悪性腸内環境において、オーバーコロニー化したAkkermansia muciniphilaによるムチンの過剰消費は腸管バリアーの損傷を促進する

悪性腸内環境において、オーバーコロニー化したAkkermansia muciniphilaによるムチンの過剰消費は腸管バリアーの損傷を促進する

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10018180/

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Shuang Qu、Yinghui Zheng、[...], and Meng Qin
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アブストラクト
腸内細菌叢の障害は、腸管バリアにダメージを与え、腸疾患の原因となる。そこで、in situ悪性大腸がん（CRC）モデルを用いて、有意な変化を示す微生物叢をスクリーニングした。存在量が増加したコロニーのうち、Akkermansia muciniphila（A.ムチニフィラ）は、腸管バリアの必須成分であるムチンを分解する特徴があることで知られています。A. muciniphilaの役割については、依然として議論の余地がある。そこで、過剰なA. muciniphilaが腸管バリアに及ぼす影響を調べるため、抗生物質で本来の腸内細菌群を破壊した後に生菌懸濁液を投与し、A. muciniphila過剰コロニー化マウスモデルを確立しました。その結果、A. muciniphilaのオーバーコロニー化により、腸管ムチン量が減少することが明らかになった。また、A. muciniphilaの過剰コロニー化マウスモデルでは、タイトジャンクションタンパク質のmRNAおよびタンパク質の発現量も有意に減少した。これらの結果から、A. muciniphilaによる過剰なコロニー形成は、ムチンの分泌と分解のダイナミックなバランスを崩し、腸管粘液層の厚さを減少させ、腸管バリアを損傷し、最終的には大腸炎やCRCの発症を悪化させることが明らかになりました。これらの結果は、A. muciniphilaがプロバイオティクスとして機能することの安全性について認識を高めるものである。
キーワード：腸疾患、Akkermansia muciniphila、腸管バリア、腸内細菌叢、ムチン
1. はじめに
腸内細菌叢と様々な疾患、特にクローン病；（Palmら、2014）、潰瘍性腸炎（Kummenら、2017）、過敏性腸症候群（Liuら、2017）などの炎症性腸疾患（IBD）や大腸がん（CRC；Cokerら、2022）などの腸疾患には強い関連が報告されています。中でもCRCは世界的に高い発症率と死亡率を誇っています（Sung et al.、2021）。メタゲノミクス次世代シーケンサー技術が開発されて以来、研究者は腸内細菌叢と腸疾患の関係を発見しています（Rajagopala et al.、2017）。腸をコロニー化する複雑で広範な微生物叢は、腸の内容物の必須部分であり、免疫制御や消化・代謝の調節など、多くの生理的プロセスに重要な役割を担っています（Schultz et al., 2017; Zheng et al., 2020）。したがって、腸内細菌叢のディスバイオシスは、腸疾患の主要な原因となっています（Mahalhalら、2018；Wong and Yu、2019；Lee、2021）。腸内細菌叢は、食物摂取量や生活習慣、薬剤の使用などの変化により量や組成が変化し、腸疾患のリスクが高まります。病原性微生物による侵入を阻止する腸管バリアには、腸内細菌叢が重要な構成要素として含まれています。腸内バリアシステムは、腸内細菌叢のディスバイオシス、病原性微生物叢の過剰なコロニー形成、粘液の過剰消費、腸管粘液層の薄膜化などにより損傷し、腸管上皮細胞が微生物環境にさらされます（Van der Sluisら、2006；Johanssonら、2008；Kim and Ho、2010）。炎症は、細菌が上皮細胞に直接接触することで発症し、病原性細菌が産生する有毒な副産物によって悪化する。炎症は、腸の病気やCRCの主な原因となっています。
腸管粘液層は主にムチンによって構成されています。ムチンの分解は、宿主の腸内環境の乱れにつながる有害因子である（Paone and Cani, 2020）。腸杯細胞はムチンを継続的に分泌し、大腸菌に生存のための豊富なエネルギー供給を行う（Ouwehand et al., 2005）。一部の腸内細菌叢は、Akkermansia muciniphila (A. muciniphila; Sicard et al., 2017) のように、ムチンをゆっくりと分解する効果を持つ。Akkermansia muciniphilaは、ヒトの腸内に生息するグラム陰性の強嫌気性細菌で、Verrucomicrobiaの代表属である（Derrien et al., 2004）。Akkermansia muciniphilaはムチンを唯一の炭素と窒素源としており、ムチンを破壊する61種類の酵素を生産する（Derrien et al., 2004）。A. muciniphilaの存在量の減少は、肥満、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、心血管疾患と関連すると考えられていた（Everard et al., 2013; Zhang et al., 2013; Everard et al., 2014; Li et al., 2017）。