化と損傷組織への遊走の増加、またはその両方の組み合わせによって説明できる。Treg細胞の増殖に対するIGF-1の直接的な役割は、IGF-1レセプターのTreg細胞特異的欠失マウス（CKOと命名）を分析することによって割り出された。CKOマウスは、Foxp3 EGFP/Cre融合カセット（Zhou et al, 2009）を持つマウスと、IGF-1R遺伝子のExon3-floxed対立遺伝子（Foxp3creIgf1rfl/fl（Temmerman et al, 2010））を持つマウスを交配して作製した（補足図S3D）。CKOマウスは、免疫チャレンジ（接触過敏症、CHS）を受けるまで、Foxp3creおよびIgf1rfl/fl対照（CTRL）と区別がつかなかった（補足図S3E-I）。Treg細胞は、FoxP3発現レベルの低下（図6AおよびB）、細胞数の減少および増殖状態の低下（図6C、D、補足図S3J、K、およびS4A-C）を示した。CTRL遺伝子型間に表現型の違いは認められなかった（補足表S4とS5）。

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図6
IGF-1/IGF-1受容体軸はin vivoでTreg細胞の増殖と機能を制御する
A, B IGF-1受容体欠損Treg細胞（Foxp3cre Igf1rfl/fl）は、接触過敏症チャレンジにより、より低いレベルのFoxP3（平均蛍光強度；*P < 0.001, n = 16）を発現する。

C Foxp3cre Igf1rfl/fl（KO）、Igf1rfl/+およびIgf1rfl/fl（CTRL）末梢血CD4+細胞のフローサイトメトリー解析は、接触過敏症Foxp3cre Igf1rfl/flマウスにおけるFoxP3+ Treg細胞の減少を示した（n = 26; *P = 0.0049; **P = 0.021）。

D 脾臓FoxP3+細胞の代表的フローサイトメトリー解析は、接触過敏症Foxp3cre Igf1rfl/flマウスのTreg細胞における増殖（Ki67発現）の減少を示す。着色したプロットはアイソタイプコントロールに対応する。

E トップパネル： Igf1rfl/fl (CTRL)マウスとFoxp3cre Igf1rfl/fl (KO)マウスのCD4陽性細胞の異なる集団のIGF-1受容体ウェスタンブロット解析。CKO Treg集団におけるIGF-1受容体の特異的欠失を示す。レーン1、2：Treg細胞（CD4+CD25high）、レーン3、5：メモリーCD4+CD25-CD44+CD62L-T細胞、レーン4、6：ナイーブCD4+CD25-CD44-CD62+T細胞。下のパネル： ローディングコントロール（β-アクチン）。

F rhIGF-1ミニポンプは、EAE誘導後、図5Eのような疾患の最初の徴候が現れたとき（11日目）に移植し、臨床的評点を4週間にわたって決定した（2-way ANOVA、P = 0.048、n = 36）。

CTRLマウスおよびCKOマウスのCD4+細胞集団（TregおよびTコンベンショナル（Tconv）細胞、CD4+CD25-CD44+およびCD4+CD25-CD62L+）におけるIGF-1レセプターレベルのウェスタンブロット解析は、CD4+CD25+ Tregを含む集団において特異的にIGF-1レセプターの枯渇を示した（図6E）。T細胞活性化はまた、CKOバックグラウンドではより低いレベルではあるが、CTRL Tconv細胞にIGF-1レセプター発現を誘導した。これらの細胞ではFoxp3Cre（GFP）の発現が見られなかったことから、これはおそらくTreg CKO細胞からの間接的なフィードバックによるものと思われる（補足図S4DおよびE）。

EAEモデルで試験したところ、rhIGF-1の集団的治療効果はCKOバックグラウンドでは完全に消失し（図6F）、疾患進行の阻止とIGF-1を介したTreg細胞活性化の間に直接的な関連があることが立証された。これらのデータを総合すると、IGF-1がin vivoでTreg細胞の増殖を直接的かつ特異的に刺激することが証明され、IGF-Iが炎症性障害に対する免疫応答の質と振幅を調節できるメカニズムが示された。

