微生物叢由来の3-IAAは膵臓がんにおける化学療法の効果に影響を与える
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掲載：2023年2月22日
微生物叢由来の3-IAAは膵臓がんにおける化学療法の効果に影響を与える
https://www.nature.com/articles/s41586-023-05728-y
Joseph Tintelnot, Yang Xu, ...Nicola Gagliani 著者を表示する。
Nature (2023)この記事を引用する
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指標詳細
概要
膵管腺癌（PDAC）は、転移性疾患の高い発生率と治療への限定的な反応により、2040年までに2番目に死亡率の高い癌になると予想されている1,2。PDACの一次治療である化学療法に反応する患者さんは全体の半数以下であり3,4、遺伝子の変化だけではこの状況を説明することはできません5。食事は治療への反応に影響を与える環境因子ですが、PDACにおけるその役割は明らかではありません。ここでは、ショットガンメタゲノムシークエンスとメタボロームスクリーニングを用いて、微生物叢由来のトリプトファン代謝物インドール-3-酢酸（3-IAA）が治療に反応する患者において濃縮されていることを示しました。ヒト化PDACモデルマウスにおいて、糞便微生物叢移植、トリプトファンの短期食事操作、3-IAA経口投与は、化学療法の効果を高めることがわかった。機能欠損実験と機能獲得実験を組み合わせて、3-IAAと化学療法の有効性が好中球由来のミエロペルオキシダーゼによって認可されていることを示す。ミエロペルオキシダーゼは3-IAAを酸化し、化学療法との併用により活性酸素種（ROS）分解酵素であるグルタチオンペルオキシダーゼ3およびグルタチオンペルオキシダーゼ7のダウンレギュレーションを誘発する。これらの結果、がん細胞では活性酸素の蓄積とオートファジーのダウンレギュレーションが起こり、代謝体力が低下し、ひいては増殖が阻害される。ヒトでは、2つの独立したPDACコホートにおいて、3-IAAレベルと治療効果の間に有意な相関があることが確認された。以上のことから、我々は、PDACの治療において臨床的意義のある微生物叢由来の代謝物を同定し、がん患者の治療中に栄養学的介入を検討する動機を提供する。
主な内容
5-FU、イリノテカン、オキサリプラチンとフォリン酸の併用療法（FOLFIRINOX）、またはゲムシタビンとナブパクリタキセル（GnP）によるポリケモセラピーは、転移性PDAC（mPDAC）患者に対する標準治療法として考えられています3,4。しかし、この治療法に反応する患者は全体の半数以下であり、反応しない患者（NR患者）は疼痛に苦しみ、最終的には数週間以内に死亡します3。PDACにおける遺伝子の変化は、治療が奏効した患者（レスポンダー（R）患者）とNR患者の違いをうまく説明できないため5,6、腸内細菌を含む環境因子が化学療法の効果のメディエーターとなる可能性が残されています。したがって、R群とNR群の違いを説明しうる環境因子を同定し、今後の治療法開発につなげることが急務となっています。
腸内細菌叢は、メラノーマ患者において免疫療法に対する反応を誘導することが示されており、食習慣によって調節することができます7,8,9,10。まれに、長期生存している限局性PDAC患者では、細菌が腸から腫瘍に移行し、抗腫瘍免疫活性化を制御することができます11,12。しかし、侵襲的な免疫療法抵抗性のmPDACを患う患者のほとんどは多剤併用療法で治療されており、微生物叢や食習慣がその効果に影響を与えるかどうか、またどのように影響を与えるかは現時点では明らかではありません1,13。
3-IAAによる化学療法への反応性の誘導
我々は30人のmPDAC患者を募集し、そのうち23人は抗生物質を投与されておらず、化学療法開始前に腸内細菌叢を分析するのに十分なサンプル材料を提供した（図1aおよびExtended Data図1a）。患者コホートは、主に放射線学的奏効に基づいて、あるいは病勢が安定した場合やコンピュータ断層撮影（CT）スキャンがない場合には、無増悪生存期間（PFS）と血清腫瘍マーカーの減少に基づいてR群とNR群に分けられた（詳しい基準については方法を参照のこと）。R患者（n=11）の平均PFSは40.9週で、NR患者（n=12）のPFS12.8週より有意に高く、全生存期間はR患者で51.9週、NR患者で26.4週だった（拡張データ図1b、図1c）。R患者の微生物叢は、NR患者の微生物叢とは異なっていた（図1bおよびExtended Data図1d-f）。微生物叢と化学療法への反応との間の潜在的な因果関係を調べるために、最初に採用した10人のRおよびNR患者の微生物叢をgnotobioticマウスに移植し、その後、Pdx1-Cre, LSL-KRASG12D, LSL-Trp53R172H/+ (KPC) 膵臓がん細胞を同所的に注入した (Extended Data Fig. 2a-d) 。注目すべきは、両群（RおよびNR）において、4人の患者がFOLFIRINOXで治療され、1人の患者がGnPで治療されたことである。元のドナー治療にかかわらず、化学療法（5-FU、イリノテカン、オキサリプラチン；FIRINOX）治療後に、R患者の微生物叢でコロニー化したマウスでは腫瘍が小さく、NR患者の微生物叢でコロニー化したマウスでは認められなかった（図1cおよびExtended Data 図2e）。腸内細菌がPDAC腫瘍に転移している可能性を考慮し11、次に16S rRNA配列決定により腫瘍内細菌を分析した。その結果、12個の腫瘍のうち2個でしか腫瘍内細菌を検出できなかった（Extended Data 図2f）。したがって、化学療法に対する反応は、循環する微生物叢由来の代謝産物を介して間接的に制御されているという仮説が立てられた。
図1：PDACのマウスモデルにおいて、3-IAAはFIRINOXに対する反応を誘導する。
図1
a, mPDAC患者23名の腸内細菌叢を化学療法（chemo）開始前に配列決定した。b, 治療前のNR（n = 12）とR（n = 10；1人の患者は品質管理後に除外された）の微生物叢のブレイ・カーティス非類似度行列による主座標分析（PCoA）。 c, 無産化マウスに5種類のRまたはNR微生物叢をコロニー形成し、KPC癌細胞を定位注入してマウスにFIRINOX治療を行うか未治療とした。腫瘍重量は、腫瘍細胞注入後20日目における各実験の未処置群の平均腫瘍重量との相対値で示す（n＝9 NR1-3；n＝8 R2；n＝7 R1およびR3；n＝5 NR5、R4およびR5；n＝4 NR4；9つの独立実験からプールされたもの）。d,e, RおよびNR患者3名の血清（d）およびRまたはNR微生物叢でコロニー形成したグノトビオティックマウスの血清（n = 3、生物学的複製）（e）において異なる豊富な代謝物を示すVolcano Plot。NS、有意ではない。 f、R-微生物叢をコロニー化したグノバイオティックマウスに、表示濃度のトリプトファンを与え、食事介入4日目の3-IAA血清濃度を示す（各n＝5）。 g、左、FIRINOX処理後の同所KPC腫瘍（n＝8、5または9）の腫瘍重量を示す。右、fから食餌群ごとにランダムに選択した5匹のマウス（n＝15）の3-IAA血清濃度と腫瘍重量との相関。 h、SPFマウスにKPC細胞を同所的に注入し、3-IAAでまたは（＋／-）FIRINOXでまたはなしで処理し、腫瘍重量を実験の20日目に評価した（n＝5または6）。各記号は1匹のマウスを表す。2回（f,g）または3回（h）の独立した実験のうち1回を示す。有意なP値を示し、MANOVA（b）、両側入れ子t検定（c）、フォールドチェンジ分析および両側t検定（d，e）、単純線形回帰およびピアソンのr（g）およびテューキーのポストホック検定を伴う一元配置分散分析（f〜h）によって決定された。
ソースデータ
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この問題に対処するため、私たちは、RおよびNR患者とそれに一致するコロニー形成されたグノトビオティックマウスの血清を分析し、液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた標的メタボロームスクリーニングを実施しました。その結果、NR患者に比べR患者では、トリプトファン代謝物の3-IAAが最も有意に濃縮されていることがわかった（図1d）。これと同様に、3-IAAは、NRに比べてRの微生物叢にコロニー形成されたgnotobioticマウスの血清中にも濃縮されていた（図1eおよびExtended Data図2g）。
R患者のどの腸内細菌が3-IAA産生の増加に寄与し得るかを特徴付けるために、NR患者と比較してR患者の微生物叢における一般的な3-IAA産生細菌株14の存在比を分析した。15種類の3-IAA産生菌のうち、Bacteroides fragilisとBacteroides thetaiotaomicronがRA患者で増加し、in vitroでの3-IAA産生能を確認しました（Extended Data 図2h、i）。
次に、3-IAAの前駆体であるトリプトファンの食事濃度を調節することによって、マウスの3-IAAの血清レベルを変化させ、それによって化学療法の効果に影響を与えることができないかと考えた（参考文献15）。トリプトファンは抗腫瘍免疫応答の発達を損ない、その結果、腫瘍の成長を促進する可能性があるため16,17、我々はまず、異なる期間の食事介入をテストした。14日間のトリプトファン暴露は腫瘍の成長を促進したが、4日間のみの治療期間では十分ではなかった（Extended Data Fig.2j、k）。したがって、腫瘍形成促進効果16,17 を回避するために、残りの実験では 4 ～ 5 日間の介入を選択することに決定した。
第二に、我々は、4日間の高トリプトファン食が、R微生物叢にコロニー形成されたgnotobioticマウスの血清中の3-IAA濃度を増加させるのに既に十分であることを観察した（Fig.1f）。さらに、この食事介入をFIRINOXと組み合わせた場合、腫瘍の重量が減少することが観察された（図1g）。加えて、3-IAA血清レベルは腫瘍重量と逆相関していた（図1g）。注目すべきは、これらのトリプトファン媒介効果、すなわち3-IAA濃度の増加および腫瘍重量の減少は、NR-微生物群培養マウスでは消失したことである（拡張データ図2l,m）。これらのデータは、トリプトファン高含有食の効果が3-IAAによって媒介されることを示唆するが、この一連の実験で観察された反応の増加に寄与する他のメカニズムを排除することはできない。そこで、特定病原体非含有（SPF）マウスに3-IAAを直接補充したところ、我々の介入は、Rマイクロバイオータをコロニー化したマウスで測定された濃度に達するのに十分であり、SPFのみならずNRコロニー化gnotobioticマウスにおいても化学療法の効果を増大させることがわかった（図1hおよび拡張データ図3a-c）。また、二次胆汁酸デオキシコール酸（DCA）や一次胆汁酸グリココール酸（GCA）など、異なる消化管癌に影響を与える他の微生物叢調節代謝物も試験した18,19。さらに、R 患者または R-マイクロビオータが定着したグノトビオティックマウスで増加した他の 2 つの代謝物、すなわちインドール誘導体のインドール-3-プロピオン酸（IPA）およびヒプリ ン酸を FIRINOX と組み合わせて試験することにした。これらの代謝物はいずれも、3-IAAと同様の効果をもたらさなかった（Extended Data Fig.3d、e）。これらのデータを総合すると、微生物叢由来のトリプトファン代謝物 3-IAA が化学療法に反応したヒトおよびマウスの血清中に増加し、トリプトファンによる食事介入によって 3-IAA のレベルが調節されることが示された。さらに、3-IAAは化学療法抵抗性のPDACをも治療感受性にした。
3-IAAの効果は、ミエロペルオキシダーゼによって認可される
微生物叢由来の代謝物、特にトリプトファン代謝物は、自然免疫と適応免疫の形成に重要な役割を持ち17、ひいては化学療法の効果やPDACの予後を決定する重要な役割を担っている11,20。そこで、化学療法を行っていない、あるいは行ったR-あるいはNR-マイクロバイオータコロニー化したgnotobioticマウスの腫瘍浸潤免疫細胞を分析することにした。その結果、化学療法後のR-マウスでは、NR-マイクロバイオータコロニー化マウスに比べてCD8+ T細胞の頻度が増加し、好中球が減少していることが一貫して観察された。未治療のマウスと比較した場合、腫瘍浸潤性免疫細胞には変化が見られなかった（Extended Data Fig.4a、b）。CD8+T細胞は、腸内細菌叢によって活性化されると、PDACの退縮を誘導することができる11,21。しかしながら、抗体処理によってCD8+またはCD4+とCD8+ T細胞の両方を枯渇させても、標準または高トリプトファン食のいずれかを受けたR-マイクロバイオータコロニー化マウスにおける化学療法の有効性は低下しなかった（Extended Data 図5a-d）。同様に、CD4+およびCD8+T細胞の枯渇は、SPFマウスにおける3-IAAおよびFIRINOXの効力を低下させなかった（Extended Data 図5e）。したがって、3-IAAの効果は、T細胞の存在に依存しないようである。