しかし、A. muciniphilaがムチンの分泌を促進し、細胞外小胞を通じて腸の透過性を低下させることから、大腸炎やCRCにおけるA. muciniphilaに関する研究は議論の余地があります（Chelakkot et al., 2018）。また、A. muciniphilaが腸管炎症時の腸管バリア機能に有益な影響を与えることが示されている。例えば、A. muciniphilaは、DSS誘発大腸炎における腸管バリア機能の回復、大腸炎の症状の改善、および腸管バリア損傷の修復に役立ちます（Kang et al., 2013; Zhai et al., 2019; Wang et al., 2020）。しかし、粘液層の枯渇は、A. muciniphilaによるムチンの消費によって、粘液層が薄くなり、炎症が増加することで悪化する可能性があります。Akkermansia muciniphilaは腸粘膜の再構築を妨げ、Salmonella typhimuriumによる大腸炎の症状を悪化させる（Ganesh et al., 2013）。他の研究でも、A. muciniphilaが遺伝的に感受性の高い宿主の大腸炎を促進する病原体として作用することが示されています。我々の以前の研究では、DSS誘発急性潰瘍性大腸炎においてA. muciniphilaの過剰増殖が報告された（Huang et al., 2022）。しかし、これが腸内細菌叢の代償的な制御なのか、A. muciniphilaの病原性作用なのかは不明なままである。また、腸炎がCRCに進行すると、腸管バリアが完全に破壊され、その際にA. muciniphilaのコロニー形成が報告されることはほとんどない。
本研究では、in situ悪性CRCモデルの腸内細菌叢の変化を探り、過剰にコロニー化したA. muciniphilaが腸管バリアに与える影響について検討した。
2. 材料と方法
2.1. 試薬について
CT26細胞は、Procell Life Science & Technology Co, Ltd.から購入した。(中国、武漢)から購入した。Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培地および牛胎児血清（FBS）は、Gibco（中国、上海）から購入した。アンピシリンナトリウム塩、ネオマイシン硫酸塩、メトロニダゾール、バンコマイシンHClは、Macklin Biochemical Co. (中国、上海)から購入した。Akkermansia muciniphilaは、BeNa Culture Collection（中国・河南省）から入手した。チオグリコール酸培地は、Qingdao Hope Bio-Technology Co, Ltd.（中国・青島）から購入した。(中国・青島)から購入した。
2.2. 動物
動物実験では、Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.から提供された20〜22gの雄のBALB/Cマウスを使用した。(Ltd.（中国・北京）から提供された20〜22gの雄性BALB/Cマウスを使用した。すべてのマウスは、12/12時間の暗黒/明暗サイクル、水と餌への自由なアクセスを持つ標準的な実験室条件下で飼育された。すべての手順は、実験動物の世話と使用（ライセンス番号：2022D019）に従って実施された。
2.3. 細胞培養とin situ悪性CRCマウスモデル
CT26細胞（CVCL_7254）は、10%FBSと1%ペニシリンとストレプトマイシン（PS）を添加したRPMI1640培地で培養し、37℃、5%CO2でインキュベートされた。トリプシン-EDTA(0.25%)で亜培養し、107細胞/mLの濃度で単細胞の懸濁液を得た。この懸濁液を4匹のマウスの左腋窩に1匹あたり100μLの容量で注入した。10日後に直径約1cmの皮下腫瘍が成長した。皮下腫瘍発生マウスを安楽死させ、皮膚を消毒し、皮下腫瘍を剥がし、直ちに100U/mLのPSを含む生理食塩水に浸漬させた。活発に増殖している腫瘍の肉質組織を1 mm3片に切り分けた。
マウスをコントロール群（CTL群、n＝5）、大腸腫瘍モデル群（CRC群、n＝7）、偽手術群（SHAM群、n＝5）にランダムに分けた。CRC群のマウスは、イソフルランを吸入して麻酔し、仰臥位で寝かせた。腹部中央に約1cmの切開を加え、盲腸を慎重に摘出した。盲腸と結腸の接合部の局所漿膜を針で削り取り、準備した腫瘍ブロックを3M医療用組織接着剤で傷口に接着し、外腸管セグメントを腹腔内に埋め戻し、傷口を縫合した。全ての工程は無菌的に行われた。マウスは覚醒後15日間、SPFグレードの動物実験室で日常的に飼育された。
2.4. Akkermansia muciniphilaの培養と過大殖民Akkermansia muciniphilaマウスモデル
経口摂取用A. muciniphilaの液体培養は、嫌気室内でチオグリコール酸培地にて培養した。5-7日の培養物を収穫し、4,000×gで10分間遠心分離し、滅菌生理食塩水に再懸濁した。