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考察
本研究では、rhIGF-1によるヒトおよびマウスのTreg細胞増殖の直接的活性化について報告し、臨床的に関連性があり、ヒトにおける薬物送達方法として受け入れられている方法（Yaturu, 2013）を用いた、限られた期間の持続的なrhIGF-1全身投与が、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療において、実現可能で容易に適用可能な治療手段であることを実証した。組換えIGF-1は、小児の低身長の治療にはすでに広く使われているが（Richmond & Rogol, 2008）、慢性疾患の治療における結果はまちまちである。糖尿病患者におけるIGF-1の全身投与に関する初期の研究では、投与期間中にグルコースとインスリンのレベルが低下し、血糖コントロールが改善された（Zenobiら、1992；Carrollら、1998；LeRoith & Yakar、2007）。大規模な研究において、IGF-Iを12週間投与された糖尿病患者は、インスリン必要量の大幅な減少を経験したが(Morrowら、1994年)、副作用として、浮腫、顎の痛み、頻脈、網膜症の悪化がみられた(Quattrinら、1997年)。

IGF-1の効果は、多発性硬化症のさまざまなモデルでも試験されている。初期の報告（Yaoら、1995；Liuら、1997およびその中の参考文献）では、IGF-1がオリゴデンドロサイトとミエリンの再生に直接作用し、臨床的な改善をもたらすと仮定していた。しかしながら、その後の研究で、Lovett-Rackeら（1998）は、IGF-1を発症後または慢性期に投与した場合には、いかなる保護作用も観察できなかった（Cannellaら、2000）。また、IGF-1の局所投与は、老化したマウスの再髄鞘化（O'Learyら、2002年）にも、EAEからのマウスの保護（Genoudら、2005年）にも効果を示さなかった。これらの研究を総合すると、IGF-1療法はほとんど予防効果がなく、発症後にIGFBP3とともに投与された場合には、かえって劇症化する可能性さえあることが示された（Lovett-Racke et al, 1998）。

これらの報告とは対照的に、われわれは、比較的短期間ではあるがrhIGF-1の全身投与を継続した免疫疾患動物モデルにおいて、有意かつ持続的な改善を観察した。糖尿病マウスのグルコースホメオスタシスに対するrhIGF-1の有益な効果は、治療そのものをはるかに超えて拡大し、膵臓機能の持続的な改善を示した。EAEモデルでは、rhIGF-1を持続的に投与することにより、抗原反応が引き起こされた後でも明らかな改善が見られた。

広範な研究にもかかわらず、自己免疫疾患に対抗するIGF-1の作用の正確なメカニズムは不明なままである。IGF-1をT1D発症の予防に関与させるとするこれまでの報告（Bergerotら、1995；Kainoら、1996；Georgeら、2002；Chenら、2004；Casellasら、2006；Agudoら、2008）では、主にその分裂促進作用（Smithら、1991；Le Roith、1997）が罹患組織に作用し、自己免疫攻撃によるストレスから組織を保護することが挙げられている。自己免疫疾患におけるIGF-1の全身投与による治療効果に重要な役割を果たすものとしてTreg細胞を確立することにより、我々の報告は、自己免疫マウスの炎症膵臓におけるTreg数の減少とFoxP3発現の減少を記録した以前の研究（Feuererら、2009；Bluestoneら、2010）を基礎としている。最近の研究では、STZを投与したマウスの肝臓でIGF-1を過剰発現させると、膵臓内のTreg細胞数が増加することが明らかになったが（Anguela et al, 2013）、Tregの生存率を向上させるIL-7産生樹状細胞、あるいは肝臓から分泌されるTGF-βによる従来のT細胞のTreg細胞への転換を介した間接的な効果が提唱された。対照的に、本研究では、自己免疫疾患に対する外因性rhIGF-1の保護作用が、Treg細胞の増殖を直接刺激することに起因することを示した。このことは、成人期におけるTreg細胞系の維持の主要なメカニズムが継続的な自己複製であることを考えると、重要な発見である（Rubtsov et al, 2010）。

