腸内細菌叢由来のトリプタミンとフェネチルアミンはメタボリックシンドロームと過敏性腸症候群のインスリン感受性を損なう

2023年8月24日 09:19

オープンアクセス
出版：2023年8月17日
腸内細菌叢由来のトリプタミンとフェネチルアミンはメタボリックシンドロームと過敏性腸症候群のインスリン感受性を損なう

https://www.nature.com/articles/s41467-023-40552-y

Lixiang Zhai, Haitao Xiao, ...Zhao-Xiang Bian 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：4986（2023）この記事を引用する

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メトリクス詳細

要旨
過敏性腸症候群（IBS）患者ではメタボリックシンドロームの発症率が有意に高いが、そのメカニズムは不明である。腸内細菌叢は代謝異常および胃腸障害の発症と因果関係があることから、IBSにおける腸内細菌叢異常はメタボリックシンドロームの発症に寄与している可能性がある。ここでは、ヒト腸内細菌Ruminococcus gnavus由来のトリプタミンおよびフェネチルアミンが、2型糖尿病（T2D）およびIBSにおける腸内細菌異常症誘発インスリン抵抗性において病原的役割を果たすことを示す。我々は、R. gnavus、トリプタミンおよびフェネチルアミンのレベルが、T2D患者およびIBS患者におけるインスリン抵抗性と正の相関があることを示した。R.gnavusの単結合は、無菌マウスにおけるインスリン感受性とグルコースコントロールを障害する。R.gnavus由来の代謝産物であるトリプタミンおよびフェネチルアミンの投与は、健常マウスおよびサルの主要代謝組織におけるインスリンシグナル伝達を直接的に障害し、この効果は微量アミン関連受容体1（TAAR1）-細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）シグナル伝達軸によって媒介される。本研究で得られた知見は、インスリン抵抗性の発症におけるトリプタミン/フェネチルアミン産生因子の役割を示唆し、IBSにおけるメタボリックシンドロームの有病率増加の分子メカニズムを提供し、腸内細菌異常によって誘発されるメタボリックシンドロームの管理のための潜在的な治療標的としてTAAR1シグナル伝達軸を強調するものである。

はじめに
過敏性腸症候群（IBS）は一般的な機能性腸疾患であり、腸習慣の変化と腹痛の再発を特徴とする1。最近の研究では、IBSはメタボリックシンドロームやT2Dの有病率が高いことが示されており、IBSが代謝異常の危険因子であることが示唆されている2,3,4。しかし、メタボリックシンドロームにつながるIBSの原因や分子メカニズムはまだ不明である。腸内細菌叢は、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、糖尿病などの代謝性疾患や、IBSなどの消化器疾患との相関性や因果関係について、過去数十年にわたり広く研究されてきた5,6,7。したがって、消化器疾患における腸内細菌叢異常症は、代謝性疾患の発症に関与している可能性があるが、消化器疾患に関連した腸内細菌叢異常症が代謝性疾患の発症に果たす病的役割やその背景にある分子メカニズムはまだ解明されていない。

代謝性疾患患者における腸内細菌叢組成の変化は、リポ多糖、短鎖脂肪酸、胆汁酸、トリメチルアミンN-オキシド、イミダゾールプロピオン酸などの腸内細菌産物の含量の変化を誘発することが示されており、これらの変化は、動物およびヒトの両方の研究において、耐糖能に有益または有害な影響を及ぼすことが広く認識されている8,9。これらの微生物代謝産物に加えて、芳香族アミノ酸や分岐鎖アミノ酸を含む食事性アミノ酸も、腸内細菌叢によって多くの代謝産物に異化され、宿主の代謝の健康に影響を及ぼす可能性がある10,11,12。我々の以前の研究では、嫌気性でグラム陽性のIBS関連細菌であるRuminococcus gnavusが、IBS患者の下痢症状を誘発するために、食餌性アミノ酸であるトリプトファンとフェニルアラニンを利用してトリプタミンとフェネチルアミンを産生することが示された13。また、最近の研究では、R. gnavusがメタボリックシンドロームの特徴と正の相関があることが示されているが14、メタボリックシンドロームに関与するR. gnavusの因果関係や関連する病態因子は不明である。

本研究では、メタボリックシンドロームおよびIBSにおけるインスリン抵抗性の発症に、腸内細菌由来のトリプタミンおよびフェネチルアミンが寄与していることを明らかにした。本研究で得られた知見から、R. gnavusとそれに由来するトリプタミンおよびフェネチルアミンは、IBS患者におけるインスリン抵抗性と正の相関があることが明らかになった。また、R. gnavusを単離した無菌マウスでは、糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミン濃度の上昇に伴って、インスリン抵抗性および耐糖能異常が生じることを明らかにした。メカニズム的には、腸内細菌由来のトリプタミンとフェネチルアミンは、微量アミン関連受容体1（TAAR1）-細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）シグナル伝達軸の活性化を介して、代謝組織におけるインスリンシグナル伝達を障害する。TAAR1の薬理学的拮抗作用は、R. gnavusでコロニー形成した抗生物質投与マウス、あるいはIBS患者の糞便微生物叢を移植したマウスにおいて、インスリン抵抗性を予防した。さらに、食物繊維介入試験において、糞便中のトリプタミンとフェネチルアミンの濃度が、ともにT2D患者の耐糖能異常と正の相関を示し、T2D患者のインスリン感受性の改善と負の相関を示したことから、トリプタミンとフェネチルアミンは、腸内細菌叢異常によって引き起こされるIBSとインスリン抵抗性の併存因子であることが示唆された。我々は、IBSにおける腸内細菌叢異常に関連するインスリン抵抗性の原因的役割に関する知見を提供しただけでなく、メタボリックシンドローム管理のための腸内細菌叢に基づく治療法を開発するための基礎的知見を構築した。

研究結果
過敏性腸症候群におけるR. gnavus由来トリプタミン／フェネチルアミンとインスリン抵抗性の正の関連性
まず、IBS患者と健常対照者（HC）の空腹時血糖値（FBG）、トリグリセリド（TG）、インスリン抵抗性の指標であるトリグリセリド・グルコース・インデックス（TyG）を測定した。興味深いことに、IBS患者では空腹時血糖、トリグリセリド、トリグリセリド・グルコース（TyG）指数がすべて有意に上昇しており（すべての症例でp≦0.001、図1A-C）、IBS患者は健常対照群と比べて糖尿病リスクが高いことが示唆された。次に、HCおよびIBS患者のショットガンメタゲノム配列データ15とインスリン抵抗性マーカーTyG indexを用いて、腸内微生物とインスリン抵抗性の関連を解析した（図S1A）。特徴的な腸内微生物のうち、R. gnavusはHCおよびIBS患者においてTyGと正の相関を示し（r = 0.2、HCではp = 0.034、IBSではr = 0.186、p < 0.001、図1D, E）、TyG indexが高いIBS患者で濃縮されていた（p = 0. 03、図S1B）。これは、R. gnavusが血清トリグリセリドやヘモグロビンA1c（HbA1c）の上昇を含むメタボリックシンドロームのいくつかの特徴と関連していることを示した最近の集団ベースの臨床研究14と同様であった。また、R. gnavusはトリプタミンおよびフェネチルアミンの主要な産生菌であることが以前報告されているが13、我々はまた、HCおよびIBS患者において、糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミン濃度がTyGと正の相関を示し（r = 0.196および0.255、p < 0.001、図S1C）、TyG指数が高いIBS患者において有意に濃縮されることを見出した（いずれもp < 0.05、図S1D、E）。