15匹のマウスを、コントロール群（CTL群）、抗生物質カクテル群（1g/Lアンピシリン、1g/Lメトロニダゾール、0.5g/Lバンコマイシン、0.5g/Lネオマイシン、AMVN群）、A. muciniphila＋抗生物質カクテル群（AKK群）の3群（n＝5）にランダムに分けた。10匹のマウスに、移植前に200μLの抗生物質カクテルを1日1回、2日間経口投与した。AMVN群またはAKK群にランダムに割り付けた。AKK群のマウスには、A. muciniphila（滅菌生理食塩水中1×109CFU）400μLを1日1回7日間投与し、CTL群およびAMVN群のマウスには、等量の滅菌生理食塩水を投与した。マウスの体重は毎日記録した。糞便サンプル、血液、および血清は、最後のガベージの翌日に採取された。その後、すべてのマウスを人為的に安楽死させ、大腸サンプルおよび糞便サンプルを採取した。便、部分結腸組織、および血清は-80℃で保存し、血液は分析まで4℃で保存した。部分的な大腸セグメントは、さらなる処置のために4℃で組織固定剤（Wuhan Servicebio Technology Co.Ltd.）で保存した。
2.5. 大腸組織の切片化および染色
安楽死させたマウスから無傷の結腸を取り出し、肛門から約2cmの結腸組織1cm切片を切除し、4％パラホルムアルデヒドに入れ、固定した。組織をアルコールで脱水した後、キシレンでヒアリン化し、パラフィンに包埋した。埋め込んだパラフィンブロックを固定し、ミクロトームで5～8μm厚のスライスに切り出し、45℃の恒温器に入れて乾燥させた。
切片からキシレンでパラフィンを除去し、ヘマトキシリン・エオシン（H&E）切片を高濃度から低濃度のアルコールで洗浄し、最後に蒸留水で洗浄してから染色した。切片をヘマトキシリン水溶液に3分間入れて核を染色し、エオシン水溶液に3分間入れて細胞質を染色した。切片は無水エタノールとキシレンで脱水し、乾燥させ、ガムで封をした。
大腸切片はアルシアンブルーで染色し、ムチンを検出した。大腸切片を脱脂し、グラジエントアルコールで脱水した後、蒸留水で再水和した。切片をアルシアンブルー酸性化液に3分間浸し、アルシアンブルー染色液で30分間染色し、流水で5分間すすいだ。核固形染色液で5分間再染色し、流水で1分間すすいだ。染色したスライドをPannoramic SCAN (3DHISTECH Kft)を用いてスキャンした。画像解析はImageJで行った。
2.6. 免疫蛍光分析
大腸切片を脱脂し、勾配アルコールで脱水した。切片は2％BSAで37℃、30分間ブロックした。蛍光標識した抗ZO1タイトジャンクションタンパク質ウサギpAb（GB111402、Servicebio、北京、中国）および抗MUC2ウサギpAb（GB11344、Servicebio）を切片に滴下して加え、37℃で30分間インキュベートした。切片を0.01 mol/L PBS (pH = 7.4) で3回、毎回5分間リンスした。DAPI陰性染色を用いて細胞の輪郭を形成し、緩衝グリセロール（分析的に純粋な非蛍光性グリセロールをpH = 9.2、0.2M炭酸緩衝液と9：1で混合）でブロッキングした。染色したスライドを上記に示したようにスキャンした。画像解析は、ImageJ.
2.7. 糞便DNA抽出と16SリボソームDNA遺伝子配列決定
マウスを安楽死させる前に、無菌状態で糞便を採取した。製造者の指示に従って、便ゲノムDNA抽出キット（D2700、Solarbio® Life Science）を用いて、凍結した新鮮な糞便からDNAを抽出した。16SリボソームDNA（16S rDNA）遺伝子配列決定法は、我々の以前の研究（Huang et al.、2022年）に記載されていた。リボソームRNA遺伝子のV3-V4 16S rDNA標的領域は、PCR（95℃5分、その後95℃1分、60℃1分を30サイクル）で増幅した。および72℃で1分間、最終伸長72℃で7分間）を、フォワードプライマー341F 5′-CCTACGGNGGCWGCAG-3′ およびリバースプライマー806R 5′-GGACTACHVGGTATCTAAT-3′ （アンプリコンサイズは466） を用いて行った．PCR試薬は、New England Biolabs, United Statesから入手した。
アンプリコンは、製造者の指示に従って、AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, United States)を用いて2％アガロースゲルから抽出・精製された。その後、それらのアンプリコンをABI StepOnePlus Real-Time PCR System (Life Technologies, Foster City, United States)を用いて定量した。精製したアンプリコンを等モルプールし、標準プロトコルに従ってIllumina NovaSeq 6000でペアエンドシーケンス（PE250）した（n＝5／グループ）。
2.8. 定量的リアルタイムPCR解析
糞便 DNA 抽出の手順は、セクション 2.7 に記載されている。DNA濃度は分光光度計（NanoDrop, Thermo Fisher, Waltham, MA, United States）により測定した。定量的リアルタイムPCRは、細菌の定量に使用された。定量的リアルタイムPCRは、2X SG Fast qPCR Master Mix（High Rox; B639273, Beyotime, Beijing, China）を用いて行い、ABI QuantStudio 6 Flex（Thermo Fisher）を用いて相対DNA発現量を測定・解析した。各反応は三重に行った。2-ΔΔCt法を用いて、内部コントロールと比較したDNAの相対量を算出した。内部参照遺伝子としてEubacteriaを使用した。AMVN群およびAKK群の最終結果は、CTL群に対する相対値で計算した。相対的なプライマー配列は、補足表1にある（n = 3/グループ）。
