クルクミンを担持した機能性リポソームによるStreptococcus mutansバイオフィルム治療法

ORIGINAL RESEARCHの記事
Front. Chem., 17 March 2023
第2部 ケミカルバイオロジー
第11巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fchem.2023.1160521
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歯科・整形外科用バイオアクティブマテリアルの進歩
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クルクミンを担持した機能性リポソームによるStreptococcus mutansバイオフィルム治療法

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fchem.2023.1160521/full

Functional liposome loaded curcumin for the treatment of Streptococcus mutans biofilm

Zhimin Hu† Ying Tang† Bulin Jiang Yue Xu Siying Liu and Cui Huang*.
中国武漢市武漢大学口腔生物医学重点実験室・口腔医学院・口腔医学基礎科学繁殖基地（湖北省MOST
はじめに 主にStreptococcus mutans（S.ミュータンス）が形成するプラークバイオフィルムは、う蝕の発生・進展に重要な役割を担っています。プラークコントロールの方法としては、従来から抗生物質による治療が行われている。しかし、薬剤の浸透性の悪さや抗生物質耐性などの問題が、代替戦略の模索を促している。本稿では、光線力学的効果を持つ天然植物抽出物であるクルクミンのS. mutansに対する抗菌効果を通じて、抗生物質耐性を回避することを期待しています。しかし、クルクミンは水溶性が低く、安定性に乏しく、代謝率が高く、クリアランス速度が速く、バイオアベイラビリティに限界があるため、臨床応用は限定的である。近年、リポソームは、高い薬物充填効率、生体環境下での高い安定性、放出制御、生体適合性、無毒性、生分解性など、多くの利点を有することから、薬物キャリアとして広く利用されるようになってきた。そこで、クルクミンの欠点を回避するために、クルクミン担持リポソーム（Cur@LP）を構築しました。
方法は以下の通りである： Cur@LPはNHSとの縮合反応によりS. mutansバイオフィルムの表面に付着することができる。リポソーム（LP）とCur@LPは透過型電子顕微鏡（TEM）および動的光散乱（DLS）により特性評価した。Cur@LPの細胞毒性は、CCK-8アッセイとLDHアッセイで評価した。Cur@LPのS. mutansバイオフィルムへの付着は共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM）で観察した。Cur@LPの抗バイオフィルム効果は、クリスタルバイオレット染色、CLSM、走査型電子顕微鏡（SEM）により評価した。
結果は以下の通りである： LPとCur@LPの平均直径はそれぞれ206.67±8.38nmと312±18.78nmであった。LPとCur@LPのζ電位はそれぞれ約19.3mVと約20.8mVであった。Cur@LPのカプセル化効率は(42.61 ± 2.19) %であり，クルクミンは2時間後に±21%まで急速に放出された。Cur@LPは細胞毒性がほとんどなく，S. mutansバイオフィルムに有効に付着してその増殖を抑制することができる。
考察 クルクミンは、がんをはじめとする多くの分野で広く研究されているが、これはその抗酸化作用や抗炎症作用に起因していると考えられる。現在、S. mutansバイオフィルムへのクルクミンの送達に関する研究はほとんどない。本研究では、S. mutansバイオフィルムへのCur@LPの付着と抗バイオフィルムを検証しました。このバイオフィルム除去戦略は、臨床への応用が期待される。
1 はじめに
う蝕は、ヒトの罹患率でトップ3に入る疾患である（Selwitz et al.、2007）。う蝕の重要な発症メカニズムの一つは、歯面にデンタルプラークと呼ばれるバイオフィルムが形成されることである（Valm, 2019）。S. mutansは、う蝕の主な原因菌と考えられている（Forssten et al.、2010）。S. mutansは、スクロースを基質として、グルコシルトランスフェラーゼにより水不溶性のグルカンを合成することができる（Kawabata and Hamada, 1999）。この過程は、歯の硬組織表面にS. mutansが永続的に定着し、細胞外高分子物質（EPS）を産生することを助長し（Klein et al., 2015）、他の細菌の定着やバイオフィルムの成熟にも好条件となる（Kolenbrander et al., 2002）．さらに、S. mutansは酸産生能（Cui et al., 2019）と耐酸性（Baker et al., 2017）の両方を備えています。様々な糖質を有機酸に輸送・代謝し、EPSが豊富でpHが低い環境を形成することができ、これが歯組織の継続的な破壊の重要な理由となっています（Lemos et al.、2019）。