図1：過敏性腸症候群におけるR. gnavus由来トリプタミン／フェネチルアミンとインスリン抵抗性の正の関連と因果関係。
図1
A-C 健常対照者（HC、n = 89）と比較したIBS-D患者（n = 290）におけるFBG、TG、TyGレベル（両側t検定により決定）。D, E HCとIBS-D患者におけるR. gnavusの相対量とTyGレベルの間のスピアマンの相関（片側検定による）。F, G R. gnavus ATCC 29149のコロニー形成後の無菌マウスにおけるOGTTおよびITT指数（各群n = 6）（両側検定により決定）。H, I R. gnavus ATCC 29149のコロニー形成後の無菌マウスの血清および糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミン濃度（各群n = 6）（両側t検定により決定）。J, K L. casei TDC+またはL. casei WT（各群n = 6）のコロニー形成後、抗生物質を投与したマウスにおけるOGTTおよびITT指数（両側t検定により決定）。L, M 人工L. casei TDC+またはL. casei WTを3日間コロニー形成させ、抗生物質を投与したマウスの血清および糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミンレベル（各群n = 6）（両側t検定により決定）。P値は、通常の二元配置分散分析またはスチューデントのt検定によって決定した。データは平均値±S.D.で示した。Fig. S1の追加データを参照。

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R. gnavusのコロニー形成は、トリプタミンおよびフェネチルアミンの過剰産生を伴うインスリン感受性障害を引き起こした。
メタボリックシンドロームにおけるR. gnavusの病原的役割を評価するために、ヒト腸内細菌R. gnavus株（ATCC 29149）を無菌マウスにコロニー形成させた。体重に有意な変化は認められなかったが（図S1F）、R. gnavusをコロニー形成させた無菌マウスは、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）およびインスリン負荷試験（ITT）により、耐糖能の低下とインスリン感受性の低下を示した（いずれもp＜0.05、図1F、G）。

R.gnavusは、我々の以前の知見や他の研究13,16で示されたように、トリプトファンとフェニルアラニンをトリプタミンとフェネチルアミンに脱炭酸することができる腸内一次微生物であることから、R.gnavusをコロニー形成した無菌マウスでは、耐糖能とインスリン感受性が低下するとともに、糞便中のトリプタミンとフェネチルアミン濃度の上昇が認められた（すべての症例でp < 0.01、図1H, I）。R.gnavus由来の脱炭酸酵素（TDC）が産生するトリプタミンとフェネチルアミンがin vivoでインスリン感受性を損なうかどうかをさらに検討するために、トリプタミンやフェネチルアミンを産生しない常在菌のグラム陽性菌Lactobacillus caseiにR.gnavus（ATCC 29149）由来のTDC遺伝子を異所的に発現させた。その結果、トリプタミンとフェネチルアミンの両レベルは、一晩の接種後、空ベクターおよび培地対照のL. caseiと比較して、操作したL. casei TDC+株の培養液中で有意に増加した（図S1G, H）。L.カゼイTDC+株のコロニー形成は、空ベクターL.カゼイと比較して、抗生物質投与マウスにおいて高いOGTTおよびITT指数を誘導し、トリプタミンおよびフェネチルアミンレベルを上昇させた（すべてのケースでp < 0.05、図1J-Mおよび図S1I）。このことは、R. gnavus由来TDCから産生されるトリプタミンおよびフェネチルアミンがin vivoでインスリン感受性を損なう可能性を示している。

トリプタミン／フェネチルアミンと2型糖尿病における耐糖能異常との正の関連性
我々はさらに、健常対照者とT2D患者におけるトリプタミン、フェネチルアミン、およびそれらの前駆体（トリプトファンとフェニルアラニン）の糞便中濃度を測定した。その結果、トリプタミンとフェネチルアミンはT2D被験者の糞便サンプルで有意に高いことがわかった（p = 0.011と0.031、図2A, B）。一方、トリプトファンとフェニルアラニンのレベルは、T2D被験者の糞便サンプルでは変化しなかった（図S2A, B）。さらに、芳香族微量アミン（トリプタミン、フェネチルアミン、チラミン）の1つであるチロシンおよびチラミンのレベルも、T2D被験者では有意な変化は認められなかった（図S2C, D）。さらに、相関解析の結果、T2D患者において、糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミンは空腹時血糖値（FBG）と正の相関を示し（r = 0.443および0.378、p = 0.005および0.008、図2C、D）、トリプタミンおよびフェネチルアミンが耐糖能異常と正の相関を示すことが明らかになった。

図2：トリプタミンとフェネチルアミンは、2型糖尿病患者および自然発症糖尿病サルにおける耐糖能異常と正の相関がある。
図2
A, B T2Dの有無にかかわらず、糞便サンプル中のトリプタミンとフェネチルアミンのレベル（NGTの被験者n = 25人、T2Dの患者n = 25人）。C, D T2Dの有無にかかわらず、糞便中のトリプタミン/フェネチルアミン値とFBG値との間のスピアマンの相関（NGT患者25名、T2D患者25名）。E, F 年齢をマッチさせたサルの血清および糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミンレベル。G, H 糖尿病前症および糖尿病の有無にかかわらず、糞便中のトリプタミン/フェネチルアミン濃度とHbA1c指数とのスピアマンの相関（n = 26/群）。I, J 糖尿病前症および糖尿病の有無を問わず、サルの糞便中トリプタミン/フェネチルアミン濃度とFBG指数とのスピアマンの相関（n = 26/群）。K, L 糖尿病前症および糖尿病の有無を問わず、サルの糞便を用いたバッチ培養実験におけるトリプタミンおよびフェネチルアミンの産生量（n = 26/群）。P値は片側通常の二元配置分散分析またはスチューデントのt検定により決定した。データは平均値±S.D.で示した。S2.

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年齢、抗糖尿病薬、食事パターンなどの宿主変数は、ヒト疾患の腸内細菌叢研究を混乱させる可能性がある17。これらの変数の影響を減らすために、我々はまた、代謝性疾患の前臨床霊長類モデルである自発性メタボリックシンドロームのサル（Macaca fasicularis）の糞便トリプタミン、フェネチルアミン、およびチラミンレベルを測定した18。FBG値とHbA1c値19に基づき、年齢をマッチさせた未治療のサルを正常群、糖尿病予備群、糖尿病群に割り付けた（図S2E-I）。その結果、糖尿病サルの糞便懸濁液を摂取させたマウスは、正常サルの糞便懸濁液を摂取させたマウスよりも高いグルコースレベルを示したことから（すべてのケースでp＜0.05、図S2J）、糖尿病サルの腸内細菌叢とその代謝産物が耐糖能異常の発症に関与していることが示唆された。次に、サルの血清と糞便中のトリプタミン、フェネチルアミン、チラミン、およびそれらの前駆体（トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン）を定量した。一貫して、トリプタミンとフェネチルアミンは糖尿病サルの血清と糞便で有意に増加した（すべてのケースでp < 0.05、図2E、F）が、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、チラミンの糞便レベルは有意に変化しなかった（図S2K-N）。相関分析の結果、サルでは、トリプタミンとフェネチルアミンの糞便／血清濃度は、いずれもHbA1c（r = 0.253および0.245、いずれもp < 0.05）（図2G、H）およびFBG（r = 0.275／0.255およびr = 0.452／0.368、いずれもp < 0.02）（図2I、Jおよび図S2O、P）と正の相関があった（図2I、J）。また、嫌気的条件下で、糖尿病前および糖尿病サルの糞便から採取した腸内細菌の培養液中により高濃度のトリプタミンおよびフェネチルアミンを検出し（p = 0.006 および 0.02, 図2K, L）、サルの糖尿病関連微生物叢がトリプトファンおよびフェニルアラニンをトリプタミンおよびフェネチルアミンに変換する高い触媒能を有することを確認した。

