糞便微生物叢移植は、再発性Clostridioides difficile患者において、大腸IL-25を増加させ、組織炎症を弱める。

2021年10月27日
糞便微生物叢移植は、再発性Clostridioides difficile患者において、大腸IL-25を増加させ、組織炎症を弱める。

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mSphere.00669-21

著者紹介 N. Jan https://orcid.org/0000-0001-7197-891X, R. A. Hays, D. N. Oakland, P. Kumar, G. Ramakrishnan, B. W. Behm, W. A. Petri Jr. https://orcid.org/0000-0002-7268-1218, C. Marie https://orcid.org/0000-0001-8193-2771 csm8r@virginia.eduAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mSphere.00669-21
PDF/EPUB
mSphere
第6巻 第5号
2021年10月27日
ABSTRACT
序論
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
ABSTRACT
Clostridioides difficile感染症（CDI）は、米国で最も一般的な院内感染症である。抗生物質による腸内細菌叢の異常が感受性の主な原因であり、便中細菌叢移植（FMT）が再発に対する有効な治療法として浮上してきた。我々は以前、CDIモデルマウスにおいて、抗生物質による腸内細菌叢の異常がインターロイキン25（IL-25）の発現を低下させ、FMTがIL-25シグナルを回復させることで一部保護することを証明した。今回、我々はヒトにおいて、FMTが再発性CDI（rCDI）患者の大腸でIL-25発現を誘導するかどうかを調べるために前向き研究を実施した。FMT実施時および60日後に大腸生検標本と血液を採取した。大腸生検検体は、FMT前後のIL-25タンパク質レベル、全組織トランスクリプトーム、上皮関連微生物叢について解析し、末梢免疫細胞は免疫表現型分析を行った。FMTは、大腸内細菌叢のα多様性と大腸組織中のIL-25レベルを増加させた。さらに、FMTは、恒常性維持遺伝子の発現を増加させ、炎症性遺伝子を抑制した。最後に、循環しているTh17細胞は、FMT後に減少した。炎症の抑制に伴うサイトカインIL-25レベルの上昇は、FMTが2型免疫の常在活性化の回復を介してCDIの再発を防ぐために一部作用していることと一致する。
重要性 糞便微生物叢移植（FMT）は、ほとんどの患者にとって C. difficile 感染症に対する有効な治療法です。しかし、複雑な混合微生物を導入することは、一部の患者にとって意図しない結果をもたらすこともあります。FMTの効果を再現する標準的なプロバイオティクス治療薬を作ろうとする試みは、これまで成功していません。我々は、C. difficile 感染症の再発を治療するために FMT を受けた患者において、どのような免疫マーカーが変化するかを理解しようと努め、FMT によって回復した免疫シグナル伝達分子 IL-25 を特定しました。この知見は、IL-25による補助療法がC. difficile感染症の治療に有用である可能性を示している。
イントロダクション
Clostridioides difficileは、生命を脅かす下痢や大腸炎を引き起こす可能性のある日和見病原体である。C. difficile感染症（CDI）の初期治療は、通常、バンコマイシンやフィダクソミシンなどの抗生物質で行われます（1）。初発CDIに対する標準的な抗生物質治療の有効性は58～78％で、初回再発後は大幅に減少します（2）。約20〜30％の患者が、治療終了後2週間以内に再発性CDI（rCDI）を発症します（3）。最近のメタアナリシスでは、FMTの総合的な有効性は76.1％であり、rCDIとは対照的に難治性CDI患者に対する有効性は低い（63.9％対79％）ことが分かっています（4）。
rCDI治療におけるFMTの使用は増加していますが、FMTの作用機序は十分に解明されていません。FMTは、ニッチ排除、栄養競合、抗菌ペプチドの産生を介してC. difficileに直接的な抑制効果を及ぼすと仮定されています（5-7）。また、FMTは、粘液層の強化、腸管上皮細胞の分化・増殖を通じて、宿主の腸管上皮に疾患の再発に対する抵抗力を高める変化を誘発する可能性がある（8）。
FMTのメカニズムが不明である理由の1つは、宿主の免疫応答が大きく変化し、C. difficile感染症の重症度やFMTの効果に複雑な影響を与えることです（9-12）。1型自然リンパ球（ILC1s）を介した1型反応は保護的であることが示されており（13）、17型免疫反応は宿主のダメージ増加に関係し、ILC2sを介した2型免疫反応は好酸球の動員を介して組織の修復に関係している（14、15）。したがって、rCDIの治療法としてのFMTの背後にあるメカニズムを分析する際には、患者の多様性と微生物叢と宿主免疫反応の相互作用を考慮することが重要である。
我々は、FMTが腸管上皮産生サイトカインIL-25を介して自然免疫系に常在菌-細菌シグナルを回復させることにより、部分的にrCDIから保護するように作用すると仮定した。この仮説を検証するため、FMTを受けたrCDI患者を臨床試験に前向きに登録し、FMTの前後で大腸生検標本と末梢血液を採取した。目的は、FMTによって誘導される局所および末梢の免疫応答を解析することであった。大腸生検検体は、RNA配列決定によるFMTに対する腸管上皮の転写反応と、サイトカインの免疫測定法によるタンパク質レベルの反応を評価するために使用された。腸管および末梢の免疫細胞集団は、高次元フローサイトメトリーで解析した。さらに、大腸生検標本から16S rRNA遺伝子配列決定により宿主上皮関連細菌を同定した。
結果
参加者
rCDI感染症の治療のためにFMTを受けた患者10名を募集した。このうち90％はFMT前に少なくとも2回のrCDI再発を経験していた。10名のうち6名は両日とも受診したが、4名はFMT後60日のフォローアップ受診に来なかった。FMT後の60日間のフォローアップ期間において、すべての患者のCDI再発および入院はゼロであった。さらに、FMTは少なくとも2年間、さらなるCDIの再発を防止した。しかし、すべての患者が下痢がなくCDI検査も陰性で臨床的に治癒したが、両方の受診を完了した6人のうち、2人はRome IV基準（16）で定義された感染後過敏性腸症候群（IBS）と一致する症状が持続していた。2回目の受診を完了した6名は女性であった。臨床的特徴を表1にまとめた。
表1
表 1 C. difficile 感染症の再発に対して FMT 治療を受けた患者の人口統計学的特徴とベースラインの臨床データ
臨床的特徴 コホートにおける値
合計（n = 10） 2 回目の受診を伴う（n = 6）
60 (6/10) 100 (6/6)
FMT時の平均（SD）年齢、年 71 (7.71)a 69.83 (8.70)
女性 90 (9/10) 100 (6/6)
FMT時のBMIの平均値（SD） 31.76 (8.91)a 28.79 (8.68)
FMT前の患者あたりのCDI再発の平均数（SD） 3.1 (0.60) 3.2 (0.75)
再発した患者数/総患者数
    2 10 (1/10) 17 (1/6)
    3 70 (7/10) 50 (3/6)
    4 20 (2/10) 33 (2/6)
FMTの前にバンコマイシンを投与した割合 100 (10/10) 100 (6/6)
