セカルマイクロバイオタ移植：多様に選択された近交系ドナー系統のセカルマイクロバイオタが、レシピエントニワトリのセカル微生物プロファイル、セロトニン作動性、および攻撃的行動に与えるユニークな影響

2023年5月2日 17:20

公開日：2023年05月02日
セカルマイクロバイオタ移植：多様に選択された近交系ドナー系統のセカルマイクロバイオタが、レシピエントニワトリのセカル微生物プロファイル、セロトニン作動性、および攻撃的行動に与えるユニークな影響

ユエチ・フー
Jiaying Hu、
...
成亨偉（チェン・ヘンウェイ
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動物科学・バイオテクノロジー誌 14巻記事番号：66 (2023) この記事を引用する
2 Altmetric（アルトメトリック
メトリックス詳細
アブストラクト
背景
ヒトの試験や齧歯類の研究から蓄積された証拠は、腸内細菌叢の調節が宿主の生理的ホメオスタシスと行動特性に影響を与えることを示している。同様に、腸内細菌叢の変化は、ニワトリの攻撃的な行動を減らし、健康を改善するための実現可能な戦略となり得る。本研究では、早期の食道微生物移植（CMT）がレシピエントニワトリの食道微生物組成、脳内セロトニン作動性活性、攻撃的行動に及ぼす影響を明らかにするために実施された。
実施方法
非攻撃的行動と攻撃的行動をそれぞれ持つニワトリ63系統と72系統をドナーとして、市販のデカルブXLをCMTのレシピエントとして使用した。84羽の1d齢の雄ヒヨコを、1処理あたり7ケージ、1ケージあたり4羽（n = 7）の生理食塩水（コントロール、CTRL）、63系統の糞便液（63-CMT）、72系統の糞便液（72-CMT）の3処理のうちの1つにランダムに割り付けた。移植は、d1から10まで1日1回経口ガベージで行い、3週目から5週目まで週1回ブーストした。5週目と16週目に、ホームケージでの行動を記録し、体重が同程度のニワトリを処置間のペア攻撃テストに割り付けた。試験後のニワトリから血液、脳、糞便のサンプルを採取し、CMTが誘発する生物学的および微生物学的変化を検出した。
結果
63-CMT鶏は、5週目に視床下部のセロトニン作動性活性が高くなり、攻撃的な行動が減少した。また、Lachnospiraceaeに属する2つのアンプリコン配列変異体（ASV）とRuminococcaceae UCG-005 ASVは、それぞれ脳のトリプトファンおよびセロトニンのレベルと正の相関があった。72-CMT鶏は、5週目の脳内ノルエピネフリンとドーパミンのレベルが低く、16週目の血漿中セロトニンとトリプトファンのレベルが高いことがわかった。72-CMT鶏のMollicutes RF39およびGCA-900066225に属するASVは、5週目の脳内5-ヒドロキシインドール酢酸（5-HIAA）と負の相関があり、Bacteroides ASV1つは16週目の血漿セロトニンと負の相関があった。
結論
その結果、幼少期のCMTは、レシピエントニワトリの中枢性セロトニン作動性システムおよびカテコールアミン作動性システムとともに、糞便微生物組成を調節することによって攻撃的行動を制御できることが示された。CMTは、微生物叢-腸-脳軸に沿ったシグナル伝達を制御することで、攻撃的な行動を抑制する新しい戦略である可能性が示唆された。
はじめに
心理学における「攻撃性」とは、社会集団の中で身体的、生理的、心理的な危害をもたらす様々な行動のことを指す。進化的に保存された行動として、攻撃性はヒトからニワトリを含む様々な動物まで、動物界に広く存在します。進化の観点から、攻撃性は生存と繁殖のための重要なスキルとして機能し、動物が資源を確保し、周囲の環境に適応することを可能にします[1]。ニワトリの場合、体格、頭部、付属器、櫛などの視覚的手がかりから過去の出会い（序列または社会的順位）を記憶・認識し、個人に対して確立した戦いを見せることで優位階層を維持する小さな集団の中で自然に生活する野生の祖先（アカジャコウネコ Gallus gallus）に攻撃性の起源をさかのぼることができます［2、3］。しかし、費用便益分析に基づくと、集団内での暴力などの攻撃性や関連する損傷行動は、社会的ストレスを引き起こし、社会の安全を妨げ、支配者と従属者の両方の健康を損なう[4, 5]。現代の集約的な動物生産システムでは、慣れない動物の混合や再グループ化などの日常的な管理方法が、社会構造の安定性を乱し、個体間の攻撃的行動を増加させ、動物の生産、健康、福祉を損なうことがあります[6]。鶏の場合、攻撃性は過剰なストレス、傷害、さらには死亡につながり[7]、養鶏業界にとって大きな経済的損失となる。したがって、攻撃性を制御するアプローチを開発し、それによって鳥の健康を改善し、養鶏産業の経済的利益を増加させることが極めて重要である。
近年、多くの研究が腸内細菌叢と、腸脳軸の機能制御を介した宿主の生理的および心理的健康との関連に焦点を当てている。腸脳軸の存在を示す最初の証拠は、19世紀初頭に研究者が人の感情状態が腸の健康を支配することを発見したときに報告されました [8]。これに対応して、腸内細菌叢は内分泌器官として機能し、神経伝達物質や神経栄養因子の生体機能 [9]、免疫プロセス [10]、エネルギー代謝 [11] を制御することによって、宿主の気分安定と行動展示の両方に影響を及ぼします。ヒトでは、腸内細菌叢の組成の摂動が精神疾患の病態生理に関連している [12]。例えば、うつ病患者は健常者と比較して、バクテロイデーテス属とプロテオバクテリア属の存在量が増加しています [13]。無菌（GF）マウスを用いた微生物叢移植研究により、脳機能の制御における腸内微生物叢の因果関係がさらに明らかになりました。例えば、うつ病患者からの糞便微生物叢移植（FMT）は、GFレシピエントにおいて、セロトニン（5-HT）、ノルエピネフリン（NE）、エピネフリン（EP）などのいくつかの脳神経伝達物質の減少とともに、特有のうつ様行動を誘発する [14]. FMTがドナーの表現型をレシピエントにもたらすという同様の知見は、自閉症[15]、統合失調症[16]、アルツハイマー病[17]などの精神疾患でも証明されており、腸内細菌と脳の間の機能的リンク、すなわち、微生物-腸-脳軸をさらに示しています。これらの知見に基づき、我々は、ニワトリの攻撃的行動の制御においても、腸内細菌叢が同様の機能を示す可能性があると仮定した。
