糞便微生物叢移植と短鎖脂肪酸の補充は、腸内細菌叢、Th17細胞の分化、ミトコンドリアエネルギー代謝を調節することにより慢性脳低灌流による大腸機能障害から保護される

公開日：2022年12月26日
糞便微生物叢移植と短鎖脂肪酸の補充は、腸内細菌叢、Th17細胞の分化、ミトコンドリアエネルギー代謝を調節することにより慢性脳低灌流による大腸機能障害から保護される

https://link.springer.com/article/10.1186/s12974-022-02675-9

Shao-Hua Su, Yi-Fang Wu, ...Jian Hai 著者を表示する。
Journal of Neuroinflammation 19巻、記事番号：313（2022）この記事を引用する

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2 アルトメトリック

指標詳細

概要
背景
慢性脳低灌流状態（CCH）における腸内細菌叢と腸管障害の関連についてはほとんど知られていない。そこで，腸内細菌叢および代謝産物である短鎖脂肪酸（SCFA）のCCH後の腸管機能への影響とその機序について検討した．

方法
ラットに両側総頸動脈閉塞術（BCCAo）を施し、CCHを誘発した。腸内細菌叢およびSCFAs代謝産物は、それぞれ16S rRNAシーケンスおよびターゲットメタボロミクスによって評価された。また、大腸組織のトランスクリプトーム解析も行った。その後、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光分析により、潜在的な分子経路と発現量の異なる遺伝子を検証した。さらに、ヘマトキシリン・エオジン染色、ムチン2染色、タイトジャンクションタンパク質の発現レベルにより、大腸バリアの完全性を評価した。その上、大腸の炎症はさらにフローサイトメトリーと炎症性サイトカインの発現レベルによって評価された。さらに、大腸ミトコンドリア機能障害は、膜電位、活性酸素種、電子輸送鎖（ETC）活性、アデノシン三リン酸量、およびミトコンドリア超微細構造により解析された。

結果
CCHは腸内細菌組成およびSCFAsの微生物代謝を変化させ、ミトコンドリアETC活性および酸化的リン酸化の阻害と関連し、ミトコンドリアのエネルギー代謝の調節不全につながった可能性がある。さらに、CCH は病原性 Th17 細胞の分化を誘導し、インターフェロン制御因子 4 と signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) の複合体形成を促進し、STAT3 のリン酸化を増加させた。これは、大腸バリア機能の障害と慢性的な大腸の炎症と関連していた。一方、FMT と SCFA 補給は、Ruminococcus_sp_N15_MGS_57 の腸内含量を増加させ、酢酸含量を増加させることにより SCFA の微生物代謝を調節し、Treg と Th17 細胞のバランス、ミトコンドリア ETC 活動、酸化的リン酸化を改善し、CCH による腸内細菌異 常を改善するとともに大腸炎およびミトコンドリアエネルギー代謝異常を予防することが示された。

結論
以上の結果より，FMTおよびSCFA補給は，慢性脳虚血下の大腸機能障害に対する有望な治療戦略であることが示唆された．

はじめに
慢性的な脳血流低下状態である慢性脳虚血（CCH）は，脳虚血によるアポトーシス，炎症，過剰なオートファジーを介して，様々な脳血管疾患や認知機能障害の病態と関連する[1,2,3,4,5]．したがって，CCHに対する防御は，慢性脳虚血の治療戦略として有効である可能性がある．CCHへの介入は，エンドカンナビノイド系，コリン作動性神経系，adiponectin，レプチン受容体などの標的が考えられている[3, 6, 7, 8]．しかし，これらの治療法は，あくまで脳虚血による神経細胞傷害を対象としたものである．CCIは頭蓋内損傷だけでなく，便秘，便失禁，消化管出血などの消化器系合併症も引き起こす[9]．CCIに伴う消化器症状は最近注目されているが，その基礎的なメカニズムを解明するためにはさらなる調査が必要である．

腸内細菌叢は、ヒトの宿主と共生する多様な細菌種から構成されています。腸内細菌叢の健全性と安定性は、恒常性のバランスを維持するために極めて重要です。微生物叢-腸-脳軸に沿った双方向コミュニケーションにおける微生物叢の機能的効果を支持する証拠が増えている [10] ．研究では、腸脳軸に対する腸内細菌叢の影響と、多発性硬化症、パーキンソン病、自閉症、アルツハイマー病、うつ病、統合失調症などの中枢神経系の疾患における潜在的な役割が強調されている [11,12,13,14]．しかし、これらの疾患における腸内細菌叢の役割については、依然として議論の余地がある。最近の研究では、虚血性脳卒中が腸内細菌叢の組成の変化を誘発することが確認されているが [15, 16] 、CCIによる修飾腸内細菌叢と腸管損傷の関連についてはほとんど知られておらず、CCHによって修飾された腸内細菌叢による腸機能の調節の基礎となるメカニズムも特徴付けられてはいない。したがって、これらの相互作用をよりよく理解することは、CCHによる腸管機能障害の治療のための新しい治療標的を提供する可能性がある。

短鎖脂肪酸（SCFA）は、主に酢酸、プロピオン酸、酪酸からなる腸内代謝の重要な産物であり [17] 、食事および栄養成分の腸内細菌叢による発酵に由来するものである。経口補充と糞便微生物叢移植（FMT）の両方が、腸の機能不全から保護するために、腸内のSCFAsの含有量を増加させることができます[18]。しかし，我々の知る限り，FMTおよびSCFAがCCH誘発性腸管障害に及ぼし得る効果およびメカニズムはまだ解明されていない．腸内細菌叢やSCFAがCCH誘発腸管障害に対してどのように直接的または間接的に効果を発揮するのかは、まだ明らかにされていない。したがって、腸内細菌叢およびSCFAが腸機能に及ぼす影響を明らかにすることは、CCI後の腸管障害に対する微生物を用いた治療戦略の開発にとって重要な意味を持つと考えられる。

そこで本研究では、CCIによる腸管機能障害の治療に新たな知見を提供するために、CCH後の腸内細菌叢およびSCFAsの腸管機能への影響を調べ、潜在的なメカニズムを探索することを目的とした。

材料および方法
動物および実験プロトコール
雄のSprague-Dawleyラット（年齢、5週、体重、180±10g）は、上海実験動物資源センター（中国、上海）および上海SIPPR-Bk実験動物有限公司（中国、上海）より購入した。Ltd. (中国、上海)から購入した。実験に先立ち、ラットは温度23±1℃、湿度60％の恒温恒湿施設に、12時間の昼夜サイクル（午前8時半から午後8時半まで点灯）で収容し、水と標準ラット用飼料を自由に摂取できるようにした。1週間の順化後、ラットを4つのグループのいずれかにランダムに割り当てた［SCFAの標的メタボロミクスには1グループあたり5匹、RNA配列決定には1グループあたり3匹、病理組織学的分析または免疫蛍光染色（ジヒドロエチジウム（DHE）染色には1グループあたり3匹）には1グループあたり5匹のラット。ウェスタンブロットまたは免疫沈降法（IP）は1群4匹（IPは1群3匹）；酵素結合免疫吸着法（ELISA）または生化学検査は1群5匹；フローサイトメトリーは1群3匹]とした。(1）偽手術群；（2）両側総頸動脈閉塞（BCCAo）群；（3）BCCAo＋FMT群；または（4）BCCAo＋SCFAs群。

4群すべてのラットを12週間後に犠牲にした。新鮮な糞と結腸の組織は、実験のために直ちに採取されるか、後の使用のために-80℃で保存された（Fig.1）。動物を用いたすべての実験は、同済病院動物実験委員会（中国・上海）の承認を受け、Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに準拠して実施された。

Fig.1
図1
実験手順のタイムライン。ラットは、偽薬、BCCAo、BCCAo＋FMT、BCCAo＋SCFAを含む4群に無作為に分けられた。ラットは、これらの4つのグループで異なる介入を12週間受けた後、その後の実験のために犠牲にされた。ABX抗生物質投与

フルサイズ画像
BCCAoの手順
8-12週目のBCCAoは、ラットのCCHを維持するのに十分であり、ヒトのCBFの低下に最もよく似ている[19]。本研究では、12週間をCCHの最大慢性低灌流期として選択した。我々の以前の研究 [3] で述べたように、各ラットはペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg）の腹腔内注射により麻酔された。正中線を切開して両側総頸動脈を露出させ、5-0絹糸でしっかりと二重結紮した。偽手術群のラットも同様の処置を受けたが、両側総頸動脈の結紮は行わなかった。

抗生物質治療とFMT
以前の研究[20]で述べたように、BCCAo＋FMT群のラットは、腸内細菌叢を枯渇させるために抗生物質処理（バンコマイシン、100mg/kg；硫酸ネオマイシン、200mg/kg；メトロニダゾール、200mg/kg；およびアンピシリン、200mg/kg）を毎日4日間胃内投与された。FMT実験について：偽手術群の各ラットから便サンプルの新鮮な糞を朝採取し、混合した。次に、偽手術群の混合便を滅菌生理食塩液に100 mg/mLに再懸濁し、直ちにFMTに使用した。その後、ホモジネートをナイロンフィルター（ポアサイズ、20μm）に通し、大きな粒子状物質や繊維状物質を除去した。糞便液を回収し、レシピエントラットに毎日2mLを12日間、胃内投与した[21]。介入後の腸内細菌叢が時間の経過とともに構造的にも機能的にも徐々に初期状態に近くなることを避けるため［22］，3日に1回，12週間にわたって胃内投与が繰り返された．

SCFA処理
BCCAo＋SCFAs群のラットには、既報の通り［23］、SCFAsのカクテル（酢酸ナトリウム、67.5 mM；プロピオン酸ナトリウム、25.9 mM；酪酸ナトリウム、40 mM；Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO, USA）を無菌リン酸緩衝食塩水（PBS）中、体重10 gに対して 0.1 mLで12週間にわたって胃ろうから供給した［24］。

胃内灌流
胃内灌流は、頭頸部をまっすぐに保ったまま、口から胃内にチューブを慎重に挿入し（距離、5-7 cm）、薬剤または液化糞便試料を注射器からゆっくりと注入した。チューブを抜いた後、30秒間ラットの姿勢を維持し、ラットがもがいたり、呼吸が乱れたりした場合は、処置を中止し、直ちにチューブを抜いた。ラットが落ち着きを取り戻し、呼吸が整ったところで、再度胃ろうの処置を行った。