現在、プラークコントロールは、う蝕を抑制するための重要な治療手段の一つであることが証明されています（Addy, 1986）。しかし、クロルヘキシジンなどの一般的に使用される抗菌剤は、バイオフィルムやプラークの蓄積を効果的に抑制できるものの（Brookes et al., 2020）、マイクロリークの増加（Salama et al., 2015）、歯の変色（Van Strydonck et al., 2012）、耐性菌増加（Kampf, 2016）などの副作用が多くある。さらに、0.12%クロルヘキシジンは歯垢のある歯面に歯石を形成しやすいことが報告されています（Zanatta et al., 2010）。最も深刻な副作用は、クロルヘキシジン洗口液に対する重度のアレルギー反応であり、呼吸停止や死亡に至る（Pemberton and Gibson, 2012）。
抗菌剤の数々の副作用を回避するために、研究者はカチオン性抗菌ペプチド（Lin et al., 2021; Sun et al., 2023）、銀ナノ粒子（Nafarrate-Valdez et al., 2022）、天然植物由来の植物エキス（Smullen et al., 2012）といった他の方法に目を向けています。私たちの研究グループは、植物エキスの応用研究に長い間取り組んできました。これまでの研究で、エピガロカテキン-3-ガレート（EGCG）（Yu et al., 2021）、ケルセチン（Yang et al., 2017）、レスベラトロール（Guo et al., 2021）など、多くの植物エキスがS. mutansに対して抑制作用を有することが分かっています。クルクミンはウコンに含まれる黄色い色素で、古くから染料や食品香料として使用されており、生体親和性に優れている（Gupta et al.、2013）。現在、クルクミンには抗酸化作用、抗炎症作用、抗菌作用、抗真菌作用、抗ウイルス作用、抗がん作用、神経保護作用があることが示されています（Aggarwal et al.、2007年）。また、クルクミンは光増感剤でもあるため、光線力学的療法（PDT）にも利用できます（Paschoal et al.、2015年）。さらに、クルクミンは細菌のクオラムセンシングに関わる遺伝子の発現を制御することで、有効な抗バイオフィルム効果を発揮する可能性が報告されている（Kali et al., 2016）。
しかし、クルクミンの低い水溶性、悪い安定性、高い代謝速度、速いクリアランス速度、限られたバイオアベイラビリティは、その臨床応用を制限している（Yavarpour-Bali et al.、2019）。そのため、研究者は、生体内でのクルクミンの利用率の向上を目指し、クルクミンを送達する多くの方法を開発してきました（Ma et al., 2019）。近年、リポソーム（LP）は、高い薬物充填効率、生体環境での高い安定性、放出制御、生体適合性、非毒性、生分解性などの多くの利点により、広く使用されている薬物キャリアとなっています（Xing et al., 2016）。現在、Cur@LPは、がん（Feng et al., 2017）、アルツハイマー病（Mourtas et al., 2014）、てんかん（Agarwal et al., 2013）、急性骨髄性白血病（Sun et al., 2017）に対する治療において広く研究されている。しかし、クルクミンが口腔内環境のS.ミュータンスバイオフィルムを標的とする研究はまだ少ないです。
前述の内容を踏まえ、クルクミンをバイオフィルムに送達するために、接着性を有するリポソームを設計しました。リポソームの表面には、アミノ基と結合する活性化カルボキシル基を保有できるNHS基があります（Wildling et al.、2011）。この戦略（図1）では、クルクミンを搭載したリポソームがバイオフィルムの表面に付着し、クルクミンをより効果的にバイオフィルムに送り込むことができます。そして、クルクミンを光活性化することで抗菌光線力学療法を行い、S. mutansバイオフィルムの除去効果を得ることができました。本研究の目的は、S. mutansバイオフィルムに対するCur@LPの除去効率を探索することであった。その結果、設計したリポソームがS. mutansバイオフィルムの表面に効果的に付着し、それに対応した抗菌効果を発揮することがわかりました。また、in vitroの実験では、Cur@LPが大きな細胞毒性を示さないことが確認されました。本戦略がS.mutansバイオフィルム除去治療の新たなアプローチとなることを期待する。

図1
図1. S.ミュータンスバイオフィルムに対するCur@LPの抗バイオフィルム主図。
2 材料と方法
2.1 化学物質と試薬