FMT後にIBS様症状を呈した者 20名（2/10） 33.3名（2/6)
FMT後にCDIが再発した者 0名（0/10） 0名（0/6） %（％）（名/総数
他の被験者と同じFMTドナーを使用した場合の割合 40 (4/10) 50 (3/6)
他の被験者と同じ FMT ドナーがいなかった %（人数/合計） 60 (6/10) 50 (3/6)
a
1 名の患者についてデータが欠落している。
FMTは大腸の2型サイトカインを増加させた。
FMTに伴う免疫細胞シグナルの変化を評価するために、大腸生検組織溶解液中の47種類の細胞シグナルタンパク質を測定した（補足資料の表S1参照）。インターロイキン25（IL-25）とIL-4サイトカインは、好酸球の動員や2型免疫反応に関連しており、FMTによって回復すると事前に予想されたため、特に興味を引かれた（15）。さらに、インフラマソームの活性化はC. difficile感染症の病因の中心であることが示されており、IL-1は以前の研究で特に特定されていたため（17）、IL-1aとIL-1bも試験結果における分析のために先験的に選択された。
補足資料
TABLE S1
LuminexアッセイによるFMT前と後のタンパク質濃度（Benjamini-Hochberg調整による患者別の線形混合コントロール）。表S1、DOCファイル、0.08 MBをダウンロードする。
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IL-1a、IL-1b、IL-25のタンパク質濃度がFMT後に有意に増加し（線形混合効果モデル、P < 0.05）、FMT後にIL-4濃度が増加する傾向があることがわかった（P = 0.058） (Fig. 1)．IBS様症状を発症した2名の患者を取り出すと、IL-1aとIL-1bの増加はもはや有意ではなく（それぞれP＞0.1、P＞0.05）、IL-4の増加はやはり有意ではない（P＞0.1）、一方でIL-25の増加は依然として有意であり（P＜0.05）、IBS様症状が特定のサイトカイン濃度に影響を与えていることが示唆される結果となりました。
図1

図1 FMTは大腸のTh2サイトカインレベルを上昇させた。組織サイトカインのレベルはLuminex assayによって定量された。FMT前後の組織サイトカインの中央値および四分位範囲（IQR）が示されている。患者をランダム変数とした線形混合効果モデルが、P値の算出に使用された統計検定である。Luminexアッセイに使用したサンプルでは、FMT前後で総タンパク質濃度に有意差はなかった（データは示さず）。各サンプルの総タンパク質濃度で正規化しても、同様の結果が得られた（Fig.S1）。標準曲線範囲外のMFIは外挿した（四角）。
補足資料
図S1
総タンパク質濃度で規格化すると、IL-25はやはりFMT後に増加することが示された。関心のある4つのサイトカインのうち、IL-25だけがFMT後に有意に増加した（線形混合効果モデル、P < 0.01）。FMT後にIBS様症状を呈した2名の患者を除外しても、この増加は有意であることがわかった（P < 0.05）。図S1、TIFファイル、0.5 MBをダウンロードする。
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パラレル・トランスクリプトーム解析では、IL-25転写物を同定できなかったが、FMTはIL1a（log2 fold change [log2FC] = 0.83）およびIL1b（log2FC = 0.47）の発現を適度に増加させていたが、これらの増加は有意ではなく（図S2AおよびB）、これらのサイトカイン遺伝子はいずれも分化発現遺伝子として同定されていない。IL-1阻害剤IL1RA（IL1RNによってコードされる；log2FC＝0.83）の転写レベルの増加がFMT後に見られた（図S2C）。IL1A転写物はIL-1aタンパク質レベルと負の相関があり（r < -0.6）、一方IL1B転写物はIL-1bタンパク質レベルと正の相関があった（r > 0.6）（図S2D）。IL1RN転写物は、IL1RAタンパク質濃度と正の相関があった（r＞0.7）（図S2D）。
補足資料
図S2
異なる分析間の相関は、遺伝子転写、タンパク質濃度、および上皮内微生物の存在量の間にいくつかの関係を示している。FMTの前から後まで、IL1A（A）、IL1B（B）、およびIL1RN（C）転写の中程度の誘導があり、これらの増加は有意ではなかった（P > 0.1、Wald検定）。3つの遺伝子すべてについて、FMTに対する転写反応は患者ごとに変化した。IL1Aの転写については、一部の患者では、FMT前からFMT後までほとんど変化がないか（患者3）、減少していた（患者6）。IL1Bの転写については、患者10が転写の減少を示し、患者5と7は転写にほとんど変化がなかった。IL1RN の転写については、患者 5 と 10 が転写の減少を示した。IL1A遺伝子の転写はIL-1aタンパク質濃度と負の相関を示したが、IL1BとIL1RN遺伝子については、それぞれのタンパク質と正の相関を示した。Akkermansia属は胆汁分泌経路遺伝子と正の相関を示し（E）、IL-25タンパク質濃度と負の相関を示した（F）。図S2、TIFファイル、0.5 MBをダウンロードする。
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FMTに対する転写反応
大腸組織における転写反応を評価するために、FMT直前に得られた大腸生検標本とFMT60日後に得られた標本における遺伝子発現を比較した。トランスクリプトームシーケンス（RNA-seq）から得られた正規化遺伝子数の主成分分析（PCA）を行い、訪問先、患者、FMT後のIBS様症状の発現による教師なしグループ分けを検討した（図2A）。主成分2（PC2）はサンプルをFMT前とFMT後のグループに分け、PC1はFMT後にIBS様症状を発症した患者に関連したものであった。PC1特有のネガティブローディングは、OLFM4によってもたらされた（Fig.2B）。OLFM4は、大腸上皮における炎症の選択的マーカーであるオルファクトメジン-4をコードしている（18）。最大のポジティブローディングであるLYZはリゾチームをコードしており、IBS患者では健常対照者に比べて発現レベルが低いことが以前から判明している（19）。PC2を特異的に駆動するトップローディングは、ST6GAL2（ネガティブ）とHLA-DRB5（ポジティブ）であった。ST6GAL2はシアル酸転移酵素をコードしている。特に消化器系に関連して、シアル酸の異化は腸の炎症や微生物の異常増殖に関係していることが示されている（20-22）が、ST6GAL2の具体的な役割はまだ確立されていない。HLA-DRB5は、免疫細胞の抗原提示に特異的なHLAクラスIIタンパク質をコードしており、潰瘍性大腸炎に関連している(23)。PC1とPC2の負荷量には、MTRNR2L12、MTRNR2L8、MTRNR2L2の3遺伝子が重複しており、これらは細胞保護作用があるとされているミトコンドリアペプチドのヒューマニンのアイソフォームをコードしている(24)。
図2