2.9. RNA抽出および定量的逆転写PCR解析
RNAeasy™ Animal RNA Isolation KitとSpin Column (R0027, Beyotime)を用いて、冷凍大腸組織からメーカーの指示に従いRNAを抽出した。オクルディン、クローディン-4、ZO-1 mRNAの含有量は、定量的逆転写PCRにより測定した。BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit（D7268S, Beyotime）を用いて定量的逆転写PCRを行い、ABI QuantStudio 6 Flex（Thermo Fisher）を用いて相対RNA発現量を測定・解析した。各反応は三重に行った。内部コントロールと比較したRNAの相対量は、2-ΔΔCt法により算出した。内部参照遺伝子としてGAPDHを使用した。相対的なプライマー配列は、補足表1にある（AMVNグループについてはn＝4、AKKグループについてはn＝5）。
2.10. データ前処理およびバイオインフォマティクス解析
16S rDNA遺伝子のシーケンスデータは、我々の先行研究（Huang et al., 2022）を参照して処理・解析した。まず、FASTPを用いてフィルタリングを行い、生シーケンスデータから高品質のリードを得た。次に、ペアエンドのクリーンリードを、FLASH（バージョン1.2.11）を用いて、最小オーバーラップ10bp、ミスマッチエラー率2％で生タグとしてマージした。
品質管理後に保持されたクリーンリードは、UPARSE（バージョン9.2.64）パイプラインを使用して、97%以上の類似度を持つ運用分類単位（OTU）にクラスタリングした。すべてのキメラタグはUCHIMEアルゴリズムを用いて除去され、さらなる解析のために有効なタグが得られた。最も存在量の多いタグ配列を、各クラスター内の代表配列として選択した。代表的なOTU配列は、SILVAデータベース（バージョン132）に基づき、ナイーブベイズモデルとRDP分類器（バージョン2.2）を用いて、信頼閾値0.8で生物に分類された。
アルファ多様性指数はUsearch（バージョン10.0.240）を用いて計算し、GraphPad Prism 9（version 0.1.1; GraphPad Software Inc.、La Jolla, CA, United States）を用いて可視化した。R (version 4.0.5; The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) の Vegan パッケージ (version 2.5-7) を使用して、非計量多次元尺度法 (NMDS) の Bray-Curtis 距離を描画した。NMDSプロットのグラフと微生物叢組成の積み上げ棒グラフは、ggplot2パッケージ（バージョン3.5.5）を使用してRで可視化した。サンプル間の階層的なクラスターを得るために、R Veganパッケージのunweighted pair group method with the arithmetic means（UPGMA）関数を使用した。バイオマーカーの特徴は、線形判別分析効果量（LEfSe）分析およびLEfSeソフトウェア（バージョン1.0）を用いて各グループでスクリーニングした。
2.11. 統計解析
すべてのデータは、GraphPad Prism 8.0を使用して分析し、グラフを作成した。2つのグループのデータは、Student's t-testとWelch's t-testを使用して分析した。2つ以上のグループのデータを分析するには、二元配置分散分析に続いてTukeyの多重比較検定を使用した。最後に、データは平均値±SEMで表示し、p＜0.05の値を有意とみなした。
3. 結果
3.1. in situ悪性CRCモデルにおける大腸組織の悪性化障害
がん状態における腸内微小環境の変化を調べるために、in situ悪性CRCモデルを使用した。CRCの発症を評価するため、マウスの体重と生存率を3週間調べた。W3でマウスを人道的に安楽死させ、大腸組織を採取してH&E染色を行い、腸管障害を証明した。CRC群のマウスの体重は、他の群に比べ有意に減少した（図1A）。CRCグループの一部のマウスは、腫瘍により死亡した（図1B）。H&E染色では、免疫細胞の浸潤と大腸組織の損傷が表示された。図1Cに示すように、in situ腫瘍は大腸組織に深刻なダメージを与えた。CTL群およびSHAM群と比較して、CRC群では固有層の腸腺数の減少、陰窩の無秩序で歪んだ配置、基底形質細胞の数の増加、および炎症性浸潤が観察された。
図1
in situ悪性大腸癌（CRC）モデルにおける大腸組織の悪性化損傷。(A）3週間におけるマウスの体重の変化。(B) 生存率。(C）W3におけるヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色。スケールバー、100μm。...
