パイオニア・コロナイザー： ニワトリの腸内形態を変化させ、微生物叢を発達させる細菌たち
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目次
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はじめに
材料と方法
結果
ディスカッション
結論
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ORIGINAL RESEARCHの記事
Front. フィジオール、2023年3月29日
第2回 鳥類生理学
第14巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1139321
この記事は、「研究テーマ」の一部です。
鳥類マイクロバイオーム：胚発生から成体まで
全9件の記事を見る
パイオニア・コロナイザー： ニワトリの腸内形態を変化させ、微生物叢を発達させる細菌たち
Margie D. Lee1,2* Adriana A. Pedroso2† Brett Lumpkins3† Youngjae Cho2† and John J. Maurer2,4
1バージニア工科大学バージニアメリーランド獣医学部（米国バージニア州ブラックスバーグ）。
2ジョージア大学獣医学部家禽診断研究センター（ジョージア州アテネ、GA、米国
3ジョージア大学農業環境科学部家禽科学科、ジョージア州アテネ、GA、アメリカ合衆国
4バージニア工科大学農業生命科学部動物・家禽科学科（米国バージニア州ブラックスバーグ市
一般的に鶏に投与される微生物は、腸の機能、飼料変換を改善し、病原体のコロニー形成を減少させる有益なマイクロバイオームの発達を促進します。鶏の糞便から抽出され、ヒナのサルモネラ菌の定着を抑制することが示されている競合排除製品は、適切な腸の発達と動物の成長に必要な重要な先駆結腸菌を有しています。我々は、孵化後1日目のヒナにこれらの先駆的なコロニー形成細菌を接種することで、腸の解剖学的構造とマイクロバイオームの発達が促進されると仮定した。ブロイラー鶏の孵化日に、競合排除製品を飲料水として投与し、腸の形態学、腸内細菌叢、生産パラメータに与える影響を、無処置の対照群との比較で評価した。16S rRNA遺伝子、末端制限断片長多型（T-RFLP）を用いて、回腸の群集組成を評価した。孵化日に投与した競合排除製品は、3日齢のニワトリにおいて、対照群に比べ、絨毛高、絨毛高/幅比、杯細胞生産を約1.25倍、腸細胞糖輸送体発現を1.25〜1.5倍増加させた。次の段階として、競合排除製品に存在する2つの主要な細菌門のパイオニア・コロニー形成細菌を表すBacteroidiaとClostridiaを含む定義された製剤をヒナに接種した。両菌群を含む規定製剤は、リン酸緩衝食塩水処理群と比較して、16日齢および42日齢の鳥類において、それぞれラクトバチルス腸内細菌量を3分の1から半分に減少させる一方で、絨毛高（空腸：1.14～1.46倍、回腸：1.17倍）、杯細胞数（回腸：1.32～2.51倍）および飼料効率（第1日）を改善したことが年齢によって示された。したがって、先駆的なコロニー形成種を含む特定のプロバイオティクス製剤は、腸の発達、飼料効率および体重増加において利益をもたらすことができる。
はじめに
マイクロバイオームは、病原体のコロニー形成や病原性行動に対する効果的なバリアとして機能することが多くの例で示されているが、病原体排除の基盤となるメカニズムは依然として解明されていない（Nurmi and Rantala, 1973; Berg, 1980; Faure et al, 1984）．約50年前、Nurmiは、成鳥の糞便微生物群を播種したヒナがサルモネラ菌のコロニー形成に抵抗することを示し（Nurmi and Rantala, 1973）、この現象を「競合排除」と名づけた。この発見以来、数多くのグループが、成長を促進する抗生物質の効果を代替したり（Vuong et al., 2016）、他の有害な微生物を抑制するために、単一または複数の微生物種をプロバイオティクスとして研究してきました（Fukata et al., 1991; Hofacre et al., 1998a）。しかし、セカルマイクロバイオームを用いたNurmiのアプローチほど、病原体排除に効果的な定義されたコンソーシアムはありません。競合排除はその後商業化され、オリジナルのシードストックから糞便細菌を増幅し、サルモネラ菌が5 log10以上減少した凍結乾燥培養物を顧客に配布し、家禽用のサルモネラ菌排除製品として販売された（Leeら、2023年）。Hofacreらは、この競合排除製品の投与により、家禽の壊死性腸炎の重症度も低減できることを実証した（Hofacreら、1998a）。この研究は、病気の重症度を高めることを意図した条件で2019年に再現され（Hofacreら、2019）、病気コントロールにおける重要な新しい概念を示している。ヒナは孵化日に1回投与され、その後3週間後に鳥類病原性C. perfringens分離株の3回連続高用量経口投与に挑戦しました。この結果は、腸内生物生産物を投与した3週間後に、10億個の病原性毒素原性クロストリジウム・ペルフリンゲンス細胞を3日間連続して経口投与した場合のヒナの抵抗性を、競争排除の原理で説明するには不十分であったため、パラダイムの転換が示唆されました。実際、その後の研究で、腸内生物産物であるAviguard®の1回の投与は、壊死性腸炎を防ぐためにバシトラシンまたはバージニアマイシンを継続的に与えるのと同等の性能を示した（Hofacreら、1998b）。これらの結果は、競合排除製品が腸内環境を変化させ、腸内病原体に対する抵抗力を高める可能性を示している。
動物や植物に生息する微生物のコンソーシアムであるマイクロバイオームを理解することは、真核生物の発達に新たな視点を提供する。単胃脊椎動物の腸内細菌叢の栄養学的および生理学的な貢献についての理解はまだ進んでいません。病気や生理、発生におけるマイクロバイオームの役割は、「無菌」被験者と「慣行飼育」された子実体とを用いた研究から推測されることが多い。単胃動物は「無菌」（gnotobiotic）で飼育することができます（Pleasants, 1959; Meyer et al., 1964）が、gnotobioticのマウス、ブタ、ラットは、従来通りに飼育した同胞と比較して成長および体重増加が減少します（Dymsza et al., 1965; Waxler and Drees, 1972; Al-Asmakh and Zadjali, 2015）。Gnotobiotic動物はまた、腸管感染症にかかりやすく、腸管病原体を研究するための優れたモデルとなっています（Sprinzら、1961；Eatonら、2008；Reevesら、2012年）。特定の細菌種による増強は、gnotobiotic動物の腸内生理、成長、および疾患抵抗性に大きな影響を及ぼすことが示されている（Dymszaら、1965；Shirkeyら、2006；Mahowaldら、2009；Cheld-Shovalら、2014；Greigら、2018；Yinら、2022）。さらに、gnotobioticマウスが肥満マウスからの糞便移植を受けた場合に明らかなように、マイクロバイオーム組成は動物の体重増加に大きな影響を与えることができます（Turnbaughら、2006年）。
