腸内細菌叢の不安定性のマーカーとしての便中β-ディフェンシン-3分泌の変化

腸内微生物
第15巻 2023年 - 第1号

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研究論文
腸内細菌叢の不安定性のマーカーとしての便中β-ディフェンシン-3分泌の変化

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2023.2233679

ザルワ・サキブ
,
Giada De Palma
,
ジュン・ルー
,
マイケル・スレット
,
プレミスル・ベルチック
&
スティーブン・マイケル・コリンズ
論文 2233679｜2023年02月20日受理、2023年07月03日受理、オンライン公開：2023年07月18日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2233679
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要旨
微生物叢の組成変化（ディスバイオーシス）は、過敏性腸症候群（IBS）の基盤である可能性があるが、微生物叢指向療法を行うためのバイオマーカーは今のところ得られていない。そこでわれわれは、マウスモデルを用いて、糞便中のβ-ディフェンシンの変化が腸内細菌叢異常症のマーカーとなりうるかどうかを検討した。IBSに関連する4つの介入、すなわち抗菌薬の混合投与、欧米化食（高脂肪・高糖質食、高塩分食）、軽度の拘束ストレスを用いて実験的にディスバイオシスを誘導した。糞便中のマウスβ-ディフェンシン-3および16S rRNAベースのマイクロバイオーム・プロファイルを、ベースライン時、これらの介入中および介入後に評価した。軽度の拘束ストレスを除く各介入により、微生物叢の組成および多様性プロファイルが変化した。抗菌薬または高脂肪・高糖質食への曝露は、軽度の拘束ストレスではなく、ベースラインと比較して糞便中のβ-ディフェンシン-3の減少をもたらした。対照的に、高塩食への暴露はベースラインと比較してβ-ディフェンシン-3を増加させた。混合抗菌薬に暴露されたマウスは、最も大きな組成変化を示し、β-デフェンシン-3レベルと細菌多様性の間に最も有意な相関を示した。高塩食もまた、β-デフェンシン-3の変化と細菌多様性の間に有意な相関を示したが、これは宿主における識別可能な炎症性変化を伴わなかった。このように、IBS増悪の要因として認識されている食餌変化や抗菌薬曝露は、糞便中のβ-ディフェンシン-3レベルの変化を伴う顕著な腸内細菌異常症を誘発した。我々は、便中β-ディフェンシンの連続モニタリングが、ディスバイオシスのマーカーとして機能し、微生物指向の治療介入が有効なIBS患者の同定に役立つ可能性があることを提案する。
キーワード
過敏性腸症候群
抗菌薬
高脂肪食
高塩分食
ストレス
微生物叢
ディフェンシン
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はじめに
ここでは、腸内細菌叢の組成、機能または時間的安定性の変化を表すために、腸内細菌叢異常症という用語を用いている。腸内微生物の組成は、遺伝、心理的ストレス、免疫活性化、生理機能の変化などの宿主因子と、感染、食事、抗生物質曝露などの環境因子の両方によって影響を受ける。腸内感染や広範な抗生物質への曝露は、IBS発症の危険因子として認識されているCitation4,Citation5であり、食事はIBSにおける症状の一般的な引き金であるCitation6-8。これらの観察結果は、本研究において抗生物質への曝露、食事の変化、ストレスなどの介入を選択し、ディスバイオシスを誘導することを合理化している。健康な成人では腸内細菌叢は安定しているが、Citation9,Citation10では、細菌叢組成の被験者内変動は個人間の変動よりも小さい。Citation11-14 さらに、一部のIBS患者ではヒトの細菌叢の時間的不安定性が証明されている。Citation15-17 このことから、腸内細菌叢の組成的不安定性を反映する単純なディスバイオシスのマーカーCitation18は、微生物叢指向療法が有効なIBS患者を同定するのに有用であると考えられる。興味深いことに、最近の研究引用19では、無菌マウスにIBS微生物叢をコロニー形成させると、IBS様表現型が誘導されることが示されており、微生物叢がIBSの発現に寄与していることが強く示唆されている。
デフェンシンは、宿主とその常在微生物との間の恒常性を維持し、病原体から保護する役割を果たす小さな陽イオン性抗菌ペプチドである。Citation20 デフェンシンは、炎症刺激や外因性微生物物質に応答して、主に大腸上皮細胞、パネス細胞、免疫細胞によって産生され、Citation21,Citation22 宿主粘膜への病原体の侵入に対する効果的なバリアとして機能する。 Citation23-25αおよびいくつかのβ-ディフェンシンは消化管内で構成的に発現しており、そのほとんどは炎症中も安定している。Citation26,Citation27 しかし、β-ディフェンシン-3（ヒトβ-ディフェンシン-2のマウスホモログ）のような他のものは、主に病原体との遭遇時に誘導される。例えば、パネス細胞が機能不全に陥ると、微生物叢の組成が著しく変化する。