攻撃行動の制御は、主に中枢神経細胞の活動を変化させることによって行われる[18]。攻撃性の5-HT欠乏仮説[19]に基づき、5-HTはこのプロセスに関与する主要な調節神経伝達物質である。ヒトでは、中枢神経系（CNS）内のセロトニン作動性機能の低下は、対人攻撃性や衝動的な行動を含む気分および行動障害と関連しています [20]。同様に、攻撃的なニワトリは通常、視床下部などの特定の脳領域で5-HT濃度が低下していることが知られています[21]。また、5-HTの前駆体であるトリプトファン（TRP）を食事で補給すると、ウズラの恐怖心[22]、ブロイラーの攻撃性[23]、テレスト魚類の攻撃性が低下することが報告されている[24]。
高度近交系鶏63系統と72系統は、それぞれマレーク病に対する抵抗性と感受性を60年以上にわたって選択し続けてきた[25、26]。また、神経内分泌系、免疫 [27, 28]、腸内細菌叢組成 [29]、攻撃的行動 [30] における系統の違いも証明されている。社会的ストレスに応答して、ライン72のニワトリはライン63のニワトリよりも攻撃的である。これらの知見と一致して、ライン72の雄鶏はライン63の雄鶏よりも低いレベルの脳内5-HTを示す[31]。本研究の目的は、攻撃性において脳内セロトニン作動性の媒介が不可欠であることを考慮し、分岐選択されたドナー（ライン63および72）からの早期の食道微生物移植（CMT）が、腸脳軸を介して食道微生物組成および中枢セロトニン作動性システムを調節することにより、レシピエントの攻撃的行動を潜在的に低減するかどうかを調べることである。
研究方法
試験デザインおよび治療法
実験ワークフローを図 1 にまとめる。マレーク病抵抗性または感受性について選択された近交系鶏系統63および72（the Avian Disease and Oncology Laboratory, East Lansing, MI, USA）をドナーとして使用した［25］。60世代の選抜後、1系統あたり60週齢の雌鶏10羽から子宮内容物をランダムに採取し、系統内で均等にプールした。プールした5グラムの黄頸部内容物を1：10の割合で腸内細菌叢培地に懸濁し、経口投与するまで-20℃で保存した［32］。市販の系統である合計84日齢のDekalb XLヒヨコをレシピエントとして使用し、1処理あたり7ケージ、1ケージあたり4羽（n = 7）の3処理のうちの1処理にランダムに割り当てた： CTRL（0.1mLの生理食塩水、コントロール）、63-CMT（0.1mLのライン63セカル内容液）、72-CMT（0.1mLのライン72セカル内容液）を16週間試用した。経口摂取はd1～10まで毎日行い、3週目から5週目までは毎週ブーストした。5週目（ブースト5日後）および16週目にそれぞれ1ケージあたり1羽から血液、視床下部および両側の糞便内容物を採取した。EDTAコートチューブを用いて、サンプリングした各鳥の上腕静脈から5mLの血液サンプルを採取した。血液サンプルを700×gで15分間、4℃で遠心分離し、その後、血漿を分離し、さらなる分析まで-80℃で保存した。次に、サンプリングしたニワトリを、組織収集（すなわち、セカル内容物および視床下部組織）のために頸部脱臼により殺した。視床下部は、以前に記載された脳の解剖学的ランドマークに従って、各サンプルされた鳥から解剖された[33、34]。採取後、食道内容物および視床下部組織は急速冷凍し、分析まで-80℃で保存した。水と飼料は自由摂取させた。ワクチン接種、餌の配合と栄養成分、周囲の温度と湿度、照明プログラムなどの一般的な管理は、デカルブホワイトの管理ガイドライン[35]に従った。
図1
実験デザインの模式図（BioRender.comで作成）。63-CMT：63人のドナーから糞便内容液を受け取った、72-CMT：72人のドナーから糞便内容液を受け取った、CTRL：生理食塩水を受け取った、コントロール
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行動分析学（Behavioral Analysis
ホームケージでの攻撃的行動
頭上カメラ（Panasonic WV-CP254H）に連動したデジタルビデオ録画（DVR）システム（Geovision GV-1480）を用いて、5週目と16週目（n = 5）の24時間、ホームケージ内の鶏の行動を記録しました。記録された映像はEZViewLog500を用いてリアルタイムで閲覧し、点灯1時間後（5時58分）と消灯1時間前（19時58分）から収集した。攻撃的なペッキングは、前述した定義に従って判断した：「1羽が頭を上げ、他の鳥の頭や体にくちばしを1回または複数回、力強く突き刺すこと。受け手は通常、攻撃的なニワトリから身をかがめたり離れたりすることで回避行動を示す」[36]。攻撃的なつつきの頻度は、2時間のビデオセグメントでカウントし、1時間あたりの1羽あたりの平均つつき数として計算した（1時間あたりのケージあたりのつつき数＝つつきの総数/2時間/各ケージ内の鶏の数）。
ペア行動テスト
5週目と16週目に、以前に発表された手順に従い、処理間でペア行動テストを実施した[37]。簡単に説明すると、処理間で同様のBWを有するニワトリを、新規ケージでの攻撃性試験のためのペアにランダムに割り当て（n＝7）、各試験時間におけるニワトリの体重を表1に示した。すべての試験は、試験室において朝の8:00から24:00の間の同じ時間帯に行われ、各ペアは30分間連続記録された。その後、攻撃行動の頻度をカウントし、1ペア1羽あたりの平均攻撃的つつき回数として算出し、統計解析を行った。
表1 ペアテストした鳥の5週目と16週目の体重
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セカール微生物プロファイル
16S rRNAアンプリコンシーケンス