16S rRNA遺伝子配列の決定
スナップ凍結した糞便サンプルの16S rRNA遺伝子の塩基配列をBioNovoGene Co. (中国、蘇州)に依頼した。QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) を用いて、糞便サンプル（250 mg, wet weight）から、製造者の指示に従って全DNAを抽出した。DNAの完全性とサイズは1％アガロースゲル電気泳動で確認し、DNA濃度はNanoDrop分光光度計（NanoDrop Technologies, LLC, Wilmington, DE, USA）を用いて決定した。各DNAサンプルについて、16S rRNAを、V3およびV4超可変領域を方向的に標的とするプライマー341F (5'-CCT AYG GGR BGC ASC AG-3')/806R (5'-GGA CTA CNN GGG TAT CTA AT-3') で増幅させた。各20μLのPCR反応液には、4μLの5×FastPfu Buffer、2μLの2.5mM dNTPs、0.8μLの各プライマー（5μM）、0.4μLのFastPfu DNA Polymeraseおよび10ngの鋳型DNAが含まれていた。PCR反応は、95 ℃で3分間の最初の変性ステップ、95 ℃で30秒間の変性、55 ℃で30秒間のアニーリング、72 ℃で45秒間の伸長を27サイクル行い、最後に72 ℃で10分間伸長するステップを含むものであった。反応はGeneAmp™ PCR System 9700 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)で行った。すべてのPCR産物はAxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit (Axygen Scientific, Inc., Union City, CA, USA) で精製し、QuantiFluor™-ST fluorometer (Promega Corporation, Madison, WI, USA) で定量化した。精製したアンプリコンの正規化した等モル濃度をプールし、NovaSeq PE250 シークエンシング装置（Illumina, Inc.、San Diego, CA, USA）を用いて、メーカーの仕様書に従って配列決定した。

細菌16S rRNA遺伝子のハイスループットシーケンス解析は、Quantitative Insights into Microbial Ecologyソフトウェア（バージョン1.9.1）［25］を使用して処理した。キメラ配列はUSEARCH配列解析ツール（Uparse software v6.0.307）を用いてフィルタリングした。類似度の閾値が97%以上の配列は、クラスタリングアルゴリズムCluster Database at High Identity with Tolerance (v4.6.1) を用いて一つの操作上の分類単位に割り付けた。アルファ多様性値は、サンプルの種の多様性を決定するために計算され、観察された_種とシャノン多様性指数で評価された。ベータ多様性は、サンプル間の種多様性の違いを評価するために用いられ、非計量的多次元尺度法（NMDS）により特徴づけられた。属レベルでは、Tukey検定とWilcoxon順位和検定を使用して、細菌の存在量と多様性を比較した。ノンパラメトリック検定として類似性分析を行い、グループ間の群集構造および種の差異を特定した[26]。MetaStatを用いたノンパラメトリックWilcoxon検定に基づいてヒートマップを作成した（p < 0.05）。線形判別分析効果量（LEfSe）法を適用し、異なる頻度で存在する分類群を評価した。

16S rRNA遺伝子配列データは、BioProjectデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject）にアクセッション番号PRJNA869931で寄託された。

SCFAsのターゲットメタボロミクス
スナップ凍結した糞便サンプルおよび大腸組織のSCFAsのターゲットメタボローム解析を、BioNovoGene株式会社により実施した。糞便100 mgと大腸組織300 mgを、安定同位体標識SCFA標準物質を添加した酸性水に分散させ、ジエチルエーテルで抽出した。エーテル層は直ちにTRACE 1300ガスクロマトグラフ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いてガスクロマトグラフ質量分析（GC-MS）により分析した。この研究で使用したSCFA標準物質は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、バレレート、イソバレレート、およびカプロン酸の混合物であった。定量は内部標準とのキャリブレーションにより行った。ホモジナイズした組織のタンパク質含量を正規化した。その後、サンプル（1 μL）を10:1のスプリット比で注入した。キャリアガスにはヘリウムを用い、1.0 mL/minの一定流速で注入した。注入温度、トランスファーライン温度、イオン源温度はそれぞれ250 °C、250 °C、230 °Cに設定された。初期温度プログラムは、90 ℃で2分間の等温加熱とし、その後10 ℃/分の速度で120 ℃まで、さらに5 ℃/分で150 ℃まで、最後に25 ℃/分で250 ℃まで上昇させ、2分間維持した。データはフルスキャンモード（電子衝撃イオン化，70eV）で取得し，m/z範囲は35-780であった。

プラットフォームから.rawフォーマットで得られたGC-MSデータは、msConvertツール（（ProteoWizard）を使用して.mzXMLフォーマットに変換された。その後、Rパッケージ（v3.3.2）を用いて、データセットの正規化、変換、インピュテーション、外れ値除去後のスケーリングを行いました。7種類のSCFA代謝物のレベルを定量化し、ノンパラメトリックなMann-Whitney U検定で比較した。直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）を適用し、群間差の同定を行った。

RNA配列決定とデータの蓄積
スナップ凍結結腸組織から抽出したRNAは、BioNovoGene株式会社によって配列決定された。NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep Kit for Illumina® (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) を用いてcDNAライブラリーを調製し、精製したcDNAライブラリーをイルミナ®で解析した。精製したcDNAライブラリーは、NovaSeq PE250シーケンス装置を用いて、サンプルあたり> 6G raw reads (150 bp, pair-ended)でシーケンスした。分化発現遺伝子（DEG）は、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）によるパスウェイ解析、Gene Ontology（GO）解析、および遺伝子セット濃縮解析（GSEA）の基準p < 0.05 および |log2fold change|> 0.5 に基づいてRNA配列決定（RNA-seq）により特定された。

RNA-Seqデータは、BioProjectデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject）にアクセッション番号PRJNA781099で寄託された。

ミトコンドリアの単離
ミトコンドリア画分は、Qproteome® Mitochondria Isolation Kit (Qiagen GmbH) を用いて単離した。大腸組織（～20 mg）を切り刻み、プロテアーゼ阻害剤溶液を含む溶解バッファー2 mL中でホモジナイズした。上清を1000×g、4℃で10分間遠心分離した。次に、得られたペレットを1.5 mLの氷冷した破砕バッファーに再懸濁し、破砕した。1000×g、4℃で10分間の遠心分離後、上清を回収し、6000×g、10分間の遠心分離を行った。ペレット（ミトコンドリアを含む）を750μLのミトコンドリア精製バッファーに再懸濁し、ミトコンドリア精製バッファー層の上部に添加した。14,000×g で 15 分間遠心した後、チューブの下部に形成されたミトコンドリアを含むペレットまたはバンドを新しいチューブに移した。この懸濁液を 1.5 mL のミトコンドリア保存液で 8000×g, 10 分間の遠心分離により 3 回洗浄した。高純度化したミトコンドリアをミトコンドリア保存液に再懸濁し、膜電位測定に使用した。残りのミトコンドリアおよび細胞質画分は-80 ℃で保存し、後で使用した。

ミトコンドリア膜電位
単離したミトコンドリアの膜電位は、JC-1染色キット（Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China）を用いて測定した。簡単に言うと、10μLの新鮮なミトコンドリアを100μLのJC-1染色試薬中で10分間インキュベートした。倒立顕微鏡（IX71；オリンパス株式会社、東京、日本）を用いて、波長488nmおよび594nmの画像を撮影した。赤と緑の強度の比を観察し、単離されたミトコンドリアの膜電位を評価した。健康なミトコンドリアは 594nm で高い赤色蛍光強度を示し，488nm で低い緑色蛍光強度を示したが，障害のあるミトコンドリアは逆の結果を示した．

大腸のアデノシン三リン酸（ATP）量と電子輸送連鎖（ETC）複合体I-V活性
大腸組織は、ショ糖（0.25M）、エグタジン酸（0.5mM）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（1：40；Roche Life Science, Penzberg, Germany）を含む氷冷したHEPES緩衝液（3mM、pH7.2）中で均質化させた。組織ホモジネートのタンパク質濃度は、Pierce™ BCA Protein Assay Kit ( Pierce Biotechnology, Waltham, MA, USA ) を用いて測定した。次に、ATP および ETC Complex I-V assay Kit ( Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China ) を用いて、製造者の指示に従って画分を定量化した。簡単に言うと、等量の新鮮なタンパク質をすべてのウェルにロードし、分光光度計を使用して以下のように吸光度を測定した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）デヒドロゲナーゼ（複合体 I）および ATP 含有量は ε340 nm、ミトコンドリア複合体 III（シトクロム c 還元酵素）または複合体 IV（シトクロム c 酸化酵素）は ε550nm、複合体 II（コハク酸コエンザイム Q 還元酵素）は ε605、複合体 V（F0F1-ATPase／ATP合成酵素）は ε660 nm であっ た。便宜上、ATP量はµmol/mLで、その他の結果はµmol/mg of proteinで表した。

病理組織学的解析と免疫蛍光染色
パラフィン包埋切片を脱パラフィンし、PBSで5分間3回洗浄し、病理組織学的解析と免疫蛍光染色を行った。病理組織学的解析のために、スライスを製造者の指示に従ってヘマトキシリン・エオジン（HE）染色キット（Baso Diagnostics, Inc.、武漢、中国）で染色し、倒立顕微鏡（Olympus IX71）で見て、腸粘膜の形態的変化を確認した。免疫蛍光染色のために、切片をエチレンジアミン四酢酸（EDTA）-トリス溶液（pH9.0）に98℃で30分間浸漬して抗原回収し、PBSで5分間3回リンスし、10％非免疫ヤギ血清で室温で30分間インキュベートして非特異標識をブロックしてからムチン2に対する抗体（1：50；サンタクルーズバイオテクノロジー、Inc, Dallas, TX, USA）を用いて4℃で一晩インキュベートした[27]。PBSで洗浄後、切片をテトラエチルローダミンイソチオシアネート標識二次抗体（1:200；Santa Cruz Biotechnology, Inc.）と37℃で1時間インキュベートした。結腸組織のMUC2陽性スポットをレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSM 700; Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany）で画像化した。

DHE 染色
活性酸素種（ROS）は、DHEによる染色によって検出された。簡単に言うと、切片を10mM DHE（Beyotime Institute of Biotechnology）中で室温、暗所で30分間インキュベートし、倒立顕微鏡（Olympus IX71）下で観察した。

ELISA法
大腸組織中のアセチルコエンザイムA（Ac-CoA）の量は、市販のELISAキット（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China）を用いて、製造者の説明書に従って定量化した。簡単に言うと、50mgの組織をホモジナイズし、4000×gで10分間遠心分離し、上清を分離した。各群の総タンパク質濃度をBCA法により測定し、等量のタンパク質（50μL）の光学濃度（450nm）をマイクロプレートリーダーで測定し、標準曲線を参照して濃度を決定した。Ac-CoAの濃度は、タンパク質のng/mLとして表した。