IBSではディフェンシン分泌の変化が確認されている。LanghorstらCitation33は、巨視的な炎症がないにもかかわらず、IBS患者の糞便中のヒトβ-ディフェンシン-2濃度が上昇していることを明らかにした。同様に、便中β-ディフェンシン-2濃度の上昇がIBS患児で認められ、腹痛や腸管透過性の亢進と関連していたことから、自然免疫系の活性化が示唆された。引用34 しかし、IBS患者では対照群と比較してβ-ディフェンシン-2濃度が低下していることも報告されている。引用35 ごく最近の研究では、ヒトβ-ディフェンシン-2濃度の測定とマイクロバイオームプロファイルの組み合せが、IBD患者とIBS患者を鑑別するマーカーとして機能することが提唱されている。 引用36 最近、我々は、無菌マウスにIBS-D微生物叢をコロニー形成させると、胃腸通過の速さ、腸管透過性の変化、分泌の変化など、腸管機能が変化し、レシピエントマウスにおける大腸β-ディフェンシン-3発現の増加を伴うことを示した。 引用19 これらの結果から、IBSの自然史に関連した介入を用いて腸内細菌叢を実験的に擾乱した結果、糞便中のβ-デフェンシン-3濃度に変化が生じるかどうかを調べるために、マウスを用いた今回の概念実証試験が行われた。
結果
抗菌薬はマウスの腸内細菌叢組成を破壊し、糞便中のβ-ディフェンシン分泌を減少させる
以前に記載された非吸収性抗菌薬（AMC）Citation37,Citation38の混合物は、Bray CurtisおよびAitchison距離行列を用いて作成したPCoAプロット（図1a、表1、補足表S1）に示されているように、微生物叢組成の顕著かつ持続的な崩壊を引き起こした。ベースライン時のマウスの便微生物叢プロファイルは、図1aに示すように、AMC介入後に大きなドリフトを伴いながらクラスタ化し、回復期にはベースラインへの逆転は最小限であった。糞便微生物多様性は、シャノン多様性指数（Shannon Diversity Index）で示すように、AMC後1週間はベースラインには戻らなかった（図1b）。アルファ多様性はベースラインと比較して介入期間中は低かった。マウスでは、正味細菌量に統計的に有意な変化は認められなかった（補足図S2aおよびS2b）。AMCが正味の微生物組成に及ぼす影響を確認するため、ANCOM-BC解析を行い、発現量の異なる細菌を見つけた。その結果、Anaerotruncus属、Butyricicoccus属、Candidatus Arthromitus属、Candidatus Saccharimonas属、Clostridium属の数種、Defluviitaleaceae属、Enterorhabdus属、Lachnospira属、Mucispirillum属、Muribaculum属、Peptococcus属、Prevotellaceae属、Sporobacter属、Tyzzerella属など、回復期にも持続する細菌群の相対量が変化していることがわかった（図1c）。AMC投与中はこれらの細菌のほとんどが減少したが、マウスではBacteroides属とProteus属の存在量が増加した。AMC投与はβ-ディフェンシン-3レベルの減少を伴い（図1d）、これは回復期にも持続した（図1e）。β-ディフェンシン-3レベルと全体的な細菌多様性との間には正の相関がみられ（図1f）、これらの反応の関連性が示唆された。微生物組成とβ-ディフェンシン-3レベルにはオスとメスで大きな違いは認められなかったが、微妙な違いが認められた。例えば、すべての男女の便微生物叢プロフィールと細菌分類群は、ベースライン時、介入期間中および回復期間中、同様の傾向を示したが（補足図S1a）、介入期間中、腸球菌属、エシェリヒア属、赤痢菌のみが女性で増加した（補足図S4）。さらに、男性ではベースラインからβ-ディフェンシン-3レベルが3倍減少したのに対し、女性ではAMC介入期間中に1倍強の減少が認められたのみであった（補足図S1b）。
図1. a) マウスの実験期間中の糞便微生物叢組成のBray Curtis距離行列分析に基づくPCoAプロット。群集組成はADONIS2により999通りの順列で比較した。各ドットは個々のマウスの細菌叢を表す。b)シャノン多様性指標を用いたα-多様性の変化、分析は1-way ANOVAと多重比較のためのダンの検定で行った。c)ANCOM-BCを用いて評価した、マウスで有意差のあるすべての豊富な分類群（属レベルで集計）のヒートマップ。群間で有意差のある分類群については、FDR（q < 0.05）を用いて多重比較の補正を行った。ヒートマップ上の色の濃さは、各細菌分類群の相対的存在量に基づいて計算したzスコアを用いて作成した。 d) 実験期間中のマウスの糞便中のβ-ディフェンシン-3値の変動を示す時間経過グラフ。e)3つの実験時点におけるβ-デフェンシン分泌の平均変化の合成を、10パーセンタイルから90パーセンタイルまでのひげを持つ箱ひげプロットとして示した。統計的差異はKruskal-Wallis検定と多重比較のためのpost hoc Dunn's検定を用いて計算した。 f) 実験期間中のマウスのα多様性値の変化とディフェンシン分泌量の相関。赤の記号はベースラインとβ-ディフェンシン-3レベルの関連を表し、緑と青の記号はそれぞれ介入時点と21日目の回復時点を表す。相関はSpearman rank indexを用いて作成した。ベースライン1日目と7日目を合わせて解析した。n = 4-5匹/群。p < 0.05を有意とみなした。**** = p ≤0.0001, *** = p ≤0.001, ** = p ≤0.01, * = p ≤0.05。
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表1. 抗菌薬、高脂肪・高糖質食および高塩食がマウスの糞便微生物叢組成に及ぼす影響に関するBray Curtis距離行列（上）およびAitchison距離行列（下）のADONIS2統計解析に基づくPおよびR2（群間分散）値。