全ゲノムDNAは、QIAamp Fast DNA Stool Mini kit (Catalog #: 51504, Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いて、製造者の説明書に従ってセカールサンプルから抽出した。16S rRNA遺伝子の配列を決定し、レシピエントであるニワトリの腸内微生物群集の多様性と構造に対するCMTの効果を特徴付けるために分析した［38］。簡単に言うと、16S rRNA遺伝子のV4領域は、515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGTAA-3'）及び806R（5'-GACTACHVGGTWTCTAAT-3'）を用いてゲノムDNAから増幅した。各25μLのPCR反応は、9.5μLのPCRグレードの水、12.5μLのQuantaBioのAccuStart II PCR ToughMix（2×濃度、1×最終）、1μLのGolayバーコード付きForward Primer（5μmol/L, 200pmol/L 最終）、1μLのReverse Primer（5μmol/L, 200pmol/L 最終）、および1μL のテンプレートDNAで構成されていました。PCRの条件は以下の通りである： 94℃、3分間でDNAを変性させ、94℃、45秒間、50℃、60秒間、72℃、90秒間で35サイクル、その後72℃、10分間で完全に増幅させる。アンプリコンは、PicoGreen assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて定量化した。その後、1本のチューブに容量をプールし、AMPure XP Beads（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）を用いて洗浄した後、蛍光光度計（Qubit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて定量を行いました。定量後、プールのモル比を決定し、2nmol/Lまで希釈して変性させた後、10%のPhiXスパイクで最終濃度6.75 pmol/Lまで希釈した[39]。アンプリコンは、アルゴンヌ国立研究所（米国イリノイ州シカゴ）で2×150 bpペアエンドリードを用いてIllumina Miseqプラットフォームで配列決定した。
塩基配列の解析
アンプリコンは順方向配列と逆方向配列の両方について各配列の13番目の塩基でトリミングし、QIIME, v2020.2を介してDivisive Amplicon Denoising Algorithm（DADA 2）パイプラインでノイズ除去した。DADAで生成されたアンプリコン配列バリアント（ASV）は、99% Silva v132分類学データベースを参照として分類された（https://data.qiime2.org/2020.2/common/silva-132-99-515-806-nb-classifier）。セカルサンプルは、5週目と16週目にそれぞれ13,580リードと24,907リードに希釈された。α-diversityは、FaithのPD指数で評価した。微生物群集の非類似性を可視化するため、R studio（バージョン3.6.2）のカスタムスクリプトに加えて、Phyloseq、DESeq2、ggplot2パッケージを用いて、非重み付けUniFracに基づく主座標分析（PCoA）のプロットを実施した。治療効果はAdonisを用いて評価し、一対比較は順列多変量分散分析（PERMANOVA）検定を用いて評価した。QIIME 2による多重比較には、偽発見率（FDR）調整P値（q値）を用いた。 R studio（バージョン3.6.2）は、DESeq2パッケージ（バージョン1.30.1）を用いて、門および属レベルの差分豊富ASVに対する治療効果を決定するために行った。log2倍変化の有意差は、Benjamin and Hochberg testを用いたP値補正を伴うWald testで判定した。有意水準は、P < 0.05、LDAスコア > 2の場合に決定した。
脳内セロトニン作動性活性
セロトニン作動性経路に関与する検査遺伝子を表 2 に示した。視床下部サンプルの全RNAは、RNeasy Mini Lipid Kit (Catalog #: 74804, Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いて、同社が提供する説明書に従って抽出した。総RNAの純度および濃度は、NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)を用いて確認した。逆転写は、Reverse Transcription Reagent Pack (Catalog #: N8080234, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて実施した。逆転写試薬の混合物は、2μLのRNase阻害剤、2.5μLのマルチスクライブ逆転写酵素、5μLのランダムヘキサマー、10μLのTaqMan逆転写バッファ、20μLのデオキシ核酸、および22μLの塩化マグネシウムで構成されていた。各サンプルの全混合物は、61.5μLにRNAサンプルの調整された体積とRNaseフリーの水を加えて最終的に100μLにしたものであった。RNAサンプルは、Techne TC-3000G PCR Thermal Cycler (Bibby Scientific Limited, Stone, UK)を用いてcDNAに逆転写された。セロトニン経路の活性に対するCMTの影響を探るために、視床下部組織の左側における関連遺伝子（表2）のmRNA存在量を、以前に記載したプロトコルを用いてRT-qPCRで検出した［40］。ハウスキーピング遺伝子としてGlyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)が使用された。サイクリング条件は、50 ℃で2分間、95 ℃で10分間の保持段階を経て、95 ℃で15秒間、その後60 ℃で1分間のサイクルを40回繰り返した。結果は、標準曲線法を用いて定量した。標準品は3連で測定し、標準偏差は2.0未満、変動係数は2.0％未満であった。
表2 中枢性セロトニン作動性経路に関与する関連遺伝子
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脳内モノアミンプロファイル