他の無菌動物モデルとの比較では、腸内細菌叢を持つニワトリは、ビタミン欠乏飼料（Coates et al., 1968）や高繊維・低代謝エネルギー飼料（Muramatsu et al., 1991）で育った場合を除いて成長面で不利になると考えられています。Gnotobiotic-chickensは、慣行飼育の鳥と比較して、杯細胞が少なく、硫酸化ムチンが多く（Cheled-Shovalら、2014）、絨毛が短く、クリプト深度が低い（Cowieson、2022）。しかし、抗菌剤を添加した飼料でニワトリを飼育した場合、体重増加や飼料転換は改善したが、無菌動物では観察されなかった（Lev and Forbes, 1959）。さらに、この現象は重度汚染環境で飼育された鶏で顕著であったことから、成長阻害は病原菌の影響である可能性が高い。そこで、商業養鶏では、virginiamycinやbacitracinのような抗生物質が、飼養密度の高い農場や衛生状態の悪い農場での成長成績を改善した（Eyssen and de Somer, 1963）。この改善はC. perfringensのような病原性腸内細菌種の抑制によるものと考えられたため、米国では家禽の壊死性腸炎を防ぐための予防薬として抗生物質が広く使用されるようになった。この習慣は、ヨーロッパで成長促進用抗生物質が禁止され（Casewell et al., 2003）、米国で抗生物質不使用の生産に向けた動きが出てから減少傾向にあります（Diaz-Sanchez et al., 2015）。
母親の腸内マイクロバイオームは、子孫のための重要な生物源であり、多くの研究が、最初のマイクロバイオームの播種が子孫の健康にとって重要であることを示している（Neu and Rushing, 2011; Koleva et al., 2015; Chen et al., 2018; Kubasova et al., 2019a; Klein-Jöbstl et al., 2019; Treichel et al., 2019; Yu et al., 2019）。現代の家禽生産システムは、生産性を高め、病気の感染を減らすために、孵化と孵化の過程で子孫の物理的存在を排除し、それによって鶏からひよこへの細菌の移行を中断させました。その結果、孵化したばかりのヒナは多様な母体微生物群にアクセスできず、環境微生物の播種を受けやすくなり（Pedroso et al.、2015）、これらの生物は腸の初期発達や病原体の排除において有益な効果をもたらすとは考えられません。しかし、鶏の腸内には、生後4日目に酸素を消費する連鎖球菌とγ-プロテオバクテリアで始まり、その後、偏性嫌気性クロストリジウムで置換されるという、一貫した予測可能な微生物の継承がある（Lu et al., 2003; Jurburg et al., 2019）。しかし、ヒナが早期にセカルマイクロバイオームを提示された場合、病原体のコロニー形成に抵抗する安定したコミュニティを形成します（Ramírez et al.、2020）。マイクロバイオームは動物の生理に影響を与えるため（Cheled-Shoval et al., 2014; Heath-Heckman et al., 2014; Kremer et al., 2014; McFall-Ngai, 2014）、特に腸の発達初期には、宿主が初期のパイオニアコロナイザーに反応することで明らかになるだろう（Shao et al., 2014; De Maesschalck et al., 2015; Gourbeyre et al., 2015）．
パイオニアコロナイザーの生態学的概念はよく確立されており、機能的に多様な腸内細菌叢の発達を増強する上で重要であることが示されている。2005年、Backhedらは、パイオニアコロナイザーが動物宿主と共進化し、栄養学的・解剖学的観点から腸内環境に影響を与えるプロセスを概念化しました（Backhed et al.、2005）。彼らは、同系統のマウスを用い、腸内細菌叢の欠如に伴う発育不全を、Bacteroides thetaiotaomicron1種を投与することで完全に緩和できることを実証しました。その後の研究で、幹細胞の分化は、宿主の腸管ムチンを利用した細菌の代謝物によって刺激されることが明らかになりました（Sommer and Backhed, 2013）。これらの知見は、成熟したニワトリの腸内細菌叢に含まれるパイオニアコロナイザーを含むプロバイオティクス製剤が、孵化したばかりのヒナの腸の発達を促進し、成績を向上させる可能性を示しています。
本研究では、孵化直後のブロイラー鶏を競合排除製品で処理し、無処理の対照群と比較して、16 S rRNA遺伝子末端制限断片長多型（T-RFLP）、腸管形態計測（絨毛高、絨毛高／幅比、杯細胞数）、体重増加および飼料転換率で測定した腸内コミュニティ構造に対する処理結果の影響を検討しました。第二段階として、競合排除製品Aviguard®（Lee et al., 2023）の2つの支配的なフィラを代表する鶏冠から特定の種を選択し、PBS処理群に対する生産成績、腸内生理、腸内マイクロバイオームの変化への影響を調べるために、これらの鶏冠生物からなる異なる製剤またはPBSを新たに孵化したひなに投与しました。鶏の腸機能に対する同様の形態学的改善は、20～50の異なる属からなる競合排除製品よりも、偏性嫌気性パイオニアコロナイザーからなる2～5種のプロバイオティックカクテルで得られる可能性がある（Lee et al.、2023）。
材料と方法
競合排除製品、プロバイオティクス製剤、PBSを投与したニワトリの腸内群集の16S rRNA遺伝子解析