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次に、ANCOM-BC解析（図1c）、β-デフェンシン-3レベル、およびシャノン多様性指数に基づいて、有意に豊富であることが判明した細菌分類群間の関係を探索した。その結果、β-ディフェンシン-3レベルだけでなく、シャノン多様性とも相関する属がいくつか同定された（表2）。これらの属には、Acetatifactor属、Alistipes属、Anaerotruncus属、Anaerosporobacter属、Bacteroides属、Butyricicoccus属、Candidatus Arthromitus属、Candidatus_Saccharimona属、Defluviitaleaceae属、Enterorhabdus属、Prevotellaceae属、Lachnospira属、Lactobacillus属、Mucispirillium属、Peptococcus属、Sporobacter属が含まれた。興味深いことに、保護／抗炎症作用を持つ細菌はβ-デフェンシン-3レベルと負の相関を示し、表2に示すように、β-デフェンシン-3が低いのは、バクテロイデス（r = -0.6、p < 0.001）やアリスティペス（r = -0.5、p = 0.01）Citation39,Citation40のような、これらの抗炎症作用を持つ細菌が多いためかもしれないことが示唆された。逆に、炎症促進作用を持つ細菌の多さは、低いディフェンシンレベルと正の相関があった（表2）。例えば、炎症促進作用が報告されているPrevotellaceaeCitation41,Citation42（r = 0.6、p < 0.001）、Candidatus ArthromitusCitation43（r = 0.8、p < 0.001）、EisenbergiellaCitation44（r = 0.5、p = 0.01）、Muribaculum taxaCitation45（r = 0.6、p < 0.001）はすべて、AMC暴露後のディフェンシンレベルの低下と正の相関があった。
表2. 差異のある細菌分類群（属）の存在量、ディフェンシンレベル、微生物多様性（シャノン多様性）の相関。ANCOM-BC分析で発現量に差が認められた細菌分類群は、すべての実験条件においてβ-ディフェンシンレベルと相関していた。さらに、β-ディフェンシンと相関する差次的に豊富な分類群が、微生物の多様性とも相関するかどうかを確認するために、追加の相関を行った（シャノン指数値を使用）。すべての相関は相対存在量に基づき、スピアマン順位指数とFDR補正を用いて作成した。
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高脂肪・高糖食はマウスの腸内細菌叢組成を一過性に変化させ、糞便中のβ-ディフェンシン分泌を減少させる
高脂肪・高糖質「西洋」食（HFHSD）は、βおよびα多様性解析で示されるように、ベースラインと比較して細菌組成を変化させ（図2a,b）、これらの変化は食餌中止後1週間以内に正常化した。ベータ多様性の変化は、Bray CurtisマトリックスとAitchison距離マトリックスに基づく統計解析によって確認され、どちらのマトリックスも同様の結果を示した（表1）。マウスでは正味細菌量に変化は見られなかったが（補足図S2cおよびS2d）、糞便微生物組成の変化は属レベルで明らかであった（図2c）。ANCOM-BC解析に基づくヒートマップでは、食餌暴露中に比例的なシフトを示した細菌属のほとんどが、すべてのマウスで食餌を中止するとベースラインレベルに戻ることが明らかになった（図2c）。Anaerosporobacter、Candidatus Arthromitus、Eisenbergiella、Muribaculum、Prevotellaceae、Parasutterellaを含む多くの細菌分類群は介入中に減少し、Anaerotruncus、Angelakisella、Lactococcus、Ruminiclostridium、Tyzzerellaのような分類群は一過性に増加した。図2d,eに示すように、β-ディフェンシン-3レベルは食餌中に減少し、回復期に正常化し始めたが、ベースラインレベルには戻らなかった。さらに、糞便中のβ-ディフェンシン-3レベルは、マウスのα多様性の変化と正の相関があった（r = 0.6, p = 0.002）（図2f）。興味深いことに、炎症性細菌であるCandidatus ArthromitusCitation43（r = 0.5、p = 0.04）およびEisenbergiellaCitation44（r = 0.6、p < 0.001）の多さは、HFHSD曝露後の低いディフェンシンレベルおよびシャノン多様性と正の相関を示した（表2）。
図2. 高脂肪・高糖質食投与は一過性に腸内細菌叢組成を破壊し、マウスの糞便β-ディフェンシン分泌を変化させる。 a) マウスの実験期間中の糞便微生物叢組成のブレイ・カーティス距離行列分析に基づくPCoAプロット。群集組成はADONIS2により999通りの順列で比較した。楕円は95％信頼区間を示し、ADONIS2に基づいて各群の重心を中心とした分布として生成された。 b) シャノン多様性指標を用いたアルファ多様性の変化、分析は1元配置分散分析（1-way ANOVA）と多重比較のためのダンの検定によって行われた。c)ANCOM-BCを用いて評価した、マウスにおいて有意差のあるすべての豊富な分類群（属レベルで集計）のヒートマップ。ヒートマップ上の色の濃さは、各細菌分類群の相対的存在量に基づいて計算したzスコアを用いて作成した。 d) 実験期間中のマウスの糞便β-ディフェンシン-3値の変動を示す時系列グラフ。e)3つの実験時点におけるβ-デフェンシン-3分泌量の平均変化の合成を、10パーセンタイルから90パーセンタイルまでのひげを持つ箱ひげプロットとして示した。統計的差異は、Kruskal-Wallis検定と多重比較のためのpost hoc Dunn's検定を用いて計算した。 f) 実験期間中のマウスのα多様性値の変化とディフェンシン分泌量の相関。赤の記号はベースラインとβ-ディフェンシンレベルの関連を表し、緑と青の記号はそれぞれ介入時点と21日目の回復時点を表す。相関はSpearman rank indexを用いて作成した。ベースライン1日目と7日目を合わせて解析した。n = 4-5匹/群。p < 0.05を有意とみなした。**** = p ≤0.0001, *** = p ≤0.001, ** = p ≤0.01, * = p ≤0.05。