好中球はPDACに非常に多く存在し、好中球数の低下（好中球減少）はmPDACの予後良好と関連している22。3-IAAは、好中球の特徴であるミエロペルオキシダーゼ（MPO）が高濃度に存在する細胞に対して特異的に毒性を示します23。メカニズム的には、MPOは3-IAAを酸化し、3-methylene-2-oxindole（MOI）などの毒性産物を誘導することができる24,25。これに伴い、T細胞ではなく骨髄由来の好中球（好中球はT細胞よりもMPOレベルが高い）を3-IAAとFIRINOXで培養すると、細胞の生存率が低下することが分かった（拡張データ図6a）。さらに、骨髄由来の好中球培養液にMPOを添加したり、内因性MPOのレベルが高い未熟な好中球（プレ好中球）を使用すると（参考文献26および拡張データ図6b）、3-IAAおよびFIRINOXの毒性が増加した（拡張データ図6c、d）。対照的に、IPAは、in vitroでの好中球細胞死を誘導するFIRINOXの効力を増加させなかった（拡張データ図6e）。3-IAAとFIRINOXに対する好中球の反応をさらに特徴付けると、この処理は、MPOの放出として測定される好中球の脱顆粒と壊死を誘発したが、好中球細胞外トラップ（NET）の形成やアポトーシスには至らなかった（拡張データ図6f～h）。次に、これらの結果がin vivoでも再現可能であるかどうかを検討した。3-IAAとFIRINOXの併用により、SPFマウスの腫瘍および脾臓における好中球の頻度と数が減少した（図2aおよび拡張データ図6i）。注目すべきは、これは3-IAA治療単独の場合ではなかったことである（Extended Data Fig.6j）。
図2：3-IAAおよびFIRINOXの有効性は、MPOによって認可されている。
図2
a、SPFマウスにKPC細胞を同所的に注入し、3-IAAを含むまたは含まないFIRINOXで処理し、FIRINOX処理後3日目に腫瘍を分析した（n = 8ずつ）。同所腫瘍またはそれぞれの脾臓の免疫サブセットをフローサイトメトリーで決定した。CD8+ T細胞 (CD3+CD8+); CD4+ T細胞 (CD3+CD4); マクロファージ (CD11b+F4/80+); 好中球 (CD11b+Ly6G+) は、総生存免疫細胞 (CD45+) に対する相対値として示されている。b, aと同様に処理・分析した照射マウスおよび野生型（WT）（n = 4）またはMpo-/-（n = 5または6）骨髄（BM）再構成マウスの同所KPC腫瘍または各脾臓の腫瘍重量および免疫サブセットの計数。c、照射され、野生型、Mpo-/-またはAhr-/-骨髄再形成されたマウスは、KPC細胞を同所的に受け、FIRINOXまたはFIRINOX＋3-IAAで5日間処理した（各n＝5）。すべてのマウスは、高トリプトファン食による4日間の食事介入を受けた。腫瘍の重量はFIRINOX投与後7日目に評価した。各記号は1匹のマウスを表す。2つの独立した実験をプールしたもの（a）、または2つの独立した実験のうち1つを示す（b,c）。有意なP値を示し、両側Mann-Whitney検定（a）または両側t検定（b,c）により決定された。
ソースデータ
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有毒な3-IAA生成物の放出における好中球由来のMPOの重要な役割を考えると、このことが3-IAAとFIRINOXの腫瘍増殖に対する有効性の増加を説明できるのかどうか疑問に思った。この疑問を解決するために、野生型またはMpo-/-マウスの骨髄キメラを樹立した。予想通り、FIRINOXと3-IAAで処理すると好中球が枯渇し、野生型再構成マウスでは相乗効果を示しました（図2b）。しかし、Mpo-/-骨髄で再構成したマウスでは、3-IAAを加えても腫瘍は小さくならず（図2b）、MPOが3-IAAとFIRINOXの効果に不可欠であることが示唆された。MPOの役割をさらに裏付けるように、3-IAA酸化産物MOIは、3-IAAとFIRINOXで処理した後の野生型SPFマウスの腫瘍において、FIRINOX単独の腫瘍と比較して増加した（拡張データ図7a）。さらに、Mpo-/-骨髄再形成マウスの腫瘍では、MOIのレベルが強く減少した（拡張データ図7b）。
最後に、3-IAAおよび他のインドール27の細胞内受容体としてのアリール炭化水素受容体（AhR）の重要な役割を考慮し、Ahr-/-骨髄再構成マウスが3-IAAおよびFIRINOXに抵抗性であるかどうかを検討した。Ahr-/- 骨髄再形成マウスの腫瘍の大きさは、3-IAA および FIRINOX 処理後に野生型再形成マウスの腫瘍と同程度に縮小した（図 2c）ことから、3-IAA および FIRINOX 処置の有効性を媒介する AhR の役割は否定された。さらに、AhrをノックダウンしたKPC細胞がin vivoで3-IAAおよびFIRINOX処理に反応したことから、AhRはがん細胞においても不要であることがわかった（Extended Data 図7c）。
これらのデータは、3-IAAおよびFIRINOXの有効性が、AhRシグナルではなく、免疫細胞由来のMPOによって認可されることを示している。
3-IAAの効果は、活性酸素とオートファジーに依存する
MPOを介した3-IAA の酸化は、培養好中球に活性酸素を誘導し23、活性酸素は化学療法による細胞死の主要メディエーターである28。したがって、MPOの存在下での3-IAAとFIRINOXの有効性は、活性酸素によって媒介されると仮定した。これに対処するため、我々は、化学療法の有無にかかわらず、3-IAA、3-IAAと好中球、または3-IAAとMPOの投与量を増やしてマウスおよびヒトPDAC細胞を培養した。3-IAAは、用量依存的に活性酸素を直接増加させた。好中球またはMPOの添加は、がん細胞における活性酸素の蓄積をさらに促進し、MPOの添加は、マウスおよびヒトPDAC細胞株の生存率を低下させた（拡張データ図7d-k）。注目すべきは、3-IAA酸化産物であるMOIの直接添加も、マウスおよびヒトPDAC細胞におけるFIRINOXの効力を増加させたことである（拡張データ図7l,m）。
さらに、in vivoでの活性酸素誘導に対する3-IAAとFIRINOX処理の効果を検証するために、SPFマウスに3-IAAとFIRINOXまたはFIRINOX単独を投与しました。我々のin vitroデータと同様に、3-IAAとFIRINOXによる処置は、フローサイトメトリーによるがん細胞の活性酸素として、または全腫瘍組織染色におけるニトロチロシンとして測定された、高い酸化ストレスを誘発しました（拡張データ図7n,o）。さらに、活性酸素の生成と3-IAAの酸化の間の関連性を強化するために、フローサイトメトリーによって、野生型骨髄再形成マウスと比較してMpo-/-マウスのがん細胞で3-IAAとFIRINOXで処理した後の活性酸素のレベルがはるかに低いことを確認しました（拡大図7p）。
次に、3-IAAおよびFIRINOXで処理した腫瘍における活性酸素の蓄積に、どの酸化ストレス関連経路が関与しているのかを検討した。この目的のために、3-IAAとFIRINOXで処置したマウスの腫瘍をFIRINOX単独で処置したマウスの腫瘍と比較して、mRNA配列データにおける既知の活性酸素産生酵素または活性酸素分解酵素の発現を分析した（拡張データ図8a）。我々は、活性酸素分解酵素であるグルタチオンペルオキシダーゼ3（GPX3）およびグルタチオンペルオキシダーゼ7（GPX7）がin vivoでダウンレギュレートされており、3-IAA、FIRINOXおよびMPOで処理すると、in vitroのKPC細胞でGPX3およびGPX7が同様にダウンレギュレートされていたことが分かりました（Extended Data Fig.8b）。がん細胞におけるGpx3およびGpx7のノックダウンは、FIRINOX処理後の活性酸素の蓄積を増加させるのに十分であり、3-IAAおよびFIRINOXと同程度にFIRINOXに対するがん細胞の感受性を増加させた（拡張データ図8c、d）。注目すべきは、Gpx3のノックダウンがin vivoでのFIRINOXに対する感受性を確立するのに十分であったことです（Extended Data Fig. 8e）。最後に、活性酸素スカベンジャーのN-アセチルシステイン（NAC）で処理すると、R-微生物群培養（すなわち高3-IAA）マウスにおけるFIRINOXの効力が消失することから、活性酸素の蓄積が3-IAAおよびFIRINOXの効力に必須であることを示すことができた（図3a）。
図3：3-IAAとFIRINOXで処理すると、オートファジー活性が低下する。
図3
a、GnotobioticマウスをR微生物叢でコロニー化し、KPC細胞を起座注入した。マウスは未処置、またはFIRINOX、NAC（9〜13日目）、またはFIRINOX＋NAC（n＝5ずつ）で処置された。実験の20日目における腫瘍重量を示す。 b、同所性KPC腫瘍を有するSPFマウスを、+/- 3-IAAで置換し、FIRINOXで処理し、示されたように分析した。IHC、免疫組織化学。 c、ヘマトキシリン・エオジン（H＆E）、LC3BまたはKi67で染色した同所腫瘍の代表画像（左）およびフィールドあたりの陽性細胞（各n＝5）についてのそれぞれの統計値（右）。d,e、GFP-LC3B-RFPレポーター細胞株Hy19636_GLRMをSPFマウスに注入し、マウスを表示通りに処置した（n = 5ずつ）。グラフは、FIRINOX処理後1日目のGFP/RFP比（d）および3日目の腫瘍重量（e）である。代表的な合併免疫蛍光画像または3倍の倍率で示した領域を示す；スケールバー、10μm。 f、KPC癌細胞をR-微生物叢に定着させたマウスに定位注入し、スキームに示した処理を適用した（n = 4または5）。腫瘍重量は、実験の18日目に示す。 g、NR微生物叢でコロニー化したgnotobioticマウスからの同所性KPC腫瘍の腫瘍重量は、示された処置の9日後に示す（n＝4または5）。CQ、ヒドロキシクロロキン。1回の実験（c）または2回の独立した実験のうちの1回（a,d,e-g）を示している。各記号は1匹のマウスを表す。有意なP値は、一元配置分散分析に続いてDunnettのポストホックテスト（a,c,f）またはTukeyのポストホックテスト（d,e）、あるいはクラスカル-ワリス検定に続いてDunnのポストホックテスト（g）によって決定されたことを示す。
ソースデータ
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次に、高濃度の活性酸素に対する分子応答はどうなっているのだろうかと考えた。これに対処するため、3-IAAとFIRINOX、またはFIRINOX単独で治療したSPFマウスから分離した腫瘍について、標的タンパク質スクリーニングとmRNA配列決定を行った（図3b）。オートファジーは、3-IAAとFIRINOXで治療したマウスから分離した腫瘍でダウンレギュレートされた主要経路の一つでした（拡張データ図8f、gおよび補足表1〜3）。注目すべきは、オートファジーはPDACが増殖・隆起するために必須の代謝プログラムであることだ29。次に、3-IAAとFIRINOXで処理したSPFマウスから分離した腫瘍において、オートファジー基質LC3Bが減少し、p62/SQSTMが増加していることを見出した（図3cおよび拡張データ図8h）。これに伴い、R-微生物群培養マウス（高3-IAA）の腫瘍も、NR-微生物群培養マウス（低3-IAA）の腫瘍と比較して、LC3Bの存在量の減少およびp62/SQSTM1の存在量の増加を示した（拡張データ図8i,j）。LC3Bとp62/SQSTMの変化は、3-IAAとFIRINOXで処置したマウスにおいて、Ki67の発現として測定した腫瘍細胞増殖の減少を伴っていた（図3c）。しかし、切断型カスパーゼ-3で測定したアポトーシス細胞数の変化は、処置後3日目まで観察されなかった（拡張データ図8k）。オートファジーのダウンレギュレーションが3-IAAとFIRINOXの相乗効果を説明する必須の下流機構であるのか、それとも単に観察されたがん細胞増殖の減少に関連しているのかを検証するため、生体内で機能獲得実験と機能喪失実験を実施した。まず、二糖類であるトレハロース30で処理すると、オートファジー報告細胞31におけるGFP/RFP比の減少によって測定されるように、オートファジー活性が正常化することが観察された（図3dおよび拡張データ図8l）。第二に、トレハロースは、活性酸素スカベンジャーNACと同様に、3-IAAおよびFIRINOXの治療効果を完全に逆転させるのに十分であった（図3e,f）。第三に、オートファジー阻害剤ヒドロキシクロロキンで処理すると、NR-マイクロバイオータコロニー化マウス（低3-IAA）の腫瘍がFIRINOX処理に対して感作された（図3g）。最後に、ドキシサイクリン誘導性ドミナントネガティブATG4Bタンパク質（mSt-ATG4B）29を通じてがん細胞のオートファジーを阻害すると、ドキシサイクリン処理を行わない対照細胞（mSt）またはmSt-ATG4B細胞と比較して、SPFマウスのFIRINOX治療に対する感受性が上昇した（拡張データ図8m）。
全体として、これらのデータは、FIRINOX処理中に3-IAAとMPOが存在する場合、活性酸素の蓄積が増加し、癌細胞のストレス適応が損なわれ（すなわち、オートファジーがダウンレギュレートされ）、最終的に腫瘍細胞の増殖の減少を誘発することを示唆している。
3-IAAは治療薬としての可能性を秘めている