市販の競合排除製品から細菌を回収するため、生理食塩水中で10分間インキュベートすることで細菌細胞を再水和し、遠心分離により回収した。以下に概説する様々な処理と時間帯からニワトリの腸を採取した。細菌画分は、以前に記載されたように（Apajalahtiら、1998；Luら、2003）、複数回の差動遠心分離によって腸内容物から回収された。DNAは、Mo Bio kit (Mo Bio Laboratories Inc., Solana Beach, CA)を用いて、細胞懸濁液を6,000rpmで20分間叩打して抽出した（Lu et al., 2008）。細菌群集は、以前に記載されたように（Luら、2006；Luら、2008）、配列ベースのデータベースを用いた16S rRNA末端制限断片長多型（T-RFLP）分析によって評価された。5′FAM（カルボキシフルオレセイン-N-ヒドロキシスクシンイミド・エステル-ジメチル・スホキシド）でラベルされたユニバーサル16S rRNAプライマー8Fおよびラベルされていない1429Rが群集DNAを増幅するのに用いられた（Luら、2008）。各DNAサンプルについて、3回に分けて18サイクルのPCR反応を行い、T-RFLP解析のためにプーリングした。ネガティブコントロールとして、DNAテンプレートはPCRに含めなかった。このネガティブコントロールでは、アンプリコンは観察されなかった。アンプリコンを制限酵素HaeIII（New England BioLabs; Ipswich, MA）で消化し、ABI PRISM 310 DNAシーケンサー（PE Biosystems; Foster City, CA）での電気泳動により分析した。各サンプルについて、断片をサイズ標準に手動で合わせることにより、バックグラウンドより50単位以上高いピーク面積とピーク高さのみを分析し、35～525 bpのDNA断片のみを検査した。T-RFLピークは、以前に発表されたクローンライブラリーからInsilco HaeIIIパターンの16S rRNA遺伝子データベースと比較することで同定した（Lu et al., 2003）。
T-RFLPによって検出された細菌種または系統の相対的な存在量は、各ピークの面積と1つのサンプル内のすべてのピークの合計面積との間の比を計算することによって決定した（Lukowら、2000）；3つの分析の平均比は、パーセントに変換された。細菌群集の多様性を評価するために、Shannon多様性情報指数（Shannon and Wiener, 1963）を使用した。多様性指標は分散分析（SAS, 2008）を用いて分析し、Aviguard®を投与した鳥と何も投与しなかった鳥（無処置対照群）の腸内コミュニティの違いを明らかにしました。
鶏腸内からのパイオニアコロニーニング菌の分離
Aviguard®は、Clostridia目とBacteroidia目に属する偏性嫌気性菌（Pedroso et al., 2015; Lee et al., 2023）を主体としており、若鳥の腸内形態計測を改善することから、この競合排除製品に取って代わるパイオニアコロナイズ種を分離し特定しようと考えた。地元の加工工場から入手した市販ブロイラー鶏の死骸の糞便から嫌気性で先駆的なコロニー形成細菌が分離された。3羽の鶏の頭蓋内容物をあらかじめ還元血清瓶に絞り、90％N2および10％H2を含む嫌気性チャンバー内で20mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で連続的に希釈した。この懸濁液をルーメン液-グルコース-セロビオース＋ペプトン（RGCAP）-10、RGCAP-30、10％改変ルーメン液培地（M98-5）、リッチ培地（RM）（ATCC Medium 1,341；20g グルコース、10g イーストエキス、2g K2HPO4 、1L dH2Oあたり15g寒天）寒天（Kelley、1983）にプレートし、45℃で5日間95%N2と5%H2の下でインキュベートした。分離されたコロニーは、以前に記載されたように16 S rDNA配列決定によって特徴付けられた（Luら、2003年）。Escherichia coli、Parabacteroides distasonis、Bacteroides salyersiae、Phocaeicola doreiおよびRomboutsia lituseburensis ATCC 25759の選択した分離株を、嫌気性条件（80% N2、10% CO2 および 10% H2）下でRGCAP-10寒天上で5日間培養した。コロニーを採取し、109CFU/mlの濃度になるようにあらかじめ還元した生理食塩水に再懸濁した。
偏性嫌気性菌は培養により分離され、16S rRNAアンプリコンシークエンシングにより同定されました。サブカルチャーにより、P. distasonis、B. salyersiae、P. dorei（旧名：Bacteroides dorei）と同定されたBacteroidia目に属する偏性嫌気性細菌が得られた。それらのゲノムの部分配列から、バクテロイディア目に特徴的な多糖類利用遺伝子と関連するグリコシルヒドラーゼ（Grondin et al.、2017）が明らかになった。これらの遺伝子、16S rRNA、および他のハウスキーピング遺伝子のDNA配列により、種レベルでの同一性が確認された（BLASTスコア：≧98%のヌクレオチド同一性；100%のカバー率）（表1）。Bacteroidiaのゲノムには、酢酸およびプロピオン酸代謝のためのいくつかの注釈付き遺伝子が存在した。また、Bacteroides salyersiaeとP. doreiは、酪酸産生を担うホスホトランスブチリラーゼと酪酸キナーゼとしてアノテーションされた遺伝子を有していた。これらの遺伝子は、単離されたP. distasonisのゲノムを検索しても、BLAST検索を含む公開されたP. distasonisゲノムのアミノ酸レベルでの注釈付き検索でも、存在しなかった。これらのバクテロイディアは、核となる糖質活性酵素（CAZymes）を含むが、その他のCAZymesの分布には、これらの分離株間で違いがあった。炭水化物や発酵の代謝に違いがあるため、鳥類に投与するBacteroidiaカクテルの一部として、複数の種を含めることにしたのです。
表1
TABLE 1. 本研究で説明したプロバイオティクスの製剤化に使用したセカルス菌。
R. lituseburensisは、競合排除製品Aviguard®やその他の飼料添加物を与えられた鳥類に豊富に存在する系統であるため（Lu et al., 2008）、R. lituseburensisの分離株はAmerican Type Culture Collection（ATCC 25759）から購入して本研究に組み込んだ。また、鶏の腸内試料から分離した大腸菌は、雛に偏性嫌気性菌を播種するために必要な嫌気性環境を確立するためのγ-プロテオバクテリアのパイオニアとして機能した（Espey, 2013）.