レシピエントであるニワトリの中枢性セロトニン作動性活性に対するCMTの影響を調べるために、重複したサンプルを、以前に記述したようにHPLC（UltiMate™ 3000 RSLCnano System, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA）により実行した［41］。簡単に説明すると、視床下部の右側を秤量し、0.2 mol/L 過塩素酸で 10:1 の割合でホモジナイズし、1 分間ボルテックスした。その後、上清を14,000r/minで10分間、4℃で遠心分離した。上清を微量遠心管に採取し、MD-TM移動相（Thermo Fisher Scientific Inc.、Waltham, MA, USA）で1：1で希釈した。移動相の流速は0.8mL/分であった。1回の注入につき10μLでサンプルを重複して実行した。5-ヒドロキシインドール酢酸（5-HIAA）、セロトニン（5-HT）、トリプトファン（TRP）、ノルエピネフリン（NE）、エピネフリン（EP）、ドーパミン（DA）の濃度は、対応する標準から作成した参照曲線により、湿潤組織1グラムあたりのナノグラム（ng/g）として算出した。
末梢のセロトニンとトリプトファン
血漿中の5-HTおよびTRP（My BioSource, San Diego, CA, USA）の濃度は、それぞれのELISAキットを用いて、相対する会社の説明書に従って測定した。簡単に説明すると、50μLのサンプルを100μLのホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート試薬と37℃で60分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄した後、ELISA検出用のクロモゲン溶液AおよびBを50μL、37℃で15分間添加した。その後、停止液（0.25 mol/L H2SO4）を加え、5分以内に450 nmで吸光度をモニターした。
統計解析
固定効果は治療と年齢とした。生理・行動データは応答変数とした。データは、ホームケージでの行動データを除き、SAS 9.4（SAS Institute Inc.、Cary、NC、USA）のPROC MIXED反復測定手順を用いて分析したR studio（バージョン3.6.2）を使用した。ホームケージにおける攻撃的なペッキングの頻度は、解析前にBox-Cox変換を用いて正規化した。ペアテストの行動データは、Kruskal-Wallis検定を用いて分析し、その後、多重比較のためのDunn検定に従った。その他の正規化された生理データは一元配置分散分析で実施し，処理効果による最小二乗平均の有意差を仕切るためにTukey-Kramer検定を用いた［42］．各処理について、有意に差のある豊富なASVと差のある神経伝達物質濃度との相関を見つけるために、スピアマンの順位検定を使用した。有意性はP≦0.05とし、傾向は0.05＜P≦0.1と定義した。
結果
レシピー鶏の攻撃行動の違いについて
72-CMT鶏と比較して、63-CMT鶏は5週目のホームケージ（P = 0.039, 図2A）およびペアテスト（P = 0.040, 図2B）においてより攻撃的なペッキングを示した。16週目には、72-CMT鶏は63-CMT鶏とCTRL鶏の両方と比較して、ペアテストではより攻撃的なペッキングを行う傾向があったが（P = 0.093）、ホームケージでは行わなかった（P = 0.455）。
図2
5週目と16週目のレシピエント鶏の攻撃的なペッキングの頻度。A ホームケージでの行動 B ペアテスト。数値は平均値±SEM、n = 7. *は有意差（P≦0.05）を示し、#は傾向差（0.05＜P≦0.1）を示す。63-CMT、63人のドナーからセカル内容液を受けた、72-CMT、72人のドナーからセカル内容液を受けた、CTRL、生理食塩水を受けた、コントロール
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レシピエント鶏のセカール微生物プロファイルの変化
セカルマイクロバイオタ移植は、レシピエント鶏のセカル微生物の構造と多様性に異なる効果を誘発した（表3および図3）。5週目では、63-CMT鶏の系統的多様性（FaithのPD指数）は治療法の中で最も低く（P = 0.033, 図3A）、16週目では72-CMT鶏よりも低い傾向にあった（P = 0.090）。また、Unweighted UniFracに対する処理効果は、5週目にレシピエント鶏で認められたが（P = 0.005）、16週目には認められなかった（P > 0.05、Fig. 3B）。ポストホックペアワイズ検定の結果、63-CMT鶏と72-CMT鶏の間で微生物群集構造に有意差があった（P = 0.006, Table 3）。門レベルおよび科レベルの群集組成を図3Cに示す。
表3 5週目におけるレシピエント鶏のUnweighted_UniFrac metricに対するセカルマイクロバイオータ移植の影響
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図3
5週目と16週目のレシピエントニワトリのセカール微生物プロファイルに対するセカール微生物移植の影響（n = 7）。A フェイスのPD指数、数値は中央値±SEM、*は有意差（P≦0.05）、#は傾向差（0.05＜P≦0.1）を示す。B 5週目と16週目のレシピエント鶏のUnweighted UniFracの主座標分析（PCoA）。各ドットは1羽（n＝7）を表し、PCo1およびPCo2は、各座標によって説明される分散の割合を表す。C レシピエントニワトリの門および科（相対存在量＞1％）レベルでのセカル微生物組成プロファイル。63-CMT、63人のドナーから黄頸部内容液を受け取った、72-CMT、72人のドナーから黄頸部内容液を受け取った、CTRL、生理食塩水を受け取った、コントロール