3-IAAの治療的意義の可能性をさらに検討するため、3-IAAとFIRINOXの反復投与によるマウスの生存率への影響、他のがん種の治療、3-IAAと異なる化学療法の組み合わせ、すなわちGnPの有効性を検証した。3-IAAとFIRINOXを一緒に3サイクルまで、しかしどちらも単独では、同所性PDACの生存期間を有意に増加させた（図4a）。注目すべきは、3-IAAは皮下の大腸腫瘍（MC38）または肺腫瘍（LLC）の治療においてもFIRINOXと相乗効果を示し（Extended Data図9a、b）、さらに同所的PDACにおいてもGnPと相乗効果を示した（Extended Data図9c）ことである。これらの知見は、癌治療における3-IAAの一般的な役割の可能性を強調する。
図4：3-IAAはPDACにおいて臨床的に適切である。
図4
a、SPFマウスにHy19636細胞を同所的に注入し、示されたように処理し、それらの全生存をKaplan-Meier推定法で描いた（未処理n＝12；FIRINOX n＝14；3-IAAn＝9；3-IAA＋FIRINOX n＝10）。b-d、ハンブルグコホートの患者の3-IAA血清濃度を化学発光免疫測定法（CLIA）で測定し、全白血球数が最も少ない時点（化学療法開始後3ヵ月以内）の血中好中球数（b）、リンパ球数（c）、単球数（d）と化学療法開始前の数の比に相関を持たせた。e, CTスキャンで測定された腫瘍の大きさは、ハンブルグコホートの患者のPFSと相関していた。 f, g, ハンブルグコホートの患者の化学療法2～3サイクル後の3-IAA血清濃度は、PFS（f）または全生存（g）と相関していた。1人の患者は、死亡する前に癌が進行していなかったので、fから除外された。h,i, ミュンヘン集団の患者の治療開始前の3-IAA血清濃度は、PFS（h）または全生存期間（i）と相関があった。各記号は1人の患者を表す。2つの独立した実験をプールした（a）。平均値および95％信頼区間。P値を示し、log-rank Mantel-Cox検定（a）または単純線形回帰およびピアソンのr（b-i）により決定された。
ソースデータ
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最後に、ヒトにおける我々の知見の関連性を評価したいと考えた。化学療法に反応した患者では好中球減少の割合が高いことが観察され、マウスのデータおよび好中球減少とPDAC予後の既知の関連と一致した22 (Extended Data Fig. 9d)。注目すべきは、化学療法後の好中球減少のレベルであり、リンパ球や単球の減少は、それらのMPOのレベルの違いから予想されるように、3-IAA血清濃度と相関していた（図4b-d）。さらに、我々の観察コホート（ハンブルグコホート、拡張データ表1）では、3-IAA血清濃度とPFSまたは全生存率との有意な相関が認められたが、二次胆汁酸DCAでは認められなかった（図4f、gおよび拡張データ図9e）。我々は、Ludwig-Maximilians-University (LMU) HospitalのmPDAC患者の第2のコホート（ミュンヘンコホート、拡張データ表1）でこれらの知見を検証した（図4h,i）。化学療法効果を事前に予測するための臨床的に評価可能なマーカーがないことを反映して、患者特異的変数（年齢、性別、体重）および腫瘍特異的変数（腫瘍サイズ、腫瘍マーカー）のいずれもPFSと有意に関連しなかった（図4eおよびExtended Data図9f）。
考察
要約すると、我々の結果は、微生物叢由来の代謝物3-IAAがPDACにおける化学療法への反応の重要な増幅器であることを同定するものである。FIRINOX治療中に3-IAAとMPOが高濃度で存在する場合、活性酸素の蓄積が増加し、がん細胞のストレス適応が損なわれ、最終的にPDAC細胞の増殖が減少することになる。分析対象患者数が限られているにもかかわらず（ハンブルグコホート n = 23、うち血清サンプルが入手できたのは21、ミュンヘンコホート n = 24）、化学療法中（ハンブルグコホート）または化学療法開始前（ミュンヘンコホート）に測定した3-IAA血清濃度とPFSまたは全生存の間に強い相関性が観察された。
これらのデータは、直接的な治療または食事介入によって化学療法中に3-IAA血清濃度を上昇させ、最終的にはPDACのNR患者の生存率を高めることを目的とした臨床試験を開始する初期の前提条件となるものであった。特定の食事によって3-IAAの基質であるトリプトファンを増加させることは容易に実現できるが、この方法は、食事介入後に3-IAAの血清濃度がR-微生物叢に定着したマウスでのみ上昇するという所見に示唆されているように、微生物叢の構成に影響される。したがって、優良製造規範の標準的な条件下で3-IAAを製造することが可能になれば、3-IAAによる直接治療が理想的であり、特に、NR微生物叢でコロニー化したマウスにおける我々の実験が示すように、望ましくない微生物叢の存在を回避する能力を考慮すれば、3-IAAによる直接治療が理想的である。
今後の臨床試験を計画する前に、化学療法がない場合、インドールや他のトリプトファン代謝物がPDAC16のAhRを介した抗腫瘍免疫反応の発達を損なう可能性があることを考慮することが重要である。しかし、我々のデータは、化学療法なしで4〜5日間の3-IAA投与は腫瘍の成長に影響を与えるのに十分ではなく、化学療法と組み合わせた場合にのみAhR非依存的なメカニズムで腫瘍の成長を減少させることを示している。とはいえ、介入研究を行う前に、より多くの観察研究が必要である。
あるいは、癌患者の治療に試験的に用いられている糞便微生物叢の移植は、10人の異なるヒトドナーの便を用いた我々のgnotobioticマウス実験で示されたように、3-IAAの血清濃度を高め、それに応じて化学療法への反応を高めるのに十分である可能性がある8,9。本研究は、B. fragilisとB. thetaiotaomicronがR患者の微生物叢に濃縮され、3-IAAを産生できることを示唆している。しかしながら、3-IAAを産生することができる分類学的に異なる膨大な数の細菌種を考慮すると、これらの細菌が本当にR患者の3-IAA産生の原因であるかどうかを明らかにするために、より大規模な研究が必要である（参考文献14,15）。このような研究は、糞便微生物叢移植の将来的な研究のためのドナーの選択を狭めるために興味深いものである。
3-IAAとFIRINOXによる治療による腫瘍サイズの効果と並行して、PDACのマウスモデルで好中球の枯渇も観察された。PDAC患者において、化学療法中の好中球の枯渇と3-IAAの血清濃度の間に正の相関があることがハンブルク・コホートで観察されました。これらのデータは、マウスと同様に、3-IAAがヒトにおける好中球減少症の発症に寄与する可能性を示唆している。しかしながら、化学療法剤の代謝の変化、化学療法剤の排泄の阻害、化学療法剤の投与量の違いなど、他の要因が好中球減少症を引き起こす可能性があることを考えると32、ヒトにおける3-IAAと好中球減少症の間に因果関係があるかどうかをしっかりと結論づけるためには、この特定の側面に注目した研究が必要である。さらに、好中球のレベルは多くのがん種で生存の重要な予測因子であるため、他のがん種で記述されたメカニズムの調査が保証されるかもしれない33,34。
今回の発見は、PDACや大腸がんなどの他のがん種の治療、特にFIRINOXベースのレジメンで治療を受けている患者さんにとって、大きな変革をもたらす可能性があります。さらに、我々の発見は、化学療法に対応する活性酸素-オートファジー軸に対する微生物由来の代謝産物の効果に取り組む研究の開発の引き金となるであろう。
研究方法
患者およびヒト材料
mPDACと診断され、GnPまたはFOLFIRINOXによる治療が予定されている患者を本研究に募集した（n = 30）。ハンブルグ倫理委員会（Ethikkommission der Ärztekammer Hamburg, Germany）の承認に基づき、全患者からインフォームドコンセントを得た。治療開始後3カ月間に抗生物質を投与された患者、治療前の便を届けなかった患者、化学療法を開始しなかった患者、COVID-19を発症した患者は解析から除外した（n = 7）。化学療法開始前にホームサンプリングキット（OMNIgene, Gut OMR-200）を用いて便を採取し、ショットガンメタゲノムシークエンシングを行った。1サンプルは、サンプルチューブの過負荷により固定がうまくいかず、微生物相の表現が制限されたため、配列決定後に除外された。したがって、微生物相解析のための最終的なコホートには22人の患者が含まれていた。この腫瘍縮小は、治療開始前の時点と、地元の放射線科医が評価した一次治療中に最良の反応を示した時点を比較したCTスキャンにおける原発腫瘍と最大転移巣の減少として計算される（CT反応評価では通常20～30％の変化が有意とみなされる35）。病勢安定またはCTスキャン欠測の場合は、PFS140日以上（現実のFOLFIRINOXおよびGnPコホートのPFS中央値36）または血清腫瘍マーカー40％以上低下（PDAC緩和治療における予後カットオフ37）の基準を考慮した。機能実験用の便は、添加物を含まないチューブで採取し、直接実験室に運び、その後20％グリセロール（Teknova、G1723）で希釈し、分注して-80℃で凍結した。血液は化学療法の3サイクル目または4サイクル目に採血し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）と1対1で混合し、勾配遠心分離により血漿を分離した。ミュンヘン集団の血清材料は、化学療法開始前に採取され、現地の基準に従って処理された。ミュンヘン倫理委員会（プロジェクト番号：284-10）の承認に基づき、すべての患者からインフォームドコンセントを得た。
動物モデル
この研究で使用されたすべてのマウスは、C57BL/6バックグラウンドであった。すべてのマウスは、機関審査委員会 'Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit und Verbraucherschutz' (Hamburg, Germany)に従って使用された。マウスは、周囲温度20±2℃、湿度55±10％、暗-明周期12時間のSPFまたは無菌条件下で飼育され、4〜16週齢の年齢および性別が一致した同腹仔がほとんど使用された。骨髄キメラの樹立に用いたMpo-/-骨髄は、S. BaldusとM. Mollenhauerから提供されたものである。骨髄キメラを樹立するために使用したAhr-/-骨髄は、C. Esserから提供された。
ヒト微生物叢のコロニー形成のために、便を解凍し、脳心筋梗塞ブロス（BHI）で洗浄し、BHIで希釈した。この懸濁液200マイクロリットルをアイソケージに収容したgnotobioticマウスに1回経口投与した。2〜4週間後、腫瘍の実験が開始された。
サンプルサイズは小規模のパイロット実験に基づいて計算され、マウスは治療開始前に無作為に割り付けられた。複雑な治療スケジュールのため、マウスを治療する人は盲検化されていない。同所的PDACのモデルについては、PBSとマトリゲル（Corning、356231）の1：1混合物中に、5×104-10×104 KPC、2×105 Hy19636、1×105 mSt-ATG4B/mStまたは1×105ノックダウンKPC（AhR、GPX、スクランブルコントロール）細胞を同所的に注射した。腫瘍重量は、特に指示のない限り、腫瘍細胞注入後20日目に評価した。皮下腫瘍増殖のために、2.5×105個のLLC-GFPまたは1×106個のMC38細胞を脇腹に皮下注射した。皮下腫瘍の成長はノギスを用いて1日おきに測定した。腫瘍重量は、腫瘍細胞注入後17日目に評価した。活性実験マウスの皮下腫瘍の最大許容直径は1.5 cmであり、限界を超えることはなかった。
骨髄キメラの場合、レシピエントマウスは骨髄移植の24時間前に9.6 Gy（BioBEAM 2000）を照射された。その1日後に、野生型、Ahr-/-またはMpo-/-マウスから分離した1×106-4×106の骨髄細胞を静脈注射により移植した。移植から3〜4週間後、がん細胞を定位注射し、以下に述べるように処理した。移植の成功は、腫瘍浸潤免疫細胞の定量的PCR（qPCR）により検証された。
化学療法は、指定された時点（通常、がん細胞注入後11日目）に腹腔内（i.p.）で開始された。オキサリプラチン（アコード）5mg kg-1、イリノテカン（アコード）20mg kg-1、5-FU（メダック）50mg kg-1は、他の研究38,39に記載されているようにFIRINOX治療に使用された。Folinic acidは使用せず、GnP治療にはgemcitabine（Hexal）120 mg kg-1およびnab-paclitaxel（Celgene）30 mg kg-1を使用した。T細胞の枯渇は、化学療法治療の1日前から3日ごとに、200μg抗CD8抗体クローン53-6.7（BioXcell、BE0004）単独または200μg抗CD4抗体クローンGK1.5（BioXcell、BE0003）との併用で、 i.p. 処理により達成された。対照マウスは、同様の濃度および間隔で、それぞれのアイソタイプコントロールクローン2A3（BioXcell、BE0089）で処置した。オートファジー誘導は、化学療法治療の1日前および当日に、3g kg-1の濃度のトレハロース（Sigma、T9449）の2回のi.p.注射を用いて達成された。同様に、PBSに溶解した60 mg kg-1のクロロキン（Sigma, C6628）を、化学療法治療の1日前と当日にi.p.注射した。