我々の以前の研究では、食物繊維の介入が短鎖脂肪酸産生菌の増殖を促進することにより、T2D被験者のグルコースホメオスタシスを改善することが報告されている20,21。興味深いことに、我々はR. gnavus CAG0075が食物繊維介入に対して有意に抑制されることを明らかにした（補足データ1）。R. gnavus CAG0075のTDC配列は、R. gnavus (ATCC 29149)の参照TDC配列16と比較して100％の同一性を示し、R. gnavus CAG0075とR. gnavus (ATCC 29149)の平均ヌクレオチド同一性は99.1％であったことから、R. gnavus TDCはT2D被験者のインスリン感受性改善と負の相関があることが明らかになった。次に、本研究で高繊維食を摂取したT2D被験者の糞便サンプル中のトリプタミンおよびフェネチルアミン濃度を測定した。R. gnavusの減少と一致して、糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミンレベル、ならびにトリプタミン／トリプトファンおよびフェネチルアミン／フェニルアラニンの比は、食物繊維介入により有意に抑制された（W群に示す）（p = 0.001、図3A、Bおよび図S3A、B）。高食物繊維を投与したT2D被験者（W群）では、糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミン濃度の低下とHbA1cおよびHOMA-IR指標の改善との間に正の相関が認められた（BMIで調整後、r = 0.569/0.269およびr = 0.544/0.356、いずれの場合もp < 0.05、図3C、Dおよび図S3C、D）。さらに、トリプタミン／フェネチルアミンとTDC配列を持つ細菌ゲノムとの相関解析を行ったところ、TDC遺伝子を持つ5つのゲノムのうち、トリプタミンと正の相関を示したのはR. gnavus CAG0075のみであった（補足データ2）。これらの結果から、トリプタミンおよびフェネチルアミンを伴うR. gnavusは、T2D被験者のインスリン感受性改善と負の相関があることが示唆された。

図3：トリプタミンおよびフェネチルアミンは、食物繊維を投与した2型糖尿病患者におけるインスリン感受性の改善と負の相関がある。
図3
A, B 対照群（U群；n＝16）および高食物繊維群（W群；n＝27）のT2D被験者の糞便サンプル中のトリプタミンおよびフェネチルアミンレベル（0日目および84日目）。C, D 高繊維食を摂取したT2D被験者（W群；n＝27）における糞便中のトリプタミンおよびフェネチルアミン濃度とHOMA-IR指数との間のSpearmanの相関分析。血清および糞便中のフェネチルアミンおよびトリプタミン濃度の差は、片側普通の二元配置分散分析（one-tailed ordinary two-way ANOVA）またはスチューデントのt検定（Student's t-test）で分析した。データは平均値±S.D.で示した。図S3の追加情報を参照。

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トリプタミンとフェネチルアミンはインスリン感受性を損なう
インスリン抵抗性の病態生理学におけるトリプタミンとフェネチルアミンの役割を理解するために、IBS被験者とT2D被験者の糞便サンプルから検出された病態生理学的範囲内でトリプタミンとフェネチルアミンを正常マウスに投与した。正常マウスにトリプタミンまたはフェネチルアミンを腹腔内投与したところ、トリプタミンおよびフェネチルアミンは、OGTTおよびインスリン負荷試験（ITT）で観察される耐糖能およびインスリン感受性に対して顕著な抑制効果を示した（いずれもp＜0.05、図4A-D）。さらに、トリプタミンとフェネチルアミンは、白色脂肪組織（WAT）、肝臓、骨格筋などの主要な代謝組織において、インスリン誘導性のAktリン酸化を有意に抑制した（すべての場合においてp＜0.05、図4E-H）。また、トリプタミンとフェネチルアミンは正常マウスにおいて血清TGレベルの有意な上昇を誘導した（いずれもp<0.05、図S4A, B）。マウスで得られた知見を検証するために、我々は静脈内ブドウ糖負荷試験（IVGTT）を用いて、経口投与で10 mg/kgを単回投与した正常サルにおいて、トリプタミンによって耐糖能が同様に障害されるかどうかを調べた。その結果、トリプタミンを投与したサルは、グルコース負荷試験において高い血糖値を示した（p<0.05、図S4C）。さらに、トリプタミンとフェネチルアミンを投与したサルとマウスの両方で、血清インスリンレベルの有意な上昇が見られた（すべてのケースでp < 0.01、図S4Dと図S4K）。

図4：トリプタミンとフェネチルアミンはマウス、サル、in vitroモデルにおいてインスリン感受性を損なう。
図4
A, B トリプタミンを指示された投与量（0.4mg/kg、2mg/kg、10mg/kg）またはコントロール（生理食塩水に1％DMSO）をi.p.投与した後の正常マウスのOGTTおよびITT（n＝6/群）。*対照群とトリプタミン群（10mg/kg）の比較。#対照群とトリプタミン投与群（2mg/kg）との比較。C, D フェネチルアミンを指示用量（1 mg/kg、2 mg/kg、5 mg/kg）または対照（生理食塩水に1％DMSO）をi.p.投与した後の正常マウスのOGTTおよびITT（n＝6/群）。*コントロール群とフェネチルアミン群（5mg/kg）の比較。#コントロール群とトリプタミン処理群（2mg/kg）との比較。E, F マウスのWAT溶解物、肝臓溶解物および骨格筋溶解物における、インスリン（1 U/kg）によって刺激されたAKTリン酸化に対するトリプタミン処理（10 mg/kg）のi.p.による効果のウェスタンブロット（および定量）。(n = 3/グループ）。G, H マウスのWAT溶解物および肝臓溶解物におけるインスリン（1 U/kg）によって刺激されたAKTリン酸化に対するi.p.によるフェネチルアミン処理（5 mg/kg）の効果のウェスタンブロット（および定量）。(n = 3/グループ）。I, J 3T3-L1細胞におけるインスリン（20 nM）によって刺激されたインスリンシグナル伝達に対するトリプタミン処理（25 μM）の効果のウェスタンブロット（および定量）（n = 3/グループ）。K, L 3T3-L1細胞（n = 3/グループ）において、インスリン（20 nM）によって刺激されたインスリンシグナル伝達に対するフェネチルアミン処理（25 μM）の効果のウェスタンブロット（および定量）。データは平均値±S.D.で示した。P値は両側普通の一元配置分散分析またはスチューデントのt検定によって決定した。図S4の追加情報を参照。

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in vivoの研究と同様に、トリプタミンとフェネチルアミンを投与すると、インスリン作用の研究に有効なヒト細胞株である3T3-L1脂肪細胞において、時間依存的にインスリンシグナル伝達が阻害されることが示された（いずれの場合もp＜0.05、図4I-L）。また、トリプタミンは3T3-L1脂肪細胞において用量依存的に基礎グルコース取り込みを阻害することも示した（p＜0.05、すべての場合、図S4E）。対照的に、トリプトファン、フェニルアラニン、インドール-3-酢酸、フェニル酢酸を含むトリプタミンとフェネチルアミンの前駆体および代謝物を同量処理しても、3T3-L1細胞におけるインスリン誘導AKTリン酸化は変化しなかった（図S4F, G）ことから、トリプタミンとフェネチルアミンは、それらの前駆体や代謝物ではなく、インスリン感受性を損なうことが示唆された。さらに、トリプタミンとフェネチルアミンの急性投与は、GLP-1とPYYの血清レベルに有意な影響を及ぼさないことが示された（図S4H、I）。