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さらに、処理間で差のあるASVを検討した（図4）。5週目において、63-CMT鶏対72-CMT鶏、72-CMT鶏対CTRL鶏、63-CMT鶏対CTRL鶏の間で、差次的に存在するASVの数はそれぞれ38、68、52であった（図4A）。CTRL鶏と比較して、63-CMTレシピエント鶏では、GCA-900066225、Lachnoclostridium、Christensenellaceae R7グループ、Flavonifractor、Ruminococcaceae UCG-014, Faecalibacterium, Alistipes, Fournierella, Ruminococcaceae UCG-005に属する9つのASVが濃縮されていました；一方、72-CMTレシピエント鶏では、Alistipes、Candidatus Arthromitus、Dielma、Merdibacter、Faecalibacterium、Flavonifractor、GCA-900066225、Anaerofilum、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae UCG-005、Ruminococcaceae NK4A214グループおよびLachnoclostridiumに属する12のASVが強化されています。63羽のCMTレシピエント鶏に比べ、Akkermansia、Dielma、Merdibacter、Anaeroplasma、Ruminococcaceae UCG-008, Faecalibacterium, GCA-900066225, Ruminococcaceae UCG-014, CAG-56, Blautiaに属するASV10種類が72羽CMTレシピエント鶏より多く含まれていました。
図4
63-CMTグループとCTRLグループ、63-CMTグループと72-CMTグループ、72-CMTグループとCTRLグループの間で、A5週目およびB16週目において異なる量のASVをDESeq2分析した。各ASVのlog2倍変化値の推定値を計算し、各ポイントは有意差のあったASVを表す（P≦0.05）。63-CMTは63人のドナーからセカル内容液を受けた、72-CMTは72人のドナーからセカル内容液を受けた、CTRLは生理食塩水を受けた、コントロール
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16週目には、63-CMT鶏と72-CMT鶏、72-CMT鶏とCTRL鶏、63-CMT鶏とCTRL鶏の間で、それぞれ30、14、25個の異なるASVが存在した（図4B）。それらのASVはBacteroidetes、Desulfobacterota、Firmicutes、Proteobacteriaの各ファイラに属しています。CTRLニワトリと比較して、63-CMTニワトリでは5つのASV（Alistipes、Clostridia_UCG-014、Incertae_Sedis、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae）がより豊富であり、72-CMTニワトリではBacteroides属とClostridia_UCG-014に属するASV2つが豊富だった。63-CMT鶏と比較して、72-CMT鶏では3つのASV（Bacillus、Escherichia-Shigella、Bacteroides）がより豊富であった。
レシピエントニワトリの脳内モノアミンの変化
頭蓋内細菌叢移植によって、レシピエントであるニワトリの中枢性セロトニン作動性システムのバイオマーカーに生じた変化を図5に示した。5週目に、63-CMTニワトリは視床下部の5-HT（P = 0.037）および5-HIAA（P = 0.007, 図5A）の濃度が高く、セロトニンのターンオーバーについては差が認められなかった（P > 0.05, 図5B）。16週目の5-HTおよび5-HIAAのレベルには治療効果が認められなかったが（図5C）、63-CMT鶏の5-HTターンオーバーはCTRL鶏と比較して上昇した（P = 0.011, 図5D）。さらに、63-CMT鶏は、5週目のCTRL鶏（P = 0.089）および16週目の72-CMT鶏（P = 0.063）と比較して、視床下部におけるTRPの濃度が高い傾向にあった。微生物叢の調節は、ノルアドレナリン系の活性化にも影響を与えた。5週目では、72-CMT鶏はCTRL鶏と比較してNE（P = 0.072、図6A）およびDA濃度（P = 0.031、図6C）が低かったが、63-CMT鶏はそうではなかった。16週目のNE、EP、DA濃度には治療効果はなかった（P＞0.05、図6）。TPH2, Htr1a, Htr1b, 5-HTTの遺伝子発現については、16週目に63-CMT群でMAOA mRNA存在量が増加した以外は、差異は見られなかった（P = 0.024, 表4）。
図5
A-B5週目およびC-D16週目におけるレシピエントニワトリの視床下部におけるセロトニン作動性活動のパラメータに対する食道マイクロバイオータ移植の影響。数値は最小二乗平均値±SEM、n = 7. *は有意差（P≦0.05）、#は傾向差（0.05＜P≦0.1）を示す。5-HIAA、5-Hydroxuindoleacetic acid；5-HT、セロトニン；63-CMT、ライン63のドナーからセカル内容液を受けた；72-CMT、ライン72のドナーからセカル内容液を受けた；CTRL、生理食塩水を受けた、コントロール；TRP、トリプトファン
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図6
5週目および16週目のレシピエントニワトリの視床下部におけるAノルエピネフリン、Bエピネフリン、Cドーパミンのレベルに対する食道マイクロバイオータ移植の影響。数値は最小二乗平均値±SEM、n = 7. *は有意差（P≦0.05）、#は傾向差（0.05＜P≦0.1）を示す。63-CMT、ライン63のドナーからセカル内容液を受けた、72-CMT、ライン72のドナーからセカル内容液を受けた、CTRL、生理食塩水を受けた、コントロール
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表4 5週目および16週目のレシピエントニワトリの視床下部におけるセロトニン経路に関与する遺伝子の相対的mRNA発現に対する食道微生物移植の影響