DSPE-PEG-NHS［1，2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-n-［ポリ（エチレングリコール）］-ヒドロキシスクシンイミド］、L-α-ホスファチジルコリン、クルクミン［1，7-ビス-（4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル）-1，6-ヘプタジエン-3，5-ディオン］およびコレステロールはAladdin Bio-Chem Technology（上海、中国）より入手した。S. mutans IngbrittおよびMC3T3-E1骨芽細胞前駆体細胞は、武漢大学（中国）School of Stomatologyから提供された。Brain heart infusion (BHI) brothはBeijing Land Bridge Technology Co.から購入した。(Ltd.（中国）より購入した。ジメチルスルホキシド（DMSO）はBioFroxx（ドイツ）より入手した。寒天は北京太陽生物技術有限公司（Beijing Solarbio Technology Co. (北京、中国)から入手した。クリスタルバイオレット染色液および乳酸脱水素酵素（LDH）細胞毒性アッセイキットは、Beyotime Biotechnology Co. (中国、上海)から購入した。メタノール、エタノール、ジクロロメタン、グルタルアルデヒド、スクロースは、Sinopharm Chemical Reagent Co. (China)から入手した。Cell counting kit-8（CCK-8）は、同仁堂化学（日本、熊本）から購入した。α-modified必須培地（α-MEM）は、HyClone（Logan, UT, United States）より入手した。すべての試薬および化学物質は、受け取ったまま利用した。
2.2 クルクミン溶液の調製
光増感剤として使用するクルクミンの溶液を調製し、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して20mMのストック溶液を得た。このストック溶液を孔径0.22μmのフィルターを用いて濾過した。実験当日、ストック溶液を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈し、使用するまで-20℃の暗所に保存した。
2.3 Cur@LPの調製
50mL丸底フラスコに、L-α-ホスファチジルコリン（1mg）、DSPE-PEG-NHS（0.4mg）、コレステロール（0.25mg）を質量比20：8：5でジクロロメタン10mLに溶解させた。この溶液を回転式エバポレーターを用いて43℃で蒸発させ、脂質膜を得た。次に、3mLのPBS溶液を、脂質膜を有する丸底フラスコに加えた。脂質膜の全てが溶液に懸濁されると、懸濁液は、脂質膜を効率的に水和するために一晩4℃に置かれる。次に、リポソーム調製物を水浴中で1時間超音波処理し、目に見える沈殿物をすべて除去した。2枚のポリカーボネート膜を、1mLシリンジを備えたLiposoFast™押出機（Avestin lnc., Ottawa, ON, Canada）にセットした。800nm、400nm、200nmのポリカーボネート膜を順次用いて懸濁液を通過させてリポソーム溶液を押し出し、ブランクリポソームを取得した。
同様に、L-α-ホスファチジルコリン（1 mg）、DSPE-PEG-NHS（0.4 mg）、コレステロール（0.25 mg）の添加とは別に、クルクミン濃度が150μMとなるようにジクロルメタン10 mLに一定量のクルクミンを添加した。また、ロータリーエバポレーション法によりクルクミン担持リポソーム（Cur@LP）を調製した。
2.4 Cur@LPの特性評価
リポソームの微細構造は、透過型電子顕微鏡（TEM、JEM-2100、日本）により評価した。炭素膜付き銅グリッド上に試料溶液を一滴滴下した。室温で乾燥させた後、TEMで3回観察した。
ブランクリポソームとCur@LPの平均径とゼータ電位は，動的光散乱法（DLS，zeta sizer nano zs90，英国）により求めた。
LPとCur@LPの分散性と安定性を評価するために，1，3，5，7日後のLPとCur@LPの粒子径と多分散性指数（PDI）を検出した。
2.5 Cur@LPのカプセル化効率
調製したCur@LPを845gで15分間遠心分離することにより分離した。上澄み液は、エタノールで10分間分解した。紫外線可視分光光度計を用いて、波長427nmでクルクミンの濃度を測定した。カプセル化効率のパーセントは、以下のように計算した：
カプセル化効率 %=C2C1×V1V2×100,Encapsulation Efficiency %=�2�1×�1�2×100、
ここで、C1 はジクロロメタン中のクルクミン濃度、C2 は遠心分離後の上澄み液中のクルクミン濃度、V1 はジクロロメタン量、V2 は脂質膜付き丸底フラスコに加えたPBS溶液量である。
2.6 Cur@LPのin vitro放出について
ノマドクルクミンを除去した後、分子量カットオフ（MWCO）15000のCur@LPを入れた透析バッグを、PBSとメタノールを体積比3：2で混合した30mLに37℃、220rpmのエアシェーカーで浸漬させた。所定時間に放出液（3mL）を取り出し、等量のPBSとメタノールの混合液を加えた。Cur@LPから放出されたクルクミンのパーセントは、以下のように計算された：
release %=Ct×30+∑i=n−1i=1Ci×3m×100,release %=��×30+∑�=1�=�−1��×3�×100,