ウェスタンブロット解析
大腸サンプル（20μgタンパク質）を8％、10％、または12％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に転写し、5％無脂肪乳と0. トリス緩衝生理食塩水中の1％Tween-20で1時間ブロックし、Gタンパク質共役型受容体（GPR）41（1：500；Signalway Antibody LLC, College Park, MD, USA）、GPR43に対する一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした（1: 500; Sigma-Aldrich Corporation）、ヒストン脱アセチル化1/2（HDAC1/2; 1:1500; Abcam, Cambridge, MA, USA）、オクルディン（1：2000; Abcam）、クラウディン1（1：500; Santa Cruz Biotechnology, Inc. )、インターフェロン制御因子4(IRF4; 1:1000; Cell Signaling Technology, Inc.社)、ダンバース、マサチューセッツ州、米国)。Danvers, MA, USA）、NLR family, pyrin domain containing 3（NLRP3; 1:1000; Abcam）、vascular cell adhesion molecule 1（VCAM1; 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、レチノイド酸受容体関連孤児受容体γ t（RORγt, 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc. )、トランスフォーミング成長因子β1 (1:1000、Abcam)、シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子3 (STAT3; 1:1000; Cell Signaling Technology)、リン酸化STAT3 (p-STAT3, Tyr705; 1:1000; Cell Signaling Technology) 、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4 (ND4; 1: 1000; Signalway Antibody LLC）、シトクロムcオキシダーゼサブユニット1（COX1; 1:1000; Abcam）、インターロイキン（IL）-1β（1：500; Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA）、IL-6（1：300; Santa Cruz Biotechnology, Inc. )、IL-10 (1:300; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), IL-17 (1:300; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), IL-23 (1:300; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 電圧依存性アニオン選択チャネル1 (VDAC-1; 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc. )、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH; 1:5000; Abcam)、およびβ-アクチン (1:5000, Abcam) を加え、その後、免疫グロブリンGに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラビットまたはマウス2次抗体で室温で1時間インキュベートした。抗体-タンパク質複合体は、強化化学発光基質溶液（EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA）を用いて検出し、コントロールとしてのGAPDHに対する光学密度を基に定量した。ミトコンドリアについては、VDAC1をローディングコントロールとして採用した。各タンパク質のリン酸化の程度は、ネイティブフォームの存在量（p-STAT3/STAT3）を基準として評価した。

IP
200μgの大腸ホモジネートを3μgのIRF4抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。プロテインG-セファロースビーズ（Sigma-Aldrich Corporation）をIPバッファ（10 mMTris-Cl, pH 7.5, 150 mM塩化ナトリウム, 2 mM EDTA, 0.5% Triton-100）で15分間予備洗浄し、タンパク質/抗体混合物と4℃で2時間一定回転下にインキュベートした。沈殿物を10,000 × gで1分間遠心し、IPバッファで3回洗浄して非特異的結合タンパクを除いた。その後、免疫複合体化ビーズをドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ローディングバッファーに再懸濁し、95℃で5分間加熱した後、10,000×gで遠心分離して除去し、上清を集めてIRF4とSTAT3のイムノブロッティングに使用し、入力コントロールとしてIPバッファーなしホモジネートと一緒に使用した。

細胞分離とフローサイトメトリー
単リンパ球懸濁液を、ラットの結腸固有層組織からフローサイトメトリーのために採取し、以下のゲーティング戦略で実施した：リンパ球→単細胞→生細胞→CD4＋細胞。簡単に説明すると、滅菌PBSで洗浄後、組織を切り分け、0.125 mg/mL of Liberase™ Thermolysin Medium (Sigma-Aldrich Corporation) と 0.5 mg/mL of DNase Iを用いて20分間酵素処理をした。細胞は、100μmの孔を持つ篩で濾過した。消化液の濾過は、500μLのウシ胎児血清の添加によって終了させた。残りの組織片を上記のように処理した。細胞を、40μmの孔を有する篩を通して濾過することにより収集した。500×gで5分間、室温で遠心分離した後、上清を捨て、細胞を2％のウシ胎児血清を含むPBSに再懸濁した。細胞内サイトカイン染色に先立ち、106個の細胞を、37℃、5％CO2/95％空気の雰囲気下、10μg/mLのブレフェルジンA（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）存在下、50ng/mLのフォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸および1μg/mLのイオノミシンで5時間刺激した。その後、細胞をPBSで洗浄し、Fixable Viability Dye eFluor™ 506（eBioscience, Inc, San Diego, CA, USA）と表面マーカーで4℃、暗黒下で30分間染色した後、eBioscience™ Intracellular Fixation & Permeabilization Bufferで20分間、室温、暗黒下で固定・透過化した。Tヘルパー17（Th17）細胞アッセイのために、細胞をCD4（eBioscience、クローン：OX-35）およびIL-17A（eBioscience、クローン：eBio17B7）に対する抗体とインキュベートした。制御性T細胞（Treg）アッセイのために、細胞を、CD4、CD25（eBioscience、クローン：OX-39）、およびFOXP3（eBioscience、クローン：FJK-16 s）に対する抗体とインキュベートした。IL-10の検出のために、細胞を、CD4およびIL-10（BD Pharminigen, San Diego, CA, USA, clone: A5-4）またはFOXP3およびIL-10に対する抗体とそれぞれインキュベーションした。最後に、BD FACSCalibur Flow Cytometer（BD Biosciences社製）を用いてデータを取得し、FlowJo 7.6 ソフトウェアを使用して解析した。

電子顕微鏡観察
ミトコンドリアを観察するために、約1 mm 厚の結腸組織の新鮮なスライスを 2.5% グルタールアルデヒドで 4°C で一晩固定し、0.1 M PBS で 3 回洗浄後、1%四酸化オスミウムで 4°C で 2 時間後固定し、ブロックを段階エタノールで脱水後エポキシ樹脂に埋め込んだ。無作為に選んだ超薄切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で後染色し、電子顕微鏡（Koninklijke Philips N.V., Amsterdam, Netherlands）で観察した。

統計解析
マイクロバイオーム集団、標的メタボロミクス、RNAシーケンスの統計は、上記で詳しく説明した通りです。これらを除き、データは平均値±標準偏差（SD）で表示されます。2つ以上の独立した（無関係な）グループの平均値間の統計的に有意な差は、一元配置分散分析によって同定し、その後、Dunnettの検定によるポストホック分析を行った。確率（p）値が0.05未満を統計的に有意とした（Fig.1）。

結果
FMTとSCFAsの補充は、CCHによって誘発された腸内細菌叢の変化を改善した。
BCCAo後12週目に16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。本研究では、腸内細菌叢の多様性を評価するために、observed_species指数およびShannon多様性指数を使用した。CCHは観察種数およびシャノン多様性を有意に減少させた（観察種：p＜0.001、シャノン：p＝0.004）。しかし、FMTは、観察された種の数の減少を部分的に逆転させた（p = 0.02、Fig. 2A）。4群間の腸内細菌叢の分類群の違いを可視化するために、NMDS分析を行った。その結果、BCCAoは健常対照群と比較して腸内細菌叢の組成に顕著な差異を誘発したが、CCHはBCCAo＋FMT群およびBCCAo＋SCFAs群の腸内細菌叢に有意な変化を誘発した（Fig.2B）。Bray-Curtis非類似度行列を用いた類似度分析により、偽手術群とBCCAo群、BCCAo群とBCCAo + FMT群、BCCAo群とBCCAo + SCFAs群の間で腸内細菌叢に明確な組成上の差異があることが明らかになった。腸内細菌叢上位10種のうち、Prevotellaceae_NK3B31_groupと[Eubacterium]_siraeum_groupの相対量が偽手術群と比較してBCCAoは有意に増加し、Romboutsia、Plevotella、Turicibacterの相対量が減少していた。Prevotellaceae_NK3B31_groupの相対量はFMTおよびSCFAsの補給により著しく減少し、[Eubacterium]_siraeum_group、PrevotellaおよびTuricibacterの相対量は著しく増加した。さらに、FMTやSCFAsの投与により、AkkermansiaとRuminococcusのCCH誘発相対量が顕著に増加した（図2C、D）。LEfSe解析の結果、偽手術群、BCCAo群、BCCAo＋FMT群、BCCAo＋SCFAs群の微生物シグネチャーはLachnospirales（目）/Lachnospirace（科）/ Erysipelotrichales（目）/Erysipelotrichaceae（科）/Turicibacter（属）であることが明らかとなった。Prevotellaceae_NK3B31_group（属）、Prevotellaceae（科）/Prevotella（属）、Ruminococcaceae（科）/Ruminococcus（属）/ Ruminococcus_sp_N15_MGS_57 （種）/Oscillospirales（目）および Clostridia_UCG_014 （目）/Muribaculaceae（科）、それぞれ（図2A、図2B）を参照されたし。2E).

図2
図2
FMTとSCFAsの投与はCCH誘発の腸内細菌ディスバイオシスを改善する。A シャノンインデックスとobserved_speciesによるα多様性の解析。B 非計量的多次元尺度法（NMDS）によるβ多様性の解析。C 上位10種の腸内細菌叢の属レベルでの相対的存在量。D MetaStatによるノンパラメトリックWilcoxon検定に基づくヒートマップで、腸内細菌叢の属レベルでの相対的な存在量を示す。E Linear discriminant analysis (LDA) coupled with effect size (LEfSe) による腸内細菌の存在量の有意差の解析。データは平均値±SDで表した（各群n = 8）。*P < 0.05 vs.偽薬群。#P < 0.05 vs. BCCAo群

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これらのデータによると、CCHラットは、長期のCCIにより、腸内細菌叢の豊富さ、多様性、および組成を減少させることによって、腸内微生物ディスバイオシスを発症したが、FMTおよびSCFA補充は、RuminococcaceaeおよびClostridia_UCG_014などのいくつかの種の存在量を増加させることによってCCH誘導腸内微生物破壊を調節した。

FMTおよびSCFA投与は、腸内細菌叢の調節を介してCCH誘発のSCFAs代謝を増加させた
細菌群の変化が糞便サンプルおよび結腸組織中のSCFAs濃度に影響を与えるかどうかを調べるため、SCFAsの濃度をターゲットメタボロミクスアッセイで測定した。微生物群集の構造および組成の変化と一致して、CCH、FMT、およびSCFAsは、OPLS-DAによって決定されたように、特に偽手術群とBCCAo、BCCAoとBCCAo＋FMT、およびBCCAoとBCCAo＋SCFAs群の間でSCFAsに異なるプロフィールを誘導した（図3C, D）。具体的には、糞便サンプル中の酢酸およびプロピオン酸の濃度は、BCCAo＋FMT群およびBCCAo＋SCFAs群でBCCAo群よりも有意に高かった（それぞれpFMT＝0.046および0.036、pSCFAs＝0.028および0.02）（図3A）大腸組織で酢酸と同様の傾向が見られた（pFMT＝0.032、pSCFAs＝0.008）（図3B）。

Fig.3
図3
FMTおよびSCFAs処理によりCCH誘導代謝物SCFAsが増加する。A ガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）による糞便SCFAs濃度の解析（sham、BCCAoおよびBCCAo＋FMT群ではn＝8、BCCAo＋SCFAs群ではn＝6）。B GC-MSによる大腸SCFAs濃度の解析（各群n＝5）。C, D 直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）により糞便および大腸SCFAsの棲み分け傾向をそれぞれ評価した。E, F 糞便サンプルを用いた腸内細菌叢と代謝物SCFAsのスピアマン相関解析。データは平均値±SDで表した。*P < 0.05 vs. 偽薬群。#P < 0.05 vs. BCCAo群。E, Fでは、*P < 0.05, **P < 0.01。

