細胞外レドックスシグナルがカルシウム放出を誘発し、Toxoplasma gondiiの無性発生に影響することが判明

2023年4月2日 18:28

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編集部

ポール・R・ギルソン
バーネット研究所（オーストラリア

レビューで紹介されました

カーステン・リューダー
ドイツ、ゲッティンゲン大学医療センター、医療微生物学部門

ミリヤム・アンドレア・ホルトゥア・トリアーナ
ジョージア大学（米国

目次
アブストラクト
はじめに
素材と方法
結果
ディスカッション
データの利用可能性に関する声明
著者からの寄稿
ファンディング
利益相反行為について
出版社ノート
謝辞
補足資料
参考文献
オープンサプリメントデータ
エクスポートの引用
エンドノート
リファレンス・マネージャー
シンプルなTEXTファイル
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ORIGINAL RESEARCHの記事
フロント Cell. Infect. Microbiol.、2021年8月10日
第2回寄生虫と宿主
第11巻～2021年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.728425
細胞外レドックスシグナルがカルシウム放出を誘発し、Toxoplasma gondiiの無性発生に影響することが判明
Eduardo Alves1、Henry J. Benns1,2、Lilian Magnus1、Caia Dominicus3、Tamás Dobai1、Joshua Blight1、Ceire J. Wincott1、Matthew A. Child1* 。
1英国・ロンドン、インペリアル・カレッジ・ロンドン、生命科学部
2インペリアル・カレッジ・ロンドン化学科（英国・ロンドン
3フランシス・クリック研究所（英国・ロンドン）アピコンプレックス寄生虫におけるシグナル伝達研究室
生物が環境の酸化還元変動を感知して反応する能力は、Toxoplasma gondiiのようなアピコンプレックス系寄生虫では不完全に理解されているシグナル伝達ネットワークに依存する。この細胞内寄生虫の発生に酸化還元の変化が与える影響については不明である。ここでは、標準的な抗酸化機能に関連するドメインを含む58の遺伝子のコレクションを改訂し、コードされたタンパク質がさまざまな細胞区画に広く分散していることを明らかにした。我々は、T. gondiiに感染したヒト線維芽細胞に外因性H2O2を添加すると、細胞内寄生虫の細胞質でCa2+フラックスが誘発され、脱出を誘導できることを実証した。既存のモデルと同様に、外因性H2O2によって引き起こされる脱出は、カルシウム依存性プロテインキナーゼ3とジアシルグリセロールキナーゼの両方に依存する。最後に、グルタレドキシン-roGFP2酸化還元センサー融合タンパク質を寄生虫胞に過剰発現させると、寄生虫の複製に深刻な影響を与えることを示す。これらのデータは、T. gondiiに存在する豊富なレドックスネットワークを強調し、細胞外のレドックスと細胞内のCa2+シグナルの関連性を証明し、寄生虫の脱出に至る可能性を示しています。また、細胞内環境の酸化還元電位は、寄生虫の正常な増殖に寄与していることも明らかになった。これらの結果から、寄生虫の生物学において、酸化還元が未知の制御因子として重要な役割を担っていることが明らかになった。

はじめに
Toxoplasma gondiiは、Apicomplexa門に属する単細胞の義務的細胞内寄生虫で、あらゆる温血動物に感染する可能性があります。その血清有病率は、ヒトの3分の1以上と推定されています（Halonen and Weiss, 2013; Flegr et al., 2014）。宿主内では、T. gondiiの無性ライフサイクルは、急性感染を特徴付ける急速に増殖するタキゾイトと、慢性感染に関連するゆっくりとした複製を行う嚢状ブラジゾイトの2つの異なる段階として存在します（Sheffield and Melton, 1968; Dubey, 1996）。通常は良性の感染症ですが、免疫不全患者や胎児では（Luft and Remington, 1992; Weiss and Dubey, 2009）、溶菌性タキゾイトのライフサイクルが重度の臨床病理を引き起こす原因となっています。溶菌サイクルの間、タキゾイトは宿主細胞に付着し、積極的に侵入して、寄生虫胞（PV）と呼ばれる寛容な複製ニッチを形成します。その後、寄生虫は内死原性（Goldman et al.、1958）によって複製され、最終的に宿主細胞から排出され、溶解破壊に至る。病原体であるタキゾイトと持続的な嚢胞を持つブラディゾイトの相互変換は、宿主の免疫圧の影響を受け、病気の再発を理解する上で鍵となる（Montoya and Liesenfeld, 2004）。T. gondiiが多様な宿主種に感染する能力は、宿主の防御に抵抗し、無数の環境的手がかりを効率的に認識し、迅速に対応する驚くべき能力に関連している。外部からの手がかりによって活性化される生物学的シグナルカスケードの中でも、Ca2+シグナルは最も注目され、T. gondiiで最もよく研究されている［（Lourido and Moreno, 2015）においてレビュー］。Ca2＋は、タキゾイト宿主細胞の侵入（Vieira and Moreno, 2000; Pace et al., 2014）、運動性（Wetzel et al., 2004）および退出（Endo et al、 1982）は、植物のようなCa2+依存性タンパク質キナーゼ1（CDPK1）（Murphyら、2010；Ojoら、2010）およびCDPK3（Garrisonら、2012）などのエフェクタータンパクの活性化を通じて行われます。Ca2+と並んで、他の細胞内シグナル分子も、タキゾイトの溶菌サイクルで重要な役割を果たすことが知られている。例えば、ホスファチジン酸（PA）（Bullen et al.、2016）、環状グアニジン一リン酸（cGMP）によるプロテインキナーゼGの活性化（Brown et al.、2016）などが挙げられる。

Ca2+とは対照的に、シグナル伝達分子としての活性酸素種（ROS）の研究は、Apicomplexaでは初期段階である。過酸化水素（H2O2）は、膜を通過する能力を持つ中性活性酸素分子であり（Guzik et al.、2000）、シグナル伝達におけるその役割は多様である。グルタチオン（GSH）との相互作用や、システイン残基の酸化によるリン酸化酵素、転写因子、イオンチャネルなど様々なタンパク質のアロステリック変化などが挙げられる（Winterbourn and Hampton, 2008）。通常、酸化還元に敏感なシステインの酸化は、GSHやニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスファターゼ（NADPH）（Xiongら、2011；PastoreとPiemonte、2012；Sabens Liedhegnerら、2012；Popov、2014）を酸化還元補因子として使用する酵素によって触媒される可逆プロセスである。H2O2とT. gondiiタキゾイトに関する研究の多くは、宿主細胞が自然防御の構成要素として活性酸素の有害な酸化特性を利用する能力と、この防御を克服するためにタキゾイトが用いる戦略に焦点を当てている（Murray and Cohn, 1979; Ding et al., 2004; Akerman and Muller, 2005; Luder and Gross, 2005; Luder et al., 2009）.