3-IAA（500mgkg-1）による処理は、特に指示しない限り、PBSに溶解したインドール-酢酸ナトリウム塩（Sigma、I5148）を用いて、5日間連続（化学療法前2日間から化学療法後2日間）で毎日経口ガベージにより適用された。インドール-3-プロピオン酸（3-IPA；Sigma，57400）、GCA（Sigma，G2878）、ヒップリン酸（Sigma，112003）およびDCA（Sigma，30960）をPBS中の1M NaOHに溶解し、1M HClを用いて7.4にpH調節を施した。この溶液を500 mg kg-1 (3-IPA、hippuric acid)または各250 mg kg-1 (GCA、DCA)の濃度で5日間連続経口投与した。NAC（Sigma, a7250）を1 g l-1の濃度で飲料水中に自由摂取で5日間散布した。
食事によるトリプトファンの調節は、化学療法の3日前から治療1日後まで開始された。1つの実験では、トリプトファン調節は合計14日間適用された。標準食（2.3 g kg-1 トリプトファン；アルトロミン、1320）を、合成結晶AAトリプトファンなし（0 g kg-1；SSNIFF，S9336-E701） 食、または結晶AAトリプトファン高（12 g kg-1；SSNIFF，S5714-E711） 食に変更した。その後、食餌を標準食に戻した。
がん細胞注入後5日目または8日目から合計7日間連続して、食事性ドキシサイクリン（シグマ、D9891）を625 mg kg-1の用量で食事から投与した。その後、食餌を標準食に戻した。
血清代謝物測定のため、実験終了時または指示された時点で採血した。血液は30分間凝固させ、その後10分間遠心分離した（1,000g）。血清は希釈し、特定のセクションに記載したように使用した。
DNA抽出とショットガン・メタゲノミクス
DNA 抽出は、ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA kit (Zymo Research, D4302) でサンプルを分離し、Zymo DNA Clean and Concentrator-5 (Zymo Research, D4004) で精製した。ライブラリーは、NEBnext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, E7645)を用いて、150 ngの全DNA、400-500 bpのサイズ選択、4×PCRサイクルで調製しました。
ショットガンメタゲノミクスでは、NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit (New England Biolabs, E7805)を用いてIlluminaライブラリー調製を行った。ライブラリー調製は、製造元の説明書に従って行った。サイズセレクションはAMPure XP beads (Beckman Coulter, A63882)を用いて行い、アダプター濃縮はイルミナのNEBNext Multiplex oligos (New England Biolabs, E7335) を用いた7サイクルのPCRで行い、イルミナ NovaSeq (2 × 150 bp) シークエンスに付した。
バイオインフォマティクス解析のため、生リードを低品質でトリミングし、bbdukを用いてphix174およびヒトhg19ゲノムに対してフィルタリングした（ref.40）。分類学的な種のプロファイリングのために、すべてのライブラリは、BBMap (refs. 41,42) を使用して、Unified Human Gastrointestinal Genome collection (n = 4,644) に対してマップされました。マッピング率はTranscripts per million (TPM)で正規化し、ゲノムカバー率（ゲノム幅）が10%未満のゲノムはサンプルに浸透していないものとした。データはメタゲノム演算分類単位（OTU）としてbiom形式にまとめられ、phyloseqとLEfSeで解析された（文献43,44）。種レベルの機能プロファイリングは、HUMAnN3 を用いて行い、またヒトマイクロバイオームの 990 万遺伝子統合参照カタログ41 を用いて行った。
細菌株と分離
Bacteroides thetaiotaomicron (DSM 2079), B. fragilis (DSM 2151) および Prevotella copri (DSM 18205) は German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) から取得した。細菌の分離には、グリセロールで凍結した糞便サンプルを解凍し、バンコマイシンを添加したBHI血液寒天培地プレート（5％脱脂羊の血液＆ビタミンK3）上に連続希釈で嫌気的にストリークした。37℃のインキュベーター内で2日間培養した後，96ウェルプレートのBHI-S培地にシングルコロニーを摘出し，さらに24時間培養した．thetaiotaomicron (B. theta F 5′-GAGGGTGTCGTATTTCCGAAGG-3′ R 5′-GTTCCCTGATCCAGTGTTGG-3′) または B. fragilis (B. frag F 5′-AATGATTCCGCATGTTTCA-3′ R 5′-ATTTTGGATTAGCATACGG-3′) の特異的プライマーを用いて、PCRによってスクリーニングした。PCR陽性のウェルを寒天プレート上で継代して純粋な培養物を得、サンガー配列決定によってさらに同一性を確認した後、得られた菌株はさらに使用するまでBHI-Sで維持した。すべての細菌株は、10%ウシ胎児血清(FBS)とビタミンK3を添加したBHIブロス(BHI-S)で嫌気的に培養・維持された。
菌体上清の抽出
1%トリプトファンを添加したBHI-S培地に、完全に増殖した一晩の細菌培養物（1:50の比率）を接種し、指数関数期初期まで嫌気培養を行った。嫌気培養室から培養物を取り出し、室温で4,700rpm（4,816g）、5分間遠心分離した。上清を除去し、直ちに-20℃で凍結した。
16S rRNAの塩基配列決定
腫瘍からの DNA は、DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, 69504) を用いて抽出した。約10mgの組織をATLバッファー中Proteinase Kで56℃、1時間消化した後、サンプルを製造者のプロトコルにしたがって処理した。ブランク抽出コントロールは、サンプルの抽出中に含まれた。
16S rRNA 遺伝子の可変領域 V1 と V2 は、以前の報告45 に従って、プライマーペア 27F-338R を用いてデュアルバーコードアプローチで増幅された。腫瘍の場合、3.5 µl の DNA が増幅に使用され、PCR 産物はアガロースゲル電気泳動で確認された。最終PCR産物は、SequalPrep Normalization Plate Kit（Thermo Fisher Scientific, A1051001）を用いて正規化し、等モルでプールしてIllumina MiSeq v3 2×300bp (Illumina) でシークエンシングした。配列決定後のデマルチプレックスは、バーコード配列のミスマッチ0を基準とした。データ処理は、DADA246 workflow for big datasets (https://benjjneb.github.io/dada2/bigdata.html; V1-V2領域用に調整したワークフローはこちら: https://github.com/mruehlemann/ikmb_amplicon_processing/blob/master/dada2_16S_workflow.R) を用いて行い、アンプリコン配列変異（ASV）の存在量テーブルを作成した。ASVは、DADA2が提供するベイズ分類法とRibosomal Database Project (RDP) version 16 releaseを使用して、分類学的アノテーションが行われた。属レベルで分類できない配列は、可能な限り細かい分類にビニングされました。
メタボロームスクリーン
超高圧液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（UPLC-MS/MS）を用いて、ポジティブおよびネガティブイオン化モードの両方でデータを取得し、630代謝物の同定と定量を可能にしました。血漿サンプルは、製造元の指示に従ってMxP Quant 500 Kit（Biocrates社）を使用して処理しました。簡単に言うと、血漿サンプル、キャリブレーション標準、およびコントロールサンプルの10 µlを、内部標準のキャリブレーション用に内部標準を含むフィルターに移しました。フィルターは、圧力マニホールド（Waters）を使用して窒素気流下で乾燥させた。試料を誘導体化試薬フェニルイソシアネートと60分間インキュベートした。窒素下で乾燥させた後、分析物をメタノール中の5 mmol l-1 酢酸アンモニウムで抽出し、溶出液をさらに希釈してUPLC-MS/MS分析に使用しました。対象となった分析は、UPLC分離およびフローインジェクション分析（FIA）後にMS/MSで検出された630代謝物（https://biocrates.com/mxp-quant-500-kit/）です。各測定では、すべての代謝物をカバーするために、2回のUPLC実行と3回のFIA実行が必要でした。すべての分析は、ACQUITY UPLC I-Class システム (Waters) と Xevo TQ-S 質量分析計 (Waters) を組み合わせて実施されました。逆相クロマトグラフィー分離は、C18 LC-column（Biocrates）を用い、溶離液系として0.2%ギ酸/水、0.2%ギ酸/アセトニトリルを使用しました。FIAの溶媒はメタノールで、キットメーカーから提供された修飾剤を使用しました。UPLC-MS/MSの結果のデータ解析は、7点曲線または1点キャリブレーションと内部標準の正規化に基づいて行われた。下限閾値以下の値はゼロに設定された。濃度データはMetaboAnalyst v.5を使用して解析した。濃度は解析前に対数変換し、生のP値および対数2変換したfold change値をFig.1のグラフィックに示した。
3-IAAおよびDCA CLIA
3-IAAまたはDCA血清濃度を定量するために、マウスまたはヒト血清をPBSで1対10に希釈し、化学発光免疫測定法（CLIA）（アベクサ、3-IAA abx190011; DCA 258844）を製造者のプロトコルに従って実施した。培養物中の3-IAAを検出するために、上清を上記のように処理し、そしてアッセイに直接使用した。化学発光はFLUOstar Omega (BMG Labtech) を用いて、1ウェルあたり1秒サンプリングで検出し、3,400から4,000のゲインを各アッセイで個別に調整した。濃度は付属の標準試料を用いて測定し、Prism 8.4.0を用いて補間を行った。
腫瘍組織中の3-IAAとMOIの測定
凍結した腫瘍組織を氷冷したメタノール 1:1-3 と混合し、ホモジナイザー（Precyllys 24 touch）を用いて 0.4 mm ビーズで 5,500 rpm、2 × 30 秒の条件でホモジナイズした。抽出物を4℃で遠心分離（10,000g）し、上清をLC-MS/MS分析に使用した。逆相クロマトグラフィーは、ビフェニル固定相（Raptor Biphenyl（Restek）、寸法：．溶離液A: 水 + 0.1% ギ酸 + 5 mM 酢酸アンモニウム、溶離液B: メタノール + 0.1% ギ酸 + 5 mM 酢酸アンモニウムを用い、ビフェニル固定相 (Raptor Biphenyl (Restek), 寸法: 50 mm × 2.1 mm ID; 粒径: 2.7 µm)を用いて逆相クロマトグラフィーを行った。流速は0.5ml/minとした。溶出は95%の溶離液Aから始まり、0.5分かけて75%まで直線的に減少する。この組成を4分間保持した後、初期条件に戻した。注入量は2 µlで、カラム温度は55 ℃に設定された。3-IAAとMOIはMRM（multiple reaction monitoring）モードで検出した。ポジティブエレクトロスプレーイオン化後、以下のトランジションがモニターされた。3-IAA: m/z 176.2 > 103.0; m/z 176.2 > 130.2; MOI: m/z 148.1 > 120.2; m/z 148.1 > 130.2; m/z 148.1 > 133.1. 定量は標準曲線にしたがって行った。
免疫細胞の単離とフローサイトメトリー