3.2. in situ悪性CRCモデルにおける腸内微小環境の存在感の低下
マウスの腸内微小環境の変動を調べるため、W3期間中に糞便を採取し、16S rDNAシーケンシングを実施しました。腸内細菌叢の多様性は、微生物叢のマイクロエコロジーの安定性と外部病原体の侵入に対する抵抗力を示す（He et al.、2021）。α多様性は、Ace指数、Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数、リッチネスなど、多次元（希釈曲線）、観点（異なる指数）、形態で分析した（図2A-E）。アルファ多様性指数が高いほど、群集の多様性が高いことを示す。Ace指数（図2A）、Chao1指数（図2B）、Simpson指数（図2C）、Shannon指数（図2D）、richness（図2E）はCRC群でCTL群、SHAM群に比べ有意に低かった。また、どのグループでも希釈曲線が徐々に平坦化することから、腸内の生物種数は配列数に応じて増加するものではないことがわかった。したがって、本実験で測定したサンプル数は、微生物叢の特徴を把握するのに十分であった。この結果から、CRCを発症したマウスでは、腸内細菌叢の存在量が著しく減少し、腸内微環境の安定性が損なわれていることがわかりました。
図2
CRCマウスにおける腸内細菌叢の存在量低下。3群のα多様性解析。Ace指数（A）、Chao1指数（B）、Simpson指数（C）、Shannon指数（D）、リッチネス希釈曲線（E）。(F) 非メトリック多次元スケーリング．
NMDSとUPGMAクラスタリング解析を用いて、3つのサンプルグループ間の構造的な違いを調べた。NMDS解析は、種情報に基づく多次元空間における点としてサンプルを反映させる。NMDS散布図（図2F）は、点間の距離に基づいて、3つのサンプルグループ間の不一致を反映した。2次元応力値は0.06であり、よく表現されていた。NMDS解析の結果、CRC群の腸内微小環境の組成はCTL群やSHAM群と有意に異なっており、CRCによりマウスの腸内細菌組成が変化していることが示唆されました。サンプルは、β多様性距離行列の情報をもとにUPGMA分類木で分類された。類似したサンプルは共通枝が少なかった。UPGMAクラスタリング解析（補足図1）でも、NMDS解析と同様の結果が得られた。
3.3. in situ悪性CRCモデルの腸内微小環境における構造的変化
さらに、CRCマウスにおける腸内細菌叢の組成の変化について検討した。サンプル全体の群集構造を門レベルで分析した。上位10種の微生物分類群の相対存在量を積層ヒストグラムとして報告する（図2G）。CRC群ではBacteroidetes、Patescibacteria、Actinobacteriaの相対量が減少し、CTL群やSHAM群と比較してFirmicutes、Proteobacteria、Verrucomicrobia、Epsilonbacteraeotaの相対量が増加しました。門レベルの相対存在量の結果から、CRCマウスでは腸内細菌叢の組成が変化していることが示されました。
さらに属レベルでの変化を明らかにするために、上位10属の相対存在量結果を図2Hに示す。CRC群の構造変化は、CTL群およびSHAM群の構造変化と比較して有意であった。CRCは、Candidatus saccharimonas、Ruminococcaceae UCG-014、Alistipes、Bacteroidesの存在量を減少させ、Enterococcus、Escherichia shigella、Romboutsia、Akkermansiaの存在量を著しく増加させた。同様に、CRC群では腸内細菌叢の構造が著しく変化し、腸内微小環境のホメオスタシスが破壊された。
3.4. CRCにおけるシグネチャー菌の同定とAkkermansia muciniphilaの過剰コロニー化
LEfSeソフトウェアを使用して、CRC群とSHAM群で有意に異なるバイオマーカーを数え、さらにCRCマウスの腸内の主要な微生物相を特定しました。特徴的なバイオマーカーを特定するために、線形判別分析（LDA）効果を使用した（図3A）。有意差の対数LDAスコアは3に設定し、対応するクラドグラムは補足図2に記載した。Bacteroides acidifaciens、Lactobacillus gasseri、Ruminococcaceae、Prevotellaceae、およびC. saccharimonasは、SHAMグループで濃縮されていました。しかし、CRC群では、Enterobacteriaceae、Enterococcus、Romboutsia、Lactococcus、AkkermansiaのE. Shigellaが濃縮されていた。
図3
CRCにおけるシグネチャー菌の同定とAkkermansia muciniphilaの過剰コロニー化。(A）線形判別分析（LDA）スコアが最も高いCRC群とSHAM群間の線形判別分析効果量（LEfSe）分析［log ...
さらに、3群間の環境差を明らかにするために、特徴的な微生物相の相対存在量統計を分析した。B. acidifaciens（図3B）、L. gasseri（図3C）、C. saccharimonas（図3D）の相対存在量は、CRC群で有意に減少した。一方、E. Shigella（図3E）、Enterococcus（図3F）などの病原性細菌の相対存在量は増加した。特に、アッカーマンシアの相対存在量は、CTL群およびSHAM群のそれと比較して増加した（図3G）。
CRCモデルにおける腸内細菌叢の変化を調べるために、同じ実験を繰り返した。補足図3A-Eに示すように、CRC群の腸内細菌叢はコントロール群の腸内細菌叢と有意に異なっていた。門・属レベルで有意差が認められ、VerrucomicrobiaとAkkermansiaの相対量がCRC群で有意に増加した（補足図3F,G）。また、LEfSe解析の結果、モデル群ではAkkermansiaが極めて有意に濃縮された細菌種であることがわかった（補足図3H）。これらの結果から、CRCマウスの腸内では、Akkermansiaの相対量が有意に増加していることが示唆されました。これらの結果は、前述の実験の再現性を明らかにするものである。
3.5. Akkermansia muciniphilaの過剰なコロニー形成は、軽度の炎症を引き起こす
A. muciniphila過剰コロニー化マウスモデルは，A. muciniphila過剰コロニー化時の腸管バリアの状態を評価するために，抗生物質処理後に生きたA. muciniphilaを胃内投与して確立した（図4A）．最終日にマウスの糞便を採取し、qRT-PCRによりA. muciniphilaによるコロニー形成を検出した。図4Bに示すように、AKK群のA. muciniphila mRNA相対発現レベルは、CTL群およびAMVN群のそれよりも有意に高いことが確認された。A. muciniphilaの過剰コロニー形成における抗生物質の役割を示すために、同じ濃度のA. muciniphilaのガベージを行い、抗生物質の前処理を行わないグループ（AKK-）を追加した。その結果、AKK-群とCTL群の間でA. muciniphilaの相対発現量に有意差はなかった（補足図4）。しかし、AKK群ではA. muciniphilaの相対発現量がAKK群に比べ有意に高かった。これらの結果は、抗生物質カクテル投与により腸内細菌叢の調節異常が生じ、A. muciniphilaのコロニー形成が助長され、過剰コロニー形成A. muciniphilaマウスモデルの確立に成功したことを示す。図4Cは、A. muciniphilaのガベージ前後のマウスの体重を示す。AKK群およびAMVN群の体重は、CTL群と比較して、抗生物質処理により0日目に低下した。AKKグループのマウスは、有意に体重が低かった。
図4
Akkermansia muciniphilaモデルマウスの過剰なコロニー形成。(A) 実験の模式図。(B）qRT-PCRで試験したマウス糞便中のA. muciniphilaの相対的発現量。(C）A.muciniphila投与前と投与後の体重。(D)The ...