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AMC群と同様に、HFHSD群においても、微生物組成とβ-ディフェンシン-3レベルにおいて男女間でわずかな差が認められた。例えば、細菌多様性の変化（補足図S1c）、および食事介入前、介入中、介入後の細菌属の比例シフト（補足図S5）において、男女ともに同様の傾向を示した。細菌属数におけるわずかな差異とβ-ディフェンシン-3の減少はオスとメスの両方で認められたが、この変化の大きさはオスよりもメスの方が大きく、β-ディフェンシン-3レベルが正常化したのは介入後のオスのみであった（補足図S1d）。具体的には、ディフェンシン分泌はベースラインレベルから男性では1倍以上、女性では2倍以上減少した（補足図S1d）。この差は、微生物叢のプロフィールが男性と女性で異なっているためかもしれない（補足図S1c）。
高塩分食はマウスの糞便微生物叢組成を変化させ、糞便β-ディフェンシン分泌を増加させる
高塩分食（HSD）の投与は、αおよびβ多様性分析によって反映されるように、微生物叢組成にも変化を誘発した（図3a,b 表1）。Bray Curtis距離行列とAitchison距離行列の両方を評価した統計解析では、介入時とベースライン時または回復時との間で、セントロイドが遠くグループ化されていることから、非類似性が示された。HSD介入後のアルファ多様性の変化の方向性は、AMCおよびHFHSD介入後に見られたものとは異なっていた（図3b）。微生物組成のANCOM-BC分析では、乳酸桿菌やCandidatus Arthromitusを含むいくつかの微生物分類群の存在量が減少し（図3c）、Parabacteroides、Akkermansia、Anaerotruncus、Staphylococcus、Erysipelatoclostridumの相対的存在量が増加した。AMCおよびHFHSDの介入とは対照的に、HSDはすべてのマウスにおいて、ベースラインレベルと比較して糞便中のβ-ディフェンシン-3分泌を最大2倍まで一過性に増加させた（図3d,e；補足図S1f）。図3fに示すように、変化したシャノン多様性指数値とβ-ディフェンシン-3レベルとの間に正の相関が見られた（r = 0.5; p = 0.006）。3つの時点を表す楕円の間には重なりがあったが（図3aおよび補足図S1e）、雌雄ともにp値に基づく正味の組成変化はβ多様性に非類似性を示した。図3cに示すように、高塩分食餌によって乳酸桿菌とCandidatus Arthromitusの相対量が減少し、Parabacteroides、Akkermansia、Anaerotruncus、Staphylococcus、Harryflintiaの相対量が雄雌ともに増加した（補足図S6）。
図3. a) マウスの実験期間中の糞便微生物叢組成のBray Curtis距離行列分析に基づくPCoAプロット。群集組成はADONIS2により999通りの順列で比較した。楕円は95％信頼区間を示し、ADONIS2に基づいて各群の重心を中心とした分布として生成された。 b) シャノン多様性指標を用いたアルファ多様性の変化、分析は1元配置分散分析（1-way ANOVA）と多重比較のためのダンの検定によって行われた。c)ANCOM-BCを用いて評価した、マウスにおいて有意差のあるすべての豊富な分類群（属レベルで集計）のヒートマップ。ヒートマップ上の色の濃さは、各細菌分類群の相対的存在量に基づいて計算したzスコアを用いて作成した。 d) 実験期間中のマウスの糞便β-ディフェンシン-3値の変動を示す時系列グラフ。e)3つの実験時点におけるβ-デフェンシン-3分泌量の平均変化の合成を、10パーセンタイルから90パーセンタイルまでのひげを持つ箱ひげプロットとして示した。統計的差異は、Kruskal-Wallis検定と多重比較のためのpost hoc Dunn's検定を用いて計算した。 f) 実験期間中のマウスのα多様性値の変化とディフェンシン分泌量の相関。赤の記号はベースラインとβ-ディフェンシンレベルの関連を表し、緑と青の記号はそれぞれ介入時点と21日目の回復時点を表す。相関はSpearman rank indexを用いて作成した。ベースライン1日目と7日目を合わせて解析した。n = 4-5匹/群。p < 0.05を有意とみなした。**** = p ≤0.0001, *** = p ≤0.001, ** = p ≤0.01, * = p ≤0.05。
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興味深いことに、炎症性細菌の多さはディフェンシンレベルの高さと正の相関があり、β-ディフェンシン-3が高いのはこれらの炎症性細菌の存在による可能性が示唆された。例えば、表2に示すように、EisenbergiellaCitation44（r = 0.5、p = 0.02）は、HSD暴露後の高いディフェンシンレベルと正の相関があった。逆に、Clostridium_sensu_stricto_1Citation46（r=-0.46、p=0.04）やLactobacillusCitation47（r=-0.7、p<0.001）のような防御／抗炎症作用を持つ細菌は、β-ディフェンシン-3レベルと負の相関を示した。
高塩分食がβ-デフェンシン分泌に及ぼす影響は、顕在的な炎症や免疫活性化を介するものではない
Citation48。我々は、高塩分食後のβ-ディフェンシン-3レベルの上昇が、食餌誘導性炎症反応の一要素であるかどうかを検討した。そこで、マウスに高塩食または対照食を1週間投与し、大腸におけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性と炎症関連遺伝子の発現を評価した。その結果、食餌後のマウスではMPO活性に変化は見られなかった（図4a）。図4bに示すように、腸管免疫およびバリア機能に関連する68遺伝子のうち、腸管炎症の制御に関与するT-bet（引用49）は、対照マウスと高塩分食投与マウスで発現に差が認められた（log2ratio = 1.31; p = 0.0081）。