腫瘍を採取し、同様の大きさに切断した。腫瘍を冷PBSで洗浄し、10% FBS (Gibco, 10500064), 2.5 mg ml-1 collagenase D (Roche, 11088866001) および 0.2 mg ml-1 DNase l (Roche, 11284932001) 添加のRPMI (Sigma, 61870044) で35分間37℃で連続振とうしながら消化した。その後、懸濁液を40μmのセルストレーナーで濾し、冷PBSでクエンチした。その後、免疫細胞または腫瘍細胞をFcブロックおよび生死染色（Thermo Fisher Scientific L34957 and L10119）を用いて暗所で30分間染色した。その後、細胞を洗浄し、指示されたフローサイトメトリー用抗体で染色し、再び暗所で30分間インキュベートした。フローサイトメトリーは、Fortessaフローサイトメーター（BD）を用いて行った。免疫細胞のサイトカインプロファイルを評価するために、50 ng ml-1 PMA、500 ng ml-1 ionomycinおよび1 µg ml-1 brefeldin AでT細胞の再刺激を37℃で3時間実施した。表面染色後、eBioscience社のFoxp3細胞内染色キット（00-5523-00）を用いて細胞を固定し、透過処理した。細胞内抗体は以下のものを使用した。IFNγ（1:200希釈）およびTNF（1:400希釈）。リンパ球の分類には、以下の表面抗体を用いた（CD3（1：300希釈）、CD4（1：500希釈）、CD8（1：400希釈）、CD19（1：100希釈）、CD44（1：500希釈）、PD-1（1：400希釈）およびNK1. 1（1：400希釈））または骨髄系細胞（CD11b（1：800希釈）、CD11c（1：300希釈）、CD45（1：800希釈）、Ly6G（1：800希釈）、Ly6C（1：600希釈）、Ly6B（1：200希釈）、CD115（1：300希釈）、F4／80（1：600希釈）及びMHCll（1：600希釈））であった。上皮性がん細胞は、EPCAM（1:200希釈）抗体で染色した。Ly6Bの染色には、ヤギ抗ラットIgG抗体（1:400希釈）を使用した。2,500〜5,000個のビーズ（Spherotec, ACBP 100-10）を用いてフローサイトメトリーにより細胞を計数した。好中球のin vitroでの生存率は、製造業者のプロトコールに従ってPI/Annexin V染色を用いて評価した。ROS発現は、上記のように組織を消化した後、in vivoで免疫細胞におけるROS発現を測定した。その後、ROS色素CellROX（Thermo Fisher Scientific、C10422）を1：1,000の希釈でフローサイトメトリー抗体と並行して染色した。ソフトウェアによる解析とヒストグラムの作成は、FlowJo v.10を使用して行った。
細胞培養
KPC細胞はXimbioからカタログ番号153474で入手した；Hy19636_GLRMレポーター細胞およびmSt-ATG4B/mSt細胞はA. Kimmelman31から、MC38およびLLC-GFP（ATCC）細胞はA. Giannouから、MIA PaCa-2、BxPC-3およびT3M-4細胞（すべてATCC）はC. Güngörから、それぞれ提供された。すべての細胞は、マイコプラズマの汚染について陰性と判定された。細胞は37℃、5% CO2の標準的な条件下で維持され、定期的に目視検査が行われた。細胞は、ペニシリンとストレプトマイシン（Gibco、15140122）および10％FBS（Gibco、10500064）を添加したDMEM GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific、10566016）中で培養された。インビトロ実験では、がん細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり5,000〜10,000個でプレーティングした。好中球共培養、GPXノックダウン細胞の処理、またはMPOとの共処理を伴う実験を除き、細胞は一晩播種させた。その後、表示化合物による処理と処理時間を開始した。3-IAAまたは3-IPA（3-IPA、Sigma、57400；3-IAA、Sigma、I3750）は、PBS中の1M NaOHに溶解し、示された場合には1M HClまたはDMSOを用いて7.4にPH調整された。NACはPBSで希釈し、1mMの濃度で使用した。H2O2 (Sigma, H1009)は400μMの濃度で使用された。
腫瘍細胞の生存率と増殖は、製造業者のプロトコルに従って、MTTまたはMTSアッセイ（Abcam、ab201191およびab197010）を使用して評価した。吸光度は、FLUOstar Omega（BMG Labtech）を用いて評価した。他の実験では、SYTOX（Thermo Fisher Scientific、S34857）、PI（Biolegend、421301）および2500-5000カウントビーズ（Spherotec、ACBP 100-10）を基準として、生存率をフローサイトメトリにより評価した。並行して、細胞内ROSをCellROX（Thermo Fisher Scientific, C10422）を用いて製造者のプロトコルに従って測定し、フローサイトメトリーにより評価した。
好中球またはT細胞は、健康な無処置マウスの骨髄または脾臓から分離し、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いてLY6G+CD11b+およびTCRβ+CD4+/CD8+としてそれぞれソーティングした。細胞は96ウェルプレートに1ウェルあたり20,000～50,000の濃度で播種した。好中球またはT細胞の生存率は、実験の指示された時間にSYTOX（Thermo Fisher Scientific、S34857）またはPI／Annexin V染色（Biolegend、640914）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。いくつかの実験では、200 mU ml-1 MPOまたは400 mU ml-1 MPO（Merck、475911）または指示濃度のMOI（Sigma、493397）が添加された。好中球の脱顆粒は、MPOの放出によって評価した。合計1×106個の好中球を、上記のようにFACSを使用して選別した。好中球をHBSS（Gibco、14065-56）中でインキュベートし、示された処理、または陽性対照としてN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン（fMLP；Merck、F3506）を添加した。30分間のインキュベーションの後、MPO活性アッセイキット（Abcam、ab105136）を用いて、製造者のプロトコルにしたがって、MPO活性を測定した。好中球のNET形成は、指示化合物または陽性対照として100nMのフォルボール-12-ミリスチン酸-13-酢酸（PMA；Merck，524400）と共に3時間インキュベートした後、SYTOX染色を用いて決定された。NETは、フローサイトメトリーを用いてSYTOX陽性細胞として測定した。
前好中球は、以前に記載したようにFACSで選別し（lineage-negative (CD3,NK1.1,CD19,B220)-, CD115-, Ly6B+, Ly6Gint-low）96-well plateで1ウェルあたり2万〜5万個の密度で培養した。指示された処理を施し、フローサイトメトリーでPI染色を使用して生存率を評価した。
MPO活性
腫瘍内または骨髄由来の好中球（LY6G+CD11b+）または前好中球（系統陰性（CD3、NK1.1、CD19、B220）-、CD115-、Ly6B+、Ly6Gint低）はFACSでソーティングされた。合計50,000個の細胞を、製造者のプロトコルに従ってMPO活性アッセイキット（Abcam、ab219925）を用いてMPO活性測定のために処理した。蛍光は、FLUOstar Omega（BMG Labtech）を用いて分析した。MPO活性は、製造元のプロトコルに示唆された標準曲線に基づいて計算された。
タンパク質のスクリーニング
1 群 3 個のマウスから得た腫瘍組織をプールし、scioExtract buffer (Sciomics) を用いてタンパク質を抽出した。サンプルは、タンパク質濃度を調整した scioDye 2 (Sciomics) で 2 時間標識した。参照サンプルは scioDye 1 (Sciomics)で標識した。2時間後、反応を停止し、バッファーをPBSに交換した。ラベル化された全てのタンパク質サンプルは、使用するまで-20℃で保存された。サンプルは scioDiscover 抗体マイクロアレイ (Sciomics) のリファレンスベースデザインを用いたデュアルカラーアプローチで分析された。Hybstation 4800 (Tecan) 上で scioBlock (Sciomics) を用いてアレイをブロックし、その後デュアルカラーアプローチを用いてサンプルをリファレンスサンプルと競合的にインキュベートした。3時間インキュベートした後、スライドを1×PBSTTで十分に洗浄し、0.1×PBSと水ですすぎ、その後、窒素で乾燥させた。スライドスキャンは、パワースキャナー（Tecan）を用いて、装置のレーザーパワーとPMTの設定を一定にした上で実施した。スポットセグメンテーションは、GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices)を用いて実施した。取得した生データは、中央値信号強度をアップロードした後、R-Bioconductorの(LIMMA)パッケージを使用して解析された。正規化には、特殊な不変のLowess法を適用した。3-IAAおよびFIRINOXサンプル中のダウンレギュレートされたタンパク質（M値<-0.35）またはアップレギュレートされたタンパク質（>0.35）は、STINGデータベース（https://string-db.org/cgi/input.pl）へアップロードされた。標準的なパイプラインを使用して、KEGG エンリッチメント解析を実施した。偽発見率（FDR）＜0.05のパスウェイのみが統計的に有意であるとみなされた。
RNA 抽出と mRNA 配列決定
新鮮な凍結腫瘍組織を TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific, 15596018) で溶解し、クロロホルム-イソプロパノール法で RNA を抽出した。ポリ T オリゴ付着磁気ビーズを用いて全 RNA から mRNA を精製した。断片化後、ランダムヘキサマープライマーを用いて第一鎖cDNAを合成し、次いで第二鎖cDNAを合成した。末端修復、A-tailing、アダプターライゲーション、サイズ選択、増幅、精製を経て、ライブラリーが出来上がった。ライブラリーは、QubitとqPCRで定量し、Bioanalyzerでサイズ分布の検出を行った。定量されたライブラリーは、Illuminaプラットフォームで、1サンプルあたり少なくとも6000万リードで配列決定された。
シーケンスリードはfastp (v0.20.1) で処理し、シーケンスリードの3′末端からシーケンスアダプターの配列と低品質（Phred quality score 15未満）配列を除去した。その後、STAR (v.2.7.9a) を用いてマウスリファレンスアセンブリ (GRCm39.104) にアライメントを行った47。発現量の差はDESeq2 (ref. 48)を用いて評価した。遺伝子は、対応する絶対的なlog2-transformed fold change (log2FC) が0.6以上であり、さらにFDRが0.1の値を超えない場合に、有意に差次的に発現しているとみなされた。Reactome パスウェイ Autophagy (R-HSA-9612973) の遺伝子セット濃縮解析 (GSEA) は、fgsea (v.4.1)49 を用いて行った。
qPCR
Trizol Reagent (Invitrogen,15596018) と total RNA extraction kit (Qiagen,74004/74104) を用いて、製造者のプロトコールに従って細胞株から total RNA を抽出した。cDNA合成にはHigh-Capacity cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, 4368813)を使用した。プライマーとプローブはApplied Biosystems社から購入した。マウスのプライマーとプローブは qPCR は、TaqMan Master Mix (Thermo Fisher Scientific, 4369016) を用いて、StepOne Plus system (Applied Biosystems) で行った。すべてのアッセイに40～44サイクルを適用し、テクニカルダブレットまたはトリプリケートを使用した。テクニカルレプリケートの3つの値のうち、少なくとも2つが検出されない場合、発現は非検出とみなされた。相対発現量はGapdh（Mm99999915_g1）に対して正規化した。
レンチウイルスによるshRNAの導入
マウスGpx3（TRCN000076539）、マウスGpx7（TRCN000076563）およびマウスAhr（TRCN0000218025）ならびに非標的対照shRNA（SHC002、スクランブル）に対して向けられたヒトU6プロモーター（MISSION pLKO.1 puro）の制御下で短毛RNA（shRNA）を発現するレンチウイルスベクターは、Sigma-Aldrichから入手した。レンチウイルス粒子の製造は、他の場所で詳細に説明されており50、プロトコルはオンラインで入手可能である(http://www.LentiGO-Vectors.de)。HIV-1由来のレンチウイルスベクターをKPC細胞に導入するために、24ウェルプレートの1ウェルあたり8μg ml-1ポリブレンを含む0.5 ml培地に2.5×104個の細胞をプレーティングさせた。プレーティング後、10 μl の VSV-G 擬似型非濃縮レンチウイルス粒子を加えることで、shRNA とピューロマイシン耐性遺伝子を細胞ゲノムに安定的に組み込むことができた。スピン接種による導入率を上げるため、プレートを1,000g、25℃で1時間遠心分離した。導入に成功した細胞は、導入4日後に培養液中の1μg ml-1ピューロマイシンで選択を開始した。
免疫組織化学と定量化