連続投与プロトコルを用いて、我々はrhIGF-1がTreg細胞の増殖を刺激するだけでなく、その輸送を変化させ、損傷臓器へのホーミングを可能にすることを示した。EAEの間、かなりの数のTreg細胞が脊髄に局在するが（Kornら、2007；本論文）、自己免疫反応を防ぐには、その活性は不十分であるように思われる。Websterら（2009年）は、明確なTreg細胞刺激サイトカイン（IL-2）が、このサブセットを広範囲に拡大し、疾患を予防することを示した。しかし、この効果はIL-2投与が発症前に行われた場合にのみ観察された。しかしながら、IGF-1とは異なり、IL-2治療は傷害組織へのTregの動員を誘導できなかった。拡大したTreg細胞が損傷組織に定着できないことも、IL-2を用いた糖尿病治療が失敗した背景にあるのかもしれない（Long et al, 2013）。実際、IL-2の補充は、in vitroでのTregに対するrhIGF-1の増殖効果をさらに増大させた。in vivoで高い増殖活性を持つCD44hi Tregサブセットの報告（Minら、2007年）と一致して、rhIGF-1で処理したTreg細胞は、活性化された記憶様表現型（CD44hi, CD62Llo；Feuererら、2009年；Campbell & Koch、2011年）を獲得し、二次リンパ臓器ではなく、炎症活動領域に効果的に移動できるようになる（Fissonら、2003年；Bromleyら、2008年）。従って、rhIGF-1の持続的投与は、進行した自己免疫患者であっても治療可能な魅力的な選択肢である。

多くの自己免疫疾患は、IGF-I/IGF-IR経路の異常との関連の可能性について表面的に検討されているが（Smith, 2010）、この経路とこれらの疾患の病因との間の実質的な関連は確立されていない。Treg細胞においてIGF-1/IGF-1Rシグナル伝達が果たす正確な役割とは何であろうか？FoxP3の継続的な発現は、成熟Treg細胞の系譜の同一性と機能を維持するために必要であり（Williams & Rudensky, 2007）、FoxP3の発現の減弱または消失は、Tregの抑制機能の欠陥とエフェクター細胞への転換を引き起こし、免疫疾患状態を抑制するのではなく、むしろ亢進させる（Wan & Flavell, 2007; Zhou et al, 2009）。したがって、rhIGF-1投与による治療効果は、IGF-1Rシグナル伝達を直接刺激することによって生じ、それによってTregの転写ランドスケープが安定化し、FoxP3の発現が促進されると推測される。

この点で注目すべきは、FoxP3によって直接制御されていない、共制御遺伝子の2つのTregシグネチャークラスター（クラスター4と6）に特異的に影響を与えるIGF-1の能力である（Hill et al, 2007）。クラスター4の遺伝子は増殖と活性化に関連しているのに対し、クラスター6にはIGF-1が新たな制御因子と思われる遺伝子が含まれている。この後者のクラスターに属する遺伝子の中には、IGF-1レセプターそのものがあり（Hill et al, 2007）、in vivoでTreg細胞の増殖と維持を刺激する（Rubtsov et al, 2010）。

IGF-1シグナル伝達、Treg細胞の活性化、免疫バランスの再確立の間に直接的な関連性を確立することにより、過去のアプローチ（例えば、EAEモデルにおけるCNSの細胞でのIGF-1の発現）、プロトコル（例えば、一過性の有益な効果しかないIGF-1の短期投与）、投与方法（ポンプ装置による連続投与と皮下注射）の知見と失敗を再解釈する根拠を提供する。アレルギー性接触皮膚炎が、IGF-1を介したTreg細胞活性化によって抑制された並行研究（Johannesson et al, 2014）と合わせて、我々の結果は、in vitroおよびin vivoでヒトTreg細胞増殖を刺激するための実行可能なプロトコルを提供し、また、自己免疫療法の実験的および臨床的デザインを成功させるために、Treg細胞増殖のための適切な臨床的および代用マーカーの探索に役立つであろう。筋肉修復におけるTregの関与に関する最近の証拠（Burzyn et al, 2013）を考慮すると、IGF-1によるTreg細胞増殖の局所刺激は、組織再生におけるそのよく知られた有益な効果にも寄与している可能性がある。