図4. a)対照食、高塩分食、高塩分食投与後7日間の回復期間を経たマウスの大腸ミエロペルオキシダーゼ（MPO）レベル。群間の統計的差異は、1-way ANOVA（ノンパラメトリック）を用いて評価し、ポストホックDunn分析を行った。値は10パーセンタイルから90パーセンタイルまでの箱ひげプロットで示し、n=5マウス/対照群および回復群；n=4マウス/処置群でp<0.05を有意とみなした。赤い点はp < 0.01の遺伝子。黒い点は0.01 > p > 0.05の遺伝子。ゼロの右側に存在する遺伝子は、高塩分食投与マウスでは発現が上昇し、コントロールマウスでは発現が低下していた。ヒートマップは、高塩分食またはコントロール食を投与したマウスの大腸組織における自然免疫に関連するT-bet遺伝子の発現をまとめたものである。赤は発現が低下した遺伝子、緑は発現が上昇した遺伝子を示す。T-bet： T-box転写因子。
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軽度の拘束ストレスを繰り返しても、マウスの腸内細菌叢組成や宿主糞便中のβ-ディフェンシン分泌は変化しない
軽度の反復ストレスが微生物組成に及ぼす影響は、ストレスのないマウスと比較してごくわずかであった（補足図S3a）。同様に、β-デフェンシン-3分泌にも、ストレスマウスとコントロールマウス（補足図S3bおよびS3c）、あるいはオスとメス（補足図S3d）の間で差は見られなかった。β-ディフェンシン-3レベルと全体的な細菌多様性との間に相関は認められなかった（補足図S3e）。
考察
我々の知見は、実験的に誘発された腸内細菌叢組成の変化が、β-ディフェンシン-3分泌の増減をもたらすことを示している。IBS患者または関連するマウスモデルにおけるβ-ディフェンシンレベルに関するこれまでの研究は、単一の時点で収集されたサンプルに基づいていたCitation33,Citation35,Citation36に対し、我々の研究は7日間にわたる複数の時点に関与していた。我々の介入がベースラインと比較してβ-ディフェンシン-3の増加または減少をもたらしたことを考えると、単一時点の測定ではこれらの変化を捉えられない可能性がある。
引用50 自然免疫の活性化、微生物叢組成の変化、およびIBSの症状発現の根底にある腸内生理の変化の関係は複雑である。引用51 生理機能の変化は微生物の生息環境を変化させ、その結果微生物叢組成が変化し、逆に腸内生理異常は腸内生理に影響を及ぼし、その結果宿主と微生物の関係が長期的に不安定になる。抗菌剤曝露や食生活の変化などの外来因子は、微生物組成にさらに影響を及ぼす。本研究の結果に基づき、β-ディフェンシン分泌の変動は微生物叢組成の変化による二次的なものであり、β-ディフェンシンのモニタリングがIBSにおける腸内細菌叢異常症のバイオマーカーとなりうることを提案する。このようなバイオマーカーは、微生物学的指向性治療がより多くの治療効果をもたらしそうな患者を同定するのに役立つであろう。プロバイオティクスや糞便微生物移植のような治療法の有効性に関する現在の論争は、単にこれらの介入が症状の均一性を示す患者を対象としたものである一方、すべての患者がそうであるとは限らないという事実を反映しているのかもしれない。
IBSCitation33や炎症性腸疾患Citation52,Citation53のような関連疾患における誘導性β-ディフェンシンに関する先行研究では、ディフェンシンは炎症が活発な状態で放出されると提唱されている。我々の結果は、以前に炎症を誘発することが示された高塩分食Citation48に暴露したマウスでは、明らかな炎症（図4a,b）を認めずに、糞便中のβ-ディフェンシン分泌量（図3d,e）と微生物多様性（図3b）が増加したことを示している。このことから、β-ディフェンシン-3分泌の変化は、腸内細菌叢組成の変化によって刺激され、その結果、高塩分によって誘導された常在保護細菌と炎症促進細菌のバランスが崩れたことが示唆される。Citation54,Citation55明らかな炎症よりもむしろ自然免疫の活性化が、IBS患者の少なくとも一部の病態に関与していることが示唆されており、今回の結果はディスバイオシス患者におけるこの結果と一致している。
抗菌薬曝露後（図1d,e）および高脂肪・高糖質食曝露後（図2d,e）のβ-デフェンシン-3レベルの低下は、先行研究で報告されたデフェンシン分泌の単一時点上昇と矛盾するように見えるかもしれないことを認識している。Citation19,Citation33 しかしながら、これらの所見は、IBSにおけるβ-デフェンシンレベルの低さの報告と一致しておりCitation35、これらの明らかな矛盾は、単にIBSにおける微生物叢の不安定性を反映しているのかもしれないCitation15-17。