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血漿中のトリプトファンおよびセロトニンの変化
5週目には、63-CMT鶏はCTRL鶏と比較して血漿中の5-HT濃度が高い傾向にあったが（P = 0.086、図7A）、TRPレベルには治療効果がなかった（P > 0.05、図7B）。16週目には、72-CMTレシピエント鶏は、63-CMT鶏と比較して、血漿中の5-HT（P = 0.033）およびTRP（P = 0.037）のレベルがより高くなりました。
図7
5週目および16週目のレシピエント鶏の血漿A 5-HTおよびB TRP濃度に対する食道マイクロバイオータ移植の効果。数値は最小二乗平均値±SEM、n = 7. *は有意差（P≦0.05）、#は傾向差（0.05＜P≦0.1）を示す。5-HT、セロトニン；63-CMT、ライン63のドナーからセカル内容液を受けた；72-CMT、ライン72のドナーからセカル内容液を受けた；CTRL、生理食塩水を受けた、コントロール；TRP、トリプトファン
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神経伝達物質の量と、存在量の異なるASVの相関関係
5週目では、Lachnospiraceaeに属する2つのASV（r = 0.87および0.67、P = 0.012および0.100、図8A）およびFournierella ASV 1つ（r = 0.98、P < 0.001）が63-CMTレシピエントの鶏の脳TRPと正の相関がありました。また、63-CMTのニワトリでは、1つのRuminococcaceae UCG-005 ASV（r = 0.79, P = 0.036）と脳内5-HTレベルとの間に正の相関がみられた。63-CMTのニワトリでは、16週目に相関は見られなかった（図8B）。72-CMTでは、1つのMollicutes RF39 ASV（r = -0.79, P = 0.035）および1つのGCA-900066225 ASV（r = -0.78, P = 0.039）が、脳の5-HIAAと負の相関があり、1つのCAG-56 ASVが脳のTRP（r = -0。 85、P = 0.015）は5週目に、一方、16週目には、1つのバクテロイデスASV（r = -0.74、P = 0.048）は血漿5-HTと負の相関を示しました。
図8
72-CMTおよび63-CMTのニワトリにおける神経伝達物質（およびその代謝物）濃度と細菌分類（ASV）のA5週目およびB16週目におけるスピアマン相関関係。**はP < 0.001、*は有意差（P ≤ 0.05）、#は傾向差（0.05 < P ≤ 0.1）を表しています。5-HIAA、5-ヒドロキシインドール酢酸；5-HT、セロトニン；63-CMT、63系統のドナーからセカル内容液を受けた；72-CMT、72系統のドナーからセカル内容液を受けた；CTRL、生理食塩水を受けた、コントロール；DA、ドーパミン；EP、エピネフリン； MAOA、モノアミン酸化酵素； NE、ノルエピネフリン； TRP、トリプトファン
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ディスカッション
宿主の生理的・行動的ホメオスタシスの調節に腸内細菌叢が関与していることを強調する証拠が増えつつあり、精神疾患や精神障害患者の治療における腸内細菌叢の潜在的意義が指摘されている [43]. ここでは、非攻撃的なドナーと攻撃的なドナーからのセカルコンテンツの移植が、セカル微生物群集の異なる発達パターンを及ぼし、中枢のセロトニン作動性システムとカテコールアミン作動性システムの活性が、レシピエントの発散する行動表現型に寄与することを発見した、Dekalb XL.
早期の腸内細菌叢の発達は、ヒトの健康や疾病に長期的な影響を及ぼす[44]。ニワトリでも同様の結果が明らかにされている[45, 46]。本研究では、早期のCMTにより、16週間の試験期間中、72-CMT鶏（攻撃性の高い感受性系統）は63-CMT鶏（攻撃性の低い耐性系統）と比較して、系統的多様性が増加することが示されました。これまでの研究で、パーキンソン病[47]や自閉症スペクトラム障害[48]などの精神神経疾患患者は、健常者と比較してα多様性が高いことが示されており、腸内細菌の多様性と神経疾患との間に関連性があることが示唆されました。同様に、ブロイラー鶏において、コクシジウム症のモデルであるEimeriaを接種すると、健康な対照鶏と比較して、腸内微生物の豊かさと全体的な多様性が増加することが知られている[49]。本研究では、72-CMT鶏における高い系統的多様性は、72人のドナーに見られるマレーク病に対する感受性特性と関連していると考えられる。今後、多様性と疾病の関係に関する基礎的なメカニズムを探るための研究が必要である。また、CMTによるβ-多様性への影響は年齢特異的であった。すなわち、5週目にはセカール微生物構造の違いが見られたが、レシピエントが性成熟に近づく16週目（16-17週齢頃）には見られなかった。このことは、幼少期にはCMTが腸内細菌叢の確立に大きな影響を及ぼし、成熟期には宿主の遺伝子型、環境要因、遺伝と環境の相互作用が、レシピエントである鶏の糞便微生物群集の構造にCMTよりも大きな影響を及ぼす可能性を示していると考えられる。