等量の懸濁液を混合することにより、分離株のプールを作成した。プロバイオティック培養物の3つのプールは、孵化日のヒナに投与するために調製され、以下の配合からなる；プロバイオティックカクテル1：P. distasonis、B. salyersiae、およびP. dorei、および大腸菌；プロバイオティックカクテル2：R. lituseburensisおよび大腸菌；ならびにP. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、およびR. lituseburensisと大腸菌とを含むプロバイオティックカクテル3。グリセロール（15％）を各プロバイオティクス製剤のアリコートに添加し、-80℃で保存した。
競合排除製品で処理した鳥
市販の競合排除製品（Aviguard®, Lallemand, Montreal Canada）の効果を評価するため、生後1日の市販ロスコブ雑種ブロイラーヒナ120羽を60羽ずつ2群に分けておがくず敷料で飼育した。両群とも、抗菌剤を含まない市販のトウモロコシ-大豆ミール飼料を与えた。一方のグループには、市販の競合排除製品であるAviguard®を孵化当日に製造者の指示に従って飲料水として投与し、もう一方のグループには標準的な飲料水のみを与え、製品を投与しなかった。3、7、14、21、28、49日齢で頸椎脱臼により鳥を犠牲にし、腸を採取した。回腸内容物を採取し、16S rRNA遺伝子TRFLP分析のために前記のように処理した。腸の形態計測およびグルコーストランスポーター遺伝子の発現は、以下に記載するように、3日齢の鳥から収集した腸について行った。
プロバイオティクスカクテルで処理した鳥類
孵化後40日目のヒナ（Cobb 500）を70羽ずつ3反復の4つの処理区に分けた。ヒナには、50μlの1×108 Bacteroidia cocktail (P. distasonis, B. salyersiae, P. dorei) with E. coli、R. lituseburensis with E. coli、およびBacteroidia cocktail with R. lituseburensis and E. coli を経口接種した。対照群には50μlの滅菌PBSを投与した。ニワトリには、抗菌剤を含まないトウモロコシ-大豆ミール食を与えた（表1）。プロバイオティクス製剤またはPBSの経口投与から3時間後、および1、2、3、7、16、42日目に鳥を頸椎脱臼で犠牲にし、腸を採取した。
腸の組織学および形態学的特徴
競合排除製品Aviguard®（n = 60）、プロバイオティクス製剤（3種類の製剤、各処理につき210羽）またはPBS（n = 210）を接種した後、接種後3時間または上記の時点で鶏を犠牲にし、小腸を採取した。無処置群（n＝60）を競争排除試験と一緒に入れた。実験単位あたり4羽の空腸と回腸の中央部を切除し、10％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して5 um厚の切片にした。各腸管断面について、無傷でよく整った絨毛3本を8回に分けて選び、各腸管サンプルについて絨毛の高さと幅を合計24回、各処理について288回測定した。さらに、腸の断面をMayer's Mucicarmine (Val-Bernal et al., 1999)を用いて染色し、杯細胞の数をカウントした。形態学的指標は、光学顕微鏡と×16倍率レンズを用いて決定した。画像は、Image-Pro Plus Version 3.0 software (Media Cybernetics, Silver spring, MD)を用いて解析した。グルコーストランスポーターの発現は、Gilbertら（2007）に記載の方法に従い、逆転写酵素（RT）qPCRにより測定した。
処理グループ（3つのプロバイオティクスカクテルおよびPBSコントロール）ごとに4匹の動物の空腸および回腸を採取し、測定し、脱イオン水を用いて流し、空重量を記録した。相対的腸重量（グラム／体重kg）および相対的腸長（mm／体重kg）を決定した。
動物のパフォーマンス
体重と飼料摂取量を記録し、体重増加量と飼料摂取量：ゲインを算出した。死亡の発生時には、飼料摂取量を鳥の飼養日数に基づいて調整した。生後42日目に、ペンあたり15羽のニワトリを無作為に選び、翼帯を巻き、一晩絶食させた。鶏の体重を個別に測定し、屠殺し、内臓を取り出し、死骸を12時間冷やした後、死骸全体と部位について収量を求めた。
Parabacteroides distasonis、Bacteroides salyersiae、Phocaeicola dorei、Escherichia coliおよびRomboutsia lituseburensisプロバイオティックカクテルの全ゲノム配列決定とゲノム解析
2つのサンプルを氷上で解凍し、4℃で10,000xg、15分間遠心分離し、リゾチーム処理を加えたPromega Wizard® Genomic DNA extraction kit (Madison, WI) を用いて、メーカーの説明に従って、細菌ペレットからDNAを抽出した。DNAはGeorgia Genomics and Bioinformatics Coreに提出し、Illumina sequencing (San Diego, CA) を用いて配列決定した。FastQCおよびFastQ/Aを使用して、アダプターおよび低品質配列の生配列リードをクリーニングした（Patel and Jain, 2012; Afgan et al., 2018）。SPADES配列アライメントツールを使用して、処理されたペアエンドIlluminaリードを組み立てた（Bankevich et al.、2012）。アセンブルした配列ファイルをアップロードし、Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST) (Aziz et al., 2008)で注釈を付けた。個々のコンティグ（17 kb以上）の種の同一性は、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990) によりヌクレオチドレベルで決定した（98%以上同一）。このプロバイオティクス製剤内の種の同一性は、以下のように注釈された配列のBLASTによって確認された： 小リボソームサブユニットRNA」（16S rRNA）、「大リボソームサブユニットRNA」（23S rRNA）、「SusC」、「SusD」として注釈された遺伝子、Bacteroidiaに共通して存在する多糖類利用遺伝子（Gronjinら、2017）、または表1に示すハウスキーピング遺伝子（≥98%同一、100%のカバー率）。バクテロイディアは、動物の食事からの難消化性繊維であれ、ムチンであれ、複雑な炭水化物を代謝することに長けており、宿主のために前記代謝から揮発性脂肪酸を生成する。複数のBacteroidia属が同定されたため、より詳細なゲノム解析を行い、炭水化物代謝のレパートリーが最も広いプロバイオティクス製剤に含めるべき単離株を決定した。糖質活性酵素（CAZymes）は、「Sus」、「Glycosyl hydrolases」、「amylase」、「pullanase」、「idase」としてアノテーションされた遺伝子のワード検索により、アノテーション配列から同定され、塩基レベルおよびアミノ酸レベルでのBLASTにより、それぞれ種の同一性および酵素の確認がなされた。同定されたCAZymesは、これらの酵素とアミノ酸レベルで一致するモチーフを有していた。バクテロイディアでは、CAZymesは多糖類トランスポーターSusで示されるPUL（Polysaccharide Utilization Loci）と関連していることが多い（Grondin et al.、2017）。Susから何らかのCAZymeとしてアノテーションされた遺伝子を除いた遺伝子座がいくつか確認された。仮説的タンパク質」と注釈された遺伝子は、注釈付き細菌ゲノムのBLASTX検索を介してCAZymeとして同定された。発酵酵素は、表1に示す酵素の遺伝子アノテーションの類似語検索により同定した。これらの同一性と生物種の割り当ては、それぞれアミノ酸とヌクレオチドレベルのBLAST検索によって決定された。