われわれのデータは、細菌の多様性がβ-ディフェンシンと相関していることを示しており、β-ディフェンシン-3の分泌が、防御性細菌または非防御性細菌（炎症性細菌）の存在に応じて変動していることを示唆している。特定の細菌分類群についてさらに詳しく調べると、抗菌薬曝露中に、宿主に対する炎症促進作用が報告されている細菌が、β-ディフェンシン-3レベルと正の相関を示した。これらには、Eisenbergiella属、Citation44 Muribaculum属、Citation45およびPrevotellaceae属、Citation41,Citation42に属する細菌が含まれる（表2）。さらに、炎症性のCandidatus ArthromitusCitation43は、AMC群とHFSHD群の両方でβ-デフェンシン-3レベルと正の相関を示したが、HSD群では負の相関を示した。β-ディフェンシン-3の存在量の減少は、HSD治療中にディフェンシン分泌が増加した結果であると考えられる。興味深いことに、Candidatus ArthromitusはSegmented Filamentous Bacteria（SFB）のメンバーであり、抗微生物ペプチド反応や病原性腸内細菌科細菌に対するコロニー形成抵抗性と関連しているCitation43,Citation57,Citation58。逆に、炎症性細菌であるEisenbergiella Citation44は、すべての群でディフェンシン分泌と正の相関があった。このことは、AMC処理とHFHSD処理ではEisenbergiellaの存在量が低く、HSD処理ではEisenbergiellaの存在量が高いことが、全群の処理期間を通じてディフェンシン分泌の調節に寄与している可能性を示唆している。さらに、ヒトβ-ディフェンシン-2や-3のような誘導性ディフェンシンの転写は、Prevotellaceaeの種の存在量の増加と関連している。Citation41,Citation42 逆に、ディフェンシンレベルと、BacteroidesCitation59,Citation60やAlistipesCitation39,Citation40のような炎症促進作用と抗炎症作用の両方を持つ細菌の存在量との間には、負の相関が見られた（r = -0.5、p = 0.01）（表2）。このように、我々の知見は、腸におけるディフェンシン分泌の恒常的な制御は、防御性細菌と炎症性細菌の両方の間の複雑なバランスに依存していることを示唆している（補足図S7）。
原理実証研究には限界がある。第一に、この研究は健康なマウスで行われた。微生物叢の変化は腸管透過性、運動性、内臓感受性を変化させ、逆に、例えば腸管運動性の変化は微生物組成を変化させる。 引用文献64 IBS症状発現の共通因子である食生活の変化は、腸内生理の変化とともに作用し、少なくともIBS患者のサブセットにおいて微生物叢の時間的不安定性をもたらす。引用文献15-17 我々は、腸内細菌叢異常とβ-ディフェンシン-3の増加がみられるIBSCitation19のヒト化マウスモデルにおいて、β-ディフェンシン分泌を経時的に研究することが、この概念実証研究の後、臨床研究を検討する前の論理的な次のステップになると提案する。第二の限界は、本研究で用いたストレス因子が軽度であったことである。社会的ストレスなど他の形態のストレスは、微生物叢の組成や宿主のサイトカインレベルを変化させることが示されているからであるCitation65,Citation66 第三に、腸内微生物の組成に影響を与えうる他の上皮構成成分やその分泌物の可能性を認める。例えば、抗生物質の投与は粘液層の構造を変化させ、小腸における抗菌ペプチドや免疫グロブリンの拡散に影響を与えることが示されている。 上皮細胞はサイトカインやケモカインなどの分子を産生し、これらの分子は腸内細菌叢を制御し、病原体から身を守る。例えば、マウスの黄砂誘発性大腸炎を治療するために抗生物質を投与すると、上皮細胞上のToll様受容体（TLR）を活性化する微生物のリガンドが減少することによって病状が悪化する。TLRは、健康な大腸機能を維持するのに必要な組織の恒常性と修復メディエーターの発現を促進するのに重要である。 引用70 さらに、高脂肪食は腸管上皮細胞に小胞体ストレスを引き起こし、クローディン-1の発現と粘液バリア機能の低下を招き、血清エンドトキシン濃度の上昇と腸内細菌異常症を引き起こすことが示されている。 引用71 高塩分食の長期摂取はまた、DSSマウスにおける炎症性遺伝子の発現の増加とサイトカインおよびケモカイン遺伝子の発現の減少という大腸粘膜免疫の変化とも関連している。
我々の結果は、糞便中のβ-ディフェンシン-3の変化がマウスにおける微生物叢組成の変化のマーカーとして働くという概念を支持するものである。ベースライン時と再発時のディフェンシンの比較は、IBSのような慢性消化器疾患におけるディスバイオージスの存在を同定し、微生物学的指向性治療が有効な患者を同定するのに役立つ可能性がある。
材料と方法
研究デザイン
実験的に誘導した4種類の腸内細菌叢異常症モデルを用いて、糞便中のβ-ディフェンシン-3の変化を測定し、男女ともに各検査前、検査中、検査後の腸内細菌叢組成の特徴を明らかにした。(1)飲料水中の抗菌カクテル（AMC）、(2)高脂肪・高糖質食（HFHSD）、(3)高塩食（HSD）、(4)軽度反復拘束ストレス（MRS）を用いた。AMCおよび食餌試験では、1週間の介入期間を設け、その前に1週間のベースライン期間を設け、その後回復期間を設けた。同じグループのマウスを3週間にわたって追跡し、糞便サンプルを毎日採取して、各β-ディフェンシン-3（ヒトβ-ディフェンシン-2のマウスホモログ）レベルと微生物叢の変動を測定した。MRS研究では、マウスを対照群とストレス群との間で比較した。糞便サンプルは8日間連続して採取した。
動物
すべての実験は、NIH Swiss SPFマウスを用いたMRS研究を除き、7～10週齢の特定病原体フリー（SPF）C57BL/6マウスを用いて行った。すべてのマウスはTaconic Biosciences社から購入し、マクマスター大学の中央動物施設（CAF）でプラスチックケージに入れ、温度制御されたビバリウムで12時間の明暗スケジュールで飼育し、餌と水を自由に摂取できるようにした。マウスは到着時およびベースライン期間と回復期間中、照射した対照飼料（1020、Teklad、カロリーの20％がタンパク質、29％が脂肪、51％が炭水化物、0.4％のNaと0.7％のClを含む）と滅菌水道水を自由摂取した。実験プロトコルを開始する前に動物を新しい環境に慣れさせるため、CAF到着後1週間後に実験を開始した。ケージは実験開始前後に交換した。動物の状態は毎日の全身検査と体重測定でモニターした。餌と水の摂取量も交互に測定した。すべてのマウスは、細菌汚染を防ぐため、レベルⅡのバイオセーフティフード内でのみ取り扱われた。マウスはイソフルラン（Fresenius Kabi Canada, Toronto, ON）麻酔下で標準化されたプロトコルを用いて犠牲にした。実験はMcMaster Universityの動物倫理委員会（Animal Utilization Protocol #18 -08-35）により承認された。