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SCFAの代謝の増加が、FMTおよびSCFA投与に伴う腸内細菌叢の変化によるものかどうかを明らかにするため、糞便サンプルのデータを用いてスピアマン相関分析を行った。その結果、酢酸はRuminococcus_sp_N15_MGS_57およびPrevotellaと正の相関を示し、LachnospiraceaeおよびLachnospiralesと負の相関を示しました。さらに、プロピオン酸はRuminococcusとRuminococcus_sp_N15_MGS_57と正の相関があった。しかし、興味深いことに、LachnospiraceaeとLachnospiralesは酪酸生成と正の相関があり、Prevotellaは負の相関があった（図3E, F）。

これらの結果を総合すると、FMTおよびSCFA投与後の糞便サンプルでは、酢酸およびプロピオン酸のレベルが有意に上昇していることが明らかとなった。特に、酢酸はFMTおよびSCFA投与後の大腸組織で同定された唯一の顕著な増加代謝物であり、このSCFAがCCHによる大腸機能障害に対するFMTおよびSCFA投与の効果を駆動している可能性が示唆された。FMT後の確立された腸内細菌バイオマーカーであるRuminococcus_sp_N15_MGS_57は、FMTおよびSCFA処理後の酢酸と正の相関を示し、Ruminococcus_sp_N15_MGS_57は、FMTおよびSCFA処理後の酢酸産生の増加に対してCCIに対して部分的に関与しているかもしれないと示唆された。

FMTおよびSCFA処理は、CCHによる大腸バリアー障害を緩和した
大腸バリア機能に対する FMT および SCFA 処置の影響を調べるため、形態学的変化、タイトジャンクションタンパク質 および大腸粘液層の主要成分である MUC2 の発現レベルを評価した。さらに、SCFAはGタンパク質共役型受容体やHDACの阻害を介した宿主へのシグナル伝達により、微生物-腸-脳の相互作用に影響を与える可能性がある。そこで、大腸組織におけるGPR41、GPR43およびHDAC1/2のタンパク質レベルを測定した。18週齢の雄ラットの平均体重は、BCCAo投与後に609±14gから496±8g（p＜0.01）へと顕著に減少し、FMT投与後には564±10g（p＜0.01）、SCFA投与後には534±8g（p＜0.01）へと戻った（Fig. 4A）。大腸組織をHEで染色したところ、BCCAo群では過度の粘膜損傷が認められたが、BCCAo＋FMT群およびBCCAo＋SCFAs群ではほとんど認められなかった（図4B）。さらに、CCHは、MUC2陽性細胞数およびclaudin 1やoccludinなどのタイトジャンクションタンパク質の発現レベルを有意に低下させることが確認された。それにもかかわらず、FMTとSCFA補充により、これらの変化は解消された（図4C-F）。これらの結果は、CCHが大腸バリア機能を低下させ、GPR41およびGPR43のタンパク質レベルを著しく低下させ、HDAC1/2の過剰発現を悪化させたが、FMTおよびSCFA処理により改善されたことを示しており（図4E、F）、GPR41およびGPR43の活性化とHDACの阻害を介して大腸バリア機能障害を緩和していることが示唆された。

図4
図4
FMTおよびSCFAs投与によるCCH誘発の大腸バリアー障害の緩和。A 体重の評価。B 大腸の代表的なHE染色（スケールバー＝50μm）。C 結腸における代表的なMUC2の免疫蛍光染色（スケールバー＝50 µm）。MUC2、青。青：DAPI。D MUC2陽性細胞の相対的レベル（偽薬群との比、各群n = 5）。Sham群におけるMUC2陽性点刻の平均面積を1とした。E 結腸におけるGPR41、GPR43、HDAC1/2、オクルディン、クラウディン1、およびGAPDHの代表的なウェスタンブロットである。F 結腸におけるGPR41、GPR43、HDAC1/2、オクルディン、クローディン1、およびGAPDHの相対光学密度分析（各群n = 4）。データは平均値±SDで表した。*P < 0.05 vs.偽薬群。#P < 0.05 vs. BCCAo群

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CCH後のFMTおよびSCFA治療において、炎症およびエネルギー代謝経路は関与していなかった
FMTおよびSCFA治療がCCH後の大腸組織の機能回復を促進する潜在的な分子機構を探るため、トランスクリプトーム解析を行った。BCCAo群と比較して、BCCAo＋FMT群とBCCAo群のGO解析では、FMTはサイトカインIL-1β、IL-6、IL-17の産生、Th17細胞の免疫反応、HDACの制御に関連する経路の制御を低下させ、ATP合成結合電子輸送、ミトコンドリアATP合成結合電子輸送、呼吸ETC、酸化的リン酸化は顕著に増強した（Fig.5A）。さらに、KEGG分析により、FMTがTh17細胞の分化、細胞接着分子、およびT細胞受容体およびNF-κB（NF-κB）経路を顕著に阻害することが示された（図5A）。FMTと同様に、SCFA補充は、細胞間接着、IL-1およびIL-17産生、Th17細胞の分化および免疫応答、ならびにHDAC経路の調節を著しく弱めたが、ATP合成結合電子輸送、ミトコンドリアATP合成結合電子輸送、呼吸電子輸送鎖、ミトコンドリア呼吸鎖複雑III/IV、酸化的リン酸化、酸化還元酵素活性、NADH脱水素酵素活性およびチトクロムc酸化酵素活性は著しく強めた（Fig. 5C). さらに、SCFA投与はTh17細胞の分化、細胞接着分子、T細胞受容体およびNF-κB経路を有意に抑制したが、酸化的リン酸化は促進した（図5C）。さらに、GSEAは、SCFA処理がAc-CoA代謝過程、酸化的リン酸化、および呼吸鎖複合体IVに関連する経路を有意に修正することを見いだした（図5E）。これらの結果は、SCFA処理とFMTの両方が、IL-1β、IL-6、およびIL-17のシグナル伝達、Th17細胞の分化、HDACの調節、細胞接着分子、NF-κB経路、ATP合成結合電子輸送、呼吸器ETC、および酸化的リン酸化に関連していたことを示す。

図5
図5
大腸における FMT および SCFAs 治療に関与する潜在的な分子機構。A, C RNAシーケンスデータセットに基づき、BCCAo群対BCCAo+FMT群、BCCAo群対BCCAo+SCFAs群でそれぞれ有意に濃縮されたGOまたはKEGG用語のヒストグラムを示す。横座標は-log10（p値）、縦座標はGOまたはKEGG名を表す。B, D RNAシークエンスデータセットにより、BCCAo群とBCCAo＋FMT群、BCCAo群とBCCAo＋SCFAs群のそれぞれで、我々が注目する上記パスウェイにおいて部分的に異なる発現を示す遺伝子（DEG）をボルケーノプロットしたもの。横軸はlog2（fold change）、縦軸は-log10（p-value）を示す。ウエスタンブロットの検証に合格した一部のDEGには名前を記した。E RNAシーケンスデータセットに基づき、BCCAo群とBCCAo＋SCFAs群で実施した遺伝子セット濃縮解析（GSEA）。曲線の高さは濃縮の程度を表し、正規化濃縮スコア（NES）と規範p値が表示されている。

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全体として、BCCAo＋FMT群とBCCAo群の間で850のDEGがアップレギュレートされ、330がダウンレギュレートされた一方、BCCAo＋SCFAs群とBCCAo群の間で876のDEGがアップレギュレートされ、1395がダウンレギュレートされていた。注目すべきは、ウェスタンブロット解析で確認されたND4、COX1、IRF4、NLRP3、およびVCAM1のDEGが、IL-1βおよびIL-17の産生、Th17細胞の分化、細胞接着分子、呼吸性ETC、酸化的リン酸化などのサイトカイン媒介シグナルに関連していた（図8Aおよび9F）ことである。

FMTおよびSCFA処理により、TregとTh17細胞のバランスが制御された
FMTおよびSCFA処理後のIL-1β、IL-6、IL-17産生およびTh17細胞分化経路を含むサイトカイン媒介シグナル伝達の著しい改変は、Treg/Th17バランスが結腸組織における免疫恒常性の安定化に基本的役割を果たすことを実証した。FMTおよびSCFA投与がTregおよびTh17細胞のバランスに及ぼす影響を明らかにするために、全4群から大腸組織を採取し、フローサイトメトリーを行った。各細胞タイプの相対的な存在量は、CD4+ T細胞のパーセントとして報告された。その結果、CCHはTh17細胞の割合を著しく上昇させ、これはFMT及びSCFA処理によって著しく減少したが（図6A）、Tregの割合には明らかな影響を与えず、一方FMT及びSCFA処理はTregの割合を著しく上昇させた（図6C）。IL-10は、Tregを介した炎症抑制における重要なサイトカインであるため、CD4+IL-10+およびFOXP3+IL-10+細胞の割合が続いて評価された。CCHは、CD4+IL-10+およびFOXP3+IL-10+細胞の割合を減少させ、これはFMTおよびSCFA処理によって逆転した（図6B、D）。これは、FMTおよびSCFA処理が、CCH後のエフェクターT細胞、特にTregにおけるIL-10発現を促進したことを実証するものである。以上より、FMTおよびSCFA補充は、CCHによる大腸組織の炎症に対して、大腸Tregの比率を上昇させ、大腸Th17細胞の比率を低下させ、TregとTh17細胞のバランスを改善することが示された。

図6
図6
FMTとSCFAsの投与により、大腸のTreg/Th17バランスが改善される。A フローサイトメトリーで解析したTh17細胞の代表プロットと、大腸におけるTh17細胞の割合の散布図。B フローサイトメトリーで解析したCD4+IL-10+細胞の代表プロットと結腸内のCD4+IL-10+細胞のパーセンテージの散布図。C フローサイトメトリーで解析したTreg細胞の代表プロットと結腸におけるTreg細胞のパーセンテージの散布図。D フローサイトメトリーで解析したFOXP3+IL-10+細胞の代表プロットと結腸におけるFOXP3+IL-10+細胞のパーセンテージの散布図。データは平均値±SDで表した（1群あたりn = 3）。*P < 0.05 vs.偽薬群。#P < 0.05 vs. BCCAo群