統計解析
性能および腸の測定値は、SAS（SAS, 2008）の一般線形モデル手順を用いて、完全ランダム化計画の分散分析（ANOVA）手順に従った。処理間の差の統計的有意性は、最小有意差検定（Steel and Torrie, 1980）を用いて評価した。統計的有意性の判定には、p＜0.05の確率レベルを使用した。標準誤差（SEM）は、すべての値の標準偏差をサンプルサイズの平方根で割った値から算出した。
結果
競合排除製品で腸の形態と腸管細胞の機能を改善する
競合排除製品は病原体の排除に有効であることが示されているが、鶏の腸に由来するこの微生物コンソーシアムは、腸の形態と機能を効果的に調節することができるのだろうか。この疑問を解決するため、孵化した日に競争排除製品であるAviguard®を鳥の飲み水に混ぜて投与するか、あるいは投与しないか（未処理、対照群）を決定しました。Aviguard®を投与すると、腸の形態が改善され、絨毛の高さ、高さ/幅比、絨毛あたりの杯細胞の割合が、無処置の鳥と比較して1.26～1.36倍、p<0.05（表2）上昇しました。さらに、3日齢のブロイラー鶏の回腸において、腸管トランスポーターであるGLUT2、GLUT5、SGLT1の発現量が対照群と比較して1.25～1.5倍増加した（図1；p＜0.05）。
表2
表2. 腸内生物製剤Aviguard®を投与した3日齢のブロイラー雛の回腸形態。
図1
図1. 孵化当日に競合排除製品（Aviguard®）または無処理（コントロール）を受けた3d齢ブロイラー鶏の小腸におけるグルコーストランスポーターGlut2、Glut5およびSGLT1の相対発現（p < 0.05 ）。相対的な遺伝子発現は、2-ΔΔCT法を用いて決定した。標的遺伝子の遺伝子発現を正規化するためにGAPDHを使用した。
競争的排除製品は、ニワトリ回腸における群集の多様性を安定させ、クロストリジウムの存在量を促進する
図2および図3は、孵化日の鳥にAviguard®を投与した場合のマイクロバイオームにおける細菌の構成と継起を示したものである。対照区と競合排除製品であるAviguard®を投与した区では、49日間にわたる細菌の系統型の継承に違いがみられた（補足図S1）。また、コントロールと競合排除製品を投与した鳥の間で、系統型の分布に大きな違いがあり、特にLactobacillus crispatusとR. lituseburensis（Clostridia）の存在量の違いが顕著であった。これは、21日齢以上の鳥類で最も顕著であった（図2）。無処置の鳥類では乳酸菌が最も多いグループであり（図2、補足図S1）、他の種の存在量にはばらつきがあった。しかし、アビガード®の投与により、生後3日目にはクロストリジウム属が多く、7日目には腸球菌の系統型が全系統型の60％を占める回腸細菌群集が形成されました（図2、補足図S1）。しかし、SFB/Bacteroidesの系統型は7日目にR. lituseburensisとともに出現し、28日目にはRomboutsiaが最も多く、処理群の全系統型の70％を占めた。このことから、Bacteroidesはヒヨコの嫌気性菌の継代的なコロニー形成を可能にするパイオニアコロナイザーとして働く可能性が示唆された。
図2
図2. 孵化日にAviguard®（パネル（B））または無処置（コントロール、パネル（A））を投与したヒナの3、7、14、21、28および49日齢における16S rRNA T-RFLPによる回腸細菌群集の組成を決定した。
図3
図3.対照（無処理）または孵化日に競合排除製品（Aviguard®）を投与した鳥の回腸細菌群から採取したサンプルのシャノンH多様性指数。サンプルは、3、7、14、21、28、49日齢で採取した。
シャノン多様性指数から、年齢による回腸の群集の多様性の不安定さは、Aviguard®によって低減できることが示されました（図3）。分析したすべての年齢で、コントロール群とトリートメント群の間に有意差がありました（p < 0.05）。21日齢では、コントロール群で最も顕著な多様性の減少が見られた。Aviguard®の投与により、多様性は低下しましたが、対照群の劇的な変化と比較すると安定性が得られました。
パイオニアコロナイザーは腸の機能と成長パフォーマンスを促進する
R. lituseburensisおよび大腸菌カクテルを接種した孵化直後のヒナは、投与後24時間の体重増加がPBS対照に比べて最も大きかった（15.8 vs 14.7 g; p < 0.05）（表3）。同様に、P. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、E. coliおよびR. lituseburensisカクテルを投与したヒナは、PBSコントロールに対して飼料：増体比が1.18倍（1,408 kg/g 対 1,198 kg/g; p < 0.05 ）改善した。さらに、R. lituseburensisと大腸菌のカクテル、またはP. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coliとR. lituseburensisのカクテルは、16日齢の体重増加率が高かった（438または421対411、p < 0.05）。R. lituseburensisと大腸菌からなるプロバイオティックカクテル、またはP. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coliとR. lituseburensisのカクテルは、PBSまたはP. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coliカクテル投与鳥と比較して、飼育期間終了時に4%の体重増加を抑制した。しかし、R. lituseburensisおよび大腸菌カクテルを投与した鳥は、枝肉収量が高かった（表4；76.1％ vs 73.7％，p＜0.05）．脚、腿、翼、胸肉については、プロバイオティクス製剤とPBSコントロールのいずれにも差は見られなかったため、体重増加は腸の発達の変化と関連していると考えられる。
表3
表3. Parabacteroides distasonis, Bacteroides salyersiae, Phocaeicola dorei, Escherichia coli（カクテル1）；Romboutsia lituseburensis and E. coli（カクテル2）；P. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coli and R. lituseburensis（カクテル3）；またはPBSを接種した鳥の体重増加および飼料効率（Cococktail 3
TABLE 4
表4. Parabacteroides distasonis, Bacteroides salyersiae, Phocaeicola dorei, Escherichia coli (Cocktail 1); Romboutsia lituseburensis and E. coli (Cocktail 2); P. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coli and R. lituseburensis (Cocktail 3); またはPBSを摂取した42日齢鶏の死肉率（％）．