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材料と方法
In vivo実験
使用したマウスは、特に断りのない限り、すべてC57BL/6J遺伝的背景を持つマウスである。Igf1rfl/flFoxp3creマウスは、Igf1rfl/fl（C57BL/6J; Jackson Laboratory; Temmerman et al, 2010）マウスとFoxp3cre（NOD; Jackson Laboratory; Efstratiadis et al, 2008）マウスを交配して作製した。rhIGF-1（Biovision社製）は、皮下に移植したAlzet浸透圧ミニポンプ（モデル#2004、Alzet Osmotic Pumps Company社製）を介して、0.275mg/kg/日の用量で連続的に投与した（0.25μl/h、28日間放出）。浸透圧ミニポンプの外科的植え込みは、特に指示がない限り、糖尿病またはEAE誘発の1週間前に行った。対照マウスは、偽手術マウス、またはPBS（溶媒）送達ポンプを移植したマウスのいずれかであったが、これらの2群間ではrhIGF-1送達ポンプと比較して差は観察されなかった（補足図S4F）。rhIGF-Iレベルは、製造業者のプロトコールに従ってELISA（Human IGF-I Quantikine、R&D）によって測定した。

マウスはEMBL Monterotondo Laboratory Animal Facilityで飼育した。すべてのマウス処置は、EMBL Monterotondo Ethical Committee（イタリア、モンテロトンド）の承認を得ており、国内および欧州の規制に従っている。すべての動物コロニーは、実験およびその他の科学的目的に使用される動物の保護のために存在する欧州の法的枠組み（欧州条約ETS123/欧州評議会、欧州指令86/609/EECおよび最近発表されたDirective2010/63/EU）ならびに国際実験動物飼育評価認定協会（AAALAC）および欧州実験動物科学連盟（FELASA）などの国際機関の現行ガイドラインに従って飼育されている。施設の大気候は中央監視装置で管理されており、温度、湿度、換気、空気の入れ替え、暗所・明所サイクルは厳重に管理されている。動物は個別換気ケージ（IVC）とアイソレーターで、特定病原体フリー（SPF）条件下で飼育されている。動物施設は、責任ある獣医師および管理者（LAS専門家FELASA cat.D)による完全な獣医療プログラムを受けており、これには予防医学、サーベイランス、診断、治療、病気のコントロール、および実験プロトコルで使用される動物の獣医療が含まれる。FELASAが発行したガイドラインに従い、健康監視プログラムも実施されている。監視システムの担当者は、人道的終点を決定し、さらなる苦痛を避けるために動物を安楽死させるべきかどうかを決定する責任も負っている。動物の使用を最小限に抑えるため、私たちの実験計画では3Rの原則が日常的に実施されている。各試験に含まれる動物の数を最小限にするよう特別な注意が払われ、各実験マウスから最大限のデータが得られるよう実験がデザインされている。

ヒトのデータは、インフォームド・コンセントのもと、EMBL生命倫理内部諮問委員会（BIAC）により承認され、WMAヘルシンキ宣言およびNIHベルモントレポートに規定された原則に準拠した手順およびプロトコルを用いて取得された。

糖尿病実験は、NODマウス（Jackson Laboratory）、またはC57BL/6Jマウスを用いて、Low-Dose Streptozotocin Induction Protocol（Diabetic Complications Consortium）に記載されているとおりに行った。(http://www.diacomp.org/shared/showFile.aspx?doctypeid=3&docid=19）。簡単に説明すると、新しく調製したストレプトゾトシン（Sigma）溶液を40mg/kgの用量で腹腔内に注射した。マウスは毎日1回、5日間連続して注射を受けた。グルコースホメオスタシスは、腹腔内糖負荷試験（Heikkinen et al, 2007）を用いて、指示された時点で測定した。基礎血中グルコース濃度を測定した後、20％グルコース水溶液を2gグルコース/kgの用量で絶食マウスに腹腔内投与した。血中グルコースクリアランスを30分間隔で3時間測定し、統計解析にはPrism（GraphPad Software）を用いて曲線下面積を算出した。

EAE実験は、ペプチドMOG35-55を免疫原として用い、記載（Stromnes & Goverman, 2006）に従って行った。簡単に述べると、マウスには0日目にMOG35-55ペプチド（200μg/マウス；AnaSpec）と完全フロイントアジュバント（Sigma）の1：1乳剤を注射した。百日咳毒素（400 ng/マウス；Sigma）を0日目と2日目に2回投与した。その後、マウスは臨床症状と体重減少についてモニターされた。臨床的重症度は0～5の評定尺度を用いてスコア化し、以下の評点は指示された臨床徴候に対応した（0、臨床徴候なし；0.5、尾が部分的に引きずられている；1、尾が麻痺している；2、協調運動の喪失、後肢麻痺；2.5、片方の後肢が麻痺している；3、両後肢が麻痺している；3.5、後肢が麻痺し、前肢が脱力している；4、前肢が麻痺している；5、瀕死状態）。Igf1rfl/flFoxp3creマウスによる治療介入を再現した実験では、EAE誘導後、疾患の最初の徴候が現れた時点でrhIGF-1ミニポンプを移植し、4週間にわたって臨床的評点を決定した。指示された場合、マウスは0日目に精製抗CTLA-4抗体（UC10.4F10.11、BD Pharmingen）またはアイソタイプコントロール（A95-1、BD Horizon）を0.6mg/マウスの用量で注射された。