ここで、Ct は t 時刻における混合液中のクルクミン濃度、n は放出液の抽出回数、m は透析バッグ中のクルクミンの初期総量である。
2.7 S. mutansの培養
凍結したS. mutansを新鮮なBHI培地（37g/L）に1：100の割合でエッペンドルフチューブまたは遠心分離器で希釈し、37℃で16〜24時間培養した後、S. mutansの濃度を紫外線可視分光光度計で波長600nmで測定し、108コロニー形成単位（CFUs）/mLにした。なお、S. mutansのバイオフィルムは、ショ糖（17g/L）を含むBHI（37g/L）ブロスを用いたディッシュで形成されていた。
2.8 Crystal Violet染色によるバイオフィルム量の検出
S. mutansをショ糖を含むBHIブロスで48ウェルプレートに1ウェルあたり105CFU/mLで希釈し、濃度の異なるクルクミンを添加し、ブルーライトを30秒間照射後24時間培養した（ブルーライトの照射量は1000mW/cm2、最終放射照度は30J/cm2）。光活性化作用を有しないクルクミンの抗菌濃度（mM）は、それぞれ0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8とした。光活性化効果を有するクルクミンの抗菌濃度（μM）は、それぞれ0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8とした。
24時間の共培養後、上清を捨て、PBS溶液で細菌バイオフィルムを3回洗浄した。その後、100μLのメタノールを添加し、10分間固定した。メタノール除去後、100μlの1％クリスタルバイオレットを加え、20分間染色した。クリスタルバイオレット除去後、ウェルをPBS溶液で3回洗浄した。100μlのエタノール溶液を加え、30分間溶解させた。新しい96ウェルプレートに移し、630 nmの波長で測定した。
2.9 CCK-8アッセイによる細胞生存率の検出
MC3T3-E1骨芽細胞前駆細胞を、10％（v/v）牛胎児血清および1％（v/v）ペニシリン／ストレプトマイシンを含むα-modified minimum essential mediumで、37℃、5％CO2のインキュベーターで培養した。完全培地は2日ごとに交換し、壁に付着している細胞数が80％〜90％に達した時点でトリプシンにより細胞を消化させた。次に、細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり5,000個の密度で播種し、各ウェルに100μlの培地を入れて24時間インキュベートした後、リポソームと異なる濃度のクルクミンまたはCur@LPをそれぞれ24時間添加した。各ウェルにCCK-8溶液と完全培地を体積比1：10で混合した100μLを入れ、光から離して2時間インキュベートした後、紫外線可視分光光度計で450nmの吸光度を測定した。
2.10 LDHアッセイによる細胞毒性の検出
MC3T3-E1骨芽細胞前駆細胞の培養は、2.9と同様であった。リポソーム、クルクミン、またはCur@LPを24時間添加した後、96ウェルプレートを有孔プレート遠心機（エッペンドルフ社製）を用いて400g、5分間遠心分離した。その後、上清を除去し、LDH細胞毒性測定キットのLDH放出試薬150μlを各ウェルに1時間かけて添加し、再度400gで5分間遠心した後、各ウェルの上清120μlを新しい96ウェルプレートに加え、LDH試験作動液60μlと25℃で30分間光を避けて混合してから紫外線可視光度計を用いて450nmにおける吸光度を測定した。
2.11 Plankton S. mutansに対するCur@LPの抗菌活性
S. mutansはBHIブロスで培養した。37g/LのBHIブロスで希釈したS. mutans懸濁液に、PBS、クルクミン（Cur）、リポソーム（LP）、またはCur@LPをそれぞれエッペンドルフチューブで添加した。エッペンドルフチューブ内のS. mutansの濃度は105CFU/mLであり、クルクミンおよびCur@LPの濃度は同時に10μMであった。37℃で24時間培養する前に、すべてのエッペンドルフチューブに、最終放射照度が30J/cm2の青色光を30秒間照射した。その後、紫外可視分光光度計を用い、波長600nmでS. mutansの濃度を測定した。
2.12 S.mutansバイオフィルムへのCur@LPの付着の検出
S. mutansをスクロースを含むBHIブロスで共培養ディッシュに播種し、S. mutansバイオフィルムを発達させた。クルクミンまたはCur@LPを添加し4時間共培養した後、培養液を除去し、その後各ディッシュをPBSで3回洗浄し未添着物を除去した。SYTO 59で赤く染色されたS. mutansバイオフィルムと、バイオフィルム上に付着した緑色の蛍光を発するクルクミンを共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM）を用いて観察した。蛍光画像はImageJで解析した。実験は3回繰り返し、各サンプルについて5枚の写真を撮影した。
2.13 Cur@LPの抗バイオフィルム活性の検出