最初の1週間は、孵化日のヒナに投与したプロバイオティクスに反応して、腸の発達に変化がみられた。P. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、およびE. coliカクテルを投与した鳥は、R. lituseburensis、E. coliカクテルまたはPBSコントロールをそれぞれ投与したヒナと比べて、投与後わずか3時間で、空腸相対重量が1.28～1.44倍と高まった（表5）。2日齢の時点で、P. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、およびE. coliカクテルを投与したグループは、コントロールまたは他のプロバイオティクス製剤よりも約1.2倍大きい相対空腸重量を有していました。R. lituseburensisとE. coliカクテルを投与した鳥は、42日目にPBSコントロールと比較して空腸の相対重量が18%有意に減少した（p < 0.05）。空腸の長さは、どちらのプロバイオティクスを投与した場合でも、コントロールと比較して有意な差はありませんでした。また、プロバイオティクスは回腸の相対重量や長さに影響を与えなかった（補足表S2）。
表5
表5. Parabacteroides distasonis, Bacteroides salyersiae, Phocaeicola dorei, Escherichia coli（カクテル1）；Romboutsia lituseburensis, E. coli（カクテル2）；P. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coli and R. lituseburensis（カクテル3）；またはPBSを投与した鶏の空腸の相対重量と長さを示した．
P. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coli and R. lituseburensis カクテルは、投与後わずか3時間で空腸絨毛を長く誘導し（表6；補足図S2）、PBSコントロールと比較して、7日と16日齢でも絨毛高を継続的に増加した（それぞれ1.46、1.14および1.15倍増加；p＜0.05）。しかし、R. lituseburensisと大腸菌カクテル、またはP. distasonis, B. salyersiae, P. doreiと大腸菌カクテルの場合、生後2日と3日の鳥で、PBSコントロールと比較して絨毛長が短くなった（約20％の減少、p < 0.05）。生後42日目までの空腸絨毛の高さには、いずれのグループも有意差はなかった。プロバイオティクス製剤は、鳥が42日齢になるまで、空腸で見られたような回腸の絨毛の高さの増強を誘発しないようであった。この時点で、3つの製剤はすべて、PBS対照と比較して絨毛の高さを増加させ、R. lituseburensisと大腸菌のカクテル、またはP. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coli, R. lituseburensisが絨毛高さに最も顕著に影響を与えた（それぞれ1.39倍および1.16倍の増加、p < 0.05）。より早い時点では、プロバイオティクスは、対照群と比較して、プロバイオティクス投与後3時間（P. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、およびE. coliカクテル；40％減少；p < 0.05）、および7日目に、すべての3つのプロバイオティクス製剤はPBS対照に対して約20％嘴高を削減した（p < 0.05）ようです。
表6
表6. Parabacteroides distasonis, Bacteroides salyersiae, Phocaeicola dorei, Escherichia coli（カクテル1）；Romboutsia lituseburensis, E. coli（カクテル2）；P. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coli, R. lituseburensis（カクテル3）；またはPBS投与鶏の済腸および回腸絨毛高。
P. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、R. lituseburensisおよび大腸菌のカクテルは、孵化したばかりのヒナの回腸の杯細胞数を、投与からわずか3時間後および2日目の回腸の杯細胞数をそれぞれ1.3〜2.5倍に著しく増加した（表7；p < 0.05）。P. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、および大腸菌のカクテルは、PBSコントロールと比較して、3日目に杯細胞数を1.5倍増加させ、R. lituseburensisおよび大腸菌カクテルは7日目に杯細胞数を改善しました（p < 0.05）．すべてのプロバイオティクス製剤は、42日目に絨毛あたりの杯細胞を約1.5倍増加させたが（表7）、回腸では、プロバイオティクス製剤R. lituseburensisおよび大腸菌（30％減少、7日目）、またはP. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、R. lituseburensisおよび大腸菌カクテル（28％および40％減少、3日目と42日にそれぞれ）PBSコントロールに対して（表7；p < 0.05）。
表7
表7. Parabacteroides distasonis, Bacteroides salyersiae, Phocaeicola dorei, Escherichia coli（カクテル1）；Romboutsia lituseburensis and E. coli（カクテル2）；P. distasonis, B. salyersiae, P. dorei, E. coli and R. lituseburensis（カクテル3）；またはPBSを接種した鶏の空腸および回腸絨毯長当たりのゴブレ細胞数（Cocktail 2).
P. distasonis、Bacteroides salyersiae、P. dorei、Romboutsia lituseburensisおよびEscherichia coliのカクテルは、鶏回腸における乳酸菌の存在量を低下させる。
プロバイオティクスカクテルは、PBSコントロールと比較して、鳥類の腸内細菌叢を改変することが示されました（図4）。Aviguard®処理と同様に、プロバイオティクス製剤は腸内の乳酸菌集団に影響を与えました。3日目を除いて、P. distasonis、B. salyersiae、P. dorei、R. lituseburensisおよびE. coliカクテルは、PBSコントロールと比較して、回腸乳酸菌の存在量を23%～60%減少させました。しかし、他のプロバイオティクス製剤は、腸管セグメント（空腸対回腸）または日齢に応じて、ラクトバチルス存在量を増加させました。
図4
図4. リン酸緩衝食塩水対照群のニワトリの空腸（A-D）および回腸（E-H）から採取した試料から16 S rRNA T-RFLPにより決定した、孵化日にパイオニアコロニザーを投与したニワトリの小腸細菌群集の組成（A．E）、Romboutsia lituseburenseとEscherichia coliのカクテル（B, F）、Parabacteroides distasonis, Bacteroides salyersiae, Phocaeicola doreiとEscherichia coliのカクテル（C, G）、 P．distasonis、B. salyersiae、P. dorei、R. lituseburense、E. coliカクテル（D、H）。
考察