H2O2解毒酵素カタラーゼのT. gondiiオルソログは、寄生虫の細胞質で発現し、宿主の酸化ストレスから保護する（Kaasch and Joiner, 2000; Ding et al.、2004）。2004年、Ding et al.は、T. gondiiの抗酸化系に関連する14の遺伝子群をまとめた。これらは通常、寄生虫の細胞質およびミトコンドリアに局在し、5つの主要な酸化還元系分類のいずれかに分類された：（1）代謝遺伝子（例．代謝系遺伝子（スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼなど）、（2）チオレドキシン（Trx、システインチオールジスルフィド交換を促進するタンパク質）、（3）プロテインディスルフィドイソメラーゼ（PDI、システインディスルフィド結合を破壊または形成し、タンパク質折りたたみを支援するタンパク質）、； (4）グルタレドキシン-グルタチオン（Grx-GSH、GSHをチオール-ジスルフィド交換の補酵素として使用する小型タンパク質）、（5）ペルオキシレドキシン（Prx、H2O2や有機ハイドロパーオキシドなどのハイドロパーオキシドの無毒化する酵素）。

このような寄生虫の抗酸化システムに関する広範な説明に加え、他の研究では、T. gondiiのシグナル伝達および細胞周期制御と酸化還元との関連性が検証されている。細胞内の寄生虫を還元剤であるジチオスレイトール（DTT）で外因的に処理すると、Ca2+が動員されて寄生虫が脱出する（Stommel et al., 1997）。この脱出反応は、排出された寄生虫のATPaseの活性による宿主細胞のATPの枯渇によって引き起こされた（Silverman et al.、1998）。別の研究では、酸化感受性タンパク質TgDJ-1は、T. gondiiにおいてCDPK1と会合し、マイクロネームの分泌を促進することが判明した（Child et al.、2017）。さらに最近では、酸化ストレス（亜砒酸ナトリウムによって生成）が、翻訳開始因子キナーゼTgIF2K-BによるT. gondii eIF2α（TgIF2α）のリン酸化に続いて、タキゾイトからブラジゾイトへの分化を誘発することが示されている（Augusto et al.、2020）。これらのデータを総合すると、T. gondiiは酸化還元ホメオスタシスの変化に応答して生物学的プロセスを調節していることが示唆される。

ここでは、インシリコアプローチを用いて、酸化還元関連遺伝子の大要を確立し、T. gondiiにおけるこれらの遺伝子の最新の見解を提供する。次に、H2O2が寄生虫の生物学に与える影響を調べ、感染した宿主細胞の境界の外にあるH2O2シグナルが、細胞内寄生虫の細胞質内の奥深くで受信・解釈されることを実証した。また、外因性H2O2処理によりCa2+が動員され、CDPK3依存的な脱出が起こることを明らかにした。最後に、遺伝的にコードされた酸化還元レポーターを用いて、脱出前の酸化還元振動を明らかにした。さらに、ヒトGrxの活性触媒ドメインを寄生虫の細胞質またはPVに過剰発現させると、寄生虫の無性複製が遅延するという意外な発見をした。この結果は、多種多様な抗酸化タンパク質が細胞内に存在することを裏付けるとともに、T. gondiiの基礎生物学における酸化還元の重要性を浮き彫りにするものである。

材料と方法
寄生虫と宿主の細胞培養
T. gondiiのヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（HXGPRT）を欠くRH株（Type I）のタキゾイトを初代ヒト包皮線維芽細胞（HFF）の単層上でインビトロ培養しました、 ATTC®）を37℃、5％CO2、3％O2雰囲気の加湿インキュベーターに入れ、10％の牛胎児血清（FBS）と2mM L-グルタミンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、抗生物質なしで維持しました。すべての培養物は、毎月のようにマイコプラズマ感染に対して検査された。

プラスミドおよびトランスジェニックパラサイトの作製
本研究で使用したすべてのプライマーを補足表2に示す。GRX1-roGFP2センサー（Meyer et al., 2007; Aller et al., 2013）は、プライマー1/2を用いて市販のベクターpEIGW-GRX1-roGFP2（Addgeneプラスミドn°64990）から増幅し、ギブスン・アセンブリ®マスターミックスを用いてHXGPRTの選択可能マーカーを含む消化（HF-エコリ＆PacI）pTUB8ベンダーに挿入しました。GRA8-GRX1-roGFP2 についても、プライマー 2/3 を用いて同様の戦略をとった。不活性化GRX1触媒ドメイン（GRX1cys23-26）を有するベクターを生成するために（Sunら、1998；Yangら、、 1998）、プライマー4/5を用いてpTUB8::GRX1-roGFP2上のシステインをセリンに置換し、プライマー4/6を用いてpTUB8::GRA8-GRX1-roGFP2上で環化した後、KLD反応液（NEB）により環化してベクターpTUB8::GRX1 (ser23-26)-roGFP2 および pTUB8::GRA8-GRX1(ser23-26)-roGFP2 を得た。すべてのベクターを線形化し、以前に記載されたようにRHΔku80ΔHXGPRT寄生虫にトランスフェクトした（Soldati and Boothroyd, 1993）。トランスフェクトされた寄生虫は、ミコフェノール酸（MPA；25μg/mL）およびキサンチン（XAN；50μg/mL）を培養液に添加することによりトランスフェクション後24時間選択した。96ウェルプレートに限界希釈してクローン化し、5つのクローンを選択した。ゲノムDNAは、Monarch® Genomic DNA Purification Kit (New England BioLabs)を用いて細胞外タキゾイトから抽出した。GRX1ベースのセンサーの存在は、プライマーペア7/8を用いて確認した。

カルシウムセンサー構築物pUPRT::GFP-T2A-jRCaMP1bを生成するために、赤色蛍光カルシウムセンサータンパク質jRCaMP1bをコードする配列（Danaら、2016）をカスタム合成遺伝子としてIDTに注文し、プライマー9/10を用いて適切なギブスンのオーバーハングを使用してPCR増幅した。GRA1の5'UTRは、プライマー11／12を用いてpTKO2c（Caffaroら、2013）からPCR増幅し、GFP-T2A融合配列はプライマー13／14を用いて未発表の社内プラスミドから増幅された。その後、3つの断片をすべて、PacI消化したUPRTターゲティングベクターpUPRT-HA（Reese et al.、2011）にギブソンアセンブリによってクローニングした。得られた構築物をNaeIを用いて直鎖化し、RH Δku80Δhxgprt寄生虫にトランスフェクトしてGFP-T2A-jRCaMP1bカルシウムセンサー系統を作製した。トランスフェクションから24時間後に5'-fluo-2'-deoxyuridine (FUDR) selection (5 µM)を行い、トランスジェニック寄生虫を得た。GFP-T2A-jRCaMP1bΔCDPK3株を作製するために、HXGPRTカセット（5'および3'DHFR UTR配列で挟まれた）をpGRA-HA＿HXGPRT（Coppens et al、 2006）からプライマー15／16（増幅した断片に40bpのCDPK3相同領域を導入）を用いて増幅し、RH Δku80ΔHXGPRTにpSag1：：Cas9-U6：：dbl-sgCDPK3と共トランスフェクションした。pSag1::Cas9-U6::dbl-sgCDPK3ベクターは、プライマー対17/18および17/19を用いてpSag1::Cas9-U6 (Behnke et al., 2014) ベクターをインバースPCR増幅して、それぞれ中間構築物pSag1::Cas9-U6::sg1CDPK3（sgRNA1を含む）および pSag1::Cas9-U6::sg2CDPK3（sgRNA 2を含む）生成して、生成した。KLD反応混合物を用いて両方の中間構築物を環状化した後、sgRNA1を構成する領域を、pSag1::Cas9-U6::sg1CDPK3からプライマー20/21を用いてPCR増幅し、Kpn1/XhoI線形化pSag1::Cas9-U6::sg2CDPK3にギブスンで組み立ててダブルsgRNAプラスミド pSag1::Cas9-U6::dbl-sgCDPK3 を生じた。組換え寄生虫は、GRX1-roGFP2について以前に記載したように、トランスフェクション後24時間後に選択した。CDPK3遺伝子座におけるHXGPRTカセットの統合を、プライマー対22／23および24／25を用いて、それぞれ5'および3'の統合を確認した。内因性CDPK3遺伝子座の不在は、プライマー26/27を使用して確認された。RH-GFP-Luc寄生虫［GFP変異体3およびホタルルシフェラーゼIAV（Ploemenら、2009）を発現］は、Dr Moritz Treeckから贈られた。