図2 FMTによる大腸トランスクリプトームの変動。(A）遺伝子発現データの主成分分析により、FMT前（赤）とFMT後（緑）のサンプル間の分離が確認された。2つの異なるバッチから得られたFMT前の患者3（P03）サンプルがいかに密接にグループ化されているかに示されるように、バッチの影響は最小限であった。PC1は、FMT後のIBS様症状の発現に起因する分散を捉えており、患者2（P02）と5（P05）はPC1のマイナス側にクラスター化した。PC2はFMTに関連する分散を捉えており、各患者は一貫してFMT前にPC2値が高く、FMT後にPC2値が低くなっていた。(B）PC1の負荷はOLFM4（陽性）とLYZ（陰性）、PC2の負荷はHLA-DRB5（陽性）とST6GAL2（陰性）で駆動されることがわかった。(C) FMT後の差次的発現遺伝子のボルケーノプロット。オレンジ色はlog2FC値≧1、FDR≦0.1という閾値を満たした遺伝子を示す（Wald検定、Benjamini-Hochberg調整）。ホメオボックス遺伝子、ラミニン、免疫反応に関連する遺伝子など、本文中で言及された遺伝子はここでラベル付けされている。(D）胆汁酸に関連するFMT前からFMT後までのオーバーレイされたパスウェイは、重複する遺伝子を有していた。FMT前後のDEGのFCを用い、KEGG遺伝子リストを用いてオーバーレイプレゼントパスウェイを見出した（enrichment score test, Benjamini-Hochberg adjustment）。(E）パスウェイのオーバーラップをマッピングし、共通するテーマを見出した。
また、FMTの前後で最も変動が大きい30個の遺伝子について、階層的クラスタリングを行った（図S3）。デンドログラムは、FMT後にIBS様症状を発症した患者を含まないグループ（Fig. S3、右）と、IBS様症状を発症した2人の患者を含むグループ（左）の間で最初に分岐した。IBS様症状なし群については、FMT前とFMT後のサンプルを分けてから、患者ごとに分割するのが第2階層であった。IBS様症状を発症した患者のサンプルを含むグループは、その後、FMT前とFMT後に分割する前に、患者別に分割した。FMT後にIBS様症状を発症した2人の患者はクラスタリングされなかったことから、同様のIBS様症状を持つ患者であっても、患者固有の転写反応は異なることが示唆された。
補足資料
図S3
RNA-seq回数の標準偏差による上位30個の変動遺伝子の階層的クラスタリングは、FMT後にIBS様症状を発症した患者とそうでない患者との間にある程度の分離を示す。プロットの上部付近の色のついたボックスは、訪問先（FMT前は紫、FMT後は緑）、患者ID、FMT後にIBS様症状を発症したかどうか（IBS様症状なしはオレンジ、IBS様症状発症はピンク）、その下はゼロ付近でスケールした正規化カウントのヒートマップで、カウントが低いものは青、高いものは赤で示されています。最初のレベルの階層的クラスタリングでは、サンプルは、FMT後にIBS様症状を発症しなかった患者からの5つのサンプルからなるグループと、FMT後にIBS様症状を発症した患者からのすべてのサンプルを含む別のグループに分離された。図S3、TIFファイル、0.7 MBをダウンロードする。
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FMTは組織修復の転写プログラムを誘導し、炎症反応を抑制する。
FMT前後の全患者を比較するグループ化モデルを用いて、FMT前後の差次的発現遺伝子（DEG）を解析しました。PCA（図2A）および階層的クラスタリング（図S2）の教師なし解析に基づき、患者IDをモデルに組み込んで患者間のばらつきを考慮した。合計103のDEGが同定され（log2FC ≥ 1; 誤検出率[FDR] ≤ 0.1）、そのうち62はFMTによって誘導され、41は抑制された（Fig. 2C）。誘導される顕著な遺伝子としては、ホメオボックス遺伝子（EVX2、HOXD10、HOXD12、HOXD13）、ラミニン遺伝子（LAMC2、LAMA3）などがある（表2）。ホメオボックス遺伝子は腸管上皮の発生と分化に関係することが示されており（25, 26）、ラミニンは潰瘍性大腸炎で欠損することが示されている基底膜の構成成分である（27）。抑制される遺伝子としては、HLA-DRB5、CCL11、SLC9A3などが注目される（表2）。HLA-DRB5はCD4 T細胞への抗原提示に関与するクラスII対立遺伝子であり、上記のPCAではFMTの前後を分ける成分に正の負荷がかかっているように見える。CCL11は、eotaxin-1遺伝子としても知られ、炎症性で好酸球の走化性に関与している（図2C）(28)。SLC9A3は胆汁酸の排泄と下痢に関係する（29）。
表2
TABLE 2 FMT前後の差分発現遺伝子をFDRの増加でソート（Benjamini-Hochberg法で調整したWald検定）。
遺伝子 P値 FDR Log2FC
FMTにより誘導された遺伝子
    evx2 2.00e-03 7.67e-02 6.55
    HOXD12 2.38E-04 1.81E-02 6.28
    HOXD13 1.80E-07 1.02E-04 5.37
    or51e2 1.16e-04 1.11e-02 4.35
    cpb1 1.06e-04 1.04e-02 3.91
    ST6GAL2 6.80E-18 3.28E-14 3.67
    HOXD10 1.71E-03 6.95E-02 3.16
    PRSS22 3.08E-03 9.95E-02 2.99
    MUCH5AC 1.72E-03 7.00E-02 2.81
    mmp3 2.21e-06 6.53e-04 2.60
    TNNC1 4.48E-04 2.75E-02 2.27
    インスル5 8.42E-04 4.38E-02 2.17
    KIAA1549L 2.62E-04 1.95E-02 2.13
    セルピンB5 1.76E-18 1.28E-14 2.08
    SLC6A14 4.57E-04 2.78E-02 2.05
    トリム29 7.80e-09 5.89e-06 1.89
    パッパ2 6.11E-09 4.92E-06 1.88
    spink4 5.79e-04 3.30e-02 1.85
    palm2 1.20e-03 5.60e-02 1.81
    reg4 1.66e-04 1.43e-02 1.79
    caln1 6.89e-04 3.72e-02 1.78
    CLGN 6.73E-07 2.97E-04 1.74
    KIF5C 3.22E-07 1.56E-04 1.70
    mmp1 7.24e-05 8.13e-03 1.67
    leprel1 7.38e-13 1.78e-09 1.59
    tfpi2 1.87e-04 1.52e-02 1.56
    agtr1 5.01e-04 2.98e-02 1.56
    mybpc1 2.37e-03 8.46e-02 1.55
    Me1 2.35e-04 1.81e-02 1.55
    TM4SF1 9.97E-10 1.20E-06 1.52
    IRX2 8.90E-04 4.56E-02 1.52
    S100P 4.65E-04 2.81E-02 1.46
    tslp 1.68e-03 6.89e-02 1.45
    ccdc85a 1.92e-03 7.49e-02 1.42
    LYPD6B 3.94E-04 2.56E-02 1.41
    SST 2.37E-04 1.81E-02 1.39
    Pllp 2.96E-06 7.84E-04 1.37
    ラマ3 4.63e-12 7.46e-09 1.33
    オスル1 5.00e-05 6.41e-03 1.33
    フィブクド1 2.96e-03 9.73e-02 1.31
    fam135b 1.98e-05 3.22e-03 1.30
    MME 2.69E-07 1.39E-04 1.28
    SLC6A12 1.34E-06 4.32E-04 1.27
    EREG 1.28E-06 4.23E-04 1.25
    CTSL2 7.56E-05 8.43E-03 1.24
    mlf1 3.48e-05 4.80e-03 1.23