抗菌薬投与
C57BL/6雄（n = 5）および雌（n = 5）に対し、非吸収性抗菌薬（ネオマイシン 5 mg/mL、バシトラシン 5 mg/mL、ピマリシン 1.25μg/mL）の混合液を1週間飲水に混ぜて投与した。抗菌薬混合液の調製は、ネオマイシンおよびバシトラシンを秤量し、水中で30分間撹拌して粉末状の抗菌薬を完全に溶解させてからpHを調整した。最後にピマリシンを加えた。抗菌薬は48時間ごとに新しく調製した。
食事介入
高脂肪・高糖質食（HFHSD）と高塩食（HSD）である。高脂肪・高糖食（HFHSD）と高塩食（HSD）である。プロトコールは、HFHSDまたはHSDのいずれかを1週間摂取させたマウス2群（雄5匹、雌5匹ずつ）から構成された。HFHSDはKcal%で構成された： 炭水化物35、脂肪45、繊維0.0（Prot, 20, # D12451, Research Diets, New Brunswick, NJ）、HSDはベースライン期間中に投与した対照食と同じであるが、Envigo, Teklad, WI USAから取り寄せた4％NaCl（TD.130834）を添加したものである。両群とも介入期間中は通常の無菌飲料水を投与した。
軽度反復拘束ストレス
雌雄マウスを対照群（n=雄4、雌4）とストレス群（n=雄3、雌4）の2群に分けた。ストレス群のマウスは8日間、毎日決まった時間に30分間、プレキシガラス製の拘束器に入れられた。拘束されたマウスは新しいケージに入れられ、拘束器内では最小限の動きしかできず、酸素は供給され続けた。ストレスサイクルの後、マウスは元のケージに戻され、一日中邪魔されないようにされた。実験期間中、毎日両群から糞便を採取した。NIHスイスマウスは、他のマウス系統よりもストレスに敏感であることが以前に示されているため、使用した。
HSD後のミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性を用いた顕性炎症の評価
別グループのマウス（n = 雄5匹、雌5匹/タイムポイント、合計30匹）は、上記と同じHSDプロトコールに従ったが、各タイムポイント（ベースライン、介入、回復）の終了時に犠牲にした。犠牲後、結腸全体を摘出し、組織サンプルを液体窒素中でスナップ凍結し、前述のようにMPO活性を評価した。異常値は適宜除去した。
マウスβ-ディフェンシン-3酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
マウスβ-デフェンシン-3は、ELISA（MyBioSource, MBS034940, San Diego, CA, US）により、製造業者の指示に従って測定した。簡単に説明すると、各サンプルを別々に秤量し、それに応じてPBSを添加した（サンプルの10μl/mg）。次に、ビュレットホモジナイザー（Next Advance, NY USA）で、3.0 mmセラミックビーズ（Sigma, USA）を用いてサンプルを機械的にホモジナイズした。サンプルは最大速度で10分間ホモジナイズし、続いて3000rpmで20分間遠心分離した。その後、上清を回収し、ブランクおよび標準品とともにELISAプレートにロードした。各サンプルは二重測定した。光学濃度は ELx808 吸光度リーダー（BioTek, Winooski, VT, USA）を用いて 450 nm で読み取り、結果は pg/ml で表した。
DNA単離と16S rRNAイルミナシーケンス
ベースライン時、1日目、7日目、15日目の介入時、21日目の回復期終了時に、16S rRNA遺伝子のイルミナシーケンス用に糞便サンプルを選択した。Citation19,Citation48 16S rRNA遺伝子の超可変3（V3）領域のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅は、以前に記載されたとおりに実施した。Citation74,Citation75 精製PCR産物は、McMaster Genomics施設でIllumina MiSeqプラットフォームを使用して配列決定した。イルミナシーケンスプロトコルから保存した単離gDNAは、RT-PCRを用いた細菌量の定量に用いた。簡単に説明すると、gDNAは各時点につき1つの糞便ペレットを用いて収集した。増幅は、SYBR GreenベースのPCRマスターミックス（Applied Biosystems）と以下のプライマー926 F（5' AAA CTC AAA KGA ATT GAC GG）を用いて、Step one plusリアルタイムPCRシステム（BioRad、ON、CA）で行った（95℃、10分間、続いて95℃、15秒間、55℃、40秒間、62℃、60秒間を40サイクル）。大腸菌の908-926位の926F（5' AAA CTC AAA KGA ATT GAC GG）および大腸菌の1081-1064位の1062F（5' CTC ACR RCA CGA GCT GAC）は、以前に記載されたように、V6-V8領域を標的とした。増幅の特異性を確認するため、各増幅の最終サイクルの後に融解解析も行った。各実験グループ（AMC、HFHSD、HSD）については、前述のように、91％～100％の効率を持つ標準曲線をサンプルとともに走らせた19。
16S rRNAの処理と解析/16S Ribosomal RNA遺伝子の解析