酸化還元に関連するT. gondii遺伝子の同定
Toxoplasmaデータベース（ToxoDB (Gajria et al., 2008), release 50 beta 17 Dec 2020）内で、遺伝子テキスト検索オプションで「thioredoxin」「glutathione」「glutaredoxin」「peroxiredoxin」「protein disulfide」のキーワードを用いてT. gondiiの酸化還元シグナルに関する遺伝子リストを取得した。各遺伝子について、National Center for Biotechnology information (NCBI) データベース (www.ncbi.nlm.nih.gov/) の Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) を用いて、標準的な抗酸化グループである Trxs, Grx-GSH, Prxs, PDI の機能ドメインを確認した。各レドックス遺伝子に関連する空間的なタンパク質局在は、ToxoDBを通じて利用可能なlocalisation of organelle proteins by isotope tagging (hyperLOPIT) (Crook et al., 2018; Barylyuk et al., 2020) datasetから抽出されました。

プラークおよびレプリケーションアッセイ
プラークアッセイでは、感染したHFFからタキゾイトをシリンジで採取し、ろ過（5μm）した。~コンフルエントなHFFモノレイヤーで準備した6ウェルプレートの1ウェルあたり〜100匹のタキゾイトを加え、6日間乱れることなく成長させた。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、冷メタノールで固定した後、クリスタルバイオレットで染色し、スキャンした。プラークのカウントと面積の測定は、FIJIソフトウェアを用いて、関心領域（ROI）を描くことによって行った。複製アッセイでは、溶解したばかりのタキゾイトをμ-slide 8 well glass bottom chamber (Ibidi®) で増殖したHFFモノレイヤーに感染多重度 (MOI) 1で加えた。感染を同期させるため、寄生虫を冷やしたホスト細胞上に20分間沈降させ、37℃で2時間侵襲させた。細胞はPBSで洗浄し、細胞外のタキゾイトを除去した。細胞をさらに18時間インキュベートし、その後3％パラホルムアルデヒドで室温（RT）で20分間固定し、2％FBSを添加したPBSでブロッキングした。ORCA- Flash4.0カメラ（浜松市、日本）とNIS-Elements Viewerソフトウェア（Nikon）、60x-oil対物レンズを備えた広視野Nikon Eclipse Ti-E 倒立顕微鏡で470nmレーザー（強度4%）で励起して空胞あたりの寄生虫を数えた。すべての寄生虫株は、GFPまたはroGFP2を遺伝的にコードしていた。すべての菌株は、それぞれ3つのテクニカルレプリケートで、独立した回数をテストした。

イグレスアッセイ
RH-GFP-t2a-jRCaMP1bまたはRH-GFP-T2A-jRCaMP1bΔCDPK3寄生虫から溶解したばかりのタキゾイトを採取し、24ウェルプレート上で増殖したコンフルエントHFF細胞に接種（MOI：1）して18時間増殖した。細胞をPBSで洗浄し、成長培地をFBSを含まないフェノールレッドフリーDMEMに置き換え、さらに3時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をPBS＋薬剤（A23187、R59022、H2O2）またはビヒクル対照（水、DMSO）で30分インキュベートした。インキュベーション終了後、ウェルの上清を注意深く吸引し、200μLのRTアキュターゼ™と10分間インキュベートすることで細胞を剥離した。アキュターゼ解除した細胞懸濁液を200μLの8％パラホルムアルデヒドで固定した（20分、RT）。固定した細胞を35μmナイロンメッシュキャップの付いたファルコン5mLチューブに移した。遊離蛍光寄生虫および感染HFF集団は、BD LRSFortessa™で分析および定量化された。各チューブについて、合計5000イベントを収集した。GFPシグナルの検出には、530/30nmのフィルターを使用したブルーレーザー（488nm）を使用しました。宿主細胞のゲーティングに対する各薬剤処理の効果を評価するために、未感染のHFFコントロールを使用した。各薬剤の条件は、それぞれ6つのテクニカルレプリケートで、独立した3回テストした。

蛍光顕微鏡観察
細胞質Ca2+の蛍光測定には、RH-GFP-T2A-jRCaMP1bまたはRH-GFP-T2A-jRCaMP1bΔCDPK3寄生体を8ウェルガラス底チャンバーに増殖したコンフルエントHFFに添加（MOI：1）して18時間成長させた。ウェルはPBSで洗浄し、培地をFBSを含まないフェノールレッドフリーDMEM培地に交換し、さらに2時間インキュベートした。感染したHFFの画像を、複製アッセイについて以前に説明したのと同じ広視野顕微鏡の60x-oil対物レンズを使用して、37℃で撮影した。データ解析には、4～8匹の寄生虫を含む液胞のみを考慮した。GFP（励起470nm/発光520nm）およびjRCaMP1b（励起555nm/発光605nm）のシグナルは、100ミリ秒の取得速度で1秒ごとに最大10分間収集されました。薬剤は、1分後にピペッティングによりウェルに塗布した。画像解析は、FIJIソフトウェアを用いて行った。各チャンネルの各液胞の生の蛍光読み出し（F）は、薬物添加前のベースライン信号の平均（F0）に対して、安静時のベースライン値を1とする比F/F0を用いて正規化した。細胞内Ca2+振動シグナルと液胞の動きを区別するため、F(jRCaMP1b)/F0(jRCaMP1b)の値をGFPシグナルF(GFP)/F0(GFP)に対して正規化しました。特定の時間中のCa2+応答は、式で与えられる： (F(jRCaMP1b)/F0(jRCaMP1b))/(F(GFP)/F0(GFP))。

酸化還元測定のために、レシオメトリックGRX1ベースのセンサーを発現する寄生虫を、RH-GFP-T2A-jRCaMP1b寄生虫について説明したように処理した。酸化GRX1-roGFP2（395nm励起／520nm発光）および還元GRX1-roGFP2（470nm励起／520nm発光）を200ミリ秒の取得速度信号で1秒ごとに最大10分まで収集しました。データ解析はCa2+と同様で、酸化還元の読みは数式で求めた： (F(酸化)/F0(酸化))/(F(還元)/F0(還元))。