組織は、PBS中の4％ホルマリンで固定し、ASP300S脱水機（Leica）とEG1160組織包埋システム（Leica）を用いてパラフィンに包埋した。パラフィン切片（2 µm）を切り出し、H&Eで染色するか、以下のように免疫組織化学のために処理した：脱脂と内因性ペルオキシダーゼの不活性化（PBS中3%過酸化水素）の後、抗体特異的熱媒介抗原検索をVentana Benchmark XT machine（Ventana）を用いて実施した。切片をブロックし（PBS中10％FCS）、次に抗LC3B抗体（1：400希釈、Thermo Fisher Scientific、PA1-46286）；抗ニトロチロシン抗体（1: 100倍希釈、Thermo Fisher Scientific、A-21285）；抗CC3抗体（1:100希釈、Cell Signaling、9661）；p62/SQSTM1（1:500希釈、Thermo Fisher Scientific, PA5-20839）；および抗Ki67抗体（1：100希釈、Abcam、15580） と共にインキュベートしました。特異的結合の検出には、二次抗体、DAB染色、ヘマトキシリン対比染色試薬を含むUltra View Universal DAB Detection Kit (Ventana, Roche)を使用した。スライドは NanoZoomer 2.0-HT (Hamamatsu Photonics) を用いてスキャンし、Fiji を用いて代表画像を撮影した。
LC3B、Ki67、ニトロチロシン、CC3の定量は、盲検下で行った。陽性細胞は ImageJ v.2.1.0/1.53c を用いて決定し、閾値はそれぞれの抗体の染色強度に応じて調整し、同じ染色で分析したすべての腫瘍について維持した。陽性細胞の数は、1サンプルにつき3～5フィールドで、250～500×500μmフィールド（10×～40×倍率）ごとにカウントした。
広視野顕微鏡観察
Hy19636_GLRM PDAC細胞のGFP-LC3-RFPレポーターシグナル発現を可視化するために、組織は2% PFA溶液で4℃で一晩固定し、30%ショ糖を含むPBSでインキュベートし、ドライアイス上でTissue-Tek OCTコンパウンド（Sakura Finetek）に包埋した。さらなる解析のために，7μm切片を使用した．広視野画像は，40× 1.10 NA水浸対物レンズを装備したTHUNDER Imager 3D Live Cell and 3D Cell Culture (Leica Microsystems) を用いて行った．LEDパワーと露光時間、およびその他のシステム固有の設定は、まずポジティブコントロールの組織を用いて最適化し、最適な比較可能性を提供するために異なるグループの画像取得間で変更しないようにした。各組織切片について、平均5つの関心領域が無作為に選択され、その後の定量分析のために画像化された。ファイルナビゲーション、カラーバランスの調整、および画像解析には、ImageJイメージングソフトウェアを使用した。GFPおよびRFPの定量は、ImageJ v.2.1.0/1.53cを使用して決定された。各シグナルの平均蛍光強度は、腫瘍ごとに少なくとも5つの領域でスライドごとに決定された。
グラフの概要
図1a、拡張データ図2a,d、図1-4の小さなアイコンはBioRender.comで作成したものである。
統計解析
特に断りのない限り、すべての統計解析はGraphPad Prism 9.3.1を使って行った。正規性と対数正規性は Shapiro-Wilk 検定または Kolmogorov-Smirnov 検定を用いて検定した。正規性が与えられない場合は、ノンパラメトリック検定を実施した。特に指定がない場合は両側で検定を行い、その結果得られた有意な（P < 0.05）P 値を示した。
報告書の要約
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。
データの利用可能性
RNA-seqデータはEuropean Nucleotide Archive (ENA)に提出されました。アクセッション番号PRJEB58222で公開されています。ショットガンメタゲノムシーケンスデータは、ヒトリードをフィルタリングし、アクセッション番号PRJEB58222で公開されている。ソースデータは本論文に添付されています。
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参考文献のダウンロード
謝辞
University Medical Center Hamburg-EppendorfのMouse Pathology Core Facility、Bioinformatic Core Facility、Cytometry und Cell Sorting Core UnitおよびGnotobiotic Mice Facilityのメンバーの技術協力、患者とその家族、すべての研究施設の研究者と研究スタッフに感謝します。Saygi：RNA-seqデータの発現差異解析、C. Bang：技術協力、C. Esser：Ahr-/-ノックアウト骨髄、S. Baldus, M. Mollenhauer, K. Tinaz, C. Vosen：Mpo-/-ノックアウト骨髄、 M. Hamley：編集、 H. Pinnschmidt：統計アドバイス（医学生物学・疫学研究所 この研究は、Brigitte und Dr. Konstanze Wegener-StiftungからJ.T.への助成金、German Cancer Aid fellowship grantsからJ.T.への助成金によって支えられている。M. SchönleinとL.K.にはドイツ癌助成金、J.T.とN.G.には70114815、N.G.にはERC StG 715271、S.H.にはERC COG 865466、そしてドイツ研究財団 (DFG) プロジェクト467261817とSFB841 (via B.)による資金助成によって、K.R.に助成された。V.G.P. は Bundesministerium für Bildung und Forschung (eMed Consortia "Fibromap") および Novo Nordisk Foundation (Young Investigator Award; NNF21OC0066381) から支援を受けています。） さらに、T.R.L.、L.A.、T.S.はVolkswagenStiftungのイニシアチブ「Niedersächsisches Vorab」（76251-99）およびドイツのエクセレンス戦略（EXC 2155、プロジェクト番号390874280）に基づくドイツ研究財団から資金提供を受けています。F.C.は、AIRCが発行するiCARE-2フェローシップと、欧州連合のHorizon 2020研究・革新プログラム（マリー・スクウォドフスカ・キュリー助成契約番号800924）の支援を受けています。J.T.S.の研究は、ドイツ癌コンソーシアム（DKTK）、ドイツ研究振興財団（DFG）の405344257（SI 1549/3-2）およびSI1549/4-1、ドイツ連邦教育研究省（BMBF；01KD2206A/SATURN3）により支援を受けています。M.T.-A.とJ.T.S.は、ドイツ癌コンソーシアム（DKTK）のメンバーである。図1a、拡張データ図2a,d、および図中の小さなアイコンはBioRender.comで作成されました。
資金提供
ハンブルグ・エッペンドルフ大学（UKE）よりオープンアクセス資金を提供された。
著者情報
著者ノート
本研究は、以下の著者により共同監修された。Samuel Huber, Nicola Gagliani
著者名と所属
を使用した。ハンブルグ・エッペンドルフ大学医療センター医学部（ドイツ，ハンブルグ
Joseph Tintelnot、Martin Schönlein、Alexander Stein、Carsten Bokemeyer & Marianne Sinn
Mildred Scheel Cancer Career Center HaTriCS4、ハンブルグ・エッペンドルフ大学医療センター（ドイツ・ハンブルグ）、Marianne Sinn
Joseph Tintelnot、Martin SchönleinおよびLeonie Konczalla
ハンブルグ・エッペンドルフ大学医療センター一般・内臓・胸部外科（ドイツ・ハンブルグ
Yang Xu, Leonie Konczalla, Anastasios D. Giannou, Filippo Cortesi, Tobias S. Bröring, Faik G. Uzunoglu, Cenap Güngör, Jakob R. Izbicki 及び Nicola Gagliani
微生物免疫制御研究グループ、ヘルムホルツ感染症研究センター、ブラウンシュヴァイク、ドイツ
ティル R. レスカー、アガタ A. ビエレッカ、レナ・アメンド＆ティル ストローウィグ
I. ハンブルグ・エッペンドルフ大学医療センター医学部（ドイツ・ハンブルグ
Anastasios D. Giannou、Penelope Pelczar、Samuel Huber & Nicola Gagliani
ハンブルグ・トランスレーショナル・イミュノロジー・センター（HCTI）、ドイツ・ハンブルグ
Anastasios D. Giannou、Penelope Pelczar、Samuel Huber、Nicola Gagliani。
III. ハンブルグ・エッペンドルフ大学医療センター・医学部（ドイツ・ハンブルグ
ドミニク・カイリース＆ビクター・G・プエルス
オーフス大学臨床医学部（デンマーク・オーフス
ビクター・G・ピュエルス
ハンブルグ・エッペンドルフ大学医療センター臨床化学・検査医学研究所（ドイツ・ハンブルグ
マヌエラ・ペシュカ、トーマス・レネ
ハンブルグ・エッペンドルフ大学医療センター小児科 新生児スクリーニング・代謝研究所（ドイツ・ハンブルグ
マヌエラ・ペシュカ
ハンブルグ・エッペンドルフ大学医療センター幹細胞移植科細胞・遺伝子治療研究部（ドイツ・ハンブルグ
クリストファー・リーケン＆マクシミリアン・ユング
実験腫瘍治療ブリッジ研究所、西ドイツがんセンター、エッセン大学病院、デュースブルグ・エッセン大学（ドイツ・エッセン市
Marija Trajkovic-Arsic & Jens T. Siveke
固形癌トランスレーショナルオンコロジー部門、ドイツ癌コンソーシアム（DKTKパートナーサイトエッセン）、ドイツ癌研究センター（DKFZ）、ドイツ、ハイデルベルグ
Marija Trajkovic-ArsicおよびJens T. Siveke
アイルランド王立外科医学校薬学・生体分子科学部、血管生物学アイルランドセンター（アイルランド、ダブリン
トーマス・レネ
ヨハネス・グーテンベルグ大学医療センター血栓止血センター（CTH）（ドイツ・マインツ
Thomas Renné
ルートヴィヒ・マクシミリアン大学（LMU）病院 内科III科 （ドイツ・ミュンヘン
Danmei Zhang & Stefan Boeck
ハノーバー医科大学（MHH）（ドイツ・ハノーバー
Till Strowig
ハンブルク大学がんセンター 血液・腫瘍診療部（HOPE）（ドイツ・ハンブルク
Alexander Stein
ニューヨーク大学グロスマン医学部放射線腫瘍学教室（米国ニューヨーク州ニューヨーク市
アレック・C・キンメルマン
貢献
J.T.は、すべての実験の実施または監督、データ解析の大部分、原稿執筆、プロジェクトの設計を行った。Y.X.は、実験に協力し、盲検下で腫瘍の評価を行った。T.R.L.はバイオインフォマティクスによる微生物相の解析を行った。M. Schönleinは、患者の募集と原稿の編集に協力した。L.K.、A.D.G.、P.P.は実験用マウスモデルおよびgnotobioticマウス実験の設定に協力した。D.K.とV.G.P.は広視野顕微鏡の画像を取得した。A.A.B.は、ショットガンメタゲノミクスのためのDNA抽出と加工を行った。M.P.とT.R.はメタボロームデータの設定と取得を行った。F.C.はフローサイトメトリー解析に協力した。K.R.とM.J.はレンチウイルスによるshRNAノックダウンを実施した。L.A.はR患者の便から細菌株を抽出し、培養した。T.S.B.は実験に協力した。M.T.-A.とJ.T.S.は知的なフィードバックとサポートを提供した。D.Z.、S.B.、F.G.U.、A.S.は患者のリクルートメントに協力した。T.S.は、ショットガンメタゲノムパイプラインと知的なフィードバックを提供しました。C.G.はがん細胞株の提供および助言を行った。J.R.I.とC.B.は、知的フィードバックとサポート、原稿の編集を行った。M. Sinnは、臨床指導とフィードバック、原稿の編集を行い、患者のリクルートを支援した。A.C.K.はオートファジーのレポーター細胞および知的なフィードバックを提供し、原稿を編集した。S.H.は研究の監督と原稿の編集を行った。N.G.はプロジェクトの設計と監督を行い、原稿を執筆した。
協力者
Joseph TintelnotまたはNicola Gaglianiに連絡すること。
倫理的宣言
利益相反