S. mutansをスクロースを含むBHIブロスでコンフォーカルディッシュに播種してS. mutansバイオフィルムを形成させた後、PBS、Cur、LP、Cur@LPをそれぞれ添加した。4時間培養後、培養液を除去し、各ディッシュをPBSで3回洗浄した後、各ディッシュに新しい培養液を添加した。24時間後、上清を除去し、各ディッシュをPBSで3回洗浄し、残存するバイオフィルムをSYTO 59で赤く染色してCLSMで観察した。蛍光画像はImageJで解析した。実験は3回繰り返し、各サンプルについて5枚の写真を撮影した。バイオフィルムの面積は3回計算し、データは平均値±SDで表示した。
2.14 ex vivoヒト歯における抗バイオフィルム活性
臨床患者から非う蝕歯を入手し，小さな立方体（5×5×2mm，L×W×H）に切断した．両面をそれぞれ紫外線照射で2時間滅菌した後，キューブを24ウェルプレートに入れ，PBS，Cur，LP，またはCur@LPを添加したスクロース含有S. mutans（105CFU/mL）入りBHIブロスに浸漬して37℃で4時間培養し，培養液を除去してキューブを含む各ウェルをPBSで3回洗浄し，各ウェルで新しい培養液の添加をした．37℃で24時間培養する前に、すべてのキューブに、最終放射照度が30J/cm2の青色光を30秒間照射した。その後、培地を除去し、PBSで3回洗浄した後、2.5%グルタルアルデヒドを添加し、キューブ上のS. mutansバイオフィルムを24時間固定した。30%、50%、75%、90%、100%のアルコールで15分間ずつキューブを乾燥後、走査電子顕微鏡（SEM）によるバイオフィルムの写真撮影に使用した。
2.15 統計解析
すべてのデータは、少なくとも3連の条件下で平均±SDとして表され、各実験は独立して少なくとも3回繰り返される。統計解析には、一元配置分散分析（one-way ANOVA）および両側不対スチューデントt検定（two-tailed unpaired Student's t-test）が含まれた。データ処理および統計解析には、GraphPad Prism 7.0およびMicrosoft Excel 2019ソフトウェアを使用しました（p < 0.05は統計的に有意なことを意味します）。
3 結果
3.1 Cur@LPの特性について
図2Aは、合成されたCur@LPのTEM画像であり、良好な分散性を有する球状ベシクル様形態を形成していた。DLSの結果によると、リポソームおよびCur@LPの平均直径はそれぞれ206.67±8.38および312±18.78nmであり、図2Bに示される。LPとCur@LPの直径とPDIを長時間測定した結果（図2C、D）によると、LPの直径は3日目にわずかに増加し、その後ゆっくりと減少し、Cur@LPの直径は5日以内は安定していたが7日目に減少した。LPとCur@LPのPDIは、いずれも1日目に非常に低い値を示し、その後、時間の経過とともに徐々に増加した。しかし、Cur@LPのPDIは7日目に低下しており、Cur@LPが7日目に安定化したことがわかりました。7日後にCur@LPの直径が減少した理由は、7日後にCur@LPから放出されたクルクミンである可能性があると推測されます。一般に、LPとCur@LPのPDIは、7日以内に低いレベルを維持する。この結果は，Cur@LPが強い分散性と一定時間での安定性を有していることを示している。リポソームとCur@LPの粒子径が異なることから、リポソームへのクルクミンの担持に成功したことがわかる。図2Eに示すリポソームとCur@LPのζ電位は、それぞれ約19.3mVと約20.8mVであった。強い負電荷は電荷反発によってリポソーム懸濁液の安定性を維持することができる。
図2
図2 （A）Cur@LPの代表的なTEM顕微鏡写真。(B,C) LPとCur@LPの粒子径。(D) LPとCur@LPのPDI。(E) LPとCur@LPのゼータ電位。(F) Cur@LPの37℃におけるin vitro放出挙動。
3.2 Cur@LPのカプセル化効率とin vitroでの放出挙動
波長427nmの吸光度を検出したところ、Cur@LPのカプセル化効率は（42.61±2.19）%であった。図2Fに示す結果によると、クルクミンは2時間以内に最高値である約21%まで急速に放出され、総放出量は2〜8時間は一定で、10時間後には約18.3%まで減少した。
3.3 光活性化したクルクミンの抗菌効果
光増感剤であるクルクミンは、光活性がなくても抗菌効果を発揮し、薬剤の暗黒活性と呼ぶことができる。一方、クルクミンは可視光の他の領域と比較して最も吸光度が高い青色光で活性酸素が発生した（Seidi Damyeh et al.、2020）。そこで、クルクミンのS. mutansに対する抗菌活性を、光活性化の有無で判断した。図3に示す結果によると、光活性化しないクルクミンの最小阻害濃度（MIC）は4mMの濃度で確認され、光活性化したクルクミンのMICは10μMでした。光活性化したクルクミンの抗菌活性は、光活性化しないクルクミンよりも数百倍高いことが示唆されました。これらの結果は、図3B、Dに示す染色像にも現れており、光活性化の有無によるクルクミンのMICは、図3Bg、Dfに直感的に示されている。
図3