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最近の証拠は、サイトカインが病原性および非病原性のTh17細胞の分化を制御することを示している[28]。IL-1β + IL-6 + IL-23 病原性Th17細胞は、VCAM1を含む細胞接着分子を大量に産生し、IL-10を含む免疫制御分子を少量産生する [29, 30]。CCH に反応する生体内の病原性 Th17 細胞の分化に対する FMT および SCFA 処置の効果をさらに明らかにするために、ウェスタンブロット解析を実施して、結腸組織における IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-23 および VCAM1 のタンパク質レベルを測定した。その結果、CCHはIL-1β、IL-6、IL-17A、IL-23、VCAM1のタンパク質レベルを顕著に上昇させ、IL-10のタンパク質発現を減少させた（図7、8A、B）。このことは、FMTとSCFA投与によって蘇った病原性Th17細胞の発現をCCHが悪化させ大腸組織の炎症を促進させたことを示しており、FMTとSCFA投与は病原性Th17細胞の分化を弱め大腸組織の炎症が緩和したことを示していると言える。

図7
図7
FMTとSCFAs投与は病原性Th17細胞の分化を低下させる。A 結腸におけるIL-1β、IL-6、IL-10、IL17A、IL-23およびGAPDHの代表的なウェスタンブロット。B 結腸におけるIL-1β、IL-6、IL-10、IL17A、IL-23およびGAPDHの相対光学密度解析。データは平均値±SDで表した（各群n = 4）。*P < 0.05 vs.偽薬群。#P < 0.05 vs. BCCAo群

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図8
図8
FMTとSCFAs処理はCCH誘発炎症性IL-17経路を結腸で抑制する。A 結腸におけるTGFβ1、IRF4、RORγT、NLRP3、VCAM1、p-STAT3、STAT3およびGAPDHの代表的なウェスタンブロット。B 結腸における TGFβ1、IRF4、RORγT、NLRP3、VCAM1、p-STAT3、STAT3 および GAPDH の相対光学密度解析（各群 n = 4）。C STRINGデータベースからダウンロードしたタンパク質間相互作用ネットワークは、候補遺伝子間の相互作用を示した。D結腸におけるIRF4、STAT3およびGAPDHの代表的な免疫沈降法（IP）。(E) 結腸におけるIP複合体中のSTAT3と全細胞溶解液中のSTAT3の相対比(n = 3/群)。IP複合体中のSTAT3の相対的な存在量は、ウェスタンブロッティングによって決定され、全細胞ライセート中のSTAT3のレベルと比較される。データは平均±SDで表した。*P < 0.05 vs.偽薬群。#P < 0.05 vs. BCCAo群

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FMTとSCFA処理により炎症性IL-17シグナルが抑制された
転写因子IRF4は、Th17細胞の分化に必須である[31]。Th17細胞の串刺し刺激により、IRF4はクロマチンリモデリングを誘導し、続いてRORγtを介した転写が行われ、これらはIL17の産生を開始するために不可欠である[32]。そこで、結腸組織におけるIRF4およびRORγtのタンパク質レベルを測定した。RNA-seq 分析によって決定された IRF4 mRNA レベルと一致して、CCH は IRF4 のタンパク質発現を有意に増加させ、これは FMT および SCFA 処理によって顕著に減衰した（図 8A, B）。これは、転写因子 IRF4 が、CCH 誘発大腸組織の慢性炎症の FMT および SCFA 処理に関わる重要な調節因子である可能性を示すものであった。興味深いことに、RORγtのタンパク質レベルは、RNA-seq解析の結果、有意な変化がないにもかかわらず、IRF4と同じ傾向を示した。CCHは、IL-1β+IL-6+IL-23+病原性Th17細胞の産生を実質的に促進した。さらに、IL-1βの生成を促進することが報告されているNLRP3のタンパク質レベル[33]を大腸組織で測定した。RNA-seq 解析の結果と同様に、CCH は NLRP3 のタンパク質レベルを劇的に上昇させ、IL-1β の生成と活性化を確認した。しかし、FMTおよびSCFA投与は、NLRP3を著しく低下させた（図8A、B）。このことは、この治療戦略が、IL-1βの産生を減らすことによって、病原性Th17細胞の分化を部分的に減少させている可能性を示している。さらに、すべての慢性炎症性疾患は、ケモカイン受容体と細胞接着分子の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーからなるそれぞれの内皮および粘膜リガンドとの相互作用によって促進される炎症細胞の急速な動員およびしばしば不適切な保持によって特徴づけられる[34, 35]。そこで、RNA-seq解析で有意なDEGとして同定された細胞接着分子VCAM1のタンパク質発現を、結腸組織で続いて評価した。FMTおよびSCFA投与は、CCH誘発のVCAM1タンパク質発現の上昇を顕著に逆転させ（図8A、B）、FMTおよびSCFA補給のCCH誘発の大腸組織の慢性炎症に対する抑制効果をさらに確認することができた。

FMTとSCFA処理によりCCH誘発のIRF4/STAT3複合体の相互作用が阻害された
候補タンパク質間の相互作用の可能性を探るため、STRINGデータベースを用いて、タンパク質間相互作用ネットワークの機能濃縮解析を行った。その結果、転写因子であるSTAT3がこれらの相互作用に重要な役割を果たしている可能性が示された（Fig.8C）。FMTとSCFA処理によるこれらの分子機構が病原性Th17細胞の分化とIL-17の炎症シグナルに関与しているかどうかをさらに調べるためにCo-IPとMS解析を行ったところ、CCHに続いてSTAT3がIRF4と相互作用していることが示された。この結果は、IRF4に対する抗体を用いたIPによって確認された（Fig. 8D, E）。IRF4/STAT3 複合体における STAT3 の相対量を、全細胞溶解液における相対量と比較した。偽手術群と比較して、CCHは、IP複合体中のSTAT3/全細胞溶解液中のSTAT3のレベルを有意に増加させた。STAT3 の総量は、偽手術群と CCH 群で有意な差はなかったが、p-STAT3 のレベルは CCH 処理後に顕著に増加した。これらの結果は、CCH が IRF4/STAT3 複合体の形成と STAT3 のリン酸化を促進し（図 8A、B、D、E）、大腸組織の慢性炎症につながることを示していた。しかし、FMT と SCFA の投与は IRF4 と STAT3 の解離を誘導し、STAT3 のリン酸化を減少させ、結果として大腸組織の慢性炎症を抑制した。

FMTおよびSCFA投与はミトコンドリア機能障害を軽減した
RNA-seq データセットでアップレギュレートされたモジュールが、FMT および SCFA 処理後に主にミトコンドリア呼吸 ETC および酸化的リン酸化に濃縮されていたことを考慮し、ミトコンドリア膜電位、超構造変化、および ROS 産生を結腸組織において評価した。偽手術群と比較して、CCHは有意に活性酸素の蓄積を増加させたが、JC-1の染色により誘発される赤/緑蛍光強度の比率は減少した（図9D, H）。ミトコンドリアの超微細構造を解析すると、CCHはミトコンドリアの異常な膨張と曖昧なクリステーを誘導し（図9E）、ミトコンドリア機能障害を確認した。次に、FMT および SCFA 投与がミトコンドリア ETC 機能を調節しているか、またどのように調節してい るかを調べるために、大腸組織において ETC 複合体 I-V の活性および ATP 含有量を評価した。偽手術群と比較して、CCH投与はNADHデヒドロゲナーゼ（複合体I）、コハク酸-コエンザイムQレダクターゼ、チトクロームcレダクターゼ、チトクロームcオキシダーゼ、ATPaseの活性を顕著に低下させ、続いてATP量も減少させた（図9A, B）。本研究では、FMT および SCFA 投与後の SCFA の代謝物として酢酸が顕著であった。CCHの投与は低酸素またはグルコース欠乏の状態になるため、酢酸は多くの生化学反応に関与するAc-CoA[36]の重要な供給源として機能する可能性がある。GSEAは、SCFA処理後にAc-CoA代謝が有意に変化することを見出した（図5E）。このように、大腸の組織でAc-CoA含量が検出された。その結果、CCHはAc-CoAレベルを顕著に低下させ、FMTおよびSCFA処理によって正常化することがわかった（図9C）。これらの結果は、CCHがミトコンドリアのETCおよび酸化的リン酸化を阻害することを示唆している。続いて、有意に濃縮された DEGs ND4 および COX1 （それぞれ複合体サブユニット I および IV）のタンパク質レベルを結腸組織で測定した（図 9F, G）。その結果、CCH は ND4 と COX1 のタンパク質発現を偽手術群と比較して著しく低下させ、ND4 と COX1 が CCH によるミトコンドリア ETC および酸化的リン酸化の障害に重要であることが確認された。しかしながら、CCH によるミトコンドリア傷害は FMT および SCFA の投与により強く軽減され、慢性虚血に対するミトコンドリア代謝再プログラムによる保護作用が示唆された。

図9
図9
FMTとSCFAs投与によりCCH誘発の大腸ミトコンドリア機能障害が緩和される。A 大腸の電子輸送鎖複合体I-Vの活性（各群n = 5）。B 大腸の ATP 含有量（各群 n = 5）。C 大腸のアセチルコエンザイムAの含有量（n = 5/グループ）。D ROSの代表的なDHE蛍光染色と結腸のROSの相対レベル（sham群との比、各群n=3、スケールバー=20μm）。Sham群におけるROS陽性点刻の平均面積を1とした。E 結腸のミトコンドリアの代表的な電子顕微鏡写真（スケールバー＝0.5μm）。F 結腸のND4,COX1およびVDAC1の代表的なウェスタンブロット。G 結腸のND4,COX1およびVDAC1の相対光学濃度解析（n = 4/グループ）。H ミトコンドリア膜電位の代表的なJC-1蛍光染色（スケールバー＝50 µm）。障害ミトコンドリア：赤色蛍光の強度は低いが、緑色蛍光の強度は高い。健康なミトコンドリア：赤色蛍光の強度は高いが、緑色蛍光の強度は低い。データは平均値±SDで表した。*P < 0.05 vs.偽薬群。#P < 0.05 vs. BCCAo群

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考察
我々の知る限り、本研究は、FMTとSCFA補充が、SCFAの微生物代謝を促進すると考えられるRuminococcus_sp_N15_MGS_57の割合を増加させ、酢酸の生産を増加させ、その後ミトコンドリアETCと酸化的リン酸化を促進し結腸組織におけるミトコンドリアエネルギー代謝に変化を与えることによって、CCH誘発腸管微生物異常を改善することを初めて報告するものであった。さらに、FMTおよびSCFA投与は、病原性Th17細胞の分化およびIL-17経路を阻害することにより、CCHによるTregとTh17細胞の不均衡を逆転させ、結果として大腸組織のバリア機能障害および慢性炎症を緩和した。これらの結果は、FMT と SCFA 補給が CCI による大腸機能障害に対する有望な治療戦略を構成することを示すものである。