    LAMC2 5.03E-31 7.29E-27 1.22
    Cyp2w1 2.40E-03 8.52E-02 1.20
    TNFRSF12A 2.43E-05 3.67E-03 1.20
    CTSE 9.68E-06 1.89E-03 1.17
    RBM24 7.62E-04 4.05E-02 1.16
    GDF15 1.69E-04 1.43E-02 1.15
    SULT1C2 5.85E-05 7.11E-03 1.13
    SCEL 1.90E-03 7.46E-02 1.12
    ROD 8.83E-06 1.83E-03 1.11
    BMP7 3.44E-08 2.17E-05 1.10
    GCG 1.92E-06 5.93E-04 1.06
    RFX6 1.36E-03 6.03E-02 1.06
    col2a1 2.67e-03 9.20e-02 1.02
    Spink5 1.58e-05 2.69e-03 1.02
    TDrd6 2.30E-03 8.28E-02 1.01
    SH3TC2 1.78E-04 1.48E-02 1.00

FMTで抑制される遺伝子
    PRHOXNB 3.36E-05 4.69E-03 -3.66
    hsd3b2 1.53e-14 5.55e-11 -2.60
    col6a5 4.24e-04 2.70e-02 -2.27
    CLC 1.62E-05 2.72E-03 -2.13
    KCNG1 1.13E-03 5.43E-02 -1.92
    クレブ3L3 8.31E-06 1.77E-03 -1.88
    SLC9A3 2.50E-04 1.90E-02 -1.81
    SH2D6 4.73E-05 6.23E-03 -1.80
    PLA2G12B 1.57E-05 2.69E-03 -1.80
    NR1H4 1.08E-04 1.04E-02 -1.78
    VEPH1 2.14E-08 1.41E-05 -1.75
    SH2D7 9.90E-06 1.89E-03 -1.66
    POU2F3 9.72E-05 9.93E-03 -1.64
    ttbk1 6.68E-04 3.63E-02 -1.58
    C11orf53 6.91E-04 3.72E-02 -1.57
    SLC6A19 6.24E-05 7.29E-03 -1.50
    ネト2 6.06E-06 1.42E-03 -1.47
    BMX 5.20E-04 3.06E-02 -1.39
    TM4SF20 5.73E-05 7.11E-03 -1.36
    mgam 8.49e-07 3.42e-04 -1.35
    adc 6.36e-11 8.38e-08 -1.34
    PLIN1 3.02E-03 9.86E-02 -1.26
    ccl11 2.98e-06 7.84e-04 -1.25
    agbl2 3.67e-04 2.46e-02 -1.25
    OGDHL 1.44E-03 6.29E-02 -1.23
    RP11-1220K2.2 2.67E-07 1.39E-04 -1.23
    SLC3A1 6.40E-05 7.42E-03 -1.19
    HLA-DRB5 1.79E-12 3.66E-09 -1.19
    KCNG3 2.54E-04 1.92E-02 -1.18
    C11orf93 2.18E-05 3.42E-03 -1.18
    リップク 4.44E-04 2.74E-02 -1.15
    プレクサス1 4.39E-04 2.74E-02 -1.15
    scube2 1.25e-04 1.19e-02 -1.15
    グラムド2 6.57e-04 3.61e-02 -1.14
    ROS1 6.49E-04 3.61E-02 -1.14
    TMEM63C 7.75E-06 1.71E-03 -1.13
    KIAA1324L 9.14E-06 1.87E-03 -1.11
    SLC52A1 9.49E-05 9.80E-03 -1.10
    EYA2 1.49E-04 1.34E-02 -1.07
    BMP3 2.09E-05 3.32E-03 -1.07
    MOCS1 3.45E-06 8.94E-04 -1.02
FMTは胆汁酸分泌と嗅覚の伝達経路を抑制する。
FMTによる遺伝子発現の機能的差異を明らかにするため、FMT前後のDEGを解析し、過剰発現している経路を調べた。このモデルは、全患者に共通する有意な遺伝子発現の違いを代表しているため、患者の違いを制御するグループ化モデルからのDEGを使用した。遺伝子セットの濃縮解析は、KEGGヒト経路データベース(30)で解析された。合計7つのパスウェイが、FMT後に抑制された遺伝子の中で有意に過剰発現した（FDR < 0.1）(Fig.2D)。この7つのパスウェイのうち6つは、機能的に重複していることが確認された（図2E）。重複するパスウェイは、（遺伝子セットのサイズが小さい順に）胆汁分泌、シトクロムP450による異種生物代謝、化学発がん-DNA付加体、薬剤代謝-シトクロムP450、ステロイドホルモン生合成、ペントースおよびグルクロン酸相互変換であった。胆汁分泌とシトクロムP450は、酸化ストレス、毒素の除去、薬物処理に関連している（31, 32）。胆汁分泌は、シトクロムP450のようなモノオキシゲナーゼによって直接制御されることもある(32)。これらの経路の抑制は、FMTの前に外来侵入者や活性酸素の蓄積に対して転写反応が高まり、FMTの後に恒常性へ戻ることを示す。これらの重複経路のうち、胆汁分泌経路（FDR = 0.074; enrichment score = -0.65）と嗅覚伝達経路（FDR = 0.035; enrichment score = -0.74）は、他の重複経路と機能的にリンクしていない経路であることが判明した。二次胆汁酸はC. difficileの細胞分裂を阻害することが示されている(33)。嗅覚受容体は消化管全体に存在し、腸内細菌叢によって調節されることが以前示された(34)。嗅覚受容体の活性化は、細胞増殖およびアポトーシスの抑制に関連している(35)。
末梢のTh17サブセットは、FMT後に減少する。
全組織RNA-seq解析を補完するために、高次元フローサイトメトリーにより、FMT前後の大腸生検標本および血液中の免疫細胞サブセットのプロファイリングが行われた。大腸生検検体から固有層単核細胞（LPMC）を、静脈血検体から末梢血単核細胞（PBMC）を分離した。LPMCとPBMCサンプルの細胞集団を可視化するためにt-distributed stochastic neighbor embedding（t-SNE）プロットを使用したが、FMT前後に固有の免疫細胞サブセットは明らかにならなかった（図S4）。興味のある特定のサブセットが様々な割合で互いに重なり合って現れ、t-SNEは細胞の相対数の違いを考慮しないため、統計解析ではFMT前後のクラスターを比較することができなかった。そこで、従来のゲーティングを用いて、関心のあるサブセットにおける差異を検証した。これは、FMT後の末梢Th17（CD3+ CD19/CD20- CD4+ RORyt+）の有意な減少（P = 0.05; 患者をランダム変数とした線形混合効果モデル）を明らかにした（図3L）；同様の傾向がLPMCにも見られたが、これは統計的有意性に達しなかった(図3E)。この増加にもかかわらず、LPMCsまたはPBMCにおけるTh1/Th2またはTh17/Treg比に統計的に有意な差はなかった（データ示さず）。
図3