in vivoにおけるIGF-IによるTreg細胞の直接的な増殖刺激は、接触過敏反応の文脈におけるIgf1rfl/flFoxp3cre脾臓からのCD4陽性細胞のフローサイトメトリー分析によって決定した（Klekotka et al, 2010）。簡単に説明すると、マウスは0日目と1日目に0.5% DNFB（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MO）50μlで腹部を感作された。感作後3日目に脾臓のフローサイトメトリー分析を行った。組織解離後、単一細胞懸濁液を抗CD16/32でブロックし、さらに抗CD4、FoxP3およびKi67抗体で製造業者のプロトコールに従って染色した。

組織学的解析
組織は4％ホルムアルデヒドで一晩固定し、増加勾配のエタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。EAE実験では、脊髄を含む脊椎の一部を固定し、包埋前に0.5％EDTAで1週間脱灰した。10マイクロメートルの切片を作成し、脱脂後、エタノール勾配で再水和した。FoxP3およびCD4染色では、熱抗原回収を行い、内因性ペルオキシダーゼを1％H2O2中で10分間インキュベートして消光した。2％NGSでブロッキングした後、FoxP3抗体（Abcam）、二次抗ウサギ-AP（Sigma）、CD4（Abcam）またはプロインスリン（Abcam）を用い、Vectastain ABCキットを用いて、メーカーのプロトコールに従って免疫染色を行った。シグナル検出には、HRP標識抗体ではDAB溶液（Sigma）、AP標識抗体ではNBT/BCIP（Roche）を用いた。プロインスリンで染色した切片はヘマトキシリンで対比染色した。

画像はLMD7000（Leica）顕微鏡で撮影し、ImageJ cell counterを用いて手動で定量した。各マウスから少なくとも3つの切片を50μmずつ離して分析した。

In vitro実験
CD16/32（Clon 93）、CD4（GK1.5）、CD25（PC61.5）、FoxP3（FJK-16F）、IFN-γ（XMG1.2）、IL-17（eBio17B7）、CD71（RI7 217.1.4）およびCD44（IM7）に対する抗体は、eBioscience社から購入した。抗CD62L（MEL-14）、抗Ki-67、アネキシンVはBD Pharmingenから購入した。ヒト細胞を用いた実験では、制御性T細胞カクテル、FoxP3染色キット、バッファーセットを含む抗体をBD Pharmingen社から購入した。表面および細胞内の染色は、製造業者のプロトコールに従って行った。ウェスタンブロット分析には、ウサギのmAb IGF-I Receptor β (D23H3) XP® (Cell signaling Technology)を用いた。

in vitroマウス増殖実験では、C57BL/6マウスの脾臓から細胞を単離した。赤血球溶解後、細胞を抗CD16/32抗体、直接標識抗CD4抗体およびCD25抗体と順次インキュベートした。その後、CD4 CD25二重陽性細胞を、標準的な3レーザーFACS AriaまたはBDの5レーザーFACS Aria SORP（70μmノズル、70psi；純度98％以上）で選別し、コーティングした抗CD3（17A2、eBioscience）と可溶性抗CD28（37. 51、eBioscience）および示した因子または阻害剤（IGF-1R阻害剤PPP、Calbiochem；Ly-294,002、Sigma；Deguelin、Sigma；PD.98,059、 Sigma）。IGF-1は、特に指示がない限り、25-100 ng/mlの濃度で使用した。

in vitroヒト増殖実験では、EDTA処理した血液から単核球をフィコールハイパック（Pharmacia Biotech）勾配遠心で分離し、ヒトT調節カクテルで染色した。その後、BDの5レーザーFACS Aria SORP（85μmノズル、40psi；純度98％以上）を用いてTreg細胞を選別し、10％FCS添加RPMI中で、抗CD3/抗CD28コートビーズ（Gibco）および指示因子で6日間刺激した。表面染色後、細胞を固定し、FoxP3とKi67を染色し、FACS Aria SORPで解析した。