A. muciniphilaの過剰コロニー形成が炎症を引き起こすかどうかを、血液学的分析を用いて判断した。図4D-Gに示すように、AKK群の白血球（WBC）数は、CTL群およびAMVN群のそれと比較して有意に増加した。また、A. muciniphilaでマウスを処理した後、好中球（NE）および単球（Mon）の割合は増加したが、リンパ球（Lymph）の割合は減少した。これらの結果は、A. muciniphilaの過剰なコロニー形成が軽度の炎症を引き起こしたことを示しています。大腸組織のH&E染色（図5A）により、A. muciniphilaの過剰なコロニー形成は、陰窩を破壊し、浮腫を引き起こし、大量の炎症性細胞の浸潤をもたらした。この結果は、血液学的解析と一致した。A. muciniphilaの過剰なコロニー形成は、大腸組織を炎症させ破壊した。
図5
Akkermansia muciniphilaの過剰なコロニー形成による腸管バリアーの破壊。(A) 大腸組織のH&E染色。スケールバー、100μm。(B) 大腸組織のアルシアンブルー染色。スケールバー、100μm。(C) ...
3.6. Akkermansia muciniphilaの過剰なコロニー形成による腸管バリアーの破壊
粘液層は病原体に対する最初の防御壁であり、杯細胞はムチンを分泌して粘液層の厚さを維持している（Gustafsson and Johansson, 2022）。A. muciniphilaの過剰コロニー化が粘液層に与える影響を調べるため、大腸組織をアルシアンブルーで染色した（杯細胞は青く染色される）。図5Bに示すように、CTLグループは正常な杯細胞の形態と正常な粘液層を示したが、AMVNグループは粘液層のわずかな薄層化を生じた。注目すべきは、AKKグループの大腸組織の粘液層が著しく損傷し、杯細胞の数が著しく減少していることである。粘液層の破壊の程度を評価するために、画像中の青色の面積を定量的に決定した（図5C）。アルシアンブルー染色面積の相対平均は、AKK群でCTL群およびAMVN群に比べ有意に低かった。
ムチン2（MUC2）は分泌型ムチンであり、大腸バリアの主要なムチンであり、潤滑油の役割を果たし、細菌や毒素から大腸粘膜を保護する。MUC2レベルは、大腸粘膜の完全性の重要な指標として使用されています。ZO-1は、腸上皮細胞間のタイトジャンクションバリアの機能を示す指標である。そこで、大腸組織において、MUC2およびZO-1の発現レベルを免疫蛍光法により検出した（図5D）。MUC2タンパク質は赤、ZO-1は緑、そしてDAPIは細胞核を染色するために使用された。MUC2およびZO-1の相対蛍光強度を、3つのグループ間で統計的に定量化した。図5E,,F,Fに示すように、AKK群ではCTL群、AMVN群に比べて相対蛍光強度が有意に低く、AKK群の大腸組織ではMUC2およびZO-1のレベルが低いことが示された。また、オクルディン、クローディン-4、ZO-1の相対mRNA発現量も腸管組織で低下していた（図5G-I）。これらの結果は、A. muciniphilaの過剰なコロニー形成により、大腸組織においてムチンとタイトジャンクションタンパク質が大幅に異化され、腸管バリアが損なわれていることを示唆している。
4. 考察
本研究では、CT26細胞で作成した皮下腫瘍から腫瘍組織を移植し、in situ悪性CRCモデルを作製した。そして、CRCマウスにおける腸内微生物の生態と組成の変化を16S rDNAシークエンシングを用いて検討した。驚くべきことに、LDA解析において、A. muciniphilaの相対量が属レベルで増加した。我々の最近の研究では、DSS誘発潰瘍性大腸炎マウスにおいて同様の過剰コロニー化に気づいた（Huang et al.、2022）。前述したように、A. muciniphilaの特徴は、腸管バリアの粘液層と関連しています。そこで、腸管バリア障害におけるA. muciniphilaの役割が代償調節なのか悪化なのかを確認するために、A. muciniphilaの過剰コロニー形成マウスモデルを確立した。その結果、腸管組織において腸管バリア関連ムチンやタイトジャンクションタンパク質のレベルが低下しており、過大殖民したA. muciniphilaが腸管バリア障害を引き起こすことが確認された。
本研究では、抗生物質投与後に生きたA. muciniphila（1×109 CFU）を胃に投与し、A. muciniphilaの過剰コロニー形成マウスモデルを確立しました。いくつかの研究（Everardら、2013；Plovierら、2017）は、A. muciniphila（2×108 CFU）ガベージだけでは有害な効果がないことを示している。注目すべきは、抗生物質カクテルがA. muciniphilaによるコロニー形成に寄与する重要な要因であったことです。同時に、Eubacteriaプライマーを総菌数の内部参照（またはハウスキーピング遺伝子）として使用しました。これらのプライマーは、すべての細菌を代表するユニバーサルEubacteriaコミュニティプライマー（UniF340およびUniR514）であり、qRT-PCRおよび16S rDNA研究において、細菌量の決定またはすべての細菌の16S rDNAの捕捉に広く用いられている（Wangら、1996； Lawleyら、2017； Kuhbandnerら、2019； Chenら、2022）。相対的なqRT-PCR発現結果の目標閾値サイクル（Ct）は、デルタデルタCt法を用いて内部参照Ctで割った。したがって、今回のqRT-PCRの結果は、微生物叢全体に対するA. muciniphilaの相対量を反映しています。AKK群のA. muciniphilaの量は、CTL群やAMVN群よりも有意に多く、A. muciniphilaはオーバーコロニー化した。