シーケンシング後に得られた配列はすべて、Cutadaptを用いて、品質スコア30以上、リード長100塩基対以上の生リードからアダプター配列とPCRプライマーをトリミングおよびフィルター処理した。 引用文献19 さらに、RのDenoising Algorithm 2 (DADA 2)パッケージを使用して、ペアエンド配列のアライメントを行い、その後のすべての品質フィルタリングとキメラの除去を行いました。DADA2 Rパッケージのde novo検出でキメラと同定されたASVはすべて削除しました。マウスサンプルは、フィルタリング後、サンプルあたり平均69,846.46リードで、サンプルあたり11,055リードから171,477リードの範囲であった。解析は、すべてのイルミナランをマージし、すべての解析をまとめて実行し、必要に応じて研究で使用した各実験グループに従ってサンプルをサブセットすることで行った。統計解析にはPhyloseqとvegan packages for R, version 4.1.1（R foundation for Statistical Computing）を使用した。サンプルから非細菌性分類群をフィルタリングした後、Bray-CurtisおよびAitchison距離行列を用いて主座標分析（PCoA）を行い、β多様性を評価した。実験グループ間のβ多様性の統計的差は、veganパッケージのADONIS2関数を用いて解析した。ベースライン、1日目および7日目のリードを統合し、1つのベースラインタイムポイントとみなした。アルファ多様性の違いを評価するために、希薄化がない場合のシャノン多様性を採用した。アルファ多様性の差は、Dunnの検定を用いた多重比較のためのFDR補正を加えた一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて評価した。ベースライン期、介入期、回復期に関連する発現量の異なる細菌分類群の同定は、ANCOM-BCパッケージ（C79）を用いて実施し、データセットをフィルタリングして、少なくとも10％のサンプルで頻度が4未満のASVを除去し、絶対量を相対量に変換した。その後、サンプルを属レベルで集計し、同じ株に属する細菌を1つのエンティティに統合した。グループ間で存在量の異なる分類群に関する統計的有意性は、偽発見率（FDR）を用いて多重比較の補正を行った。細菌分類群の多重検定には、Q値0.05の偽発見率を用いた。ヒートマップ上の色の濃さは、各データセット（細菌）内で相対的に計算されたzスコアを用いて作成した。PCoAプロット、ヒートマップ、多様性ボックスプロットは、Rのphyloseq、vegan、ggplotパッケージ、またはGraphPad Prismバージョン9を用いてプロットした。
遺伝子発現解析
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany)を用いて、大腸組織サンプル全体から製造者の指示に従って全RNAを抽出・精製した。精製中に、RNease-Free DNase Set（Qiagen社製）を用いて、サンプルからDNAの痕跡を除去する追加ステップを行った。免疫、腸管バリア、および神経生物学的機能に関連する68遺伝子を含むカスタムコードセットパネルを、製造元の指示に従って実行し（NanoString Technologies Inc.、米国ワシントン州シアトル）、nSolver 4.0ソフトウェア（Nanostring Technologies Inc.）を使用してデータを解析した。得られたデータから構築したlog2比をボルケーノプロットとしてプロットし、ヒートマップとして表現した。
データ解析
統計解析は、GraphPad Prism 9（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）およびR（バージョン4.1.1）を用いて行った。統計的比較は、適宜、一元配置分散分析、二元配置分散分析、Kruskal-Wallis、Mann-Whitney、または対応のないt検定を用いて行った。多重比較の事後検定を行う場合は、Dunnの検定またはBenjamini, Krieger and Yekutieliを用いた。ノンパラメトリックのスピアマン順位検定にFDR補正を加えたものを相関の検定に用いた。両側統計検定が用いられた。p値が0.05未満を統計的に有意とみなした。
補足資料
補足資料
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謝辞
著者らは、マウス実験のサポートをしてくれたMcMasterのCentral Animal Facility (CAF)のスタッフに感謝する。また、微生物叢の解析に協力してくれたVidhya Mohan（PBの博士課程学生）に感謝する。
情報開示
利益相反の可能性は報告されていない。
データ利用声明
生の16S rRNA配列と遺伝子発現データは、NCBIのBioProject PRJNA935320に寄託されている。このBioProjectの個々の公開プロジェクトは、SRA BioProject (PRJNA932045) と Geo BioProject (PRJNA934868) である。本研究の結果を裏付ける補足データは、https://doi.org/10.6084/m9.figshare.23116457.v1。
著者貢献
ZSはすべての実験とデータ解析を行った。SMCはプロジェクトの立案と監督を行った。PBは科学的インプットと執筆支援を行った。GDPは原稿の批評的レビューを行った。MSは微生物叢解析に協力した。
補足資料
本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2233679。
追加情報
資金提供
本研究は、SMCとPBに対するCanadian Institutes of Health Foundation助成金#20001944の支援を受けた。
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