図3 FMT後、末梢のTh17細胞は減少した（P < 0.05）。LPMCs（A～G）およびPBMCs（H～N）から様々なT細胞サブセットを定量化した。末梢のTh17細胞の減少は、FMT前後でほぼ同数のTh17細胞を有していた患者7を除くすべての患者で観察された（L）。末梢のTh1細胞（J）および細胞傷害性T細胞（CTL）（N）の数は、FMT後に減少したが、これらの減少は統計的に有意ではなかった。FMT前後の生存CD45+細胞数に有意差はなく、FMT後にIBS様症状を発症した患者とそうでない患者の間でTh17細胞に有意差はなかった（P > 0.1）。P値の算出には、患者をランダム変数とした線形混合効果モデルを使用した。
補足資料
図S4
t-SNEのグループ分けでは、LPMCsとPBMCの両方において、FMT前または後に特有の免疫細胞集団は示さなかった。FMT前後に特有の免疫細胞集団を強調するために、FMT前後で別々に分析を行い、ここでは異なる色で可視化した。各免疫細胞サブセット内のグループ分けを示すために、等高線マップを使用した。FMT前後で配色とグループの大きさはほぼ同じであり、FMT前後で免疫細胞集団に明らかな違いはないことが示された。図S4、TIFファイル、0.9 MBをダウンロードする。
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FMTは微生物の多様性を増加させた。
FMTによる微生物集団の局所的な変化を評価するため、生検試料から分離したDNAを用いて16S rRNA遺伝子配列決定を行った。生検標本を用いることで、消化管内腔とは異なり、大腸上皮と密接に関連した粘膜微生物集団を調査することができます。その結果、α多様性指標であるShannon指数とSimpson指数がFMT後に有意に増加し（Mann-Whitney、P < 0.01）（図4AおよびB）、rCDIに対するFMT治療後の多様性変化に関する他の研究（36、37）と一致することが分かりました。ベータ多様性指標については、主座標分析（PCoA）プロットでFMT前後のサンプルの明確なグループ分けが明らかになった（Fig.4C）。PCoA軸1は分散の26.4％を説明し、軸2は16.9％を説明し、FMTの状態によって患者を分けた（順列型多変量分散分析[PERMANOVA]、α=0.01）。FMT後にIBS様症状を発症した患者は、PCoA分析では区別がつかなかった。
図4

図4 FMTは、上皮関連マイクロバイオームのα多様性を増加させた。シャノン（A）およびシンプソン（B）のアルファ多様性測定の増加は、分析した5人の患者のうち4人で観察された（P < 0.01, Mann-Whitney test）。患者2（P02）は、FMT後の多様性に変化が見られず、FMT後にIBS様症状を発症した。(C) PCoAプロットは、FMT前後の微生物叢集団の相対的存在度の分離を示す。この分離は統計的に有意であった（P < 0.01, PERMANOVA）。FMT前後で重なる点は、FMT後にIBS様の症状を呈した患者（P5）のものであった。
全サンプルで最も豊富な上位20個のアンプリコン配列バリアント（ASV）を分類情報ごとにグループ化し、ランク付けした。最も豊富なASVでは、多い順にEnterobacteriaceae, Akkermansiaceae, Bacteroidaceae, Clostridiaceae, Acidaminococcaceae, Rikenellaceae, Fusobacteriaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Campylobacteraceaeが上位を占めた。ASVの上位属は、多い順にEscherichia/Shigella、Akkermansia、Bacteroides、Clostridium sensu stricto 13、Phascolarctobacterium、Alistipes、Lachnoclostridium、Clostridium sensu stricto 1、Agathobacter、Faecalibacterium、Fusicatenibacter、 CampylobacterおよびCetobacteriumで、この他に、Agathobacter、FusecalibacteriumおよびCamylobacterがあった。注目すべきはEscherichia/Shigella属、Akkermansia属、Bacteroides属で、FMT前と後では存在量が異なっていた。Escherichia/ShigellaはFMTの前により多く存在することがわかり、これは以前の研究（38, 39）と一致する。AkkermansiaはFMT後に減少し、BacteroidesはFMT後に増加した。Akkermansia muciniphilaは、腸内のムチンを分解する役割を担っており、一般に腸内の炎症を抑える効果があると考えられている（40-42）。バクテロイデスもまた、腸に対して有益な効果を持つことが示されており、FMT後に増加することが示されています。C. difficileもまた、Bacteroidesの増殖を抑えることが示されています（43）。すべての患者は、FMTの前にC. difficileの治療のためにバンコマイシンを投与されており（表1）、これが微生物叢に影響を及ぼしていた可能性がある。合計15個のASVが、FMTの前後で差次的に豊富に存在することがわかった（FDR < 0.05）（表3）。また、差次的な発現量のASVはすべて、最も発現量の多いASVの上位20個のうちの1つとして存在していた。胆汁分泌に関連する遺伝子の平均転写倍数変化は、Akkermansiaの差と正の相関があった（r > 0.5）（図S2E）。アッケシソウの存在量は、IL-25タンパク質濃度と負の相関（r < -0.7）を示した（図S2F）。
表3
表3 FDRが低いほど豊富な微生物群（Benjamini-Hochberg調整によるWald検定）。
Log2FC P値 FDR Family Genus Species
-26.0 3.50E-16 1.61E-14 アッケシソウ科アッケシソウ属 A. muciniphila
23.2 1.21E-13 2.46E-12 Lachnospiraceae Agathobacter NA
23.1 1.60E-13 2.46E-12 Ruminococcaceae Faecalibacterium NA
-23.1 5.39E-13 6.20E-12 腸内細菌科 Klebsiella NA
-22.8 1.01E-12 9.33E-12 Clostridiaceae Clostridium sensu stricto 1 C. paraputrificum
7.40 4.34E-03 0.0333 リケンテツス科 Alistipes A. putredinis
6.54 7.63E-03 0.0501 バクテロイデス科 バクテロイデス属 B. vulgatus
7.95 0.0109 0.0570 バクテロイデス科 バクテロイデス属 B. ユニフォーミティ
7.80 0.0124 0.0570 バクテロイデス科 バクテロイデス属 B. caccae
7.04 0.0113 0.0570 シロイヌナズナ科 Anaerostipes A. hadrus
7.25 0.0203 0.0778 Lachnospiraceae Agathobacter NA
7.33 0.0190 0.0778 バクテロイデス科 Bacteroides B. finegoldii
7.00 0.0251 0.0887 バクテロイデス科 バクテロイデス属 NA
-5.02 0.0309 0.0947 Clostridiaceae Clostridium sensu stricto 13 C. subterminale
6.77 0.0301 0.0947 リケンテス科 Alistipes A. shahii