D.Z.は、アストラゼネカおよびAMGENから出張支援を受け、アストラゼネカおよびロシュから謝礼を受け取った。S.B.は、アストラゼネカ、BMS、セルジーン、インサイト、ヤンセン・シラグ、MSD、セルヴィエから学会発表や有償コンサルティングの謝礼、およびセルジーンから研究支援を受けたことを報告した。J.T.S.は、アストラゼネカ、バイエル、ベーリンガーインゲルハイム、ブリストル・マイヤーズスクイブ、イミュノコア、MSDシャープドーム、ノバルティス、ロシュ/ジェネンテック、セルヴィエからコンサルタントとして、あるいは継続的医学教育のプレゼンテーションに対して名誉を受け取っています。また、アバロス・セラピューティクス、ベーリンガーインゲルハイム、ブリストル・マイヤーズスクイブ、セルジーン、アイスバッハバイオ、ロシュ／ジェネンテックから研究資金を受けており、ファーマ15の所有権を持ち取締役を務めている。C.B.はSanofi Aventis, Merck KgA, Bristol-Myers Squibb, Merck Sharp & Dohme, Lilly Imclone, Bayer Healthcare, GSO Contract Research, AOK Rheinland-Hamburg および Novartisから個人的に報酬を得ていることを報告している。M. Sinnは、AstraZeneca、Amgen、BMS、MSD、Incyte、Pierre Fabre、Pfizer ServierおよびSanofiから謝礼を受け取り、Amgen、AstraZeneca、Bayer、BMS、Incyte、MSD、Pierre Fabre、RocheおよびServierから臨床研究の支援（組織的）を受けています。N.G.はRocheからの財政的支援を報告している。これらはすべて提出された研究以外のものである。A.C.K.は、Vescor Therapeutics、OncoRevに金銭的利害関係があり、膵臓癌におけるKRAS制御代謝経路および酸化還元制御経路、治療アプローチとしてのGOT1標的、アラニン輸送標的および鉄代謝のオートファジー制御に関する特許で発明者となっています。A.C.K.は、Rafael/Cornerstone Pharmaceuticalsの科学諮問委員会のメンバーであり、DecipheraおよびAbbvieのコンサルタントを務めている。残りの著者は、競合する利害関係を宣言していない。
査読
査読情報
Filipe Cabreiro氏、Marco Cassatella氏、およびその他の匿名の査読者の方々に感謝します。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。
Extended Data 図と表
Extended Data 図1 ハンブルク・コホートのmPDACを有するRおよびNR患者の生存率および微生物叢の分析。
a, 30人の患者が研究に採用された。b,c, 指定された非適格患者を除外した後、23人の患者がPFS（b）および全生存（OS）（c）の分析が可能であった。d, 微生物のLEfSe解析は、RまたはNR患者に濃縮された細菌分類群の線形判別分析（LDA）スコアをそれぞれ示したものである。箱は25～75％の値（f）、エラーバーは中央値を示し、有意なp値はGehan-Breslow-Wilcoxon検定（b、c）または両側Wilcoxon検定（f）によって決定されたことを示す。
ソースデータ
Extended Data 図2 Rの微生物相はFIRINOX処理に対する応答を誘導する。
a, mPDACを有する5人のRおよびNR患者の微生物叢を収集し、gnotobioticマウスに移植した。9人の患者をFIRINOXで、1人をGnPで治療した。微生物叢移植実験に使用した患者のPFS（b）とOS（c）をカプラン・マイヤー推定値で示す。ドナーを変えた4つの個別実験で、1群のマウスにR微生物叢を、1群にNR微生物叢をコロニー形成させた。便の移送後、ノトバイオティクスマウス（d）はKPC腫瘍細胞の同所注射を受け、未処理のまま（n＝22（NR）または20（R））または実験の11日目にFIRINOXで1回処理（n＝23（NR）または20（R））のいずれかを受けた。f、eの様々な実験から無作為に選択した腫瘍を、16S rRNA配列決定を用いて腫瘍内細菌について分析した（n＝12）。表は、異なる腫瘍（T1〜12）、H2Oまたは陽性対照について示されたクリーンリードを示す。 g、3-IAAは、それぞれ異なるドナーを有する実験ごとにn＝3〜5の無作為抽出マウスの血清中で分析した。 h、メタゲノム配列決定データは、3-IAA生産菌のパネルの存在量について分析された。化学療法中および化学療法前のNRまたはR患者の便サンプルにおいて、B. fragilisおよびB. thetaiotaomicronの存在量の増加が検出され、gnotobioticマウスの実験に使用した（1グループあたり5人のドナー、患者あたり1〜3サンプル、グループあたりn = 12）。 i, 3-IAAはゲノム予測に基づいて3-IAA生成能力を欠く細菌（プレボテラ・コープリ）と能力を持つ（B. thetaioticron および B. fragilis）の上清中で定量化された。P. copri (DSM18205), B. fragilis (BF DSM2151, Bf0901, Bf0902), B. thetaiotaomicron (DSM, Bt0901, Bt0902)が含まれる。株はすべて1％トリプトファンを含むBHIで培養し、BFi2株はBHIのみでも培養した（n＝3生物学的複製）。 j、SPFマウスにKPC細胞を同位体注射した。腫瘍細胞注入の7日後から合計14日間、マウスにトリプトファンなしの標準食（2.3 g/kg TRP）またはトリプトファン高含有食（12 g/kg TRP）を与えた（n = 3）。 k, 標準食を再導入する前に合計4日間食事介入した以外はjと同様。l, NR微生物群培養マウス（赤色）に、標準食（SD）またはトリプトファン高含有食（TRP高含有）を4日間与えた。介入4日目に採血し、3-IAA CLIAを用いて血清中の3-IAAを測定した（n＝4）。 m、FIRINOXによる治療後9日目のlからのマウスの腫瘍サイズを示す（n＝3または4）。各記号は、1匹のマウス、ヒトまたはin vitroの複製を表す。つの実験を行い（f，i-m）、または4つの独立した実験をプールした（e，g）。エラーバーはSEM、ひげは10%と90% (h)、有意なp値はGehan-Breslow-Wilcoxon検定 (b,c), 一元配置分散分析に続く Tukey の (e,m) または Dunnett の (i-k) ポストホックテスト、二元配置分散分析 (g), 両側 Wilcoxon paired-ranks test (h) または 両側t検定 (l) によって決定された。
ソースデータ
Extended Data Fig. 3 PDACのマウスモデルにおいて、3-IAAはFIRINOXに対する反応を誘発する。
a、500mg/kgの3-IAAを経口投与したSPFマウスの3-IAA血清濃度を、3-IAA適用後2、6および24時間にCLIAを用いて測定した（n = 3マウス）。R-マイクロビオタが定着したノトバイオティックマウスの無関係な血清濃度を対照として示す。 b、SPFマウスにKPC細胞を同所的に注入し、FIRINOXまたはFIRINOX＋3-IAAの2つの処置を受けた（n = 5）。実験20日目の腫瘍重量が統計的に描かれている。 c、NRコロニー化したノトビオティックマウスに、KPC腫瘍細胞を定位注射した。9日後、マウスを5日間＋／-3-IAAに置換し（d9-13）、実験スキームに描かれているように＋／-FIRINOXを処理した（n＝3または4）。腫瘍重量は、実験の20日目に示す。 d、SPFマウスに、KPC腫瘍細胞を直下注射した。腫瘍細胞注入後9日目に、マウスを、500mg／kgの3-IAA、3-IPAまたは250mg／kgのGCAおよび250mg／kgのDCAで5日間連続して処理した（n＝4）。FIRINOX処理は11日目に適用された。e、マウスをFIRINOX、FIRINOX＋3-IAA（500mg／kg）またはFIRINOX＋ヒプリル酸（500mg／kg）で処理した以外はdの場合と同様（n＝4または5）。各記号は1匹のマウスを表す。つの実験（e）または2つの独立した実験のうちの1つを示す（a-d）。エラーバーはSEMを示し、有意なp値は示され、Kruskal-Wallis検定とDunnのポストホック検定（a、c、e）、または一元配置分散分析と Tukeyのポストホック検定（b）またはDunnettのポストホック検定（d）によって決定された。
ソースデータ
Extended Data Fig. 4 ノトバイオティクスマウスのKPC腫瘍の腫瘍浸潤免疫細胞。
a, 免疫サブセット（左パネル）または細胞内サイトカインと共抑制受容体（右パネル）を分類するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。免疫サブセットは、生きたCD45+免疫細胞上の以下のマーカーの組み合わせを使用して決定された。CD8+T細胞（CD11b-CD3+CD8+）；CD4+T細胞（CD11b-CD3+CD4+）；好中球（CD11b+Ly6G+）；及びマクロファージ（CD11b+Ly6G-F4/80+）。b、R又はNRマイクロバイオータでコンロネーションしたgnotobioticマウスから得た同位腫瘍由来の免疫細胞の免疫サブセット又はサイトカインプロファイル及びPD-1の発現を実験の第20日に分析した。各記号は1匹のマウスを表す。3〜5回の独立した実験をプールした（合計でn = 11〜23）。エラーバーはSEMを示し、有意なp値は示され、両側t検定により決定された。
ソースデータ
Extended Data 図5 CD4+およびCD8+ T細胞は、3-IAAおよびFIRINOXの効力に必要でない。
R-マイクロビオタが定着したノトバイオティックマウスに、KPC腫瘍細胞を定位注射した。FIRINOXによる治療の前に、マウスに3日ごとにアイソタイプコントロール抗体またはCD8枯渇抗体のいずれかを指示通りに注射した。フローサイトメトリーにより決定した、腫瘍重量（a）および全免疫細胞（CD45+）に対する腫瘍内CD8+ T細胞の枯渇効力（b）を、実験の20日目に示す（n = 3）。 c, CD4+およびCD8+ T細胞が同時に枯渇したことを除いて、aにおけるのと同様（n = 3または4）。d、同所性KPC腫瘍を有するR-マイクロビオタコロニー化ノトビオティックマウスを、FIRINOX、FIRINOX＋トリプトファン高含有飼料（d8-12）＋アイソタイプコントロール抗体、またはFIRINOX＋トリプトファン高含有飼料（d8-12）＋CD4／CD8除去抗体で処理した（n＝4または5）。e, SPFマウスを3-IAA +/- FIRINOXとCD4/CD8枯渇抗体またはアイソタイプコントロール抗体で処理した以外は、cと同様（n = 4）。腫瘍の重量は、実験の20日目に描かれている。各記号は1匹のマウスを表す。各1回の実験を行った。エラーバーはSEMを示し、有意なp値は示され、両側t検定（a、b）、一元配置分散分析とDunnettのポストホック検定（c、d）またはクラスカル-ウォリス検定とDunnのポストホック検定（e）によって決定された。
ソースデータ
Extended Data Fig. 6 3-IAAと化学療法は好中球の細胞死を誘発する。
a、FACSでソートしたT細胞または好中球を、24時間+/- 1,000 μM 3-IAAおよび+/- FIRINOX（3.2 μM Oxaliplatin, 5.6 μM Irinotecan and 19.2 μM 5-FU）培養した。生存率はフローサイトメトリーで評価した（n = 3、生物学的複製）。 b、MPO活性は、蛍光MPO活性アッセイキットを使用して、50,000個のFACSソートした骨髄由来の好中球、骨髄からの好中球前駆体（系統陰性、CD115-、Ly6B+、Ly6Gint-low）またはPDAC浸透好中球で決定した（n = 4、生物学的複製）。c、FACSで選別した骨髄由来の好中球を、投与量を増やした3-IAA +/- MPO +/- FIRINOX（3.2μMオキサリプラチン、5.6μMイリノテカン、19.2μM 5-FU；n=3、生物学的複製）の存在下で培養した。d, FACSで選別した好中球前駆体は、3-IAA +/- FIRINOX (3.2 μM Oxaliplatin, 5.6 μM Irinotecan and 19.2 μM 5-FU; n = 3, biological replicates) の存在下で培養されました。e、好中球のみを、+/-オキサリプラチン（8μMオキサリプラチン）および1,000μM 3-IPA、1,000μM 3-IPAまたはDMSO存在下で同濃度で培養した以外はaと同様（n = 3〜6、生物学的複製）。 f、好中球の細胞死をアネキシンVおよびPI染色を用いてフローサイトメトリにより定義した以外はcと同様である。頻度は、総好中球に対する相対値で示した（n＝3、生物学的複製）。 g、NET形成を処理3時間後のSYTOX DNA染色によって定義した以外は、cと同様（n＝3、生物学的複製）。 h、1×106 FACS選別骨髄由来好中球の脱顆粒を、FIRINOX（3． 2μMオキサリプラチン、5.6μMイリノテカンおよび19.2μM 5-FU）、1mM 3-IAA＋FIRINOXまたはFIRINOX＋1μM fMLPで30分間刺激した後、MPO活性アッセイキットを用いて脱顆粒を測定した（n＝3、生物学的複製）。 i、KPC腫瘍細胞をSPFマウスに定位注入して、5日間連続して500 mg/kg 3-IAAおよび11日目のFIRINOXでマウスに+/-処理を行った（各n＝5）。脾臓および腫瘍の免疫細胞を、FIRINOX処理後3日目にフローサイトメトリーで分析した。脾臓または腫瘍の好中球数を示す。 j, 3-IAAのみを適用し、FIRINOXを適用しなかった以外は、iと同様（n = 5ずつ）。各記号は、1匹のマウスまたは1つのin vitro複製を表す。1回の実験（b）、または3回（c、d）もしくは2回（a、e-j）の独立した実験のうちの1回を示す。エラーバーはSEMを示し、有意なp値を示し、一元配置分散分析に続いてDunnettのポストホックテスト（a-h）または両側t-テスト（i,j）によって決定された。