化学物質と試薬
安定剤入り過酸化水素30％（w／w）溶液；ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤（R59022）；A23187、イオノマイシン、無水メタノール、クリスタルバイオレット溶液はSigma-Aldrich Company Ltdから得た。 α-トコフェロールリン酸2ナトリウム塩はMerkから。無水ジメチルスルホキシド（DMSO）およびパラホルムアルデヒド16％溶液は、Life Technologies社から入手した。Fisher Scientific Ltd.からのAccutase細胞剥離液。

統計解析
データは平均値±SEMで表され、2群間の両側ペアStudent tテスト、≧3間の平均値を比較するためのBonferroniの多重比較テストによる一元または二元分散分析（ANOVA）を使用して分析された。すべてのデータは、GraphPad Prism 9ソフトウェア（米国カリフォルニア州）を使用して分析された。データは、P値<0.05のとき、統計的に有意であるとみなされた。

結果
T. gondiiレドックス関連遺伝子の最新版
我々はまず、T. gondiiにおける抗酸化反応とレドックスシグナルネットワークの理解を更新することを目指した。我々は、ToxoDB (Gajria et al., 2008)にある遺伝子配列とアノテーション情報、およびプロテオームデータセットを検索し、Ding et al. (2004) が以前に要約した14の酸化還元関連遺伝子のリストを更新しました。バイオインフォマティクスアプローチにより、主要な酸化還元シグナルグループ（Trxs、PDI、Grx-GSH、Prxs）の機能ドメインを少なくとも一つ含む遺伝子をスクリーニングした。その結果、26個のTrx、16個のGRX-GSH、6個のPDI、6個のPrx、および4個の代謝遺伝子（3種類のスーパーオキシドディスムターゼと1種類のカタラーゼを含む）を含む合計58個の酸化還元関連遺伝子（補足表1）を特定した。代謝遺伝子（Sibley et al., 1986; Kaasch and Joiner, 2000; Odberg-Ferragut et al., 2000; Ding et al., 2004）を除いて、他の酸化還元シグナルグループを代表する遺伝子の大部分は未解明である。これらの遺伝子産物の細胞内分布を知るために、最近発表されたhyperLOPITデータセット（Barylyuk et al.、2020）からそれらの一次局在を抽出した（図1および補足表1）。その結果、これらのタンパク質は細胞全体に広く分布しており、異なる細胞内コンパートメントに対して空間的に異なる酸化還元制御のメカニズムが存在することが示唆されました。

図1
www.frontiersin.org
図1 58個の酸化還元関連遺伝子と、HyperLOPIT (Barylyuk et al., 2020)によって決定されたそれらの主要タンパク質位置を表示したT. gondii tachyzoiteの模式図である。遺伝子IDのアクセッション番号を示し、遺伝子を5つのグループに分類した：黒（Trxs）；赤（PDI）；緑（Prxs）；青（Grx-GSHs）およびオレンジ（代謝系遺伝子）。詳細は、補足表1に記載されている。

細胞外過酸化水素は細胞内タキゾイトの細胞質Ca2+フラックスを誘導する
他の真核生物系では、カルシウムと酸化還元シグナル伝達の間に明確な関連性がある。例えば、リアノジン受容体上のシステインの酸化は、細胞内コンパートメントからのカルシウム放出を刺激する（Meissner, 2002; Oda et al., 2015）。T. gondiiにおけるこれら2つのシグナル伝達ネットワークの間に同様の重複が存在するかどうかを調べるために、宿主細胞内のタキゾイトにおいてH2O2がCa2+応答を引き起こす能力をテストした。Ca2+センサータンパク質jRCamP1b（Dana et al., 2016）をT2Aペプチドを介してGFPに融合し、バイシストロン型タンパク質発現を行うタイプ1パラサイト（RH株）を作製した（RH-GFP-T2A-jRCaMP1bと称する）。jRCaMP1bは、jRCaMP1aと比較してダイナミックレンジとキネティックが改善されたCa2+用の明るい赤色蛍光センサーです（Dana et al., 2016）。これら2つの異なる蛍光タンパク質の比率は、細胞の動きによる蛍光の変化をCa2+シグナルから区別するエレガントなツールを提供しました（図2および補足図1A、B）。100μMのH2O2を外因的に添加すると、細胞内Ca2+レポーターシグナルの明確な増加が観察された（図2Aおよび補足動画1-3）。H2O2の酸化的特性が寄生虫のCa2+放出の引き金になっているかどうかを調べるために、抗酸化物質であるα-トコフェロールの存在下で実験を繰り返した（図2B）。感染宿主細胞単層膜を50μMのα-トコフェロールで前処理すると、細胞内寄生虫のH2O2刺激によるCa2+放出は消失した。Ca2+イオノフォアA23187を添加すると、α-トコフェロールの存在下および非存在下の両方で、寄生虫細胞質における強烈なCa2+シグナルスパイクが生じた（それぞれ図2A、B）ことから、抗酸化物質の存在は、細胞内寄生虫におけるCa2+貯蔵に干渉しないことが示唆された。H2O2のビヒクル溶媒（水）およびA231877のビヒクル溶媒（DMSO）は、Ca2+の動員を誘発しなかった（図2および補足図1C、D、それぞれ）。

図2
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図2 H2O2による細胞内寄生虫のCa2+放出誘導とCDPK3依存性脱出のトリガー。(A) 細胞内RH-GFP-T2A-jRCaMP1b寄生虫における100μM H2O2誘導によるCa2+フラックスの代表的トレース。a〜c：広視野顕微鏡画像で、ベースライン（a：30s）、H2O2添加後のCa2+ピーク（b：270s）、1μM A23187添加後（c：460s）におけるGFPとCa2+センサーの両方の寄生虫蛍光シグナル強度変化を描写した。データは、4回の独立した実験による27個の感染液胞の代表値である。(B）感染宿主細胞を50μMのα-トコフェロールで前処理した後の100μM H2O2によるCa2+フラックスの誘導の代表的なトレース。a：30秒のベースライン、b：270秒のH2O2添加後のトレース、c：520秒のA23187によって誘発されるCa2+のピーク。データは、3つの独立した実験から得られた14個の感染液胞の代表値である。(A, B)については、黒矢印は化合物添加の時刻を示す。スケールバー： 5 μM。(C）RH-GFP-T2A-jRCaMP1b寄生体のCa2+シグナル増加の強度（ベースラインに対するパーセンテージとして表される）添加後の寄生体である： 1μMのA23187単独、100μMのH2O2前処理後の1μMのA23187、および100μMのH2O2単独。灰色の点は、測定期間中に寄生虫の退出が観察された液胞のデータポイントを示し、青色の点は退出が観察されなかった液胞を示す。(D) RH-GFP-T2A-jRCaMP1b対RH-GFP-T2A-jRCaMP1bΔCDPK3寄生体の100μM H2O2添加時の寄生体Ca2+シグナル増加強度（%）をベースラインに比べて示した。C、D）ヒストグラムは、3つの独立した実験（各実験で5つの液胞を測定）のデータの平均±SEMを示し、個々の液胞のデータポイントも示した。(E、F）RH-GFP-T2A-jRCaMP1bおよびRH-GFP-T2A-jRCaMP1bΔCDPK3それぞれにおける化合物処理後のタキゾイト放出を測定するEgressアッセイ。データは、3つの独立した実験（2つの独立した実験を有するDMSOを除く）の平均±SEMを表し、それぞれについて6つのテクニカルレプリケートがある。すべてのデータは、水コントロールに対して正規化した。有意性は、一元配置のAnova、Bonferroniの多重比較検定を用いて計算した。P値： *< 0.05; **< 0.01, ***< 0.001 and ****< 0.0001.