in vitroでの極性化実験のために、FACSで精製したCD4陽性CD25陰性細胞を、IFN-γ抗体（PeproTech）、IL-12抗体（PeproTech）、抗IL-4抗体（11B11；eBioscience）（Th1）、またはTGF-β抗体（PeproTech）、IL-6抗体（PeproTech）、抗IL-4抗体、抗IL-12抗体（C17.8；eBioscience）、IFN-γ抗体（AN-18；eBioscience）（Th17）と3～5日間プレインキュベートした。FoxP3陽性細胞数は、製造業者のプロトコール（IC固定バッファーまたはFoxP3染色バッファーセット、eBioscience）に従って細胞内染色を行った後、2レーザーFACS Canto（BD Biosciences）またはFACS Aria（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリー解析により決定した。データ解析はFloJo（Tree Star Inc.）またはFACS Divaソフトウェア（BD Biosciences）を用いて行った。代表例を示す場合、実験は少なくとも3回繰り返した。

抑制実験は、選別したFACS精製脾臓細胞を用いて行った。簡単に説明すると、選別したCD4陽性CD25陰性細胞をまずカルボキシフルオレセインジアセテートサクシニミジルエステル（CFSE）（Molecular Probes社）で染色した。次に、細胞を、照射した抗原提示脾臓細胞（30Gy）、可溶性抗CD3（145.2C11；eBioscience）、およびあらかじめrhIGF-1で処理したCD4 CD25二重陽性細胞の表示された比率とともに96ウェルプレートで3日間培養した。その後、増殖細胞と非増殖細胞の割合を用いて抑制の程度を算出した。

遺伝子発現プロファイリング
Treg細胞をFoxp3cre/gfpマウスの脾臓から単離し、FACSで精製し（CD4+ CD25+ GFP+）、rhIGF-1と2日間インキュベートし、さらにFACSで精製した。RNAはRNeasy Mini Kitを用い、製造元の説明書に従って調製した（Qiagen）。ハイデルベルグのEMBL Gene Core Facilityで、RNA増幅、標識、M430 2.0チップ（Affymetrix）へのハイブリダイゼーションを2回行った。マイクロアレイデータはGeneSpringソフトウェアを用いて解析され、発現差は2倍、偽発見率はP < 0.05と定義された。マイクロアレイの結果は、遺伝子（stat1、bcl1 1b、map3k2、mapk1、tnfsf11、cd44、crebp、foxo1）のサブセットに対応するTaqmanプローブ（Applied Biosystems, Life Technologies）を用いたリアルタイムPCRによる定量的RNA解析によって確認された。mRNA量はhprt遺伝子のmRNA量に正規化した。転写標的濃縮解析は、ウェブベースのツールWebGestalt2（Zhang et al, 2005; Duncan et al, 2010）を用いて行った。本研究で実施したマイクロアレイデータは、ArrayExpressデータベース[http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/]に提出し、アクセッション番号E-MTAB-2951を得た。

統計
すべての解析は、Prism 5.0（GraphPad Software Inc.） 特に指示がない限り、統計解析はノンパラメトリックのMann-Whitney U検定またはStudent's t検定で行い、グラフは平均値と標準誤差を示した。具体的な検定と有意水準は、図の凡例に記載されている。

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謝辞
E. Perlas (Histology Facility, EMBL)には組織学的解析を、M. Al-Banchaabouchi (Phenotyping Facility, EMBL)およびM. Kamber (Laboratory of Animal Resources, EMBL)には動物の取り扱いを、C. Valeri (EMBL) にはEAEモデルマウスの手術を、T. IvacevicおよびV. Benes (GeneCore, EMBL Heidelberg)には遺伝子発現プロファイリングを、P. HeppenstallおよびS. Sattlerには原稿の批評的読解をお願いした。

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著者貢献
DBとLLがプロジェクトを発案した。DB、LLおよびBJは、組織学的解析を除き、すべての実験を計画・実施したが、組織学的解析はAPが行った。 DBは、プロジェクトを計画・監督し、実験を解析し、原稿を執筆した。NRはプロジェクトデザインに関する助言、原稿の修正、財政的支援を行った。