図3 （A）光活性化しない異なる濃度のクルクミンの抗菌性。(B）（a）0、（b）0.125、（c）0.25、（d）0.5、（e）1、（f）2、（g）4、および（h）8でCur（mM）の光活性化効果なしのクルクミンの結晶紫染色画像。 C）光活性化を有する異なる濃度のクルクミンの抗菌性状を示す。(D) Cur (μM)の光活性化効果によるクリスタルバイオレット染色画像 (a) 0, (b) 0.625, (c) 1.25, (d) 2.5, (e) 5, (f) 10, (g) 20, and (h) 40.で示した。統計的有意性は、両側スチューデントのt-テストによって計算された。データは平均値±SDで示した。
3.4 CCK-8アッセイによる細胞生存率の検出
クルクミンおよびCur@LPの細胞生存率は、CCK-8アッセイにより測定した。図4Aの結果によれば、濃度10（p＜0.05）および40μM（p＜0.0001）のクルクミンで処理した細胞の生存率は、いずれもコントロール群と比較して有意な減少を示した。しかし、図4Bに示すように、濃度10μMのCur@LPで処理した細胞の生存率は、コントロール群と比較して有意な増加を示し（p＜0.01）、濃度40μMのCur@LPで処理した細胞の生存率は、コントロール群と比較して有意差はなかった。次に、クルクミン、リポソーム、Cur@LPの濃度が10μMの場合の細胞生存率を比較したところ、図4Cに示すように、同様の結論となった。クルクミン群（10μM）はコントロール群と比較して生存率が有意に低下し（p＜0.01）、Cur@LP群（10μM）は有意に上昇した（p＜0.05）。ANOVAにより、クルクミン群とCur@LP群の間に有意差があることが示された（p < 0.001）。細胞生存率アッセイのすべての結果は、クルクミンをリポソームに担持させると、細胞毒性が効果的に低下することを証明した。
図4
図4（A）異なる濃度のクルクミンで培養した後のMC3T3-E1の細胞生存率（B）異なる濃度のCur@LPで培養した後のMC3T3-E1の細胞生存率。PBS、Cur（10μM）、LP、またはCur@LP（10μM）と共培養したMC3T3-E1の細胞生存率は、CCK-8アッセイ（C）およびLDHアッセイ（D）により検出した。統計的有意性は、両側スチューデントのt-テストによって計算された。データは、平均値±SDで示した。
3.5 LDHアッセイによる細胞毒性の検出
クルクミンおよびCur@LPの細胞毒性は、LDHアッセイによって決定した。図4Dに示すように、クルクミン群（10μM）は明らかな細胞毒性を有していたものの、Cur@LP群（10μM）はクルクミン群（10μM）と比較して細胞毒性が著しく低下していた。また、LP群はコントロール群と比較して有意差はなかった（p＞0.05）。
3.6 Planktonic S. mutansに対するCur@LPの抗菌活性
S.mutansの浮遊菌に対するCur@LPの抗菌活性を調べるため、S.mutans浮遊菌培養液にPBS、Cur、LP、Cur@LPを添加した。紫外線可視分光光度計を用い、波長600nmでS.mutansの濃度を測定した。図5Aに示す結果から、ブランクLPは細菌の増殖に大きな影響を与えないことがわかった。また、CurおよびCur@LPは、同程度に細菌の増殖を抑制した。
図5
図5（A）PBS、Cur、LP、または光活性化したCur@LPで処理した後のS. mutansの浮遊性培養物のOD値である。S.mutansバイオフィルム上のCurまたはCur@LP（緑）の付着の画像（B）および定量化（C）である（STYO 59で赤く染色する）。PBS、Cur、LP、Cur@LPで4時間処理した後のS. mutansバイオフィルムのOD値（D）およびクリスタルバイオレット染色画像（E）。データは平均値±SDで示した。
3.7 Cur@LPの接着活性
我々の設計によれば、Cur@LPはバイオフィルム表面に付着し、クルクミンをバイオフィルム内に効率よく放出することができる。そこで、CLSMによりS. mutansバイオフィルムへのCur@LPの付着能力を検出した。図5Bに示すように、Cur@LP群では、Cur群に比べ、バイオフィルム（ステイン赤）に付着したクルクミン（緑）の数が有意に多くなっていた。図5Cは、CurとCur@LPの残留クルクミン面積の定量結果を示したものである。Cur@LP群の残留クルクミン面積は、Cur群よりも有意に高い（p＜0.0001）。これらの結果は、LPが比較的短時間でバイオフィルム表面に付着し、バイオフィルムへのクルクミン送達を促進することを示した。
3.8 Cur@LPの抗バイオフィルム活性
S. mutansと実験群を4時間共培養したところ、バイオフィルムが予備的に形成された。図5Dに示す結果から、Cur@LP群（10μM）で形成されたバイオフィルムは、他の群に比べ有意に減少した（p＜0.001）。しかし、Cur群（10μM）のバイオフィルムは、対照群のバイオフィルムと比較して有意な差は見られなかった。これは、遊離したクルクミンはバイオフィルムが予備的に形成される4時間目に洗浄されるのに対し、Cur@LPはバイオフィルム上に付着できるため、完全に洗浄されずクルクミンを放出してその後の培養工程で抗菌作用を発揮したためと考えられる。また、図5Eに示す染色画像は、直感的な表示を行うことができた。さらに、PBS、Cur、LP、またはCur@LPで処理された後の残留S.mutansバイオフィルムをCLSMで観察した。図6A、Bに示すように、Cur@LPは他のグループよりも強いバイオフィルム除去効率を示すことがわかった（p < 0.001）。