H2O2処理後のCa2+シグナル増加の大きさを、Ca2+依存性メカニズムによって寄生虫の脱出を誘導することが知られている小分子（Black et al., 2000）であるA23187によって誘発される増加と比較した（図2C）。H2O2は35%±1.7の全体的なCa2+シグナルの増加を誘導した。これは、寄生虫をA23187単独で処理した場合（140±4.3）、または100μM H2O2で前処理した細胞上のA23187で処理した場合（61％±0.9）に観察されたCa2+シグナル増加よりも低いものだった。この実験の制限された時間枠（10分）内で、100μMのH2O2で処理した細胞について単一の脱出イベントが観察された（図2Cおよび補足ビデオ2）。H2O2による脱出の観察は、宿主細胞が高い感染倍率（MOI = 5）で感染した場合に、より頻繁に見られた（図2および補足ビデオ3）。また、ΔCDPK3寄生虫のH2O2によって誘導されるCa2+シグナル増加の大きさを測定した（図2D）。RH-GFP-T2A-jRCaMP1bΔCDPK3におけるH2O2によって誘導されるCa2+シグナルの大きさは、RH-GFP-T2A-jRCaMP1b (32.5% ± 1.1) と比較して低かった (18.1% ± 4.3). これは、これらの系統の安静時Ca2+レベルの以前に観察された違いを反映していると考えられる（Treeck et al.、2014）。これらのデータは、PV内のタキゾイトが宿主細胞外で開始された酸化事象を感知し、反応できることを示唆している。

過酸化水素はCDPK3に依存したメカニズムで寄生虫の脱出を誘導する
カルシウムフラックスは自然な脱出に伴い（Stewartら、2017）、カルシウムイオノフォアは脱出の誘導者としてよく特徴づけられています（Endoら、1982）。寄生虫の退出を誘導するH2O2の可能性をよりよく調査するために、フローサイトメトリーによって感染宿主細胞の集団を分析した。Ca2+センサーを発現する寄生虫からのGFPシグナルと粒子サイズを用いて、感染宿主細胞と遊離したタキゾイトを区別した（図2および補足図2A）。感染宿主細胞を異なる濃度のH2O2で処理することで、遊離タキゾイトの割合が増加するかどうかを検証した。感染宿主細胞をH2O2でインキュベートすると、遊離型タキゾイトの数が用量依存的に増加した（図2E）。我々は、H2O2刺激による脱出が、このプロセスの現在の分子的理解にどのように統合されるかを理解することを目指した。小分子R59022は、ジアシルグリセロールキナーゼ（Cookeら、1987）の阻害剤であり、ホスファチジン酸の形成を阻害することによってイグレスを阻害する（Bullenら、2016年）。テストしたすべての濃度について、H2O2で細胞を処理すると、R59022の退出阻害が薬理学的に救済されました。しかし、R59022の存在下では、H2O2はベースライン値以上の脱出を刺激しなかった。これは、H2O2効果が系に食い込む場所に相対する、R59022の2つの標的：ジアシルグリセロールキナーゼ1および2（Bullen et al.、2019）の活性の離散点に関連し得る。H2O2によるegressの刺激は、ΔCDPK3寄生体において消失し（図2F）、A231287などの他のegressアゴニストと同様に、このキナーゼへの依存性を実証した。非感染HFFを異なる濃度のH2O2でインキュベートしても、この集団におけるイベントの割合は変化せず（図2および補足図2B）、このプロトコルで使用した濃度のH2O2が宿主細胞を溶解しないことが確認された。

GRX1-roGFP2センサーを発現する細胞内寄生虫は、H2O2によって誘導される酸化を感知する。
H2O2の外因性添加が細胞内T. gondii寄生虫のCa2+フラックスを刺激することを確認した後、寄生虫細胞質およびPV内の酸化還元状態について調べた。もし、カルシウム放出が酸化的なシグナルの直接的な結果であれば、細胞内寄生虫と細胞外環境を隔てる細胞区画の酸化還元状態も影響を受けるはずだと考えたのである。そこで、酸化還元センサータンパク質GRX1-roGFP2を構成的に発現するトランスジェニック寄生虫株を作製し、寄生虫の細胞質、あるいはGRA8シグナル配列とのN末端融合の結果としてPVに標的を定めた（Cary et al.） GRX1-roGFP2は、還元型（GSH）と酸化型（GSSG）の両方のグルタチオンの変化を検出するレシオメトリックな酸化還元レポーターである（Aller et al.、2013）（図3A、図B）。重要なことは、GRX1-roGFP2を支える酸化還元リレーシステムは、他の酸化還元センサータンパク質でデータ解釈を混乱させることが知られているpHの影響を受けないことです（Gutscher et al.、2008）。GRX1-roGFP2寄生体を用いて、蛍光顕微鏡でGSH/GSSGの動的変化を追跡し、正規化GSH/GSSGシグナル比を用いて酸化事象の強度を測定した（図3Cおよび補足図3A）。PVを標的とした酸化還元センサー（RH-GRA8-GRX1-roGFP2）またはサイトゾル（RH-GRX1-roGFP2）を発現する細胞内寄生体は、100μM H2O2の外来添加により酸化イベントを検出した（それぞれ図3D、E）。PV内の酸化現象は、寄生虫の細胞質内で検出された酸化現象よりも大きく、これらの区画を隔てる生体膜を通過する際に、酸化シグナルの強度が低下したことを示している。水コントロールは、GRX1-roGFP2センサーからの酸化還元シグナルに影響を与えなかった（図3および補足図3B）。