63羽のCMTニワトリでは、Ruminococcaceae UCG-005に属するASVが豊富であり、この属は短鎖脂肪酸（SCFAs）生産者として機能することが報告されており、それによって神経伝達物質（例：5-HT、TRP、DA）の合成や攻撃的行動などに間接的に影響を与える可能性がある [50, 51]. 同様に、反復的な羽つつき行動が多い鶏と少ない鶏のケカには、異なる量のプロピオン酸とn-酪酸が検出された[52]。また、プロピオン酸を投与したラットは、PBSを投与したラット（通常のコントロール）と比較して、異なる社会的行動を示す[53]。また、SCFAを産生するいくつかの細菌は、微生物叢-腸-脳軸の制御を介して、精神科[55]やアルツハイマー病[56]の治療にサイコバイオティクス[54]として使用されている。このように、腸内細菌叢（実際の細菌）は、セロトニン作動性システムに影響を与えることによって、精神的健康を機能的に制御していることを示す可能性がある。裏付けとして、異なるドナーからのCMTがレシピエントニワトリの脳内神経伝達物質のレベルに影響を与えることを発見しました。72-CMTニワトリと比較して、63-CMTニワトリは5週目に5-HTの濃度が高く、16週目に視床下部の5-HTターンオーバー率およびTRPレベルが増加した。ヒトでは、5-HTトランスポーターをブロックすることが、社会的衝動性や攻撃性のある患者に対する効率的な治療法として用いられている[57]。また、Dennisら[58]は、ニワトリの性成熟期において、胚性5-HTの過剰投与が攻撃的・恐怖的行動を修飾することを報告している。我々の知見と同様に、視床下部5-HTレベルの上昇は、ホームケージとペアテストの両方から得られた行動観察を支持した： 63-CMT鶏は72-CMT鶏と比較して、視床下部5-HT濃度が高く、攻撃的なペッキングが少なかった。さらに、5-HTの代謝産物である5-HIAAは、攻撃性と負の相関があると考えられている[59]。興味深いことに、63-CMT鶏は処理群の中でより高い5-HIAAレベルを示し、これはセロトニン作動性活動の上昇（高い5-HIAA/5-HT比）を示していると考えられる。先に述べたように、SCFA生産者であるRuminococcaceae属UCG-005は、腸内のTRP合成に影響を与えることによって、間接的に5-HTレベルを高める可能性があります。また、Fournierella属とLachnospirace属のASVは、63-CMTニワトリの脳内TRPと強い正の相関があることがわかった。トリプトファンは5-HTの前駆体として、特定の腸内細菌株によって制御され、中枢性5-HTの合成に関与することが知られています。したがって、FournierellaとLachnospiraceaeは、トリプトファナーゼ酵素活性やインドール生産能に影響を与えることで、間接的に5-HTレベルに影響を与える可能性があると考えられる[60]。さらに、16週目において、72羽のCMT鶏は63羽のCMT鶏に比べ、Bacillus、Escherichia、Bacteroidesに属するASVが濃縮されていることが判明しました。これらの属は、宿主の炎症を促進する外毒素を産生する日和見病原体として認識されている[61]。鶏では、濃縮されたEscherichiaは常在菌のコロニー形成を阻害し、それによって他の病原体への感受性を高める可能性がある[49]。腸内の病原性細菌にさらされると、ヒトにおいてうつ病様行動を含む行動上の問題が誘発される[62]。Goehlerら[63]はまた、認知に問題を抱える患者が腸内のEscherichiaの過剰増殖を示すことを発見し、これは72-CMT鶏がペアテストにおいてより攻撃性を示す傾向があるという我々の発見と似ている。これらのことから、腸内細菌は視床下部のセロトニン作動性神経伝達を促進することにより、レシピエントニワトリの攻撃的な行動に影響を与える可能性があります。
一般に、5-HT作動性システムの活動は、5-HT合成の律速酵素であるトリプトファン水酸化酵素（TPH）と、5-HTを含むモノアミン生成を触媒する酵素であるモノアミン酸化酵素（MAO）によって調節されている[64]。CMTによる脳内TPH2 mRNAの存在量の変化は観察されなかったが、16週目の63-CMT鶏では脳内MAOA遺伝子の発現量が有意に高く、これは攻撃性が低い傾向と相関している可能性がある。脳内MAOA遺伝子の触媒活性が攻撃性を評価するバイオマーカーとなる可能性が提唱されている[65]。ある臨床研究では、反社会性人格障害者は対照群と比べて脳のMAOAレベルが低く、MAOAレベルと攻撃性の間に逆相関があることが示唆されている[66]。一般に、脳内MAOAのアップレギュレーションは、5-HTのターンオーバーの促進と関連しており、攻撃的な行動の低下を指し示している[67]。興味深いことに、63-CMTの鶏はTRPの濃度と5-HTの回転比が高く、これは腸内細菌がセロトニン代謝の変化を介して攻撃的行動を制御することを示しているのかもしれません。なお、同定されたセロトニン経路は、有害な羽つつきに関与することも以前に報告されている[68,69,70]。
アッケシソウ属はムチン層の分解を促進し、腸管透過性を高めることが報告されており、これによってパーキンソン病などの神経変性疾患の初期発症に重要な役割を果たすと考えられている[71]。McGaugheyら[72]は、Akkermansia属の存在量が不安と鬱の両方の行動指標と正の相関があることを報告しています。さらに、以前の研究では、生きたサルモネラ菌を接種したレイヤータイプの子豚の糞便内容物におけるAkkermansia属の存在量とチロシンレベルとの間に正の相関があることが判明しました[73]。チロシンの増加は、NEレベルに影響を与え、それによって脳機能と行動パターンに影響を与える可能性がある。ノルエピネフリンは、神経調節物質として、成長、ストレス反応、および炎症過程における神経可塑性に関与する複数の経路を介して、神経細胞および非神経細胞の活性を制御する [74, 75] 。NEは血液脳関門を通過して脳内に入ることはできませんが、必須アミノ酸でありNEの前駆体であるチロシンは脳神経細胞に輸送され、脳機能に影響を与えるカテコールアミンの合成に使用される可能性があります[76]。本研究では、より攻撃的なペッキングを示す72-CMTニワトリは、5週目の時点で、処理群の中で最も視床下部NEが低い。ネズミを用いた初期の研究では、ストレスによるNEの増加は、ノルアドレナリン系のネガティブフィードバックを介して攻撃性を示すことによって減衰することが示された[77]。おそらく、72-CMTレシピエントニワトリの濃縮アッカーマンシアASVは、幼少期（5週目）に攻撃性を制御する上で同様の役割を果たす可能性がある。CMTによるドーパミン伝達の変化は、さらにレシピエント鶏で観察され、72-CMT鶏では5週目に視床下部のDA濃度が最も低くなっていることがわかった。攻撃性の制御におけるドーパミンの役割はまだ特定されていないが、Schlüterら[78]は、攻撃的行動と皮質下（主に中脳）のDA合成能の間に負の相関があることを報告した。ドーパミンは報酬系 [79] と中脳辺縁系ドーパミン系 [80] を介して、リスクテイクにおけるストレスへの対処にも関与している。パーキンソン病患者では、危険な決断をする回数が多く、黒質経路のDAレベルが低下している[81]。これらを総合すると、72-CMTニワトリにおけるDAの低下は、腸内細菌がカテコールアミン系と協力して攻撃性を調節する可能性があるという我々の仮説をさらに裏付けるものである。