図6
図6】（A）PBS、Cur、LP、またはCur@LPで4時間処理した後のS. mutansバイオフィルムの残留バイオフィルム。バイオフィルムはSTYO 59で赤く染色し、すべてのサンプルについて5枚の写真を撮影した。(B）バイオフィルム除去面積の統計解析。3つの生物学的複製を示す。(C）ヒトの歯にPBS、Cur、LP、またはCur@LPで処理した後のS. mutansバイオフィルムの残存バイオフィルム。統計的有意性は、両側Student's t-testによって計算された。データは、平均値±SDで示した。
3.9 ex vivoヒト歯における抗バイオフィルム活性
近年、多くの研究者がヒトの歯のバイオフィルムに対する様々な薬剤の効果を深く研究しています（Liu et al., 2018; Wang et al., 2023）。そこで、私たちはさらに、ヒトの単離歯を用いた抗バイオフィルム実験を行うことにしました。その結果、Cur@LP群は他の群と比較してS.ミュータンスバイオフィルムの残存が最も少なく（図6C）、Cur@LPがより強い抗バイオフィルム活性を有することが示されました。これは、クルクミン単独ではバイオフィルムに効果的に接着できないため、クルクミンを担持したリポソームを用いることで接着力が高まり、抗菌効果が発揮されるためではないかと推測しています。
4 考察
S.mutansに対して抗バイオフィルム効果を発揮するために，バイオフィルムに付着可能でクルクミンを担持したリポソームの構築を行った。クルクミンはリン脂質二重膜に、Cur@LPの表面はPEGの活性誘導体であるDSPE-PEG-NHSによって取り込まれた。PEG骨格は親水性、親油性に優れ、PEG化リン脂質はカプセル化した薬物の安定性を著しく向上させることができる（Klibanov et al., 1990）。DSPE-PEG-NHSの場合、リポソーム中のNHSのカルボキシル基がS. mutansバイオフィルムのアミノ基と反応してペプチド結合を形成し、その後、リポソームがバイオフィルムに付着できる（Pandey et al.,2018）．その後、図解スケッチ（図1）に示すように、青色光照射下でバイオフィルム近傍のリポソームからクルクミンが放出され、バイオフィルムを分散させて抗菌作用を発揮することができます。臨床的には、青色光源はCur@LP溶液やゲルの塗布を容易にする広い応用範囲を持っています。
合成されたリポソームは強い負電荷を持ち、電荷反発によりリポソーム懸濁液の安定性を維持することができる。クルクミンのin vitro放出データから、クルクミンは2時間以内に急速に放出され、最高値の約21%に達することが示唆された。これは、透析液がPBSとメタノールの体積比3：2の混合液であり、37℃、220rpmのエアシェーカーで振動させていることから、振動中にクルクミンがより不安定になったものと考えられた。また、全工程で光対策を行っても、光活性化作用でクルクミンが一部分解されたとも考えられる。
クルクミンは、天然の外因性光増感剤として、PDTとしても知られる青色光励起下で基底状態の分子酸素と衝突し、活性酸素種（ROS）を生成します（Luby et al.、2019）。発生したROSは、細胞膜の脂質を酸化させ、膜結合タンパク質の破壊につながり、細菌細胞のアポトーシスやネクローシスを引き起こします（Sperandio et al.、2013）。実際には、クルクミン自体に確実な抗菌作用があるものの、PDTの役割により、クルクミンは光活性化でより強い静菌作用を発揮することができます。これは、光活性化したクルクミンの抗菌活性が、光活性化しない場合に比べて数百倍高いという実験結果とも一致する。
古典的なドラッグデリバリーキャリアとして、リポソームは細胞毒性が低いという最大の利点がある。図2C、Dに示すデータによると、Cur@LPの直径は5日以内に安定したレベルを維持し、Cur@LPのPDIは5日以内に低い範囲で徐々に増加した。この結果は、Cur@LPが良好な分散性と一定時間での強い安定性を有することを示唆した。一方、7日目にはCur@LPの直径とPDIがともに減少していることにも気づきました。これは、Cur@LPが7日間でより良い分散性を示したことを示しています。このことから、7日目にCur@LPからクルクミンが放出されたことが推測される。細胞増殖アッセイの結果、クルクミンは濃度の上昇に伴い明らかな細胞毒性を示すことが示唆された。しかし、Cur@LP群では、同濃度のクルクミン群と比較して、有意な細胞毒性は見られなかった。特に、Cur@LPは40μMの濃度でクルクミンと比較して細胞増殖を有意に行った。これらの結果は、リポソームがクルクミンの細胞毒性から細胞を保護する明らかな効果を示したことを示しています。