先行研究では、急性虚血性脳卒中が腸の機能障害と腸内細菌叢に影響を与えることが明らかにされ、腸の損傷と腸内細菌叢の間の繊細な相互作用が強調されている [18, 20, 37, 38]。しかし、現時点では、CCIが腸管障害および腸内細菌叢の異常増殖に及ぼす影響を裏付ける証拠はほとんどない。以前の研究では，脳梗塞が，6～12か月後のカニクイザルにおいて，持続的な腸内細菌ディスバイオシス，腸粘膜損傷，および慢性全身性炎症を促進することが明らかにされた[15]．本研究の結果は、CCHがRomboutsia属、Turicibacter属、Prevotella属の存在量を低下させ、SCFAs、特に酢酸とプロピオン酸の濃度を低下させ、大腸バリア機能障害と慢性大腸炎症を伴う腸内細菌ディスバイオシスを誘導することを一貫して明らかにしています。しかし、FMTとSCFA経口投与により、Akkermansia、Turicibacter、Ruminococcus、Prevotellaの相対量が増加し、糞便中の酢酸とプロピオン酸の濃度および大腸内の酢酸の濃度が上昇し、大腸バリア機能の回復と大腸炎症の抑制を伴う腸内細菌叢組成とSCFAs濃度のシフトが誘導されました。特に、FMTとSCFAsの経口投与は糞便中の酢酸とプロピオン酸の濃度を有意に上昇させたが、大腸組織では酢酸量のみが増加した。これは、SCFAsの糞便から大腸組織への吸収が阻害されることによる大腸バリアの機能障害による可能性が考えられた。大腸組織で顕著に増加した唯一の SCFA として、酢酸が FMT および SCFA 投与による CCH 誘発大腸機能障害に対する保護効果の主要なドライバーである可能性が示唆された。さらに、FMT後の微生物シグネチャーはPrevotellaceae（科）/Prevotella（属）/Ruminococcaceae（科）/Ruminococcus（属）/Ruminococcus_sp_N15_MGS_57（種）/Oscillospirales（目）で、これらの腸内細菌が酢酸濃度の上昇に関連している可能性を示唆するものであった。その後、スピアマン相関分析により、Ruminococcus_sp_N15_MGS_57の存在量と酢酸産生の間に有意な正の相関が確認され、両者がCCHによる大腸機能障害の治療にとって重要な因子である可能性が示唆された。

Tregは、Th17の抑制と抗炎症サイトカインIL-10の分泌を通じて、多様な炎症反応の専用抑制因子として働く[39]。急性虚血性脳卒中は、末梢のTregとTh17細胞のアンバランスを促進し、IL-17A産生を亢進させて炎症状態を維持することが報告された[40]。従って、CCI状態において、CCHは大腸組織において同様の傾向を誘導した。さらに、IL-1β、IL-6、IL-23 は病原性の Th17 細胞の分化を促進し、TGF-β1 と IL-6 は非病原性の Th17 細胞の分化を促進することが分かっている[29]。本研究では、BCCAo、BCCAo + FMT、BCCAo + SCFAs の各群間で TGF-β1 mRNA およびタンパク質レベルに明らかな違いは見られなかったが、IL-1β, IL-6, IL-23, VCAM1 の発現レベルは CCH 投与により著しく増加し、FMT および SCFA 投与により劇的に減少し、この戦略は病原性 Th17 細胞の分化を減少させて CCH による大腸炎症を除去することが示された。IL-10 の生成に関しては、IL-10 が Treg を介した γδT 細胞の抑制に重要であることを示す証拠がある[41]。本研究では、FMT および SCFA 処置は、CD4+IL-10+ および FOXP3+IL-10+ 細胞の割合に対する CCH 誘発の変化を逆転させた。これは、IL-10 が CCH に応答して大腸炎症を軽減する重要な役割を果たすかもしれないこと、したがって、潜在的治療標的を提示することを示唆するものである。

CCH の状態では、活性化された NLRP3 インフラマソームが IL-1β の産生を制御している[42]。本研究では、FMT および SCFA 処置により、NLRP3 および IL-1β の発現レベルが大幅に低下したことから、この介入は、NLRP3 インフラマソームの活性化を抑制することにより IL-1β の産生もダウンレギュレートし、その結果、病原 Th17 細胞の分化を低下させることができることが示唆された。IL-6が介在するTregの炎症に対する抑制機能の喪失は、STAT3のリン酸化を必要とする[43]。CCHはIL-6とp-STAT3の発現を有意に上昇させ、STAT3のリン酸化がCCI後のTregとTh17細胞のバランスに影響を与える可能性があることを確認した。しかし、FMTとSCFA投与によりこの現象は逆転し、FMTとSCFA補充によるTreg機能の保護作用が示された。IL-17産生Th17細胞の生成に不可欠なIRF4は[44]、IL-6、IL-17A、IL-22およびRORγtの産生を増加させることにより、腸粘膜におけるTh17細胞分化のマスターレギュレータとして作用する[45]。最近のデータでは、IRF4は、T細胞内在性および外来性の両方のメカニズムを通じて慢性腸炎を駆動する転写調節因子の推定上の分子マスタースイッチであることが強調されている[46]。さらに、IRF4の発現が増加すると、神経炎症反応が抑制され、脳卒中の転帰が改善することが報告されており[47]、IRF4の機能が異なる条件下で変化していることが示唆されている。本研究では、CCIに応答して結腸組織でIRF4の発現が顕著に亢進していた。さらに、CCH は IRF4/STAT3 複合体の形成と STAT3 のリン酸化を促進し、IRF4/STAT3 複合体が結腸組織で STAT3 の活性化を誘導する可能性を示唆した。一方、FMT および SCFA 処理は、IRF4 からの STAT3 の解離を促進し、IRF4 の過剰発現と STAT3 のリン酸化を消失させ、IRF4 による慢性大腸炎に対する FMT および SCFA 補給の保護効果を示唆した。

ミトコンドリアでは、トリカルボン酸サイクルで生成されたNADHがETCに入り、酸化的リン酸化とその後のATPの生成につながり、すべての細胞の生理・生化学活動に重要である[48]。CCH は、中枢神経系が関与する疾患においてミトコンドリア機能障害を悪化させることが知られており [49]、本研究では、結腸組織においても同様の作用を促進することが示された。さらに、CCH はミトコンドリア ETC 複合体 I-V の活性を阻害し、それによって ATP 生成が減少し、最終的にミトコンドリアによるエネルギー生産が低下することが示され た。酢酸は FMT および SCFA 投与後の顕著な代謝物であり，したがって低酸素状態またはグルコース欠乏状態における Ac-CoA の重要な供給源として機能する可能性がある[36]．Ac-CoA 産生の阻害は、酸化的リン酸化およびミトコンドリア ATP 生成の阻害につながる可能性がある[50]。本研究の結果は、CCHによるAc-CoAレベルの減少が、FMTおよびSCFA投与により顕著に上昇し、酸化的リン酸化およびATP生成の増加を伴うことを示しており、ミトコンドリアのエネルギー代謝異常に対するFMTおよびSCFA補給の保護効果を示唆している。したがって、酢酸によって生成された Ac-CoA は、CCH による酸化的リン酸化の変化の一因であり、CCI に反応した大腸組織のミトコンドリアエネルギー代謝の調節障害に対抗するターゲットとなる可能性があ る。さらに、複合体 I サブユニット ND4 および複合体 IV サブユニット COX1 のタンパク質発現レベルは、CCH によって有意に低下し、FMT および SCFA の投与によって上昇した。このことは、ND4 および COX1 が、FMT および SCFA 治療によって、CCH によって誘導されるミトコンドリア ETC および酸化的リン酸化の損なわれた細胞に対する重要なターゲットとなる可能性を示唆している。

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）およびHDACは、ヒストンのアセチル化状態を制御する酵素であり、SCFAはヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）およびHDACを制御する酵素として知られています。SCFAはHDACを阻害することでヒストンアセチル化を促進するという説が古くからあり[51]、本研究でもそのことが確認された。しかし、最近の研究では、SCFAsの投与はHDACの阻害よりもむしろHATの活性化を介してヒストンのアセチル化を誘導し、プロピオン酸と酪酸はp300 HATを介してヒストンのアセチル化を促進し、酢酸はHAT誘導ヒストンのアセチル化にほとんど影響を及ぼさないことが報告された[52]。酢酸のHATを介した作用はヒストンアセチル化に影響を及ぼさなかったが、微生物叢由来の酢酸はTip60 HAT複合体を介して腸の自然免疫を促進することが報告されている[53]。これらの結果から、HATはSCFAによるヒストンアセチル化に重要な役割を果たすことが確認され、SCFAの効果を制御するための潜在的な標的であることが示された。しかし、CCH 状態における HAT の活性を明らかにするためには、今後の研究が必要である。

本研究には、対処すべきいくつかの限界があった。第一に，CCH後の脳組織に対するFMTおよびSCFA処理の効果は不明なままである．第二に，本研究では脳血流を測定していないため，BCCAo3群間の虚血成功率を評価することができない．第三に，抗生物質投与により腸内細菌叢が枯渇したことを検証するためには，抗生物質投与後の16S rRNA遺伝子発現解析が必要である．さらに、抗生物質投与または食塩単独投与が腸の機能障害に影響を与えることを考慮すると、抗生物質投与または食塩をマッチさせたコントロールが、それぞれFMTおよびSCFA投与の効果を増幅したかどうかを確認するためのコントロールグループが必要であろう。第4に、大腸組織のみを調べたため、大腸のTh17細胞における効果を検証するためには、さらなる研究が必要である。第5に、CCIの適切な細胞モデルは現在のところ存在しないが、適切なCCI細胞を用いた酸素消費率の測定は、酸化的リン酸化の結果を効果的に補完するものである。最後に、SCFA処理は、炎症性サイトカインの産生を抑制するだけでなく、内皮細胞への免疫細胞の遊走および動員を防止した[54]。大腸上皮細胞は、免疫細胞とは異なるメカニズムを採用している可能性があるため、今後、大腸上皮細胞および免疫細胞に対するSCFAの影響を探る研究が必要である。

結論
以上の結果より、CCH は腸内細菌叢の組成を変化させ、ミトコンドリア ETC 活性および酸化的リン酸化の阻害に関連すると思われる SCFAs の代謝産物を生成し、ミトコンドリアエネルギー代謝の調節異常につながることが示された。また、CCHは病原性Th17細胞の分化、IRF4/STAT3複合体の形成、STAT3のリン酸化を誘導し、大腸バリアの障害と慢性大腸炎に関連していた。一方、FMTとSCFA補給は、Ruminococcus_sp_N15_MGS_57の腸内存在量を増加させ、酢酸含有量を増加させてSCFAsの微生物代謝を調節することにより、CCH誘発腸内細菌異常を改善させた。このことは、TregとTh17細胞のバランス、ミトコンドリアETC活性、酸化的リン酸化の改善によって、CCHに反応した大腸の炎症とミトコンドリアエネルギー代謝の調節不全を防ぐことにつながった。これらの知見を総合すると、CCI後の大腸機能障害に対するFMTおよびSCFA補給の治療効果の可能性が浮き彫りになった。