トリプタミンとフェネチルアミンはTAAR1-ERK活性化を介してインスリンシグナル伝達を弱める
トリプタミンとフェネチルアミンがインスリンシグナル伝達を阻害するメカニズムを調べるために、リン酸化プロテオミクス法を用いて、トリプタミンとフェネチルアミンによって有意に変化する分子成分を捕捉した（補足データ6-7）。トリプタミンを経口投与したところ、トリプタミンとその代謝産物であるインドール-3-酢酸（IAA）の濃度が15分以内に血清とインスリン感受性組織で有意に上昇することが観察された（いずれもp<0.05、図S5A, B）。これは、トリプタミンがインスリン感受性組織に入り、腸内細菌叢で産生された後に宿主で同時に代謝されることを示唆している。次に、ホルモン感受性リパーゼ（HSL）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼMAPK 1/3（ERK）、ソルビン、SH3ドメイン含有1（SHD5）を含む4つのインスリンシグナル関連タンパク質が、トリプタミン処理に応答してインスリン感受性組織で発現上昇していることを見出した（補足データ3）。これらのタンパク質のうち、ERKはT2DにおけるIRの病態に関与していることが以前に報告されている22。トリプタミンとフェネチルアミンがMAPK/ERK経路の活性化を通じてインスリンシグナル伝達を抑制するかどうかを調べるため、トリプタミン投与マウス（i.p.）でERK1/2リン酸化を調べたところ、トリプタミンによってインスリン感受性組織でERK1/2リン酸化が上昇することがわかった（すべての症例でp < 0.05、図5A, B）。次に、ERK阻害剤U0126とPD98059を用いて、耐糖能とインスリン感受性に対するトリプタミンの抑制効果がMAPK/ERK経路に依存しているかどうかを調べた。OGTTおよびITT試験において、ERK阻害剤を投与すると、トリプタミンおよびフェネチルアミン投与マウスの耐糖能とインスリン抵抗性が有意に改善した（いずれの場合もp＜0.05、図5C、D、図S5Cおよび図5G、H）。対照的に、ERK阻害剤は対照マウスの耐糖能とインスリン感受性にほとんど影響を及ぼさなかった。さらに、ERK阻害剤は、インスリン刺激によるAKTリン酸化に対するトリプタミンの阻害効果を消失させ、インスリン感受性組織におけるトリプタミン誘発ERKリン酸化を有意にダウンレギュレートした（いずれの場合もp＜0.05、図5E、Fおよび図5I、J）。これらのin vivo観察と同様に、トリプタミンとフェネチルアミンもまた、3T3-L1細胞において時間依存的にERK1/2リン酸化を誘導したが、これはERK阻害剤で前処理することによって阻害された（すべての場合においてp < 0.05、図S5D-F）。ERK阻害剤はまた、インスリン刺激を受けた3T3-L1細胞におけるAKTリン酸化に対するトリプタミンとフェネチルアミンの阻害効果を有意に抑制した（すべての場合においてp＜0.05、図S5G、H）。これらのデータから、トリプタミンとフェネチルアミンはMAPK/ERK経路を活性化することによってインスリン感受性を損なうことが示唆された。

図5：トリプタミンとフェネチルアミンはERK活性化を介してインスリンシグナルを障害する。
図5
A, B マウスのWAT溶解物、肝臓溶解物、骨格筋溶解物におけるERK活性化に対するトリプタミン処理（10 mg/kg）の影響のウェスタンブロット（および定量化）（n = 3/群）。C、D トリプタミン（10 mg/kg）、ERK阻害剤U0126（20 mg/kg）、またはコントロール（生理食塩水中1％DMSO）（n＝6/群）をi.p.投与した後のマウスにおけるOGTTおよびITT指数。#トリプタミン群とトリプタミン＋ERK阻害剤（U0126）群との比較。E, F トリプタミン（10 mg/kg）およびERK阻害剤U0126（20 mg/kg）投与が、ERK活性化およびインスリン（1 U/kg）刺激AKT活性化に及ぼす影響のウェスタンブロット（および定量）。 G, H フェネチルアミン（5 mg/kg）、ERK阻害剤U0126（20 mg/kg）、またはコントロール（生理食塩水に1％DMSO）をi.p.投与した後のマウスのOGTTおよびITT指数（n = 6/群） *コントロール群とフェネチルアミン群（10 mg/kg）の比較。#トリプタミン群とフェネチルアミン＋ERK阻害剤（U0126）群との比較。I, J フェネチルアミン（5 mg/kg）およびERK阻害剤U0126（20 mg/kg）投与が、ERK活性化およびインスリン（1 U/kg）刺激AKT活性化に及ぼす影響のウェスタンブロット（および定量）。図S5の追加情報を参照。

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トリプタミンもフェネチルアミンもGPCR受容体TAAR123,24に結合して活性化することができ、下流のインスリンシグナル伝達経路に阻害作用を及ぼす可能性がある。さらに、トリプタミンとフェネチルアミンがTAAR1-MAPK/ERKシグナル伝達軸を介して作用し、インスリンシグナル伝達を阻害するかどうかを検討した。OGTTおよびITT試験において、特異的TAAR1アンタゴニストであるEPPTBによる処置は、マウスにおいてトリプタミンおよびフェネチルアミン誘導性の耐糖能異常およびインスリン抵抗性を有意に減少させた（すべての場合においてp＜0.05、図6A-D）。EPPTBによるTAAR1拮抗作用はまた、トリプタミン誘発ERKリン酸化をダウンレギュレートし、マウスのインスリン感受性組織におけるインスリン刺激AKTリン酸化に対するトリプタミンの阻害効果を消失させた（すべてのケースでp＜0.05、図6E、Fおよび図S6A、B）。対照的に、EPPTBはコントロールマウスの耐糖能にもインスリン感受性にも影響を及ぼさなかった。これらのin vivoの結果と同様に、EPPTB投与はトリプタミンとフェネチルアミンによって誘導されるERKリン酸化の上昇を有意に抑制し（すべてのケースでp＜0.05、図S6CとE）、3T3-L1細胞におけるインスリン刺激AKTリン酸化に対するトリプタミンとフェネチルアミンの阻害効果を逆転させた（すべてのケースでp＜0.05、図S6DとF）。特に、Taar1の遺伝子破壊は、代謝組織におけるTaar1の発現を有意に抑制し（p < 0.001、すべての場合、図6G）、トリプタミンとフェネチルアミンによって誘発されたマウスの耐糖能異常とインスリン抵抗性を防御した（p < 0.05、すべての場合、図6H-K）。

図6：トリプタミンとフェネチルアミンはTAAR1-ERKシグナル軸を介したインスリンシグナル伝達を弱める。
図6
A, B トリプタミン（10 mg/kg）、TAAR1拮抗薬EPPTB（10 mg/kg）、またはコントロール（生理食塩水に1％DMSO）をi.p.投与後のマウスにおけるOGTTおよびITT指数（n＝6/群）。*コントロール群とトリプタミン群（10mg/kg）の比較。#トリプタミン群とトリプタミン＋TAAR1拮抗薬（EPPTB）群との比較。C, D フェネチルアミン（5 mg/kg）、TAAR1拮抗薬EPPTB（10 mg/kg）、またはコントロール（生理食塩水に1％DMSO）をi.p.投与した後のマウスにおけるOGTTおよびITT指数（n＝6/群）。*コントロール群とフェネチルアミン群（5mg/kg）の比較。#トリプタミン群とフェネチルアミン+TAAR1アンタゴニスト（EPPTB）群との比較。E, F マウスのWAT溶解物におけるERK活性化およびインスリン（1U/kg）刺激AKT活性化に対するトリプタミン（10mg/kg）、フェネチルアミン（5mg/kg）およびTAAR1拮抗薬EPPTB（10mg/kg）処理の効果のウェスタンブロット（および定量）（コントロールおよびインスリン群ではn＝2、他の群ではn＝3）。G 野生型マウスおよびTaar1 KOマウスのインスリン感受性組織におけるTaar1のmRNA発現レベル（n = 3/群）。H, I 野生型マウス（WT）およびTaar1ノックアウト（KO）マウスにトリプタミン（10 mg/kg）またはコントロール（生理食塩水に1％DMSO）をi.p.投与した後のOGTTおよびITT指数（n＝6/群）。WTマウスにおけるトリプタミン（10mg/kg）投与の有無の比較。#WTマウスとTaar1 KOマウスにおけるトリプタミン投与の比較。J, K フェネチルアミン（5 mg/kg）またはコントロール（生理食塩水に1％DMSO）をi.p.投与した野生型（WT）マウスおよびTaar1ノックアウト（KO）マウスにおけるOGTTおよびITT指数（n＝6/群）。 WTマウスにおけるフェネチルアミン（5mg/kg）投与の有無の比較。#WTマウスとTaar1 KOマウスにおけるトリプタミン投与の比較。データは平均値±S.D.で示した。P値は両側普通の一元配置分散分析またはスチューデントのt検定によって決定した。図S6の追加情報を参照。