腸管粘液バリアは、有害物質の侵入を防ぐ最初の自然バリアである。病気を引き起こす微生物の侵入を防御し、プロバイオティクスのコロニー形成を助けるという積極的な役割を担っている (Johansson et al., 2008)。MUC2は、腸杯細胞から分泌される糖度の高い分泌性ムチンであり、腸管粘液バリアの主成分である（Yao et al.、2021）。Akkermansia muciniphilaは通常、緩い粘液の外層に定着し、代謝物を介して杯細胞によるMUC2の合成をアップレギュレートします（Meng et al., 2020）。A. muciniphilaは粘液層を分解するものの、その厚さは変化せず、動的平衡に達する（Derrien et al., 2017）。本研究では、A. muciniphilaの過剰コロニー化により、MUC2値が通常より有意に低下したことから、過剰コロニー化したA. muciniphilaが、杯細胞が分泌する以上のムチンを消費することが示唆されました。その結果、腸管粘液バリアと腸管バリアのバランスの両方が損なわれていた。
腸のバリアの主要な構成要素は腸粘膜上皮細胞であり、それらはタイトジャンクションタンパク質によってつなぎ合わされています。腸管粘膜バリアの機械的完全性と適切な動作は、このタイトジャンクションによって維持されている（鈴木、2020）。タイトジャンクションは、オクルディン、クローディン、接合接着分子、およびZO-1、ZO-2、ZO-3などの周辺細胞質タンパク質から構成されています。本研究では、A. muciniphilaの過剰コロニー形成マウスモデルの大腸組織において、ZO-1含量が有意に減少し、オクルディン、クローディン-4、ZO-1の相対mRNA発現レベルも低下していることが明らかになりました。この結果からわかるように、A. muciniphilaの過剰摂取により腸管粘液層が薄くなり、有害な細菌が腸管上皮細胞に直接接触し、さらに上皮細胞の障害を引き起こし、細胞間のタイトジャンクションが破壊されることがわかりました。同時に、ムチンの欠乏が続き、腸管粘液層の修復が困難になると、腸管上皮細胞の修復能力がさらに弱まることも伴いました。これら2つの要因が、腸管バリアを破壊し、大腸炎やCRCの発症を悪化させる一因となりました。また、これらの要因は細菌の移動にも寄与し、病原性細菌や発がん性の可能性のある代謝物が存在する機会を提供しています。有害物質は末梢循環にアクセスし、全身組織の損傷を引き起こし、1型糖尿病（Costa et al., 2016）や全身性エリテマトーデス（Ogunrinde et al., 2019）などの深刻な自己免疫疾患につながる可能性がある。
Akkermansia muciniphilaは、次世代のプロバイオティクスであると広く考えられています。臨床試験の結果、生きたA. muciniphilaよりも低温殺菌したA. muciniphilaの方が、過体重や肥満のヒトボランティアに良い影響を与えることが示されています（Depommier et al.、2019年）。A.muciniphilaの効果については、IBD関連の研究によって多くの相反する結果が報告されています（Zhang et al.、2021）。また、A. muciniphilaが細胞外小胞を通じて抗炎症作用を発揮することが示されています（Kang et al., 2013; Chelakkot et al., 2018）。しかし、ある研究では、A. muciniphilaがSalmonella enterica typhimurium誘発腸炎において、粘膜再構成を妨げ、炎症を悪化させることが明らかになりました（Ganesh et al.、2013）。これは、A. muciniphilaがムチン産物の異化を促進し、他の腸内病原細菌に増殖に必要な物質を供給しているためと考えられる。別の研究では、IL-10-/-マウスのNLRP6遺伝子ノックアウトによる自然発症の大腸炎が悪化した後、A. muciniphilaの存在量がマウス腸内で著しく増加し（Seregin et al., 2017）、A. muciniphila経口投与が大腸炎を悪化させることが明らかになりました。A.muciniphilaの存在量はパーキンソン病と強く関連し、疾患シグネチャー微生物群であることが実証されています（Hill-Burns et al., 2017; Heintz-Buschart et al.） また、多発性硬化症やアルツハイマー病においても、A. muciniphilaの高い存在度が観察されています（Berer et al., 2017; Vogt et al.、2017）。これらの観察に関連する因果関係やメカニズムは依然として不明ですが、これらの知見は、A. muciniphilaが諸刃の剣である可能性を示唆しています。
我々の知見は、プロバイオティクスとしても考えられている腸内のA. muciniphilaが、特定の病的状況において負の効果を発揮し、腸疾患症状を悪化させる可能性があるという考えを支持しています。アッカーマンシア・ムチニフィラは、ある条件下では潜在的な病原体となる。したがって、臨床治療に使用する前に、多くの文脈でA. muciniphilaの機能を分析することが極めて重要である。今回の発見は、プロバイオティクスとしての生きたA. muciniphilaの病原性の可能性についての認識を高めるものである。生きたA. muciniphilaは、腸管バリアの損傷を悪化させ、炎症やがんの発生を促進する。そのため、大腸炎やCRCなどの疾患を持つ患者の治療にA.muciniphilaを使用することはできない。