また、Cur@LPのプランクトン性S.mutansに対する抗菌活性を調べた結果、Cur群とCur@LP群では有意差はなかった。この実験結果は、Cur@LPがプランクトン性S.ミュータンス菌に対してCurと比較して明らかな優位性を持たないことを証明するものであると思われます。しかし、その後の抗バイオフィルム実験の進行に伴い、私たちが用意したCur@LPの最大の利点は、歯に塗布したときにS.mutansバイオフィルムに付着することができることであることが分かりました。そこで、短期間処理した異なる材料がバイオフィルムに与える影響を観察するための実験を計画しました。各実験グループは、S. mutansと4時間共培養し、あらかじめ形成されたバイオフィルムにリポソームが付着する事実を観察した。その後、すべてのウェルの古い培養液を取り出し、新しい培養液を加えて24時間培養したところ、クルクミンはバイオフィルムに付着することができず、洗い流されてしまった。一方、ほとんどのリポソームはクルクミンを保持し、放出し続けることができた。クリスタルバイオレット染色の結果、Cur@LPグループの抗菌性はクルクミングループのそれよりも優れていた（図5A）。クルクミンは緑色の蛍光を持ち、CLSMで観察することができる。図6Aに示すように、Cur@LP群ではCur群と比較して緑色の蛍光が著しく強く、Cur群のクルクミンがほとんど洗い流されたためか、Cur@LPによりクルクミンの付着が増加したことが示唆された。同様に、残留バイオフィルム染色の結果も、クリスタルバイオレット染色の結果と近似していた。以上の結果から、設計したリポソームがS. mutansバイオフィルムに付着し、クルクミンを持続的に放出して抗菌性を発揮できることが示されました。
クルクミンは、がん（Maheshwari et al., 2006）など多くの分野で広く研究されており、その背景には、抗酸化作用や抗炎症作用（Hewlings and Kalman, 2017）があると考えられています。本研究では、クルクミンの口腔領域での応用を検証した。臨床的には、歯磨きなどの激しい機械的動作により、バイオフィルムへのCur@LPの付着が低下する可能性があります。この点が応用の限界であり、今後の開発の方向性になると思われる。
5 まとめ
本研究では、接着性を有するリポソームを設計・調製した。このリポソームは、S. mutansバイオフィルムに付着し、クルクミンを持続的に放出することで抗菌効果を発揮することができる。クルクミンは天然の光増感剤であるため、青色光によって刺激され、より強い抗菌効果を発揮することができる。臨床的には、青色光源の普及による利便性とS.ミュータンス菌のバイオフィルムへの接着性により、Cur@LPは幅広い応用が期待されます。
データ提供について
本研究で発表された原著は、論文/補足資料に含まれています。さらなるお問い合わせは、対応する著者にお願いします。
著者による貢献
ZH：データキュレーション、正式な分析、執筆-原案、調査。YT: データキュレーション、方法論、執筆-レビューと編集。BJ：方法論と調査。YX: 方法論と調査。SL：方法論と調査。CH：執筆・レビュー・編集、資金獲得、リソース、監督。
資金調達
本研究は、中国国家自然科学基金（81970918および82271010）の財政的支援を受けた。
利益相反
著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
出版社からのコメント
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キーワード：リポソーム、クルクミン、Streptococcus mutans、バイオフィルム、デリバリーシステム
引用元 Hu Z, Tang Y, Jiang B, Xu Y, Liu S and Huang C (2023) Functional liposome loaded curcumin for the treatment of Streptococcus mutans biofilm. Front. Chem. 11:1160521. doi: 10.3389/fchem.2023.1160521
受理された： 07 February 2023; Accepted： 2023 年 3 月 06 日；
発行：2023年3月17日
編集者
ウェイ・チャオ、香港大学、香港特別行政区、中国
レビューした人
Luelak Lomlim, Prince of Songkla University, タイ
Wenyi Li, La Trobe University, オーストラリア
中国科学院大学 Yong Liu氏（中国
Copyright © 2023 Hu, Tang, Jiang, Xu, Liu and Huang. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、学術的に認められた慣行に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： Cui Huang, huangcui@whu.edu.cn
これらの著者は、本作品に等しく貢献しています。
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