駿河湾越生田沖で捕獲されたChimaera phantasma（シルバーキメラ）の腸内細菌叢の16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスについて

3 2023年4月
駿河湾越生田沖で捕獲されたChimaera phantasma（シルバーキメラ）の腸内細菌叢の16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスについて

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mra.01149-22

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著者紹介 荻田 佑 https://orcid.org/0000-0002-6922-4470 ogitat@shinshu-u.ac.jpAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mra.01149-22
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ABSTRACT
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謝辞
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ABSTRACT
2022年4月から5月にかけて駿河湾の小下田沖で採集したChimaera phantasma（シルバーキメラ）（雌2頭、雄1頭）の腸内細菌叢を網羅的に解析した。プロテオバクテリア門に属する細菌が優占種であった。その他の細菌門の占拠率はサンプル間で大きく異なっていた。
お知らせ
宿主のホメオスタシス（1, 2）を促進する腸内細菌叢は、多くの魚類（3, 4）で解析されているが、深海魚種（5, 6）ではほとんど解析されていない。駿河湾小下田沖（34.86486N, 138.72713E）のトロール網（水深約200〜250m）でChimaera phantasma（シルバーキメラ）（7）の個体が捕獲されました。捕獲後48時間以内に腸管内容物を採取し、4℃で保存した。開腹手術後、彼らの胃腸を摘出し、下部胃内容物を滅菌した50mL遠心分離管に採取し、DNA抽出まで-80℃で保存した。標本は当研究所で液浸保存した。ZircoPrep ミニチューブ（日本ジェネティクス社製）に、魚腸内容物（5～10mg）をInhibitEX バッファー（200μL；Qiagen社製）と混合した。サンプルを5分間振とうし（Bead Ruptor 12 homogenizer; Omni）、QIAamp Fast DNA stool minikit（Qiagen）を用いてDNAを抽出した。10μLの第1PCR混合液には、2×PCRバッファー5μLにKOD FX Neo DNA polymerase（東洋紡績株式会社）0.2μLと、0. μMのプライマー341f（5′-ACACTCTTTCCCTACGACGCTTCCGATCT-NNNN-CCTACGGNGGCWGCAG-3′）および805r（5′-）の各2μLを含む。 GTGACTGGAGTTCAGACGTGCTTCCGATCT-NNNNN-GACTACHVGGTATCTAATCC-3′) を用いて16S rRNA遺伝子（V3〜V4領域）の増幅を行った．2mMデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）各2μL、および腸内容DNA1μL。反応条件は以下の通りである： 94℃で2分、98℃で10秒、55℃で30秒、68℃で30秒を30サイクル、最後に68℃で7分。PCR産物はAMPure XPシステム（Beckman Coulter）を用いて精製した。10μLの第2PCR混合物は、1μLの10×Ex Taqバッファー、0. 1 μLのEx Taq高感度（HS）DNAポリメラーゼ（TaKaRa Bio）を入れた、 プライマー2ndF（5′-AATGATACGGCACCGAGATCTAC-Index2-ACACTCTTTCCCTACGACGC-3′）および2ndR（5′-CAAGCAGAAGACGCATACGAGAT-Index1-GTGACTGAGTTCAGACGTG-3′）（イルミナ）各1μL、各2μLの2. 5 mM dNTPs、および第1ラウンドのPCR産物2μLを用いた。指標となるPCR条件は以下の通りであった： 94℃2分、94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒の12サイクル、最後に72℃5分。これらのPCR産物をAMPure XPシステムを用いて精製し、QuantiFluor二本鎖DNA（dsDNA）システム（Promega）およびSynergy H1プレートリーダー（BioTek）を用いて定量化した。dsDNA 915試薬キットとFragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies)を用いてライブラリーの品質チェックを行った。PCR産物は、MiSeq試薬キットv.3とMiSeqシーケンサー（Illumina）を用いてシーケンス（2 × 300-bp paired-end reads）されました。得られたリードは、FASTX-Toolkit v.0.0.14 (8)のfastx_barcode_splitterおよびfastx_trimmerをそれぞれ用いてデマルチプレックスおよびトリミングした。低品質リード（Qスコア<20）およびマージリード（<130 bp）はすべてSickle v.1.33 (9)を用いてフィルターで除去した。残りのペアエンドリードは、FLASH v.1.2.11 (10)を用いて結合した。クラスタリングとキメラチェックを含む配列データ解析は、QIIME2 pipeline v.2022.2 (https://qiime2.org)を用いて実施した。99%以上の類似性を示す配列は、SILVAデータベースv.138 (11)を用いて運用分類単位(OTU)にグループ化した(表1)。バイオインフォマティクス解析には、特に断りのない限り、デフォルトのパラメータを使用した。
表1
表1 本試験で分析した試料の概要
サンプルホスト種採取日（年・月・日）生シーケンスリード数品質フィルターリード数観測されたOTU数DRAアクセッションNo. C_1Chimaera phantasma2022-4-1034,80723,73513DRR413612C_2Chimaera phantasma2022-4-1743,57331,84513DRR413613C_3Chimaera phantasma2022-5-1543,59432,20499DRR413614
3つのサンプルには、合計123のOTUが含まれていた。サンプルC_2（図1）の微生物相の90%以上はプロテオバクテリアで、89.2%のPhotobacterium種と2.3%のShewanella種で構成されている。Photobacterium属は、深海魚の腸内に存在する発光性の好塩性グラム陰性種である（12）。Shewanella属は、海洋に生息する強圧性で発光性のグラム陰性種である(13-15)。プロテオバクテリアは、サンプルC_1では38.3%（4種）、サンプルC_3では26.1%（22種）を占めている。その他、占有率10%以上の分類群は、サンプルC_1ではActinobacteria（19.5%）、Firmicutes（11.7%）、Patescibacteria（10.5%）、サンプルC_3ではDesulfobacterota (35.9%) とChloroflexi (15.9%) でした。
図1
図1 Chimaera phantasmaの腸内細菌叢の分類学的組成を表す棒グラフ。分類群の相対的な存在量は、門レベルで示されている。その他」のカテゴリーには、相対的存在量が1%未満の分類群が含まれる。C_1およびC_2は雌、C_3は雄。
データの入手方法
16S rRNA遺伝子アンプリコン配列データは、DDBJ Sequence Read Archive（DRA）にアクセッション番号DRR413612、DRR413613、DRR413614で寄託されています。
謝辞
本研究は、信州大学農学部の助成金により実施されました。
サンプル採取には、青山沙織さん（Sarah）、佐藤茂樹さん（慈愛丸船長）に感謝します。英文校正はエディテージ(www.editage.com)に感謝する。
参考文献
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