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TAAR1阻害は腸内細菌異常によって誘導されるインスリン抵抗性を緩和する
次に、TAAR1の薬理学的拮抗作用が耐糖能とインスリン抵抗性に及ぼす影響を、R. gnavusを含む腸内細菌叢と、トリプタミンとフェネチルアミンの濃度が高く、TyG指数が高いIBS患者の糞便微生物叢によって誘導された抗生物質投与マウスで検討した。無菌マウスにおけるこれまでの知見と同様に、R. gnavusをコロニー形成させた抗生物質投与マウスは、インスリン感受性の低下と耐糖能障害を示し、R. gnavusのこれらのインスリン感受性の低下作用はEPPTB投与により部分的に消失した（すべての症例でp＜0.05、図7A-C）ことから、TAAR1の阻害はR. gnavus誘導性のインスリン抵抗性を緩和することが示された。次に、糞便微生物叢移植試験を行ったところ、トリプタミンおよびフェネチルアミン濃度が高いIBS患者の糞便微生物叢も、抗生物質投与マウスにおいて耐糖能異常を示した（すべての症例でp＜0.05、図7Dおよび図S7A）。この知見に続いて、マウスにおけるTAAR1の遺伝子破壊もまた、TyGインデックスが高く、トリプタミンおよびフェネチルアミンレベルが高いIBS患者の糞便微生物叢によって誘導される耐糖能異常を有意に抑制することを示した（すべてのケースでp＜0.05、図7Eおよび図S7B）。

図7：TAAR1阻害はトリプタミンおよびフェネチルアミン産生菌によって誘導されるインスリン抵抗性を緩和する。
図7
A, B R. gnavus ATCC 29149によるコロニー形成およびTAAR1拮抗薬EPPTB（10 mg/kg）によるi.p.投与後の抗生物質投与マウスにおけるOGTTおよびITT指数（n = 6/群）。*コントロール群とトリプタミン群（10 mg/kg）の比較。#トリプタミン群とトリプタミン+TAAR1拮抗薬（EPPTB）群との比較。C 抗生物質投与マウス（各群n = 3）の肝臓溶解液におけるインスリン（1 U/kg）によって刺激されたAKT活性化に対するR. gnavus ATCC 29149およびTAAR1拮抗薬EPPTB（10 mg/kg）の効果のウェスタンブロット（および定量）。D 抗生物質投与マウスに、トリプタミンおよびフェネチルアミン濃度が低いか高いHCおよびIBS被験者の糞便微生物叢を移植した後のOGTT指数（n = 6/群）。*HC低トリプタミンおよびPEA群とIBS高トリプタミンおよびPEA群との比較。#IBS低TM・PEA群とIBS高TM・PEA群との比較。E 抗生物質を投与したマウスに、TyG指数が低値または高値のIBS被験者の糞便微生物叢を移植した後のOGTT指数（n = 6/群）。データは平均値±S.D.で示した。P値は両側普通の一元配置分散分析またはスチューデントのt検定により決定した。図S7の追加情報を参照。

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考察
腸内細菌叢とヒトの代謝の健康との間に因果関係があることを示唆する証拠が増えている。最近の横断研究（合計n = 5215）では、R. gnavusが、種レベルで同定された50種の有病腸内微生物の中でメタボリックシンドロームの特徴と最も強い関連性を持つことが示された14。しかし、メタボリックシンドロームに対するR. gnavusの因果関係やその発症機序については、まだ解明されていない。トリプタミン／フェネチルアミンを介するTAAR1シグナル伝達経路が、R. gnavusによるインスリン抵抗性の基礎となる重要な分子軸であることを明らかにした今回の知見は、IBSにおけるメタボリックシンドローム有病率増加の分子メカニズムを説明する上で最も重要である。

本研究では、トリプタミン/フェネチルアミンとインスリン抵抗性の相関を明らかにするために、ヒトだけでなく、メタボリックシンドロームの前臨床モデルであるサルを用いた。第一に、T2Dの食事、化学物質、遺伝学的に誘導された動物モデルとは異なり、サルは高血糖、高脂血症、インスリン抵抗性を特徴とするヒトのメタボリックシンドロームの主要な特徴に非常に類似したメタボリックシンドロームを自然に発症する。第二に、実験サルを用いた研究では、年齢、抗糖尿病薬、食事パターンなど、ヒトの研究で腸内細菌叢に影響を与えうる交絡変数の影響を受けない。腸内細菌叢の組成は、地理的な場所、人種、民族によってかなり異なる可能性がある一方で、腸内細菌代謝産物のプロファイルは高度に保存されている25。このことから、腸内細菌と腸内細菌代謝産物を組み合わせて用いることは、ヒトの疾患の予後や診断に技術的な利点をもたらすことが示唆される。正常および糖尿病サルの糞便懸濁液をHFD飼育マウスに投与することにより、自然発症の糖尿病サルにおける腸内細菌異常症も耐糖能異常の発症に寄与することが示された。

作用機序の観点から、R. gnavus由来のトリプタミンおよびフェネチルアミンは、TAAR1-MAPK/ERKシグナル伝達経路の活性化を介してインスリン感受性を低下させ、腸内細菌叢異常に伴うIBSおよびT2Dのインスリン抵抗性に寄与することを明らかにした。TAAR1は、トリプタミン、フェネチルアミン、チラミンなどの腸内微生物由来の芳香族微量アミンによって活性化されるアミン活性化Gタンパク質共役型受容体である26。最近、TAAR1の内因性活性化因子（3-ヨードチロナミン）が、β細胞におけるインスリン分泌を促進することにより血糖コントロールを改善することが示された27。本研究では、トリプタミンとフェネチルアミンがインスリン分泌を促進することも示したが、TAAR1活性化剤であるトリプタミンとフェネチルアミンは急性および長期暴露によりインスリン感受性を低下させるので、TAAR1モジュレーターの血糖コントロールへの薬理学的使用は慎重に検討されるべきである。MAPK/ERKシグナル伝達経路は、メタボリックシンドロームやT2Dに関連したインスリン抵抗性の発現に関与している。ERK活性は、糖尿病状態のヒトおよびげっ歯類のWATで上昇し28,29、ERKシグナル伝達経路の活性化は、インスリンシグナルの主要なメディエーターの発現を有意に低下させる。さらに、特定の化学阻害剤を用いたERK経路の阻害は、db/dbマウスやHFD飼育マウスにおけるインスリン抵抗性の緩和に有効である30。TAAR1の活性化は、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIやMAPK/ERKキナーゼ1/2（MEK1/2）を含むMAPKカスケードの活性化につながる27。我々は、トリプタミンとフェネチルアミンのERK活性化作用とインスリンシグナル伝達経路阻害作用が、TAAR1アンタゴニストとTAAR1の遺伝子欠損によって消失することを示し、TAAR1-MAPK/ERKシグナル伝達軸を標的とすることが、R. gnavus誘発インスリン抵抗性に対する潜在的な治療戦略であることを示した。