家禽の飼料は多様化し、ベジタリアンの選択肢や非伝統的な原材料を使用することで、動物の成長、生理、パフォーマンスを向上させるアミノ酸やビタミンを追加で補給するようになっている（Alagawany et al.、2020）。かつて動物の成長を促し病気を予防するために使用された抗生物質はなくなり、代わりにプロバイオティクス、プレバイオティクス、有機酸、エッセンシャルオイルが使用されている。これらの同じ飼料添加物の中には、腸の発達、動物の成長、病原体の排除や制御の改善において、成長促進効果のある抗生物質に匹敵することが示されているものもある（Gadde et al, 2017; Ricke, 2021; Abd El-Hack et al, 2022）。これらの添加物は、鶏の消化管マイクロバイオームを変化させることが示されている（Dittoe et al., 2018; Khan et al., 2020; Ali et al., 2021）。現在の課題は、その作用機序を解明することです。
養鶏業者は、最適な飼料変換、病気や病原体への耐性など、望ましい属性をレシピエントである子豚に刷り込もうとしています。多くの研究が、複雑な微生物相は有害な病原体の定着を禁止し、炎症を抑え、治癒を促進し、飼料効率を高め、成長を促進する有益な微生物を育てることを示している（van der Waaij et al., 1972; Candela et al.） この概念に基づき、早期腸内コロニー形成は、腸の発達、飼料変換、動物の成長にとって不可欠である。プロバイオティクスとして先駆的なコロナイザーは、孵化したばかりのヒナの成熟した安定したマイクロバイオームを確保するためのアプローチを提供します。
市販の競合排除製品であるAviguard®は、ブロイラーの耐病性を改善することが複数の研究で示されています（Hofacre et al., 1998a; Hofacre et al., 1998b; Hofacre et al., 2019）。今回の研究では、それはヒナのマイクロバイオームを変化させ、小腸の発達を改善することもできました。空腸と回腸の乳酸菌集団は、より迅速に腸内嫌気性菌に置き換えられ、回腸のコミュニティの多様性はより安定していたことから、以前に報告されたコミュニティの継起を変更できることが示されました（Lu et al.、2003）。生後3週間のヒナにおいて、より安定した腸内コミュニティ構造は、この時期が腸の健康にとって脆弱な重要な時期であることから重要である（Hofacre et al.、1998a）。組成的には、競合排除品は、潜在的なパイオニアコロナイザーとして、腸の発達と動物の成長を誘導するのに十分な多様性を持つ、豊富な腸内メンバー種を含んでいた（Flintら、2015；Kettleら、2015；Pedrosoら、2015）。
競合排除製品であるAviguard®を投与した後の小腸において、最も豊富な細菌門はバクテロイデーテス門とファーミキューテス門であり、特に後者の門に関してはクロストリジウム門が優勢であった。腸内細菌叢が宿主の生理機能に与える影響については盛んに研究されており、腸内細菌叢が存在しない場合、腸は適切に機能・発達しないことが明らかになりつつあります（Dubos et al., 1968; Smith et al., 2007; Sommer and Backhed, 2013）。ClostridiaとBacteroidiaは、多糖類の利用や摂食戦略において基本的な違いがあるものの、代謝を炭水化物に依存する点では似ている。バクテロイデーテスは、動物宿主が生成する栄養素である粘液糖鎖を採取するが（Koropatkin et al., 2012）、クロストリジアは、難消化性繊維からエネルギーを採取する能力でも知られている。今回調べたBacteroidia属とClostridia属は、ムチンや難消化性繊維から糖を遊離させるCAZymを多く持っていた。また、Bacteroidia属はムチンを加水分解してフコースを遊離させ、フコース発酵の副産物が幹細胞の発達を刺激することにより、腸内糖質組成に影響を与えることが示されている（Bry et al., 1996）。フコースはニワトリの腸内糖質における終末糖質であることが示されており、バクテロイデスが鳥類のパイオニアコロナイザーとしても機能する可能性を示している（Alroy et al.、1989； Madrid et al.、1989； Bryk et al.、1999）。また、本研究で用いたB. salyersiae、P. dorei、R. lituseburensisは、酪酸を生産するための発酵酵素と経路を有している。P. distasonisはこれらの酵素を持たないが、プロピオン酸の生産に必要な酵素を持ち、いくつかの分離株は酢酸の生産に関わるアセチルCoAヒドロラーゼも持っていることが判明した。
したがって、これらのプロバイオティクス分離株は、宿主動物が代謝できる揮発性脂肪酸（VFA）を生成する。代謝上、ClostridiaとBacteroidiaの仲間は、腸内で同じ栄養素を奪い合うのではなく、協力し合っている（Mahowald et al.、2009）。この協力により、VFAである酪酸が増加し、幹細胞の分化を促進したり、炎症性サイトカインの発現を抑えるなど、宿主である動物に様々な恩恵をもたらすという利点もある（Mahowald et al.、2009年）。ClostridiaとBacteroidiaの両方は、発酵の最終産物として、マイクロバイオームの組成を変化させ、腸の生理学に影響を与えることができる様々なVFAを生成します（Segainら、2000；Prydeら、2002；Atarashiら、2013；Cockburnら、2015）。酪酸は、宿主の腸内細胞の酪酸トランスポーターを刺激し（Mahowaldら、2009）、炎症を弱め（Vieiraら、2012）、腸の完全性を促進し（Pengら、2009）、腸の損傷の治癒（Butznerら、1996）。一方、大腸菌やシトロバクターなどのプロテオバクテリアをヒナのパイオニアコロナイザーとして使用すると、腸の健康状態の低下につながる可能性のある腸の炎症状態が誘発された（Wilsonら、2020；Chasserら、2021a； Chasserら、2021b）。
また、本研究で用いたP. distasonis分離株は、ビタミンB12依存性エタノールアミン利用遺伝子座とビタミンB12トランスポーターを有しており、サルモネラ菌などのプロテオバクテリアや他の腸内細菌とエタノールアミンを競合させると考えられる（Thiennimitr et al., 2011; Anderson et al., 2015; Kaval and Garsin, 2018）。さらに、これらのClostridia属やBacteroidia属は、乳酸菌の個体数を抑制することで間接的に飼料変換率の向上を引き出したと考えられる。乳酸菌は、最大8種類のアミノ酸、ビタミン、重要な補酵素を合成する能力を欠く、従属栄養生物です（Makarova et al., 2006; Cai et al., 2009）。乳酸菌は多くの炭水化物を発酵させることができますが、ムチンからこれらの糖を獲得する酵素は持っていません（Makarova et al.、2006；Cai et al.、2009）。したがって、乳酸菌は宿主と遊離糖、ペプチド、アミノ酸をめぐって競合し、ClostridiaやBacteroidiaなどの厳格な嫌気性菌はムチンを利用することに専念している。飼料制限下、あるいは小麦対トウモロコシ・大豆のような消化率の低い飼料では、この競争のために小腸内細菌叢の組成が飼料転換や体重増加に大きな影響を与える可能性があります（Torok et al., 2008; Metzler-Zebeli et al., 2019）。実際、飼料制限下では、回腸の乳酸菌の存在量と総体重増加の間に負の相関関係が示されている（Metzler-Zebeli et al.、2019）。低体重の鳥は、乳酸菌が支配的なマイクロバイオームも持つ傾向があります（Zhao et al.、2013）。