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利益相反
DB、LLおよびNRは、「Use of IGF-1 in the modulation of Treg cell activity and the treatment and prevention of autoimmune disorders and diseases」と題するEP2012/069721仮特許出願を行った。

この論文では以下のように説明されている。
問題点
自己免疫疾患はますます広まりつつあり、心臓病や癌のような他のよく認識されている病状を凌駕する恐れがある。その蔓延により、これらの疾患は、その壊滅的な結果に苦しむ人々の生活に影響を及ぼすだけでなく、医療システムの経済にも負担をかけている。現在の治療法は中程度の効果を示し、自己免疫によって引き起こされる持続的な炎症と組織損傷を避けるために、不均衡な免疫系を抑制することに依存している。しかし、これらの治療法は、必然的に長期的に深刻な悪影響をもたらす。健常者では、免疫系は宿主に害を及ぼす反応を抑制する一方で、病原体に対する迅速かつ正確な防御反応を可能にする平衡状態にある。自己免疫患者では、この平衡状態が失われ、免疫系が自己と非自己を区別できなくなる。Tレギュラトリー細胞（Treg細胞）はこのプロセスにおける重要な役割を担っており、炎症を抑制し、正常な免疫応答と自己寛容をコントロールする。Treg細胞を注射すると、臓器移植における免疫抑制が改善され、自己免疫の進行も抑制される。しかし、これらの細胞を十分に機能的に生産することは技術的に困難であり、またそれに伴うコストも高いため、研究者たちは、体内でこれらの制御細胞の数を増加させる安全な薬剤など、別のアプローチを模索している。

研究結果
本研究では、自己免疫疾患との闘いにおける新規のIGF-1送達法の実現可能性を証明し、IGF-1が、Treg細胞の拡大、活性化、罹患組織への移動をもたらし、長期的な免疫寛容と臨床転帰の改善をもたらす、天然に存在する成長因子であることを明らかにした。IGF-1は、慢性全身投与という集中的ではあるが臨床的に適切なアプローチを用いて、複数の自己免疫疾患モデルマウス（1型糖尿病と多発性硬化症）において自己免疫反応を抑制した。IGF-1は、ヒトまたはマウスのTreg細胞の増殖を特異的に誘導し、他の炎症性T細胞サブセットには影響を及ぼさなかった。重要なことは、この刺激作用は、in vivoでもin vitroでも、機能的IGF-1レセプターに依存していたことである。このことは、適応免疫系に対するIGF-1の作用の細胞型特異性を示し、自己免疫疾患の改善が観察されたことを説明し、全身的に投与されたIGF-1は、Treg細胞の増殖を増加させることによって、自己抗原に対する寛容を再確立できるという仮説をさらに支持するものである。

インパクト
今回の研究結果は、1型糖尿病や多発性硬化症などの一般的で壊滅的な自己免疫疾患や、移植片対宿主病における移植寛容、妊娠中の胎児寛容、微生物やアレルゲンに対する過剰な免疫反応の制御など、他の用途における組換えIGF-1の使用の根拠と前臨床試験を提供するものである。Treg細胞の機能にIGF-1が直接関与していることを明らかにすることで、その作用機序を理解するための基礎が得られ、臨床試験デザインのための適切な臨床マーカーやサロゲートマーカーの探索に役立つであろう。これらの結果は、Treg細胞の拡大を損なわず、寛容が発現するのに十分な時間が与えられる限り、IGF-1と他の薬剤（抗炎症剤または免疫抑制剤）との新しい組み合わせにも役立つであろう。rhIGF-1は、すでに重度の原発性IGF-I欠乏症の治療薬として承認されており、さまざまな臨床場面ですでに試験されていることから、自己免疫疾患や炎症性疾患の治療に使用するためのヒト試験を遅滞なく実施することができる。われわれのこれまでの研究と、Tregの作用を組織修復に関連付ける新たな知見とを合わせると、この研究は、組織の機能性を回復させ、線維化、萎縮、あるいは再生中の非解消性炎症の持続を抑制するために不可欠な、必要な細胞や分子を組織化するためのこの成長因子の可能性を強調している。

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補足情報
この論文の補足情報は、http://embomolmed.embopress.org。

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