TAAR1以外にも、AhRや5-HTR4などいくつかのトリプタミン受容体が同定されている31,32。しかし、トリプタミンが介在するERKの活性化は、3T3-L1細胞ではAhRや5-HTR4に対するアンタゴニストでは抑制されなかったことから、TAAR1が支配的な役割を果たしていることが示唆された（図S6G）。トリプタミンとその代謝産物であるIAAはAhRシグナルのアゴニストであるが32、血清中のIAA濃度はトリプタミンの約40-100倍であることから、IRの制御に対するAhR活性化の有益な効果は、主にIAAによって媒介されると考えられる（図S5A, B）。重要なことは、IAAを投与しても正常マウスの耐糖能やインスリン感受性は低下しなかったことである（図S4J）。このことは、腸内細菌叢の組成変化によって誘導される代謝異常は、主にトリプタミン/TAAR1シグナル伝達軸によって媒介されるが、T2Dの文脈ではIAA/AhRシグナル伝達軸によって媒介されないことを示唆している。我々はまた、トリプタミンおよびフェネチルアミン誘導性インスリン抵抗性におけるセロトニンの役割を決定し、TPH1の化学的阻害剤LX-1031を用いてセロトニン合成を阻害しても、トリプタミンの急性投与による耐糖能の抑制効果には影響しないことを明らかにした（図S6H）。このin vivoでの所見と並行して、我々は、セロトニンを産生しないin vitro細胞株モデルである3T3-L1脂肪細胞において、トリプタミン／フェネチルアミンが時間依存的にインスリンシグナル伝達を直接阻害することを示した。しかし、末梢のセロトニン生合成を阻害すると肥満と代謝機能障害が減少し33、腸管EC細胞から循環系へのセロトニン放出は肥満と2型糖尿病を増加させることから34、セロトニンはインスリン感受性の調節にも重要な役割を果たしている。したがって、トリプタミン／フェネチルアミンによるセロトニンの刺激も、長期的にはインスリン抵抗性の発現に寄与する可能性がある。このことは、TAAR1リガンドとしてのトリプタミンとフェネチルアミンが犯人であることを示唆しており、治療アプローチをデザインする一つの可能性は、R. gnavusの減少を促進するか、あるいは細菌のTDCを阻害することによってトリプタミンとフェネチルアミンの産生をブロックすることである。

R.gnavus由来のトリプタミンとフェネチルアミンがIBSにおけるインスリン抵抗性の発症に寄与しているというメカニズム的洞察に加え、Blautia hansenii、Enterocloster (Clostridium) boltae、Enterococcus faecalisなど様々な細菌種がトリプタミンとフェネチルアミンを産生することが最近の研究で示されている16,33。これらのトリプタミンおよびフェネチルアミン産生菌種の中で、R. gnavusは芳香族アミノ酸を芳香族微量アミン（トリプタミン、チラミン、フェネチルアミン）に変換する触媒能力が、他の菌種に比べて最も高い33。IBSにおけるインスリン抵抗性の発症に関与する腸内細菌異常症の役割をさらに明らかにするために、我々はまた、IBS患者におけるこれらの細菌、トリプタミン／フェネチルアミン、およびインスリン抵抗性の指標との関連を調べ（図S7C-H）、メタボリックシンドロームにおける他のトリプタミンおよびフェネチルアミン産生菌B. hanseniiの存在量の増加を支持する証拠を提供した。細菌性TDCが多くの細菌株に存在することを考えると、R. gnavusやB. hanseniiのようなトリプタミンおよびフェネチルアミン産生菌の存在量を減らすか、トリプトファン脱炭酸酵素を阻害するか、トリプタミン/TAAR1シグナル伝達を遮断することによって、トリプタミンおよびフェネチルアミンレベルを調節する治療的アプローチが実行可能かもしれない。

興味深いことに、我々の研究では、食物繊維の介入により、T2D被験者におけるトリプタミンおよびフェネチルアミンのレベルとR. gnavusの存在量が有意に抑制されることが示され、食事の変化やプレバイオティクスによる腸内細菌叢由来のトリプタミンおよびフェネチルアミンの操作が、メタボリックシンドロームやIBSを管理するための潜在的な方向性であることが明らかになった。我々は、トリプタミンおよびフェネチルアミンのダウンレギュレーションを伴うR. gnavusの減少が、インスリン抵抗性の改善と正の相関があることを示した。食品、腸内細菌叢、代謝ホメオスタシスの相互作用に関する知見を考慮すると、代謝性疾患の発症リスクを軽減するために、全身的な観点から食事を管理することは、重要な治療戦略となる可能性がある。トリプタミンとフェネチルアミンのレベルを調節するために、高繊維食や低トリプトファン/フェニルアラニン食など、食事の側面から適切な管理プロトコルを特定するためには、そのメカニズムに関するさらなる詳細が必要である。

以上より、R. gnavusとそれに由来するトリプタミンおよびフェネチルアミンは、IBSおよびメタボリックシンドロームにおけるインスリン抵抗性の発症に重要な因子であることが示された。今後、メタボリックシンドロームと胃腸障害の異なるコホートにおいて、また異なる地理的地域において、これらの因子の治療およびインスリン抵抗性予測における相対的重要性を明らかにしていく予定である。

研究方法
サル研究
最初のカニクイザル（Macaca fascicularis）メタボロミクス研究は、Yunnan Yinmore Biotechnology company（中国、昆明市）の倫理承認（No.YMB1704）を得て実施した。サルの糖尿病の診断は、公表されている基準34,35,36に基づいて行った。具体的には、年齢をマッチさせた（10～23歳）サルを、正常（FBG＜75mg/dL、Hb1Ac＜3.5％と定義）、糖尿病予備軍（FBG80～130mg/dL、Hb1Ac4.0％～6.0％）、糖尿病（FBG＞130mg/dL、Hb1Ac＞6.0％）に分類した（各群n＝26）。血清と糞便を含む生物学的サンプルを採取し、分析まで-80℃で保存した。第二のカニクイザル（n = 5、11～21歳）介入試験は、Huazhen Biosciences company（広州、中国）の倫理承認（No.HZ2021047）を得て実施した。トリプタミン投与前後にOGTTおよび血清インスリン値を含む生化学的パラメーターを測定した。これらの試験中、カニクイザルに抗糖尿病薬の投与は行わなかった。

マウス試験
すべてのマウス試験は、香港バプティスト大学（中国・香港特別行政区）の「教育・研究におけるヒトおよび動物被験者の使用に関する委員会（Committee on the Use of Human & Animal Subjects in Teaching & Research）」によって承認され、中国・香港特別行政区保健局の「動物（実験管理）条例（Animals (Control of Experiments) Ordinance of the Department of Health, Hong Kong SAR, China）」に従って実施され、ARRIVEガイドライン37に従って報告された。6～8週齢、体重20～25gの雄性C57BL/6 Jマウスを香港中文大学実験動物サービスセンター（香港特別自治区、中国）から購入した。マウスは12時間の明暗サイクルで飼育され、温度は25℃前後、湿度は60%に制御され、餌と水は自由に摂取できた。

抗生物質投与マウスは、バンコマイシン50 mg/kg、ネオマイシン100 mg/kg、メトロニダゾール100 mg/kg、アンピシリン100 mg/kg、ストレプトマイシン50 mg/kgを含む抗生物質カクテルを用い、既報38と同様に9日間（1日1回）経口投与した。抗生物質カクテルの投与は、糞便微生物叢移植の18時間前に中止した。糞便微生物叢移植実験中は抗生物質の投与を中止した。無菌マウスはNanjing GemPharmatech Co.から購入し、無菌マウスを用いたモノアソシエーションスタディは、既報39と同様に滅菌プラスチックアイソレーターで行った。

Taar1（NM_053205）ノックアウトマウス（C57BL/6 J）はCRISPR/Casを介したゲノム工学を用いて作製し、Cyagen Biosciences (Suzhou) Inc.から提供された。Taar1ノックアウトマウスおよびその野生型同腹子は、以下のプライマー（F1： gacaaaacgtagttggaagactga, r1： gtgtgcctagaaaccttaacatctg, r2： aatgtttgtgatagcgtggcaaag）。