データおよび材料の入手方法
16S rRNA 遺伝子配列および RNA-seq データは BioProject データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject) にアクセッション番号 PRJNA869931 および PRJNA781099 でアップロードされています。この論文で使用したその他のデータは、当研究グループでのさらなる利用のため、必要な場合は秘密保持のもと、対応する著者から入手可能である。

略語
CCH:
慢性脳梗塞

SCFAs:
短鎖脂肪酸

FMT:
糞便微生物叢移植法

BCCAo:
両側総頸動脈閉塞症

HDAC
ヒストン脱アセチル化

GC-MS:
ガスクロマトグラフ質量分析計

DEGs:
分化型遺伝子

KEGG:
京都府遺伝子・ゲノム百科事典

GO:
遺伝子オントロジー

GSEA:
遺伝子セットエンクリッチメント解析

ATP:
アデノシン三リン酸

NADH-DH:
NADHデヒドロゲナーゼ

SQR:
コハク酸-コエンザイムQレダクターゼ

CCR
シトクロムC還元酵素

CCO
シトクロムCオキシダーゼ

ATPアーゼ
ATP合成酵素

ETC
電子輸送系

HE：ヘマトキシリン・エオジン
ヘマトキシリン・エオジン

DHE
ジヒドロエチジウム

ELISA
酵素結合免疫吸着測定法

IRF4:
インターフェロン制御因子4

NLRP3:
NLRファミリー、ピリンドメイン含有3

VCAM1:
血管細胞接着分子1（Vascular cell adhesion molecule 1

TGFβ1：トランスフォーミング成長因子β1
トランスフォーミング増殖因子β1

COX1:
チトクロームcオキシダーゼサブユニット1

ND4:
NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4

RORγt：レチノイド酸受容体関連オーファン受容体γt
レチノイド酸受容体関連オーファン受容体γt

STAT3
Signal transducer and activator of transcription 3（シグナル・トランスデューサー・アンド・アクティベーター・オブ・トランスクリプション3）。

FOXP3：フォークヘッドボックスP3
フォークヘッドボックスP3

参考文献
Struys T, Govaerts K, Oosterlinck W, Casteels C, Bronckaers A, Koole M, Van Laere K, Herijgers P, Lambrichts I, Himmelreich U, Dresselaers T. In vivoでは慢性脳低灌流による長期血管リモデリングの証拠が示されている。J Cereb Blood Flow Metab. 2017;37:726-39.

論文

キャス

Google Scholar

ヘインズワースAH、マーカスHS. in vivo実験モデルはヒトの脳小血管疾患を反映しているか？システマティックレビュー。J Cereb Blood Flow Metab. 2008;28:1877-91.

論文

Google Scholar

カンナビノイド受容体作動薬WIN55,212-2と脂肪酸アミドヒドロラーゼ阻害薬URB597は、c-Jun N-terminalキナーゼのシグナルを阻害することにより、慢性脳低灌流による神経細胞のアポトーシスを抑制する。Neuroscience. 2015;301:563-75.

論文

キャス

Google Scholar

Wang L, Wang J, Wang F, Liu C, Yang X, Yang J, Ming D. VEGFによる慢性脳低灌流ラットの認知およびシナプスの改善にはオートファジー過程が関与しています。Neuromolecular Med. 2017;19:423-35.

論文

キャス

Google Scholar

Qu C, Qu C, Xu L, Shen J, Lv D, Li Y, Song H, Li T, Zheng J, Zhang J. Nuclear receptor TLX may be through regulating the SIRT1/NF-κB pathway to ameliorate cognitive impairment in chronic cerebral hypoperfusion.核内受容体TLXは、慢性的な脳低温障害において認知障害を改善するためにSIRT1/NF-κB経路を制御する可能性がある。ブレインレズブル。2021;166:142-9.

論文

CAS

Google Scholar

ラット慢性脳灌流下における大脳皮質へのアディポネクチンの選択的蓄積を明らかにした。NeuroReport. 2020;31:148-55.

論文

CAS

Google Scholar

Shimada T, Shindo A, Matsuyama H, Yata K, Niwa A, Sasaki R, Ayaki T, Maki T, Wakita H, Tomimoto H. Chronic cerebral hypoperfusion upregulates leptin receptor expression in astrocytes and tau phosphorylation in tau transgenic mice.慢性的な脳低灌流は、アストロサイトのレプチン受容体の発現とタウのリン酸化を上昇させる。Neurosci Lett. 2019;704:133-40.

論文

キャス

グーグル・スカラー

Damodaran T, Müller CP, Hassan Z. Chronic cerebral hypoperfusion-induced memory impairment and hippocampal long-term potentiation deficits are improved by cholinergic stimulation in rats.慢性脳低灌流による記憶障害と海馬長期増強障害は、ラットのコリン作動性刺激によって改善される。Pharmacol Rep. 2019;71:443-8.

論文

キャス

グーグル・スカラー

Camara-Lemarroy CR, Ibarra-Yruegas BE, Gongora-Rivera F. Gastrointestinal complications after ischemic stroke.（虚血性脳卒中後の消化器系合併症）。J Neurol Sci. 2014;346:20-5.

論文

Google Scholar

メイヤー EA. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nat Rev Neurosci. 2011;12:453-66.

論文

CAS

Google Scholar

Morshedi M, Hashemi R, Moazzen S, Sahebkar A, Hosseinifard ES. 多発性硬化症におけるプロバイオティクスの免疫調節および抗炎症効果：システマティックレビュー。J Neuroinflammation. 2019;16:231.

論文

キャス

Google Scholar

サンプソンTR、デベリウスJW、スロンT、ヤンセンS、シャストリGG、イルハンZE、チャリスC、シュレッターCE、ロシャS、グラディナルV、チェッセレMF、ケシャバルジアンA、シャノンKM、クラジュマルニック-ブラウンR、ウィトゥング-スタフシェデP、ナイトR、マズマニアンスKK. 腸内細菌叢は、パーキンソン病モデルにおける運動障害と神経炎症を制御する。Cell. 2016;167:1469-1480.e12.

論文

キャス

Google Scholar

Jiang C, Li G, Huang P, Liu Z, Zhao B. The gut microbiota and Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 2017;58(1):1-15.

論文

Google Scholar

Fung TC, Olson CA, Hsiao EY. 健康と病気における微生物叢、免疫系、神経系の相互作用。Nat Neurosci. 2017;20:145-55.

論文

キャス

Google Scholar

Chen Y, Liang J, Ouyang F, Chen X, Lu T, Jiang Z, Li J, Li Y, Zeng J. Persistence of gut microbiota dysbiosis and chronic systemic inflammation after cerebral infarction in cynomolgus monkeys. Front Neurol. 2019;10:661.

論文

Google Scholar

Blasco MP, Chauhan A, Honarpisheh P, Ahnstedt H, d'Aigle J, Ganesan A, Ayyaswamy S, Blixt F, Venable S, Major A, Durgan D, Haag A, Kofler J, Bryan R, McCullough LD, Ganesh BP.（以下、Blasco MP）。脳卒中後の炎症における腸管マスト細胞およびヒスタミンの年齢依存的な関与。J Neuroinflammation. 2020;17:160.

論文

CAS

グーグルスカラー

マクファーレンS、マクファーレンGT．短鎖脂肪酸の産生を制御する。2003;62:67-72をプロクルートソック。

記事

キャス

Google Scholar

Lee J, d'Aigle J, Atadja L, Quaicoe V, Honarpisheh P, Ganesh BP, Hassan A, Graf J, Petrosino J, Putluri N, Zhu L, Durgan DJ, Bryan RM Jr, McCullough LD, Venna VR.腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸は、脳梗塞後の回復を促進する。腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸は、高齢マウスの脳卒中後の回復を促進する。Circ Res.2020;127:453-65。

論文

CAS

Google Scholar

ラットにおける両側総頸動脈永久閉塞：慢性脳灌流低下による神経変性疾患のモデル．Brain Res Rev. 2007;54:162-80.

論文

CAS

Google Scholar

Chen R, Xu Y, Wu P, Zhou H, Lasanajak Y, Fang Y, Tang L, Ye L, Li X, Cai Z, Zhao J. Transplantation of fecal microbiota rich in short chain fatty acids and butyric acid by regulate gut microbiota tranced brain ischemic stroke tranced. Pharmacol Res. 2019;148: 104403.

論文紹介

キャス

Google Scholar

Hu J, Luo H, Wang J, Tang W, Lu J, Wu S, Xiong Z, Yang G, Chen Z, Lan T. Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice.マウスの腸管バリア破壊は、慢性的な高塩分摂食によって引き起こされる初期の腎障害を誘発する。Exp Mol Med. 2017;49: e370.

論文

Google Scholar

Liu X, Dai M, Ma Y, Zhao N, Wang Z, Yu Y, Xu Y, Zhang H, Xiang L, Tian H, Shui G, Zhang F, Wang J. Reconstruction and dynamics of the human intestinal microbiome observed In Situ. Engineering. 2021. https://doi.org/10.1101/2020.02.25.964148v1.

論文

Google Scholar

Zou J, Chassaing B, Singh V, Pellizzon M, Ricci M, Fythe MD, Kumar MV, Gewirtz AT. 食物繊維を介した腸内細菌叢の滋養は、IL-22を介した大腸の健康を回復させることにより、食事誘導性肥満から保護する。セルホストマイクロビー。2018;23:41-53.

論文

キャス

グーグル・スカラー

Nafday SM, Chen W, Peng L, Babyatsky MW, Holzman IR, Lin J. Short-chain fatty acids induce colonic mucosal injury in rats with various postnatal age（短鎖脂肪酸は様々な生後年齢のラットの大腸粘膜損傷を誘発する。小児科研究 2005;57:201-4.

論文

CAS

Google Scholar

Caporaso JG、Kuczynski J、Stombaugh J、Bittinger K、Bushman FD、Costello EK、Fierer N、Peña AG、Goodrich JK、Gordon JI、Huttley GA、Kelley ST、Knights D, Koenig JE, Ley RE, Lozupone CA, McDonald D, Muegge BD, Pirrung M, Reeder J, Sevinsky JR, Turnbaugh PJ, Walters WA, Widmann J, Yatsunenko T, Zaneveld J, Knight R.（ケーニッヒ・イー、レイ・RE、ロズポーンCA、マクドナルドD、ミューゲBD、ピルングM、リーダーJ、セビンスキーJR、ターンボーPJ、ウォルターズWA QIIMEはハイスループットなコミュニティシークエンスデータの解析を可能にします。Nat Methods. 2010;7:335-6.

論文

CAS

Google Scholar

Chapman MG, Underwood AJ. 多変量集合における生態的パターン：ANOSIMテストにおける負の値の情報と解釈. 海洋生態学の進歩。1999;180:257-65.

論文

Google Scholar

Wang Y, Wen R, Liu D, Zhang C, Wang ZA, Du Y. キトサンオリゴ糖のDSS誘発腸管バリアー障害に対するin vitroおよびin vivoでの効果探索。Molecules. 2021;26:2199.