考察
本研究で得られた最も重要な知見は、FMT後にサイトカインIL-25が増加したことである。これは、FMTが大腸上皮IL-25を介して自然免疫系への常在菌シグナルを回復させることにより、rCDIから保護するように働くというモデルを支持するものである。我々は以前、CDI のマウスモデルにおいて、IL-25 の発現が FMT によって回復し、IL-25 が腸の 2 型免疫応答を介して CDI から保護することを証明した（15）。FMT成功後のrCDI患者においてIL-25が有意に増加していることは、FMT後の恒常性回復におけるこのサイトカインの重要性に関するマウスでの研究を検証するものである。IL-25 は、好酸球浸潤や消化管粘液産生増加などの Th2 関連表現型を誘導することが示されている (44)。IL-25 はまた、C. difficile 感染時の保護反応として好酸球数を増加させることが示されている (15)。
FMT後に増加した追加のサイトカインには、IL-1bとIL-4が含まれていた。IL-1は、CD4 T細胞の役割に影響を与えることが以前に示されており（45）、特に、IL-1bは、Th2分化を促進することが示されている（46）。IL-1bはまた、マウスのC. difficile毒素によって誘導されることが示されている(17)。以前の研究では、バンコマイシンの投与後にIL-1bのレベルが上昇することが判明したが(47)、この効果はバンコマイシンの投与を中止しても持続しなかった。IL-4 は Th2 反応に重要であることが示されており、マウスでは IL-4 の転写が Th2 反応に必要であることが示されています (48, 49)。
rCDI患者のFMT治療は、上皮の転写反応、循環免疫細胞集団、細胞シグナル伝達タンパク質、粘膜微生物叢にも大きな影響を及ぼした。FMTは、ホメオボックス遺伝子やラミニンなど、腸の維持・統合に関連する遺伝子の転写を誘導し、免疫関連遺伝子（CCL11、HLA-DRB5）、解毒（胆汁分泌やチトクロームP450経路に関連）、あるいはアポトーシス遺伝子（嗅覚伝達経路に関連）の転写を抑制して、組織の炎症を弱めた。
末梢血中のTh17細胞は、FMT後に減少した。我々は以前、CDIのマウスモデルにおいて、Th17細胞がIL-17Aの産生と大腸への好中球の動員を通じて部分的にCDIを悪化させることを証明した(50)。他の研究(50-52)でも、Th17細胞とCDIとの関連が見られ、rCDI患者と新規発症CDI患者でTh17細胞の有意な減少が認められ、FMT後にこれらのTh17細胞が増加することが判明した。これは、FMTがTh17免疫細胞数を減少させるという我々の知見と一致しないが、この減少は大腸組織細胞では局所的ではなく、末梢でのみ見られた。この先行研究では、全T細胞ではなく、毒素B特異的T細胞に焦点を当てたことに注目することが重要である。これらの先行研究と我々の研究との違いは、rCDI時の毒素特異的免疫細胞の免疫反応と免疫系全体の状態、あるいはバンコマイシン治療によるCDI寛解時の免疫系との間に明確な違いが存在する可能性を強調している。
我々の結果から2つの一般的なテーマが浮かび上がってきた。ひとつは、FMT後、結腸では炎症性免疫反応の減衰を示す転写シグネチャーが存在することである。これは、主要な免疫反応関連ケモカインの抑制、解毒に関連する経路の抑制、毒素の検出やアポトーシス抑制に使用できる嗅覚信号伝達の減少によって証明される。このことは、Akkermansia muciniphilaの減少とは一部矛盾するようである。この細菌は一般に炎症と逆相関しているからである(53)。これは、FMTの前にバンコマイシンを投与した結果である可能性がある。研究では、バンコマイシンがAkkermansia muciniphilaの存在量を増加させ、C. difficile感染を減少させることが示されています（54～56）。
第二のテーマは、FMT後の治癒への進行である。これは、細胞増殖に関連するホメオボックスとラミニン遺伝子の誘導、およびタイプ2の抗炎症反応を示すIL-25組織サイトカインの増加によって証明される。2型抗炎症反応のもう一つのマーカーであるIL-4も、有意ではなかったが、FMT後に増加することがわかった。しかし、このサイトカイン濃度の増加は、好酸球関連プロセスの転写反応の増加とは一致しなかったので、この増加が好酸球の採用に直接関係しているかどうかはわからない。以前の研究で、微生物の多様性の増加とバクテロイデスの存在量の増加が、C. difficileの治療に対するFMTの成功に関係していることが示されているので（57、58）、α多様性とバクテロイデスの増加もFMT後の治癒の兆候であると言えるでしょう。
我々の研究の限界の1つは、CDIの既往のない健康な患者を同じFMTの手順のために募集することは実行不可能であるため、CDI回復の影響をFMTのみの影響から切り離すことができないことであった。今後の研究では、これらの病態の区別を助けるために、動物モデルによって補完されるかもしれない。しかし、本研究は臨床患者から直接得られたデータを解析しており、個々の患者におけるrCDIに対するFMT治療の効果を分析することが可能であることに変わりはない。
本研究のもう一つの限界は、サンプル源として大腸生検標本を用いることに伴う実験的課題であった。大量のバイオマスを取得することは困難であり、LPMCの分離やDNA増幅など、その後の解析に影響を及ぼす可能性がある（59, 60）。浸潤性局所免疫細胞集団のフローサイトメトリー解析では、生検検体由来のLPMCから分離・解析した細胞数は、血液から分離した細胞数と比較して少なかった。ある患者では、生存可能なCD45+細胞の総数が、FMT前と後の両方の試料で500以下であった。これらの差異を制御するために、患者間の差異を考慮した混合効果モデルを用いて免疫細胞の表現型の差異を解析した。微生物叢の解析では、糞便サンプルと比較して細菌DNAの回収率が低いという問題もあったが、上皮関連種の解析の利点は、FMTの作用が期待される大腸の特定領域で上皮に近接した微生物叢をより正確にスナップショットできることである(60)。
上記の限界に加え、我々の研究は、研究を完了した患者数が少ないという限界もあった。当初登録された10人の患者のうち、FMT後60日目に再来院して研究を完了したのは6人だけであった。これを考慮し、適切な場合には、FMT前に収集された未対照の患者分析も依然として分析に考慮された。例えば、FMT前後のマイクロバイオームの差異に関する16S rRNA遺伝子解析では、FMT前後の差異に関するベータ多様性テストに、試験を完了しなかった患者の多様性測定値が含まれていました。血液中の異なる免疫細胞集団の頻度など、特定の測定値には患者ごとに大きなばらつきがありました。FMT前のこれらの免疫細胞には普遍的な基準値がなかったため、大きなばらつきはグループの傾向を解釈することを難しくしていた。しかし、ペアワイズ解析を取り入れることで、患者間のばらつきを考慮することが可能になった。この変動は、宿主マイクロバイオーム組成解析よりもトランスクリプトーム解析やフローサイトメトリー解析の方が大きかった。これらの違いは、一般化には患者間の差異を考慮する必要があることを強調している。
結論
我々のペアワイズ解析から、rCDI患者はFMT後に炎症反応を弱め、細胞増殖と治癒を増加させる転写的証拠を有することが分かった。トランスクリプトーム、免疫細胞集団、マイクロバイオータの正確な関係は、腸の健康を構成するこれらの相互作用の複雑な性質のため、人により異なる可能性がある。我々の解析では、微生物叢の組成解析において集団の傾向は明らかであったが、患者別の相対的な差異を取り入れることにより、微生物叢の組成と比較してトランスクリプトームの患者間変動が大きいため、トランスクリプト解析の感度が向上することが示された。FMTがIL-25の濃度を増加させるという知見は、抗炎症性好酸球のリクルートがrCDIのFMT治療のメカニズムの一部である可能性を示している。IL-25 は FMT による rCDI 治療のアジュバントとなりうるため、粘膜のホメオスタシスの回復における IL-25 の役割については、さらなる検討が必要である。