ヒト試験
健康なボランティアとIBS患者を対象とした最初のコホート40研究は、香港バプティスト大学の倫理委員会によって承認された（HASC/15-16/0300およびHASC/16-17/0027）。参加者全員から書面によるインフォームド・コンセントに署名し、同意を得た。病的肥満、糖尿病、空腹時血糖値が7.0mmol/Lを超える被験者は本研究から除外された。

健常対照者とT2D被験者からなる第2コホート41は、上海交通大学付属第六人民病院の研究倫理委員会の承認を得た。参加者全員から文書によるインフォームド・コンセントを得た。空腹時血糖値＜6.1mmol/Lの被験者は健常対照（HC）に分類され、空腹時血糖値＞7.0mmol/LまたはOGTT（2時間）＞11.1mmol/Lの被験者はT2Dに分類された。

第3コホートGUT2D研究20は、上海交通大学生命科学・生物工程学院の倫理委員会により承認された（Ref ID：2014-016）。参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。試験は中国臨床試験登録（ChiCTR-TRC-14004959）に登録された。T2Dの参加者は、アカルボース＋通常食（対照；U群）またはアカルボース＋WTP食（介入；W群）のいずれかを84日間受けた。

本試験のデザイン、実施、報告、普及計画にはすべての患者/一般市民は関与していない。

細胞試験
3T3-L1脂肪細胞（ATCC CL-173）を10％（v/v）FBS添加DMEM中で培養・維持した。グルコース取り込みアッセイのために、3T3-L1細胞を3時間血清およびグルコース飢餓状態にした後、グルコース、FBS、インスリン、トリプタミンと30分間インキュベートした。インスリンシグナル伝達に対するトリプタミンの影響を評価するため、3T3-L1細胞をトリプタミン、ERK阻害剤、またはTAAR1拮抗剤EPPTBで前処理した後、指示濃度のインスリンで処理した。インスリンシグナル伝達に対するIAAの効果は、3T3-L1細胞をIAAで、またはIAAなしで処理した後、インスリンで指定時間処理することにより評価した。トリプタミン、U0126、EPPTBはDMSOに100mMで溶解し、ストック溶液とした。cAMP測定では、3T3-L1細胞をEPPTBで60分間前処理した後、トリプタミンで指定時間処理した。

菌株培養
トリプタミン産生ラクトバチルス・カゼイは、Ruminococcus gnavus由来のトリプトファン脱炭酸酵素（TDC）遺伝子を用いて構築した。TDC遺伝子をベクターにクローニングし、得られたプラスミドを既述の方法でL. caseiに導入した42。L.カゼイへのTDC遺伝子の挿入が成功したことは、PCRと、0.25%のトリプトファンを含むMRSブロスで培養したときのトリプタミンの産生によって確認された。L. casei TDC+およびベクターのみのL. caseiを、エリスロマイシン（50μg/mL）を含むMRS寒天プレートで培養し、さらにMRSブロスで培養した。L. casei TDC+およびベクターオンリー投与のため、L. caseiを3000rpm、10分間、室温で遠心分離して培地から回収した。300μLの滅菌PBSでL. casei接種液を調製し、抗生物質投与マウスに経口投与した。

TDCプラスミドの決定に用いたプライマーは以下の通りである（F1：CGGTCCTCGGATGATAAGA；R1：GACCCTCCGCTTACAAAGAC）。

サンガー配列決定に用いたプライマーは（F1： CGCTCGATGATAAGA；R1： gaccctccgcttacaaagac; r2： aggcagctgatctcaacaatg）である。

研究方法の詳細
試薬とリソース
試薬とリソースの詳細は（補足データ4）に記載されている。

糞便懸濁液の投与
サルの糞便サンプルは、約10 gの糞便サンプルを5×滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS、m/v）と混合し、糞便懸濁液としてホモジナイズした。HFD飼育マウス（HFD投与8週）に、サルから検出されたトリプタミンとフェネチルアミンの生理的範囲に合わせて、正常サルおよび糖尿病サル由来の糞便懸濁液を1日4g/kg、5日間経口投与した。5日目、12時間の絶食後、OGTTを行い、レシピエントマウスの耐糖能に対するサル由来の糞便懸濁液の影響を調べた。

糞便微生物叢移植
ヒトの糞便サンプルについては、約2gの新鮮糞便サンプルを5×滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS、m/v）と混合し、糞便微生物叢懸濁液としてホモジナイズした。抗生物質投与マウスには、300μLの糞便微生物叢懸濁液を5日間経口投与した。3日目、12時間の絶食後、OGTTを行い、ヒト由来の糞便微生物叢がレシピエントマウスの耐糖能に及ぼす影響を調べた。

メタボロミクス研究
約150mgの糞便を20倍量の70％メタノール（m/v）で抽出し、スチールビーズでホモジナイズした。その後、サンプルを14,000rpm、4℃で15分間遠心した。約200μLの上清をLC-MS分析用に新しいチューブに移した。等量の各サンプルを混合して、プールされた品質管理（QC）サンプルを調製した。標的メタボロミクスには、トリプル四重極（QQQ）6460 質量分析計に結合した Agilent UPLC システムを使用しました。プレカラムには Waters BEH 2.1×100 mm C18 1.7 μm カラムを使用しました。LC-MS-QQQで使用した移動相は、A：0.1%ギ酸含有水、B：0.1%ギ酸含有アセトニトリル。勾配は、2% B (0-0.5分)、2-30% B (0.5-4分)、30-100% B (4-6分)、100% B (6-8分)、100-2% B (8-8.1分)とし、2% B (8.1-10分)で維持した。標準物質リスト、MRMトランジションおよびリテンションタイムは（補足データ5）に記載されている。LC-MS データの収集と解析には、Agilent MassHunter Workstation ソフトウェアを使用しました。

糞便サンプルのバッチ培養
約50 mgの糞便サンプルを20倍量の滅菌1×PBS（m/v）と混合し、スチールビーズでホモジナイズした。この糞便懸濁液（20μL）を、0.25%トリプトファンを添加した2mLのTryptic Soy Broth（TSB）に接種し、37℃の嫌気条件下で一晩培養した。培養後、培地100μLを使用し、LC-MSの血清プロトコールに従って、LC-MS分析によるトリプタミンの定量を行った。

グルコースおよびインスリン負荷試験
経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）のために、マウスを12時間（一晩）絶食させ、トリプタミン、ERK阻害剤、TAAR1拮抗剤またはIAAを指示された投与量で投与した。30分後、マウスに2g/kgのグルコースを投与した。グルコース負荷後0、15、30、60、90、120分に、尾静脈から血液サンプルを採取し、Accu-Chekグルコースメーターでグルコースを測定した。インスリン負荷試験（ITT）では、マウスを4時間絶食させ、トリプタミン、ERK阻害剤、TAAR1拮抗剤を指示された投与量で投与した。30分後、インスリン（1U/kg）をマウスに腹腔内注射した。血糖値はOGTTに従って測定した。血清インスリンとTGの測定には、トリプタミン投与120分後に血清を採取した。

トリプタミンの組織分布
トリプタミンを5 mg/kg（0.5％CMC-Naに溶解）の用量でマウスに経口投与した。15分後、マウスをイソフルランで安楽死させ、頸椎脱臼により犠牲にした。血清、肝臓、骨格筋、WATを採取し、分析まで-80℃で保存した。約80mgの生体組織を20倍量の70%メタノール（m/v）で抽出し、スチールビーズでホモジナイズした。サンプルを14,000rpm、4℃で15分間遠心した。約200μLの上清をLC-MS分析用に新しいチューブに移した。