図3
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図3 外来H2O2による酸化は、PVと寄生虫の細胞質内で酸化還元変化をもたらす。(A）グルタレドキシン（GRX1）の触媒ドメインとro-GFP2を融合させた酸化還元センサーの模式図。このセンサーとGSH/GSSGとの相互作用、還元状態および酸化状態の励起および発光値が描かれている。(B, C) RH-GRX1-roGFP2寄生体の酸化イベント中のGSH/GSSGの動的変化を追跡する原理を証明する。(B) 10 mM H2O2処理後、還元状態（赤線）と酸化状態（オレンジ線）の両方の蛍光チャンネルを経時的にモニタリングするGRX1-roGFP2センサーの代表的な信号トレース。感染液胞の顕微鏡画像で、a：ベースライン（45秒）、b：酸化現象のピーク時（100秒）、c：ベースラインに戻った時（280秒）の疑似カラー（酸化はオレンジ、還元は赤）で表示。これは2つの独立した実験からの代表的なトレースであり、8つの液胞がある。スケールバー： 5 µm。(C) 10 mM H2O2添加時のベースラインと比較した酸化還元強度の変化を示すグラフ(B)の正規化シグナルの酸化/還元比を示す。 (D) 100 μM H2O2によるPV内の酸化還元変化を示すRH-GRA8-GRX1-roGFP2パラサイトの代表トレースである。PV内のセンサーの存在を強調する感染液胞の顕微鏡画像（左画像）、および感染した宿主細胞の明視野画像。(E) RH-GRX1-roGFP2寄生体の代表的なトレースで、寄生体細胞質内の酸化還元変化を100μM H2O2で誘導している様子を示している。感染した宿主細胞の明視野画像と並んで、細胞質上のセンサーの存在を強調する感染液胞（左パネル画像）を描写した顕微鏡画像。(D, E) 3つの独立した実験から得られた代表的なトレース。スケールバー： 5 µm。(F, G) RH-GRA8-GRX1-roGFP2（F）およびRH-GRX1-roGFP2（G）寄生虫の1μMイオノマイシン処理後の細胞内寄生虫における酸化還元揺らぎの代表的トレース。(F, G)赤矢印は、寄生虫が脱出する瞬間を示す。3回の独立した実験から得られた代表的な痕跡であり、各群9個の液胞がある。

H2O2がカルシウムフラックスを刺激することを確認した後、カルシウムイオノフォアが酸化的なイベントを引き起こす能力を調べることで、この関係の相互性を調査した。GRX1-roGFP2寄生体を用いて、イオノマイシンで脱出を促す前の安静時の酸化還元状態を測定した。イオノマイシンによる脱出は、PVまたは寄生虫の細胞質内の酸化還元状態の検出可能な変化を伴わなかった（それぞれ、図3F、G）。イオノフォアA23187は、酸化を測定するための蛍光チャネルにおいて、この低分子に関連する自家蛍光が飽和するため、使用できなかった（図3および補足図3C）。これらのデータから、イオノマイシンで誘導された寄生虫の脱出前に、GSH/GSSG比に大きな変化は生じないことが示唆された。

GRX1-roGFP2レドックスセンサーは無性複製中の寄生虫の体力に影響する
GRX1-roGFP2レドックスリレーセンサーを使用することで、グルタレドキシンの触媒ドメインの過剰発現が避けられないことを指摘した（roGFP2に融合された結果）。GRX1は酸化ストレスからの保護をもたらす小さな酸化還元酵素であり（Gutscherら、2008；Laporteら、2012）、この酵素の過剰発現は、GSH/GSSG比を還元型（GSH）の方に有利にシフトすると予想される。このことから、GRX1を過剰発現させたT. gondii株は、正常な酸化還元状態をより還元的な状態にシフトさせるのではないかと考えた。この酸化還元タンパク質の過剰発現が寄生虫の無性成長に影響を与えるかどうかを調べるため、GRXの重要な触媒システイン残基を変異させて酵素的に不活性化した酸化還元センサーを発現するトランスジェニック寄生虫株を作製した（GRX1ser-roGFP2）。その結果、GRX1ser-roGFP2センサーは、H2O2処理後のGSH/GSSGの変化に反応しなかった（図4および補足図4）。この株と、触媒的に活性なバージョンのセンサーを発現している寄生虫との生育を比較した。前回と同様に、GRX融合センサーの活性版と不活性版の両方を、寄生虫のサイトゾルまたはPVのいずれかに標的化した。対照群として、酸化還元感受性GFP（RH-GFP-Luc）を発現するトランスジェニック寄生虫株（Ploemen et al.、2009）を用いた。この株は、RHΔku80ΔHXGPRT寄生虫よりも優先してコントロールとして使用された。この株は、RHΔku80ΔHXGPRT寄生虫の代わりにコントロールとして使用されました。この株は、大きな非ネイティブセンサーの発現によって生じる代謝コストやフィットネスへの影響をより適切にコントロールできると考えたからです。また、コントロール株とレドックスセンサー株のライブイメージングを並行して行うことも可能である。プラークアッセイでは、RH-GFP-Luc寄生虫がRHΔku80ΔHXGPRTと同等の効率でHFFのコンフルエント単層上にプラークを形成できることを確認した（図4Aおよび補足図5）。触媒的に活性なGRX1を細胞質で発現している寄生虫は、RH-GFP-Lucと比較してプラークが少なかった（図4A）。PVを標的としたセンサー株を培養でうまく維持できたにもかかわらず、センサーがPVを標的としたすべての寄生虫株は、成長6日後に明確な測定可能なプラークを形成しなかった。HFF単層上に見える強く染色されたプラーク状の境界は、これらの寄生虫が正常に成長したことを示唆するが、寄生虫の溶菌成長は宿主細胞の単層回復に十分に勝てず、明確な溶解帯を形成していなかった（図4B）。触媒活性のあるセンサーまたは不活性なセンサーのいずれかを寄生虫の細胞質に向けると、寄生虫はRH-GFP-Lucコントロールに比べて小さなプラークを形成した（それぞれ、図4B、C）。これらのデータは、roGFP2が存在するだけで、寄生虫の成長に影響を与えるのに十分である可能性を示唆した。溶解サイクルに対する酸化還元環境の影響を直接調べるために、システインを供与してGSH生合成を増加させることで機能する小さな抗酸化分子である10μM N-アセチルシステイン（NAC）を添加してRH-GFP-Luc寄生体を増殖させた（Ezerina et al., 2018）。NACの添加は、RH-GFP-Luc寄生虫が生成したプラークのサイズを減少させ（図4C）、GSH/GSSGの不均衡が寄生虫の成長を損なうことを示唆しました。センサーの過剰発現が寄生虫の成長に与える影響をより理解するために、無性寄生虫の複製を20時間行った後、液胞あたりの寄生虫数をカウントした（図4D）。酸化還元センサーを発現するすべての株は、RH-GFP-Lucと比較して複製が減少し（図4Dおよび補足図6）、GRXドメインの触媒的不活性化によって複製欠陥の部分的な救済が得られた。最も遅い複製を示す株は、センサーをPVに向けたものであり、図4Bのプラーク成長データを裏付けるものであった。これらのデータから、寄生虫の増殖はGSH/GSSG比の変化に敏感であることが示唆された。

図4
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図4 GRX1-roGFPレドックスセンサーはT gondiiの無性複製に影響を与える。(A) RH-GFP-Luc寄生虫を参照対照群として用いた6日間のプラークアッセイから得られたプラーク数データを示す棒グラフ。(B) 形成されたプラークの代表的な画像。小さなプラークは白矢印で示されている。スケールバー：2mm。(C）細胞質内に酸化還元センサーを発現する寄生虫のプラーク面積（mm2）の分布を示すバイオリンプロットである。(D）寄生虫の細胞内複製に対するGRX1-roGFPセンサーおよびNACの効果を示すヒストグラムである。(A-D）すべて3回の独立した実験から得られたものであり、3回の技術的複製を行った。有意性は、(A, B)について一元配置Anova、Bonferroniの多重比較検定を用いて計算した。P値： P 値：**< 0.01, **< 0.001, ****< 0.0001. (D)の有意性解析は、補足図6に記載されている。