論文

CAS

Google Scholar

ストッキンガーB、オメネッティS. Tヘルパー17細胞の二律背反性。Nat Rev Immunol. 2017;17:535-44.

論文

キャス

Google Scholar

Wu B、Zhang S、Guo Z、Bi Y、Zhou M、Li P、Seyedsadr M、Xu X、Li JL、Markovic-Plese S、Wan YY. TGF-βスーパーファミリーサイトカインActivin-Aは、自己免疫性神経炎症時に誘導され、病原性Th17細胞の分化を促進する。Immunity. 2021;54:308-23.

論文

CAS

Google Scholar

Loos J, Schmaul S, Noll TM, Paterka M, Schillner M, Löffel JT, Zipp F, Bittner S. Intravital twophoton microscopyで明らかにしたEAEにおけるTh1、Th17、ex-Th17細胞の機能的な特徴。J Neuroinflammation. 2020;17:357.

論文

CAS

Google Scholar

Mahnke J, Schumacher V, Ahrens S, Käding N, Feldhoff LM, Huber M, Rupp J, Raczkowski F, Mittrücker HW.（マーネケ J、シューマッハ V、アーレンス S、ケディング N、フェルトホフ LM、フーバー M、ルップ J、ラツコフ F、ミットリュッカー HW. インターフェロン制御因子4はTH1細胞のエフェクター機能と代謝を制御する。Sci Rep. 2016;6:35521.

論文

キャス

Google Scholar

Wang X, Zhang Y, Yang XO, Nurieva RI, Chang SH, Ojeda SS, Kang HS, Schluns KS, Gui J, Jetten AM, Dong C. Il17およびIl17fの転写は保存型ノンコーディング配列2により制御されています。Immunity. 2012;36:23-31.

論文

Google Scholar

Heneka MT, Kummer MP, Stutz A, Delekate A, Schwartz S, Vieira-Saecker A, Griep A, Axt D, Remus A, Tzeng TC, Gelpi E, Halle A, Korte M, Latz E, Golenbock DT.（ヘネカMT、クマーMP、シュトゥッツA、デレケートA、シュワルツS、ヴィエイラ・サエッカーA、グリップA、アクストD、リーマスA、ツェンTC、ゲルピE NLRP3はアルツハイマー病で活性化され、APP/PS1マウスの病理に寄与している。Nature. 2013;493:674-8.

論文

論文

Google Scholar

バウムガートDC、カーディングSR. 炎症性腸疾患：原因および免疫生物学。Lancet。2007;369:1627-40.

記事

CAS

Googleのスカラー

Charo IF, Ransohoff RM. ケモカインとケモカインレセプターの炎症における多くの役割。N Engl J Med. 2006;354:610-21.

論文

CAS

Google Scholar

Kamphorst JJ, Chung MK, Fan J, Rabinowitz JD. 低酸素状態のがん細胞におけるアセチル-CoA産生の定量的解析により、酢酸からの実質的な寄与が明らかになった。Cancer Metab. 2014;2:23.

論文

Google Scholar

Benakis C, Brea D, Caballero S, Faraco G, Moore J, Murphy M, Sita G, Racchumi G, Ling L, Pamer EG, Iadecola C, Anrather J. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal γδ T cells.は、脳梗塞の転帰に影響を与える。Nat Med. 2016;22:516-23.

論文

キャス

Google Scholar

Liu Q, Johnson EM, Lam RK, Wang Q, Bo Ye H, Wilson EN, Minhas PS, Liu L, Swarovski MS, Tran S, Wang J, Mehta SS, Yang X, Rabinowitz JD, Yang SS, Shamloo M, Mueller C, James ML, Andreasson KI.（邦題：脳梗塞の重症度を高めるTREM1反応 脳や腸の免疫原に対する末梢のTREM1応答は、脳卒中の重症度を増幅させる。Nat Immunol. 2019;20:1023-34.

論文

キャス

Google Scholar

Liu YJ、Tang B、Wang FC、Tang L、Lei YY、Luo Y、Huang SJ、Yang M、Wu LY、Wang W、Liu S、Yang SM、Zhao XY. パルテノライドは、腸内細菌叢依存的にTreg/Th17バランスを調節することにより、大腸の炎症を改善する。Theranostics. 2020;10:5225-41.

論文

CAS

Google Scholar

Dolati S, Ahmadi M, Khalili M, Taheraghdam AA, Siahmansouri H, Babaloo Z, Aghebati-Maleki L, Jadidi-Niaragh F, Younesi V, Yousefi M. Peripheral Th17/Treg imbalance in elderly patients with ischemic stroke.高齢者の脳卒中の末梢のTh17/Tregの不均衡。Neurol Sci. 2018;39:647-54.

論文

Google Scholar

Park SG, Mathur R, Long M, Hosh N, Hao L, Hayden MS, Ghosh S. T制御細胞はγδT細胞を抑制することで腸の恒常性を維持する. Immunity. 2010;33:791-803.

論文

CAS

Google Scholar

慢性的な脳低灌流はAIM2およびNLRP3インフラマソームを活性化することを明らかにした。Brain Res. 2020;1736: 146779.

論文

CAS

Google Scholar

Goodman WA, Young AB, McCormick TS, Cooper KD, Levine AD. Stat3リン酸化は、制御性T細胞抑制に対する初代ヒトT細胞の抵抗性を媒介する。J Immunol. 2011;186:3336-45.

論文

CAS

Google Scholar

Brüstle A, Heink S, Huber M, Rosenplänter C, Stadelmann C, Yu P, Arpaia E, Mak TW, Kamradt T, Lohoff M.（ブリュストレ、ハインク、フーバー、ローゼンプレン、シュターデルマン、ユー・ピー、マック、カムラット、ローオフ）。炎症性T(H)-17細胞の発生には、インターフェロン制御因子4が必要である。Nat Immunol. 2007;8:958-66.

記事

Google Scholar

Mudter J, Yu J, Zufferey C, Brüstle A, Wirtz S, Weigmann B, Hoffman A, Schenk M, Galle PR, Lehr HA, Mueller C, Lohoff M, Neurath MF.によるもの。IRF4はIL-17Aプロモーター活性を制御し、in vivoでRORγt依存性のTh17大腸炎を制御する。Inflamm Bowel Dis. 2011;17:1343-58.

論文

Google Scholar

Buchele V, Konein P, Vogler T, Kunert T, Enderle K, Khan H, Büttner-Herold M, Lehmann CHK, Amon L, Wirtz S, Dudziak D, Neurath MF, Neufert C, Hildner K. Th17細胞による大腸炎はインターフェロン制御因子4によりT細胞外来的にポジティブ制御をうけていることを示す。Front Immunol. 2021;11: 590893.

論文

Google Scholar

Al Mamun A, Chauhan A, Qi S, Ngwa C, Xu Y, Sharmeen R, Hazen AL, Li J, Aronowski JA, McCullough LD, Liu F. Microglial IRF5-IRF4 regulatory axis regulate neuroinflammation after cerebral ischemia and impact stroke outcomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117:1742-52。

論文

キャス

Google Scholar

Mayevsky A, Kutai-Asis H, Tolmasov M. Mitochondrial function and brain Metabolic Score (BMS) in ischemic stroke: evaluation of "neuroprotectants" safety and efficacy.ミトコンドリア機能と虚血性脳卒中の脳代謝スコア（BMS）. Mitochondrion. 2020;50:170-94.

論文

キャス

グーグルスカラー

Zhao XY, Lu MH, Yuan DJ, Xu DE, Yao PP, Ji WL, Chen H, Liu WL, Yan CX, Xia YY, Li S, Tao J, Ma QH.神経損傷におけるミトコンドリア機能障害。神経傷害におけるミトコンドリア機能障害。Front Neurosci. 2019;13:30.

論文

Google Scholar

Klimova N, Long A, Scafidi S, Kristian T. Interplay between NAD + and acetyl-CoA metabolism in ischemia-induced mitochondrial pathophysiology. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2019;1865:2060-7.

論文

キャス

グーグル・スカラー

Dalile B, Van Oudenhove L, Vervliet B, Verbeke K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication（短鎖脂肪酸の微生物叢-腸-脳間のコミュニケーションにおける役割）。Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2019;16:461-78.

論文

Google Scholar

トーマスSP、デヌJM. 短鎖脂肪酸はアセチルトランスフェラーゼp300を活性化する。Elife. 2021;10: e72171.

論文

キャス

Google Scholar

Jugder BE, Kamareddine L, Watnick PI. 微生物叢由来の酢酸は、Tip60ヒストンアセチルトランスフェラーゼ複合体を介して腸の自然免疫を活性化する。Immunity. 2021;54:1683-97.

論文

CAS

Google Scholar

Li M, van Esch BCAM, Wagenaar GTM, Garssen J, Folkerts G, Henricks PAJ.（リ・エッシュ BCAM, ワゲナー GTM, ガースン J, フォルカート G, ヘンリックス PAJ. 短鎖脂肪酸の免疫細胞および内皮細胞に対するプロおよび抗炎症作用。Eur J Pharmacol. 2018;831:52-9.

論文

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謝辞
該当事項はありません。

資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金会（助成番号：81974209、81601146、81771410）の支援を受けて実施した。

著者情報
著者ノート
Shao-Hua SuとYi-Fang Wuは、この研究に等しく貢献した。

著者および所属
同済大学医学院脳神経外科 〒200065 上海市新村路389号

蘇韶華・呉毅枋・王大鵬・海健

上海交通大学医学部薬学科 〒200025 中国上海市錦江区錦江町1-1-1

林 齊

上海交通大学医学部脳神経外科、上海第六人民病院、中国、上海、200003

張 琳

寄稿
SSH、WYF、HJは本研究の構想・設計を行った。WYF、LQ、ZL、WDPが実験を行った。データ解析はWYFとWDPが行った。原稿はSSHとHJが執筆した。最終原稿は全著者が読み、承認した。

連絡先
Shao-Hua SuまたはJian Haiに連絡すること。

倫理的宣言
倫理的承認と参加への同意
同済病院動物実験委員会より実験計画および手順を承認された。

論文発表の同意
該当なし。

競合する利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言している。

追加情報
出版社からのコメント
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権利と許可
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この記事の引用
Su, SH., Wu, YF., Lin, Q. et al. Fecal microbiota transplantation and replenishment of short-chain fatty acids retulating gut microbiota, differentiation of Th17 cells, and mitochondrial energy metabolism by chronic cerebral hypoperfusion-induced colonic dysfunction protect against a chronic brain hypoperfusion, and replenishment of short-chain fatty acids. J Neuroinflammation 19, 313 (2022)。https://doi.org/10.1186/s12974-022-02675-9。

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受付終了
2021年12月16日

受理済
2022年12月17日

公開日
2022年12月26日発行

DOI
https://doi.org/10.1186/s12974-022-02675-9