これは、乳酸菌が動物宿主に対して、炎症の抑制（Chen et al., 2012; Gong et al., 2020; Šefcová et al., 2020）や病原体の排除（Chen et al., 2012; Gong et al., 2020）など重要な機能を発揮しないとは言い切れない。しかし、成長促進抗生物質の作用機構は、病原体の抑制によるものだけではない可能性があり（Arakawa and Oe, 1975）、ストレプトグラミン（Lamb et al., 1999）、グリコペプチド（Chow and Cheng, 1988）、バシトラシン（Toscano and Storm, 1982）抗生物質は乳酸菌に対して幅広い活性を持っています。実際、抗生物質の成長促進剤は、回腸において乳酸菌を抑制し、群集の多様性を低下させ、Clostridiaを好む。これは、本研究で用いた競合排除製品で観察された結果と同様である（Lu et al., 2008）。したがって、成長を促進する抗生物質がマイクロバイオームの構成と多様性に大きな影響を与えることは驚くべきことではありません（Lu et al.、2008）。抗生物質やプロバイオティクスの成長促進作用は、C. perfringensのような腸内病原体の制御に起因しているかもしれないが、その真の影響は、腸の発達を促進し、マイクロバイオームの代謝を調節し、動物が小腸で解放される栄養素をよりよく奪い合えるようにすることにあると思われる。
バクテロイデスは、鶏がヒナと一緒に飼育されたときに、成鶏からその子孫に伝達される基礎属、バクテロイデスおよびパラバクテロイデスを含んでいます（Kubasova et al.、2019a）。バクテロイデーテスは、野良鶏の腸内マイクロバイオームを播種したgnotobioticヒナについて、18日目までに支配的なフィラとなり（Thomasら、2019）、このフィラのメンバーは、このフィラ、FirmicutesおよびProteobacteriaを含む複合カクテルを投与したヒナの盲腸を安定してコロニー化できる（Kubasovaら、2019B）。バクテロイディアのメンバー種は、鶏の胃腸管から特定の病原体を排除することが示されている（Kubasovaら、2019b；Papouskovaら、2023年）。
私たちの5メンバープロバイオティクス製剤で腸の発達と動物のパフォーマンスに対する有意な改善を観察したが、これはこのプロバイオティクスが本研究で検討した競合排除製品と同じ機能をすべて実行することを意味するわけではない。組成に変動はあるものの、この製品は、ヒヨコにおけるサルモネラ菌のコロニー化を減らすことに一貫性があり（Leeら、2023）、他の腸内病原体の制御に有効であることが示されている（Hofacreら、1998a；Hofacreら、2019）。この競合排除製品は、鶏の糞便由来の、20～50の異なる属からなる複雑なコンソーシアムである。Kubasovaらは、P. distasonisを含む8メンバーのプロバイオティクス製剤で有意なサルモネラ排除を実証したが（Kubasovaら、2019b）、この同じ製剤が他の腸病原体を排除できるか、成長促進特性を有するかは不明である。おそらく、病原体に打ち勝ち、腸の発達と機能を促進し、疾患によってもたらされた腸機能の摂動を修復するためには、十分な群集の多様性が必要なのでしょう。マイクロバイオームの多様性は、病原体の排除（Pedroso et al., 2021）、および消化管へのあらゆる摂動後の恒常性の回復（Weimer, 2015）において重要です。
結論
病原体を排除するだけでなく、競合排除製品には腸の機能、発達、動物の成長を促進するための基礎的な細菌種が含まれています。鶏の膵臓から選択された腸管先駆者コロナイザーは、競合排除製品での顕著性に基づき、5つの腸管メンバー種から構成されており、腸の形態と動物のパフォーマンスを改善する上で競合排除製品に匹敵しました。プロテオバクター、乳酸菌、嫌気性腸内メンバー種のバランスは、腸の発達、飼料効率、動物の成長を促進する健康なマイクロバイオームにとって重要です（Foo et al., 2017）。かつては、成長を促進する抗生物質がこのバランスを提供していました。現在、養鶏業界が抗生物質を使用しない生産に移行しているため、腸の発達と機能を刺激し、低い飼料転換率と体重増加の改善をサポートし、腸内細菌叢の健全なバランスを維持するために、定義された腸内生物製剤が必要です。
データの利用可能性に関する声明
本研究で発表された原著は、論文/補足資料に含まれており、さらなる問い合わせは対応する著者に向けられる。
倫理に関する声明
動物実験については、University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committeeによる審査と承認を得た。
著者の貢献
MLは、資金獲得、概念化、執筆、レビュー、編集を担当した。AP、BL、YCは、この論文に記載されている実験と正式な解析を行った。JMはメタゲノム解析とデータキュレーションを行った。MLとJMは、執筆、レビュー、編集に携わった。
資金提供
本研究は、米国農務省のフォーミュラファンドおよびジョージア州獣医学部農業研究助成金の支援を受けています。JMは、USDA HATCHファンドの支援を受けた： VA-160130の支援を受けています。
謝辞
T-RFLP の方法論、解析、解釈について助言をいただいた Jingrang Lu 氏に感謝します。
利益相反
著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
補足資料
本論文の補足資料は、オンラインにてご覧いただけます：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2023.1139321/full#supplementary-material。
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キーワード：マイクロバイオーム、パフォーマンス、飼料効率、腸内発育、嫌気性菌
引用します： Lee MD, Pedroso AA, Lumpkins B, Cho Y and Maurer JJ (2023) Pioneer colonizers： ニワトリの腸の形態と微生物叢の発達を変化させる細菌。Front. Physiol. 14:1139321. doi: 10.3389/fphys.2023.1139321
Received（受理）された： 2023 年 1 月 06 日、受理された： 2023 年 3 月 14 日；
発行：2023年3月29日
編集者
スンダス・ジャベド（COMSATS大学、パキスタン
レビューした人
シアラ・キーティング（グラスゴー大学、イギリス
サラ・C・ピアース（米国農務省、米国
Copyright © 2023 Lee, Pedroso, Lumpkins, Cho and Maurer. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、学術的に認められた慣習に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： マージーD.リー、mlee2@vt.edu
†Present address： Adriana A. Pedroso, Ventura Coastal, LLC, Tipton, CA, United States; Brett Lumpkin, Southern Poultry Feed and Research, Inc., Athens, GA, United States; Youngjae Cho, Pusan National University, Busan, Republic of Korea
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