材料と方法
研究デザイン
本試験は ClinicalTrials.gov に登録されている（識別子 NCT02797288）。本研究の目的は、rCDIに対するFMTの成功の基礎となる免疫メカニズムを明らかにすることであった。具体的には、CDI のマウスモデルにおいて保護的な 2 型免疫反応を開始することが確認されている IL-25 シグナルが FMT によって増加するかどうかを検証した。参加者は、バージニア大学健康システム（UVAHS）で診療の一環として再発性C. difficile感染症のFMT治療を受けている患者から募集された。すべての患者は、FMTの前に標準的なバンコマイシン抗生物質治療を受けていた。FMT直前とFMT60日後に大腸生検標本と全血が採取された。合計10名の参加者が募集された（表1）。生検標本は、糞便移植時の被験者ではS状結腸から採取した。6名の被験者には、FMT後60日目にS状結腸からフォローアップ生検標本を採取した。主要評価項目は，大腸組織 IL-25 濃度であった．FMTが成功すれば、大腸のIL-25とIL-4が回復すると仮定された。各大腸内視鏡検査時に研究目的で採取した生検サンプルを分析し、免疫シグナルタンパク質IL-25、IL-4、IL-1の組織レベル、RNA配列決定による遺伝子発現、高次元フローサイトメトリーによる浸潤および循環免疫細胞、16S rRNA遺伝子配列決定による微生物叢の変化を明らかにした。
Luminexイムノアッセイ。
大腸生検検体を液体窒素で急速凍結し、その後、タンパク質抽出まで-80℃で保存した。生検標本は、Halt proteinase inhibitors（Thermo Fisher）を含むMAP（multianalyte profiling）溶解バッファ（Millipore）で、ビーズビーター（TissueLyser II; Qiagen）付きの5mmスチールビーズ（Qiagen）を使用して溶解した。遠心分離後、上清はイムノアッセイで使用するまで-80℃に移した。ライセートを解凍し、47-plex magnetic bead-based Luminex immunoassay kit (Milliplex; Millipore EMD)を用いてタンパク質濃度を測定した。各タンパク質の平均蛍光強度（MFI）をLuminex MagPixで読み取り、Milliplex Analyst 5.1 (Millipore EMD) を用いて解析し、5-log standard fitを用いてMFIからタンパク質濃度の算出を行った。標準の範囲外のMFIについては、それぞれの標準曲線（Milliplex Analyst由来、Matlab [MathWorks]を使用して逆計算）を使用して濃度を外挿した。FMT前後のタンパク質濃度の差は、患者IDをランダム変数として含む線形混合効果モデルを用いて、有意性（α=0.05）を検定した（表S2）。IL-1a、IL-1b、IL-4、およびIL-25は、解析計画において事前に定義されていたため、P値は多重比較のために補正されていない。残りの43個のタンパク質については、事前に選択されていなかったので、P値にはBenjamini-Hochbergによる補正が用いられた。
補足資料
表S2
フローサイトメトリーパネル。表S2、DOCファイル、0.04 MBをダウンロードする。
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mRNAの配列決定と解析
大腸生検検体は、大腸内視鏡検査時に採取し、直ちにAllprotect（Qiagen）に入れ、核酸抽出（Qiagen AllPrep）まで-80℃で保存した。RNAサンプル調製のための入力材料として、サンプルあたり1μgのRNAの総量を使用した。NEBNext Ultra RNA library preparation kit for Illumina (New England Biolabs [NEB], USA) を用いて、製造者の推奨に従ってシーケンスライブラリーを作成した。簡単に説明すると、ポリ（T）オリゴヌクレオチドを付着させた磁気ビーズを使用して、mRNAをtotal RNAから精製した。断片化は、NEBNext第一鎖合成反応バッファー（5×）中、昇温下で二価陽イオンを用いて行った。ランダムヘキサマープライマーとモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素，RNase Hマイナス（M-MuLV [H-]）を使用して一本目のcDNAを合成した．第2鎖cDNA合成はDNAポリメラーゼIとRNase Hを用いて行い，残ったオーバーハングはエキソヌクレアーゼ／ポリメラーゼ活性を介してブラントエンドに変換した．
DNA断片の3′末端をアデニル化した後、ヘアピンループ構造を有するNEBNextアダプターをライゲーションしてハイブリダイゼーションに備えた。150〜200bpのcDNA断片を優先的に選択するため、AMPure XP system (Beckman Coulter, Beverly, MA, USA)でライブラリー断片を精製した。次に、3μlのUSER酵素（NEB, USA）を、サイズ選択したアダプターライゲーションcDNAとともに37℃で15分間、その後PCR前に95℃で5分間使用した。その後、Phusion high-fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, index (X) primer を用いて、NEBNext multiplex oligonucleotides for IlluminaでPCRを行った。PCR産物は精製し（AMPure XPシステム）、Agilent Bioanalyzer 2100システムでライブラリーの品質を評価した。インデックスコード化されたサンプルのクラスタリングは、PE（ペアエンド）クラスタキットcBot-HS（イルミナ）を用いたcBotクラスタ生成システムで、メーカーの説明書に従って実施された。
クラスター生成後、ライブラリ調製物をMiSeq（イルミナ）プラットフォームで配列決定し、150bpペアエンドリードを生成した。バッチ効果のコントロールとしてFMT前のサンプルを2つ持っていた患者3を除く6人の患者について、FMT前とFMT後のサンプルをそれぞれ1つずつ、合計13のサンプルを処理した。生リードをfastp (61) で処理し、アダプター配列、ポリN配列、低品質のリードを除去した。Q20、Q30、GC含量を計算し、高品質なリードのみを保存した。ペアエンドクリーンリードを、Spliced Transcripts Alignment to a Reference (STAR) ソフトウェア (62) を用いて参照ゲノム Homo sapiens (GRCh37/hg19) にアライメントした。各遺伝子にマップされたリードを定量するためにFeatureCountsを使用した(63)。リードカウントは、R（バージョン4.0.5）のバイオコンダクターパッケージDESeq2 v1.30.1を使用して処理し、DESeqアルゴリズムを用いて正規化した。主成分分析（PCA）、階層型クラスタリング、およびpheatmap v1.0.12 （64）を用いた密度マップによりサンプル間の全体的な類似性を評価し、FMT、患者、およびFMT後のIBS症状の持続の影響を含む様々な要因の重要性と影響力を判断するために使用した。PCAからは、成分1と成分2の正負の負荷量の上位が報告された。密度マップは、最も変動が大きい30個の遺伝子からヒートマップを作成した。各遺伝子について、全サンプル間のカウントの標準偏差をばらつきの指標として計算した。差次的発現遺伝子はDESeq2のWald検定を用いて算出した(65)。グループ化モデルと患者特異的モデルの2つのモデルを使用した。グループ化モデルは、FMT前後を対比させながら、患者IDを別の変数としてモデルに加えることで患者効果を制御した（design = ∼Patient+Visit）（n = 13）。患者特異的モデルでは、患者IDとサンプルがFMT前か後かを組み合わせた項を用いて、ペアとなった各患者（合計6人）についてFMT前と後を対比させた（design = ∼Patient_Visit）。log2 fold change (log2FC) が1以上、Benjamini-Hochberg false discovery rate correction (FDR, 0.1) を用いた遺伝子を有意とみなした。