結論
今回の結果は、幼少期のCMTが、脳のセロトニン作動性システムおよびカテコールアミン作動性システムの活動を制御することを介して、レシピエント鶏の攻撃的行動の発達に影響を与えることを示しています。この結果は、微生物叢-腸-脳軸を介した家禽の攻撃性のメカニズムの理解に新たな知見を与えるものです。これらの結果は、腸内細菌叢を用いた早期介入により攻撃的行動を抑制し、家禽生産の福祉を向上させる戦略の可能性を示唆している。
データおよび資料の入手方法
本研究で使用・分析したデータセットは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。
本研究で生成・分析されたすべてのデータは、この発表論文に含まれています。
略語
5-HIAAです：
5-Hydroxuindoleacetic acid（5-ヒドロキシインドール酢酸
5-HTのこと：
セロトニン
5-HTergicです：
セロトニン作動性
5-HTTのこと：
セロトニントランスポーター
63-CMTです：
63行目のセカール溶液を使用したニワトリ
72-CMTです：
ライン72のセカール溶液を使用したニワトリ
ASVs：
アンプリコン配列バリアント
BW：
体重
CMTのこと：
セカルマイクロバイオタトランスプラント
CNSのこと：
中枢神経系
CTRLを使用：
生理食塩水を投与したニワトリ、コントロール
DA
ドパミン
ELISA
酵素結合免疫吸着法（Enzyme-linked immunosorbent assay
EP
エピネフリン
FMTのことです：
糞便微生物移植法
GF：
ジャームフリー
HPLCのこと：
高速液体クロマトグラフィー（High-performance liquid chromatography
Htr1a：
5-HT 1a受容体
Htr1b：
5-HT 1b受容体
MAOのこと：
モノアミン酸化酵素（Monoamine Oxidase
NE
ノルエピネフリン
SCFAのこと：
短鎖脂肪酸（Short-chain fatty acids
SPFのこと：
特定病原体不使用
TPHのこと：
トリプトファン水酸化酵素
TRPのこと：
トリプトファン
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謝辞
サンプル処理の技術的な支援をしてくれたCarmen L. Wickwareに心から感謝する。また、このプロジェクトに協力してくれたPurdue Poultry Animal Sciences Research Centerの農場スタッフ、USDA-ARS, Livestock Behavior Research Unitの技術者にも感謝します。
資金提供
本研究は、米国農務省NIFA-AFRIの助成金交付（No：2017-67015-26567）の支援を受けた。
著者情報
著者と所属
パデュー大学動物科学部（47907, IN, West Lafayette, USA
傅越智、胡嘉盈、マリサ・A・エラスムス、ティモシー・A・ジョンソン、成亨偉
鳥類疾病・腫瘍研究所（USDA-ARS、ミシガン州イーストランシング、48823、米国
張煥敏
家畜行動研究ユニット、USDA-ARS、ウエストラファイエット、IN、47907、USA
成亨偉（チェン・ヘンウェイ
貢献度
YF、JH、TAJ、HCが研究をデザインした。YFとJHは動物実験を行った。YFはデータの解析と解釈を行った。TAJは、配列解析において重要な指導を行った。YFとHCは原稿を執筆した。EAM、HZ、TAJ、HCは原稿を修正した。すべての著者がこの原稿を読み、公開版に同意した。
対応する著者
Timothy A. JohnsonまたはHengwei Chengに対応する。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
すべての手順は、Purdue University Animal Care and Use Committee (PACUC#: 1712001657)の承認を得ています。
出版に関する同意
該当事項はありません。
競合する利益
著者は、競合する利害関係がないことを宣言する。
権利と許可
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記がない限り、この記事で利用可能になったデータにも適用されます。
転載と許可
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Fu, Y., Hu, J., Erasmus, M.A. et al. セカル微生物叢移植：多様に選択された近交系ドナーラインのセカル微生物叢が、レシピエントニワトリのセカル微生物プロファイル、セロトニン作動性、攻撃的挙動に与える独自の影響. J Animal Sci Biotechnol 14, 66 (2023). https://doi.org/10.1186/s40104-023-00866-9
引用元：ダウンロード
2022年11月15日受理
2023年3月09日受理
2023年5月02日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s40104-023-00866-9
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キーワード
アグレッシブな行動
胸腔内細菌叢移植術
チキン
微生物叢-腸-脳軸
セロトニン作動性
動物科学・生物工学ジャーナル
ISSN: 2049-1891
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