考察
活性酸素とT. gondiiの生物学に関する研究は、当初、宿主の自然免疫反応に焦点が当てられていました。宿主マクロファージは酸化バーストを生成し、微生物感染と戦うために毒性の微小環境を作り出すことができ（McLeodら、1983；Sibleyら、1985；Dupre-Crochetら、2013）、初期の研究は、酸化ストレスを回避するためにT. gondiiが用いるメカニズム（Wilsonら、1980；Shresthaら、2006；LimaおよびLodoen、2019）に興味を持っていました。しかし、複数の生物からの証拠の増加により、H2O2がシグナル伝達分子としての機能を有することが実証されており［（Veal and Day, 2011）でレビュー］、T. gondiiの病態生理におけるROSの役割がより複雑である可能性が示唆されています。活性酸素刺激による潜在的な酸化的損傷を感知し、反応し、防御するために、細胞はTrxs、PDI、Prxs、Grxs、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼなどの酸化還元関連タンパク質のネットワークを用いている。T. gondiiがこれらの要素をすべて持っていることは以前に明らかにされており（Ding et al., 2004）、我々はこれらの酸化還元関連タンパク質の数、多様性、細胞内分布について最新の情報を提供する（図1）。カタラーゼの破壊はマウスにおける寄生虫の病原性を低下させ、H2O2に対するin vitroの耐性を低下させる（Ding et al.、2004）。ペルオキシレドキシン-1はヒストンリジンメチルトランスフェラーゼと相互作用し、クロマチン再編成により遺伝子発現を制御すると考えられる（Sautel et al、 2009）、2つのチオレドキシンはアピコプラストの生合成に必須の役割を持ち（Biddau et al.、2018）、細胞質に局在する別のチオレドキシンは寄生虫の病原性に関連している（Xue et al.、2017）。しかしながら、本研究で同定された酸化還元関連タンパク質のほとんどについて、機能的な情報はまだ得られていない。

哺乳類系において低濃度のH2O2が細胞内Ca2+応答を開始する能力はよく知られており（Roveri et al., 1992; Volk et al., 1997; Avdonin et al., 2017）、H2O2をシグナル伝達分子として確固たるものにするのに貢献してきた。抗酸化物質の添加は、平滑筋細胞においてH2O2によって誘導される細胞内Ca2+放出をブロックする（Roveri et al., 1992）ことから、H2O2の酸化的性質がCa2+シグナル伝達に必要であることが示唆されています。ヒト内皮細胞では、非毒性濃度のH2O2によって誘導される酸化は、酸コンパートメントに位置するCa2+チャネルを標的とします（Avdonin et al.、2017）。これらのモデルとは異なり、本研究は、H2O2によって誘導される酸化イベントが、感染宿主細胞内のT. gondiiタキゾイトの細胞内Ca2+を動員することを初めて報告しました（図2A）。これは、どのアピコンプレックス系寄生虫でも初めて示されたことである。宿主細胞内の寄生虫を研究することで、Ca2+と酸化還元シグナルの両方を観察するために最も適した生理的条件が得られる。さらに、遺伝的にコードされた蛍光Ca2+センサーを発現する寄生虫を使用することで、蛍光Ca2+指示色素を使用する必要がなくなりました。これらの色素の使用は細胞にダメージを与える可能性があり、一般的には色素の損失やコンパートメント化を避けるために他の低分子を使用する必要がある（Di Virgilio et al., 1990）。GFPをCa2+センサーと共発現させると、Ca2+応答と寄生虫の動きを区別することができ、シトカラシンDのような寄生虫の運動阻害剤を使用する必要がなくなる（Carter、1967）。最後に、100μMのH2O2濃度は、ヒト線維芽細胞に対して無毒であることが示されている（Hyslop et al.、1995）。以上より、H2O2処理後の細胞内Ca2+放出を調べるためのプロトコルは、寄生虫内の真の酸化還元/Ca2+ダイナミクスを損なうような細胞ストレスを回避することを目指した。筋肉細胞での既報（Roveri et al., 1992）のように、抗酸化剤の存在は、H2O2によって引き起こされる寄生虫のCa2+応答を阻害した。GRX1-roGFP2酸化還元センサーを用い、100μMのH2O2の外因性添加により、細胞内寄生虫が酸化現象を直接感知することが確認された。宿主細胞には、H2O2を消去し中和することが期待される抗酸化タンパク質の広範なネットワークが存在するため、100μMのH2O2の外因性添加によってH2O2が細胞内寄生体に到達するかどうかは明らかでない。このことは、H2O2を特異的に検出するセンサーを発現するT. gondii株を用いた今後の実験において、直接的に対処できるかもしれない（Gutscher et al.、2009）。

H2O2との相互作用の直接的な結果として寄生体内でCa2+が動員されるのか、あるいは宿主からの二次酸化シグナルを介して動員されるのかにかかわらず、Ca2+は寄生体の宿主細胞侵入（Lourido and Moreno, 2015）のあらゆる側面を制御し、脱出（Garrison et al.、2012年）を含む。顕微鏡による寄生虫の追跡に使用した短時間では、H2O2によって誘導されたCa2+シグナル応答の強度はA23187と比較してかなり控えめであり、そのことがおそらく脱出イベントがまれであった理由を説明している。H2O2による長時間のインキュベーションは、CDPK3とおそらくホスファチジン酸を必要とするメカニズムによって、寄生虫の退出を誘導した。本研究で紹介したレドックスセンサーをΔCDPK3寄生体に導入することで、カルシウムとレドックスのクロストークにおける役割を直接証明することができるだろう。私たちの研究は、酸化がT. gondiiの脱出の引き金になることを示唆する最初の証拠を提供するものである。興味深いことに、酸化還元スペクトルの反対側にある還元性分子DDTもCa2+を動員して寄生虫の脱出を誘導することができる（Stommel et al., 1997）。H2O2とDDTが寄生虫を退出させるメカニズムは異なるようだが、これらのデータは、酸化還元が寄生虫の溶菌サイクルに影響を与えることを示唆している。寄生虫の生物学は、特定の環境酸化還元電位に調整されており、酸化ストレスまたは還元ストレスによって酸化還元ホメオスタシスが乱されると、表現型が変化することが予想される。

動物においてH2O2がCa2+を動員するメカニズムはよりよく理解されているが、脊椎動物とT. gondiiの間には進化的な距離があるため、直接比較することは困難である。T. gondiiは植物により近縁であり、より類似したシグナル伝達ツールキットを共有している（Nagamune and Sibley, 2006）。最近、植物が細胞表面にH2O2受容体を持ち、活性化されるとCa2+イオンチャネルを通じて細胞内にCa2+を流入させることが報告された（Wu et al.、2020）。T. gondiiもまた、CDPK1と会合してミクロネームの分泌を促進するH2O2感受性タンパク質を有しており（Child et al., 2017）、このイベントは、寄生虫の侵入を可能にするためにCa2+の動員を必要とします（Lovett et al., 2002）。