ソースデータ
Extended Data Fig. 7 3-IAAとMPOは活性酸素を増加させ、細胞生存率を低下させる。
a、FIRINOX +/- 3-IAAで処理したSPFマウスから分離した腫瘍の処理5時間後にLC-MS/MS（左）またはMOI（右）を使用して測定した3-IAA濃度（n = 3生物学的複製）。b、3-IAA（左）またはMOI（右）の濃度は、FIRINOX＋3-IAAで処置したWTまたはMpo-/-骨髄再接種マウスから単離した腫瘍において、処置5時間後にLC-MS/MSを用いて測定した（n＝3または4の生物学的複製）。 c、SPFマウスはKPC対照またはAhr KD細胞を同所的に受け取り、FIRINOX（d11）またはFIRINOX＋3-IAA（d9〜13）で処置された（n＝4または5）。腫瘍重量は、実験の20日目に評価した。 d、KPC腫瘍細胞は、3-IAA＋／-オキサリプラチン（8μMオキサリプラチン；n＝2〜3生物学的複製）の増大する投与量の存在下で培養した。ROSの発現は、CellROX色素を用いたフローサイトメトリーにより決定された。Hy19636細胞は、3-IAA +/- 5×104個の好中球（e）またはMPO 200mU/ml（f）および+/- FIRINOX（1.6 μM Oxaliplatin, 2.8 μM Irinotecan and 9.6 μM 5-FU; n = 2-3 biological replicates）を増量しながら培養させた。ROS発現はフローサイトメトリーで評価した。関連するグループのp値のみを、明確にするために示している。MIA PaCa-2（g）、T3M-4（h）またはHy19636（i）細胞を、3-IAA +/- FIRINOX（3.2 μM Oxaliplatin, 5.6 μM Irinotecan and 19.2 μM 5-FU）の投与量の増加とともに6時間培養した（n = 3 biological replicates）。KPC（j）またはMIA PaCa-2（k）細胞は、3-IAA +/- MPO 400 mU/ml +/- FIRINOX（3.2 μM Oxaliplatin, 5.6 μM Irinotecan and 19.2 μM 5-FU；n=3生物学的複製）の増加する投与量の存在下で培養された。細胞数は48時間培養後、フローサイトメトリーで定量した。Hy19636（l）またはMIA PaCa-2（m）細胞を、MOI（100、200または400μM）+/- FIRINOX（1.6μM オキサリプラチン、2.8μM イリノテカンおよび9.6μM 5-FU; n = 5から12の生物的複製）の投与量の増加と共に培養した。n、KPC腫瘍細胞をSPFマウスに定位注入し、マウスは未処理のままか、FIRINOX（d11）、3-IAA（d9-13）または3-IAAおよびFIRINOX（各n＝5）で処理した。統計と代表写真は、ニトロチロシン（ROS）の染色を伴う指示された処置の3日後の同所腫瘍を示す。 o、SPFマウスに同所腫瘍を注射し、FIRINOXまたはFIRINOX＋3-IAAで処置した（n＝5ずつ）。処置の5時間後、ROSの蓄積をフローサイトメトリーで分析した。癌細胞（Epcam+）、T細胞（CD45+CD3+）または骨髄系細胞（CD45+CD11b+）の活性酸素レベルを示す。 p, 照射およびWT（n = 5）またはMpo-/-（n = 3）骨髄再生マウスにKPC細胞を同所的に受け、oと同様にFIRINOXまたはFIRINOX + 3-IAAを投与した。ROSレベルはoと同様にフローサイトメトリーで評価した。1回（a,b,n）または3回中1回（d,g-i）または2回（c,e,f,j-m,o,p）の独立実験を示している。エラーバーはSEMまたは中央値（n）を示し、有意なp値は両側t検定（a-c、o、p）、一元配置分散分析に続くDunnettの（d、g-n）またはTukeyの（e、f）ポストホック検定によって決定されたことを示している。
ソースデータ
Extended Data 図8 3-IAAおよびFIRINOX処理は、in vivoでオートファジーを減少させる。
a、FIRINOXで治療したマウスから得た腫瘍のmRNAシーケンスデータで見つかった活性酸素産生酵素または分解酵素の正規化発現をFIRINOX＋3-IAAで治療した腫瘍と比較（n＝3生物学的複製それぞれ；p値。b、KPC腫瘍細胞をFIRINOX（3.2μMオキサリプラチン、5.6μMイリノテカン、19.2μM 5-FU）+/- 10μMの3-IAAおよび400mU/ml MPOの存在下で培養した（n = 4生物学的複製）。GPX 3 および 7 の RNA 発現は、24 時間の処理後、qPCR を用いて測定した。発現は、ハウスキーピング遺伝子に対する相対値として描かれている。 c、スクランブル対照トランスフェクト細胞、Gpx3またはGpx7ノックダウン細胞を、+/- FIRINOX（3.2 μM オキサリプラチン、5.6 μM イリノテカン、19.2 μM 5-FU）+/- 10 μM の 3-IAAとMPOとROSで処理した（n = 3または4個の生物的複製）フローサイトメトリで評価された。d、細胞数をフローサイトメトリーを用いて計算した以外は、cと同様である（n＝4生物学的複製）。 e、SPFマウスに、スクランブル対照またはGPX3 KD細胞を用いて同所腫瘍を注入し、実験の11日目に+/- FIRINOXで処理した（n＝5または6）。f、FIRINOXで処置したマウスから得られた全腫瘍におけるリアクトーム経路オートファジーの正の濃縮を、FIRINOXおよび3-IAAで処置した腫瘍と比較して描いたGSEA濃縮プロット（n＝3生物学的複製）。 g、KPC腫瘍細胞をSPFマウスに定位注入し、3-IAAおよびFIRINOXまたはFIRINOX単独（n＝3ずつ）でマウスを処置した。FIRINOX処理から1日後、腫瘍内タンパク質を分析し比較した。3-IAAとFIRINOXで処理したマウスの腫瘍で減少したタンパク質を、濃縮KEGGパスウェイについて分析した。上位10経路が描かれ、タンパク質およびアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた経路の全リストは、SI表1〜3に提供されている。マウスは、+/- FIRINOX（d11）、+/- 3-IAA（d9-13）で処理し、p62/SQSTM1染色は処理後3日目に分析した。統計は、フィールドあたりのp62/SQSTM1high細胞の数を示す（n = 5ずつ）。代表的な写真を示す。スケールバーは100μmを表す。 i,j, KPC腫瘍細胞を、RまたはNR微生物叢でコロニー形成したグノビオティックマウスに直下注射した（n＝3または4）。マウスをFIRINOXで処理し、実験の20日目にLC3-l/ll（i）またはp62/SQSTM1（j）染色を分析した。統計は、1フィールドあたりのLC3-l/llhighまたはp62/SQSTM1high細胞の数を示す（n = 4）。腫瘍は、それぞれ異なるドナーを用いた3つの個別実験からプールされたものである。代表的な写真を示す。k、KPC腫瘍細胞をSPFマウスに直下注射し、切断型カスパーゼ3（CC3、アポトーシス）の染色を適用した以外は、hと同様に処理し、分析した。l, SPFマウスにGFP-LC3B-RFPレポーター細胞を定位注入し、FIRINOX＋3-IAA、トレハロースまたはFIRINOX＋3-IAA＋トレハロースで処理した（n = 5ずつ）。腫瘍は明視野イメージングによりGFP/RFP比について分析された。GFP/RFP比は、それぞれの群について示されている。 m、SPFマウスに、（mST-ATG4B）またはmSt対照細胞を注射した。マウスは、7日間（d5〜d12）、食事を介したドキシサイクリン処理、または標準食を受け、+/- FIRINOX処理された（n = 4または5ずつ）。実験18日目の腫瘍の大きさが描かれている。代表的な写真は実験終了時の腫瘍を示す。スケールバーは1cmを示す。ドキシサイクリン処理の長さが異なる1回（a，f-k）または2回の独立した実験のうちの1回（b-e，l）または3回の独立した実験（m）が示されている。各記号は、1匹のマウスまたは1つのin vitro複製を表す。棒はSEM（a-e,m）または中央値（h-l）を示し、有意なp値を示し、方法セクション（a,f,g）に示すように、両側Mann-Whitney検定（b）一元配置分散分析、Tukeyの（c-e,i,j,m）またはDunnettの（l）ポストホック検定、またはKruskal-Wallis検定とDunnの（h,k）ポストホック検定で決定された。
ソースデータ
Extended Data Fig. 9 3-IAAと化学療法の組み合わせは、大腸癌と肺癌の細胞株に対して有効である。
a,b, MC38大腸がん細胞株（n = 5または6；a）またはLLC肺がん細胞株（n = 4または5；b）を皮下注射し、マウスにFIRINOXおよび+/- 3-IAA（500mg/kg）を経口投与した。腫瘍を1日おきに測定し、腫瘍重量を実験の17日目に換算した。 c、同所性KPC腫瘍を樹立し、SPFマウスをGNPで1回＋／-3-IAA（500mg／kg；n＝4ずつ）治療した。d、統計は、化学療法に反応したハンブルグコホートの患者または反応しなかった患者（n＝11Rおよび12NR）における化学療法の最初の6サイクルの間の好中球減少（＜1，5＊109／l）の事象を示す。 e、DCA濃度は、ハンブルグコホートの患者の血清中の2〜3サイクルの化学療法後に測定し、PFS（n＝20）または全体生存（n＝18）と相関した。f、一変量Cox比例ハザードモデルを用いて、ハンブルグコホートにおけるPFSに対する指示変数の影響を決定した。1つの実験（b）または2つの個別実験のうちの1つ（a）が示されている。エラーバーはSEMを示し、有意なp値を示し、一元配置分散分析に続いてダネットのポストホックテスト（a、左統計）、クラスカル-ウォリス検定に続いてダンのポストホックテスト（b、左統計）によって決定された。混合効果分析に続くDunnettのポストホックテスト（aおよびb、右の統計量）、両側t検定（c）、両側カイ二乗検定（d）、単純線形回帰およびPearsonのr（e）またはCox回帰（f）により決定した。
出典データ
Extended Data Table 1 ハンブルク（観察）コホートとミュンヘン（検証）コホートの患者データ
フルサイズの表
補足情報
報告書の概要
補足表1
3-IAAおよびFIRINOX投与マウスから分離した腫瘍とFIRINOXのみ投与したマウス（対照）から分離した腫瘍を比較したタンパク質スクリーン。タンパク質スクリーニングは、「方法」に記載されているように実施され、分析された。
補足表2
3-IAAおよびFIRINOX投与マウスから単離された腫瘍でダウンレギュレートされたタンパク質のKEGGパスウェイ。FIRINOXのみで処理した腫瘍（表1）と比較して＜-0.35の差を持つタンパク質を選択し、方法に記載されているように分析した。
補足表3
3-IAAおよびFIRINOX投与マウスから分離した腫瘍で発現が増加したタンパク質のKEGGパスウェイ。FIRINOX単独処理腫瘍（表1）と比較して、＞＋0.35の差を有するタンパク質を選択し、方法において記載されるように分析した。
ソースデータ
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.1
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.9
権利と許可
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この記事の引用
Tintelnot, J., Xu, Y., Lesker, T.R. et al. Microbiota-derived 3-IAA influences chemotherapy efficacy in pancreatic cancer.（微生物叢由来の3-IAAが膵臓癌の化学療法効果に影響を与える）。Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05728-y
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受領日
2022年2月15日
受理済
2023年1月12日
公開
2023年2月22日発行
DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-023-05728-y
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研究テーマ
がん治療抵抗性
化学療法
予測マーカー
腫瘍の不均一性
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ネイチャー（Nature） ISSN 1476-4687（オンライン） ISSN 0028-0836（印刷物）
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