リン酸化プロテオミクス研究
マウスを4時間絶食させ、トリプタミンまたはビヒクルを経口投与した。WAT組織をリン酸化プロテオミクス研究用に採取した。TMT標識リン酸化プロテオミクス研究に使用したマウス組織サンプルは、既報のように調製した43。TMT標識ペプチドの分離には、Acclaim PepMap RSLCカラム（50μm×15cm）を備えたEasy nLCシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いた。LC-MS-Orbitrapで使用した移動相は、A：0.1%ギ酸を含む水、B：0.1%ギ酸を含む80%アセトニトリル、20%水であった。溶出勾配は、0-6%緩衝液Bで0-5分、6-28%緩衝液Bで5-45分、28%-38%緩衝液Bで45-50分、38-100%緩衝液Bで50-55分、100%緩衝液Bで50-60分維持した。得られたMS/MSスペクトルはProteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific)で処理し、MASCOT engine 2.6で検索した。すべてのタンパク質配列は、UniProt (http://www.uniprot.org)からダウンロードしたMusculusデータベースにアライメントした。フォールドチェンジが1.2以上または0.8未満で、p値が0.05未満のタンパク質を差次的発現タンパク質とみなした。KOALA (KEGG Orthology And Links Annotation)を用いてKEGGパスウェイのアノテーションを行い、有意に濃縮されたパスウェイを同定した。

タンパク質解析
凍結組織と採取した細胞は、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたRIPAバッファーで溶解した。ウェスタンブロッティングのために、細胞溶解液と組織溶解液を4℃で15,000rpm、15分間遠心した。上清を5×ローディングバッファーと混合し、98℃のドライバスで10分間加熱した。その後、製造元の指示に従って、サンプル中の標的タンパク質を検出した。ブロットをHRP結合抗ウサギIgGまたは抗マウスIgGでインキュベートし、増強化学発光で反応させた。ウエスタンブロットからのタンパク質バンドの定量は、Image Jを用いて解析した。

トリプタミン産生菌の特性解析
Ruminococcus gnavus（ATCC 29149/VPI C7-9株）とClostridium sporogenes（ATCC 15579株）の2つの参照トリプトファン脱炭酸酵素配列をENAからダウンロードした（A7B1V0とJ7SZ64）16。これら2つの参照配列間の同一性は、BLASTPに基づいて26％であった。GUT2Dデータセットに含まれる可能性のあるトリプトファン脱炭酸酵素配列を同定するために、BLASTPを使用して、GUT2D研究で構築された非冗長マイクロバイオーム遺伝子カタログ20に対して2つの参照配列を整列させた。アラインメントはE値＜1e-5、同一性＞30%でフィルタリングした。糞便中の代謝産物と5つの共存量グループの存在量との相関係数の反復測定は、前述の方法で算出した44。

定量および統計解析
データは少なくとも3反復の平均値とSDまたはSEM値で表した。P値はGraphPad Prism 8を用いて計算し、0.05未満のP値は統計的に有意であるとみなした。Wilcoxon rank-sum検定（片側検定または両側検定）は、T2Dの有無によるメタボロームデータの差異を判定するために使用した。その他の設定では、対にならないスチューデントのt検定または一元配置分散分析（one-way ANOVA）を指定されたとおりに採用した。臨床研究の場合、統計的手法およびランダム化方法は、上記の研究プロトコールに適宜記載されている。基礎研究については、サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いず、解析から除外したデータはない。実験は無作為化されておらず、治験責任医師は実験中および結果評価中の割り付けについて盲検化されていない。

報告の要約
研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されている。

データの入手可能性
本研究で得られた知見を裏付けるすべてのデータは、論文および補足情報内で入手可能である。ソースデータは本論文のSource Dataファイルとして提供される。本研究では、フェネチルアミンとトリプタミンを生産できるラクトバチルス・カゼイ菌株を作製した。ベクターコントロールと操作したL.casei細菌株は、Zhao-Xiang Bian（bzxiang@hkbu.edu.hk）を介して入手することができる。IBS研究40の糞便メタゲノムシークエンスデータは、CNGB Nucleotide Sequence Archive (https://db.cngb.org/cnsa/)からアクセッション番号CNP0000334で入手できる。GUT2D study20の糞便メタゲノムシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveからアクセッション番号PRJEB14155で入手できる。リン酸化プロテオミクスのデータは、ProteomeXchangeを通じてPXD044161という識別子で入手できる。リソースや試薬に関するさらなる情報およびその他のリクエストは、Zhao-Xiang Bianに直接連絡することができ、Zhao-Xiang Bianが対応する。

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謝辞
)、国家中医薬品質研究重点実験室（マカオ大学）公開研究プロジェクトプログラム(SKL-QRCM-OP21008 to CY.L.)、深圳市科学技術革新委員会(JCYJ20190808164201654 to HT.X.)に感謝する。また、Vincent and Lily Woo Foundationの支援にも感謝する。本研究のために検体を提供してくださったすべての患者および健常ボランティアに感謝する。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Lixiang Zhai、Haitao Xiao、Chengyuan Lin、Hoi Leong Xavier Wong、Yan Y. Lam. Lam。

著者および所属
香港バプティスト大学漢方薬開発センター、香港特別行政区、中国

Lixiang Zhai、Chengyuan Lin、Yan Y. Lam, Ziwan Ning, Chunhua Huang, Jingyuan Luo & Zhao-Xiang Bian

香港バプテスト大学中医薬学院、香港特別行政区、中国

Lixiang Zhai、Hoi Leong Xavier Wong、Ziwan Ning、Chunhua Huang、Yijing Zhang、Jingyuan Luo、Johnson Yiu-Nam Lau、Aiping Lu、Lok-Ting Lau、Zhao-Xiang Bian

中国深圳市深圳大学健康科学センター薬学院

蕭海涛

中国・上海交通大学生命科学・生物工程学院微生物代謝国家重点実験室・教育部システム生物医学重点実験室

ゴン孟薛・チャンチェンホン

生化学・微生物学科、ニュージャージー食品・栄養・健康研究所。米国ニュージャージー州ニューブランズウィック、ラトガース大学環境・生物科学部

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香港バプティスト大学コンピューターサイエンス学部（中国・香港特別行政区

チャオ・ヤン & ルー・チャン

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趙玲

香港バプティスト大学中医薬学院フェノーム研究センター（中国・香港特別行政区

Wei Jia

上海交通大学附属第六人民病院糖尿病重点実験室およびトランスレーショナル医学センター（中国・上海市

ウェイ・ジア

貢献
構想： Z.X.B.、L.P.Z.、W.J.、J.Y.N.L. 方法論：調査：L.X.Z.、H.T.X.、Y.Y.L.、H.L.X.W： L.X.Z.、H.T.X.、C.Y.L.、M.X.G.、Z.W.N.、G.J.W.、Y.S.D.、C.Y.、C.H.H.、Y.J.Z.、J.Y.L. 可視化： L.X.Z.、C.Y.L.、H.L.X.W. 資金獲得：プロジェクト管理：L.X.Z.、J.Y.L.、H.L.X.W：監督：L.X.Z.、J.Y.L.、Y.Y.L.、H.L.X.W： L.Zhang、L.Zhao、C.H.Z.、A.P.L.、L.T.L. 執筆-原案： L.X.Z.、H.T.X.、C.Y.L.、H.L.X.W. 執筆-校閲・編集： Z.X.B.、L.P.Z.、W.J.、J.Y.N.L.、Y.Y.L.

共著者
Wei Jia、Liping ZhaoまたはZhao-Xiang Bianまで。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communications誌は、本研究の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

追加情報
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この記事を引用する
Zhai, L., Xiao, H., Lin, C. et al. 腸内細菌叢由来のトリプタミンおよびフェネチルアミンは、メタボリックシンドロームおよび過敏性腸症候群におけるインスリン感受性を損なう。Nat Commun 14, 4986 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40552-y

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受領
2023年2月15日

受理
2023年7月31日

掲載
2023年8月17日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-40552-y

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