しかし、A. muciniphilaは、腸の杯細胞のムチン分泌能力にも影響を与える。この効果のメカニズムはまだ不明であり、さらなる研究が必要である。さらに、A. muciniphilaが他の腸内細菌に及ぼす影響については検証しておらず、A. muciniphilaと他の細菌との相互作用は明らかにされていない。これらの限界は、今後の研究で解決される予定です。本研究の結果は、A. muciniphilaが損傷した腸管粘液層の再構築をどのように妨害するかを理解する上で重要な意味を持ちます。彼らは、A. muciniphilaを臨床に適用する際には、患者の状態を考慮する必要があることを示唆している。
5. まとめ
今回の研究成果は、腸管バリアに大きなダメージを受けたCRCマウスにおいて、腸内細菌叢の存在量と構造が乱れていることを示すものです。特に、A. muciniphilaの数は、腸疾患の状況下で著しく増加した。過剰なA. muciniphilaは、腸組織におけるムチンの合成を増加させるのではなく、ムチンを分解した。腸管上皮細胞のタイトジャンクションや、粘膜バリアを修復するためのムチン産生能が破壊されることで、腸管粘膜環境が悪化し、微生物叢の変位が促進されて炎症やがんを悪化させる。本研究は、オーバーコロニー化したA. muciniphilaがムチンの過剰摂取により腸管バリアを破壊し、腸疾患の発生・進行に寄与することを示唆しています。
データ提供に関する声明
本研究で発表されたデータは、https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA009251 で一般公開されているNational Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (GSA: CRA009251) の Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics and Bioinformatics 2021) に寄託されています。
倫理に関する声明
動物実験については、中国医薬研究所の動物倫理委員会の審査・承認を得た。
著者の貢献
SQ、YZ、YHは、MQ、KNの指導のもと、本研究の構想・設計に貢献した。SQ、YZはほとんどの実験を実施した。YHはバイオインフォマティクス解析を担当した。SQとYZは原稿の第一稿を執筆した。YF、KX、WZ、YWは論文の訂正を行い、研究全般について指導を行った。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
この研究は、中国の国家重点研究開発プログラムによる助成金番号ZK20200085の一部または全部の助成を受けたものである。ZK20200085 によって部分的に支援されました。
利益相反
著者らは、本研究が、潜在的な利益相反と解釈されうる商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
補足資料
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記事情報
Front Microbiol. 2023; 14: 1111911.
オンライン公開 2023 Mar 2. doi: 10.3389/fmicb.2023.1111911
PMCID: PMC10018180
PMID:36937258
Shuang Qu, † Yinghui Zheng, † Yichun Huang, † Yicheng Feng, Kunyao Xu, Wei Zhang, Yawen Wang, Kaili Nie, * and Meng Qin * 。
北京化工大学生命科学技術学院、北京ソフトマター科学・工学先端イノベーションセンター（中国・北京市
コレスポンディングオーサーです。
編集者 中国・四川大学Yuqing Liさん
レビューした人 Zhangran Chen（厦門大学、中国）、Richard Agans（空軍研究所、アメリカ
*Correspondence: 秦 孟、nc.ude.tcub.liam@212gnemniq
Kaili Nie, nc.ude.tcub.liam@1700052102
(注) †これらの著者は、本作品に等しく貢献している。
本記事は、Frontiers in Microbiology誌のMicrobial Symbiosesに投稿されたものです。
Received 2022 Nov 30; Accepted 2023 Feb 13.
Copyright © 2023 Qu, Zheng, Huang, Feng, Xu, Zhang, Wang, Nie and Qin.
これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、一般的な学術慣行に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されません。
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