遺伝子セットエンリッチメント解析
グループ化されたモデルにおける全遺伝子とそれぞれのlog2FCのリストに対して、遺伝子セットエンリッチメント解析を実施した。Rのパッケージfgsea v3.13（66）を用いて、遺伝子の倍数変化を解析し、KEGGパスウェイを用いてエンリッチされた遺伝子パスウェイと機能を同定した。P 値は、エンリッチメントスコア統計量 (67) を用いて計算した。R の enrichplot v1.10.1 パッケージ内の emapplot 関数を使用して、機能モジュールを決定するためにエンリッチマップを構築した。次に、得られたエンリッチパスウェイとそれに対応する遺伝子リストを、患者特異的モデルを使用して各患者について選択的に絞り込み、各患者のパスウェイに対する濃縮度合いを計測した。総合的なFCの指標として、FMT前後でペアになったRNA-seqデータを持つ各患者について、関心のあるエンリッチ遺伝子パスウェイごとに、差次的に発現した遺伝子のlog FCを合計した。この合計は、その患者の特定の経路に対する濃縮の程度を表していた。
LPMCsおよびPBMCのフローサイトメトリー。
大腸生検標本から、以下のようにして、層状固有単核細胞（LPMC）を分離した。大腸生検検体は，カルシウムとマグネシウムを含まない氷冷したハンクス平衡塩溶液（HBSS）に浸漬し，直ちに実験室に輸送して細胞分離を行った．生検標本を室温で20分間消化し（Accumax；eBioscience）、ろ過して（70μm）LPMCsを単離した。PBMC単離のため、全血を遠心分離し、血漿を除去した。PBMCはFicoll（Cytiva）を加えて分離し、SepMateチューブ（Stemcell Technologies）中で遠心分離した。単離したLPMCsとPBMCは染色するまで液体窒素で凍結保存した。
単離したLPMCsとPBMCsを解凍し、蛍光色素標識抗体で染色した（表S1）。未染色、単一染色、および蛍光マイナスワン（FMO）染色したPBMCを対照として用いた。さらに、各サンプルは、固定生存率染色（Zombie NIR; BioLegend）も受けた。細胞はまず表面染色を行い、その後細胞内染色のために透過処理（Foxp3転写因子染色バッファーセット；Invitrogen）を行った。サンプルは、5レーザーCytek Aurora Borealisフローサイトメーターを用いて解析した。LPMCサンプルについては全細胞を、PBMCサンプルについては100,000細胞を収集した。これらの蛍光リードは、FlowJo V.10.7.2 を用いて解析し、t-SNE クラスタリングと従来のゲーティングによって免疫細胞サブセットを表現した（図 S3）。スペクトルデコンボリューションとゲーティングは、単一染色およびFMO染色PBMC対照試料に基づいて行われた。
任意のサンプルの各t-SNEクラスタまたは免疫細胞表現型について、生のカウントと白血球集団（生存CD45+細胞）のパーセンテージを算出した。FMT前後のこれらの生カウントとパーセンテージの差は、患者IDをランダム変数として含む線形混合効果モデルを用いて定量化された。
16S rRNA遺伝子配列の決定と上皮関連微生物叢の解析。
大腸生検検体からの細菌DNAをV4特異的プライマーを用いて増幅し、Nextera XTインデックスキットを用いてインデックス化し、MiSeqシーケンス（68）を介してIlluminaで配列決定された。FMT後の1サンプルから増幅が不十分であったため、解析サンプル数を絞った（FMT前10サンプル、FMT後5サンプル）。コントロールとしてモックサンプル（ZymoBIOMICS）が含まれていた。得られたライブラリは、RのDADA2パッケージ（69）を用いて前処理を行い、アンプリコン配列変異（ASV）のライブラリとした。分類はSilva (70) release 138 databasesで行った。フォワードリードは240 bpで、リバースリードは160 bpで切り捨てた。アンプリコンサイズは250 bp程度を想定し、pair-end libraryを使用した。この長さは、DADA2パイプラインでフォワードリードとリバースリードをマージした後に確認された。
Rのphyloseq (71) v.1.34.0 libraryを用いて、α多様性指標ShannonおよびSimpson多様性値を算出した。α多様性指標の差は、多重比較のためにボンフェローニ補正をしたRのpairwise.wilcox.test base関数でFMT前後の差を評価した。この関数は、ペアのランク付けされたマン・ホイットニー検定を使用して、差異を評価する。
主座標分析（PCoA）は、FMT前後の微生物叢の相対的存在量の違いを可視化するために実施された。FMT前後の差は、Rのvegan package (72) v.2.5.7のpermutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA)によって評価された。
謝辞
この出版物で報告された研究は、C.M.への賞番号R01AI148518、W.A.P.へのR01 AI124214 およびR01 AI152477の下、米国衛生研究所のNational Institute of Allergy and Infectious Diseasesの支援を受けたものである。
16S rRNA遺伝子マイクロバイオータ解析のためのシーケンスおよびライブラリー調製にご協力いただいた生物学部UVA Genomics Core Facility（RRID:SCR_012197）、フローサイトメトリーおよびLuminex assayにご協力いただいたUVA SOM Flow Cytometry Core（RRID：SCR_012197）、16S rRNA遺伝子分類分析にご協力いただいたバイオインフォーマティクスコアに感謝します（バージニア大学戦略投資基金 No.162 TransUniversity Microbiome Initiative）。
W.A.P.とC.M.は本研究を構想した。W.A.P.、C.M.、R.A.H.は研究の設計と実施を主導した。C.M.、G.R.、D.N.O.は、試験の実施、試料採取と処理、プロトコルの改良、データ解析に協力した。P.K.はマイクロバイオームとトランスクリプトーム解析の専門知識を提供し、原稿作成に協力した。B.W.B.は、プロトコルの改良と原稿作成を支援した。C.M.はRNA-seqを実施し、原稿作成に協力した。N.J.はフローサイトメトリーの実施、データ解析、原稿作成を行った。最終原稿は全著者が確認・承認した。
W.A.P.は、TechLab Inc.のコンサルタントである。C.M.はMerck ManualsのMedical Authorである。
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