私たちの研究は、酸化と寄生虫のCa2+放出との関連を示唆しているが、私たちのデータでは、イオノフォアによるCa2+放出が寄生虫のサイトゾルまたはPVのいずれかの酸化還元状態を変化させるという証拠は見いだせなかった。GSH/GSSGに基づく酸化還元変化を追跡するGRX1-roGFP2センサーの使用により、roGFP1やroGFP2（Hanson et al., 2004）のような他の酸化還元センサーと比較して、ダイナミクスを改善し、リアルタイムで酸化還元変動を高速かつ選択的に評価する（Aller et al., 2013）ことができます。Ca2+の動員も速いイベントであることを考えると、GRX1-roGFP2は活性酸素とCa2+の関係を調べるのに適したツールである。さらに、GRX1はH2O2と直接相互作用しないことから（Gutscher et al.、2008）、このセンサーがH2O2と寄生虫やPV内の潜在的な標的との間の最終的な相互作用を妨害することはないだろう。予想外なことに、GRX1-roGFP2のT. gondii寄生虫内での発現は、無性複製に有害であった。GRX1ベースのセンサーは一般的に耐性が高く、神経細胞では無視できる毒性を示すため、これは驚くべきことです（Gutscherら、2008年；Haselら、2015年）。GRX1の触媒ドメインの不活性化は、寄生虫の成長を部分的に回復させるだけであり、roGFP2単独で寄生虫の複製に影響を与えるのに十分であることが示唆された。細胞は、細胞質および細胞小器官内にミリモル濃度のGSHを有しており、生理的条件下では、この酸化還元緩衝分子の大部分を還元型（[GSH]>[GSSG]）で維持する（Brieger et al.） GRX1を過剰発現している寄生虫は、正常なGSH/GSSGバランスに影響を与えると予想されます。GSHを生成するために使用できる低分子化合物であるNACを添加すると、寄生虫の成長も遅くなりました。このことは、GSH/GSSGの比率が寄生虫の複製に影響を与えるという仮説を支持するものである。GRX1ser-roGFP2を発現している寄生虫は、H2O2などの酸化性分子と直接相互作用する活性型GRX1と融合していないroGFP2の能力により、酸化還元電位が変化していると考えられます（Liu et al.、2014）。

酸化還元センサーをPVに設置することで、寄生虫の無性生殖に最も大きな影響を与えることができた。宿主細胞内で無性複製を行う際、T. gondiiはPVの中に存在する。この区画は、寄生虫を宿主細胞質から分離し、寄生虫の生存と複製のためのニッチを提供している（Clough and Frickel, 2017）。宿主からのシグナル分子は、寄生虫に到達するためにPVを通過する必要があります。宿主からの酸化的なシグナルが、酸化還元センサーの緩衝作用によりPV内で異常に還元的な環境に遭遇した場合、シグナルは寄生虫に到達する前に失われてしまう可能性があります。今回の研究により、T. gondiiの複雑な酸化還元システムについての理解が深まり、寄生虫の複製が酸化還元の不均衡に敏感であることを初めて証明することができました。このネットワークの解明は、将来、酸化還元に敏感な化学反応性システインを標的とした共有結合型薬剤の創製につながると期待される。

データ提供について
本研究で発表されたオリジナルの貢献は、論文/補足資料に含まれています。さらなるお問い合わせは、対応する著者にお願いします。

著者による貢献
本研究の着想/設計、EA、MC。データの取得/分析/解釈、EA、HB、LM、CD、TD、JB、CW、およびMC。原稿作成と修正、EA、HB、CD、CW、MC。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。

資金提供
この研究は、Wellcome Trust & Royal Societyからの助成金202553/Z/16/Z（MCへ）、およびBBSRCからのBB/M011178/1（HBとMCへ）の支援を受けています。

利益相反
著者らは、本研究が、潜在的な利益相反と解釈されうる商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言する。

出版社ノート
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

謝辞
広視野顕微鏡へのアクセスと支援をしてくれたJake Baum教授とGeorge Ashdown博士、RH-GFP-Luc株を提供してくれたMoritz Treeck博士、roGFP構築物を提供してくれたLilach Sheiner博士、有益な議論をしてくれたGautam Dey博士に心から感謝します。また、South KensingtonにあるImperial College Flow Cytometry Facilityチームの技術サポートに感謝したい。図1に使用したT. gondii tachyzoiteの図版を提供してくださったMai Ito氏の芸術的貢献に感謝したい。

補足資料
本論文の補足資料は、オンラインにてご覧いただけます：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2021.728425/full#supplementary-material。

補足表1｜hyperLOPITデータセットに基づく、酸化還元センシングシステムに関連するToxoplasma gondiiの遺伝子とその主要な位置の一覧。PITH, proteasome-interacting thioredoxin; ER, endoplasmic reticulum; PM, plasma membrane; GSH, glutathione; NA, not applicable (location not predicted).

補足表2｜本研究でプラスミドの作成と配列・統合の確認に使用したプライマーの一覧。

補足動画1｜細胞内のT. gondii tachyzoitesがH2O2添加によりCa2+を動員し、その後A23187により脱出が誘導される。左パネルにGFPチャンネル、中央パネルにCa2+センサーjCaMP1bチャンネル、右パネルにチャンネルマージが表示される。各チャンネルの左上領域に時間（分：秒）が表示されています。1:06に100μMのH2O2を細胞に添加し、6:51に1μMのA23187を添加した。ビデオフレームレート： 17フレーム/秒。このビデオは、4つの独立した実験から得られた27の感染液胞の代表的なものである。MOI：1。

補足動画2｜低MOIでT. gondii tachyzoitesの退出を誘導する過酸化水素。左のパネルはGFPチャンネル、中央のパネルはCa2+センサーのjCaMP1bチャンネル、右のパネルはマージを表示する。各チャンネルの左上領域には時間（分：秒）が表示されている。00:45s に100μM のH2O2 を細胞に添加した。ビデオフレームレート： 10フレーム/秒。このビデオは、低MOI（MOI=1）を使用して捕捉された脱出イベントを示している。

補足動画3｜高MOIでT. gondii tachyzoitesの排出を誘導する過酸化水素。左パネルにGFPチャンネル、中央パネルにCa2+センサーjCaMP1bチャンネル、右パネルにマージを表示しています。各チャンネルの左上領域には時間（分：秒）が表示されている。00:30s に100μM のH2O2 を細胞に添加した。ビデオフレームレート： 15フレーム/秒。このビデオは、3つの独立した実験（MOI=5）から得られた34個の感染液胞の代表的なものである。

補足図1｜宿主細胞内のRH-GFP-t2a-jRCaMP1b寄生体のCa2+シグナルとGFP移動の蛍光追跡。(A, B) H2O2およびイオノフォアA23187で処理した後の寄生虫液胞の代表的な痕跡。(A) GFPのトレース（緑）とjRCaMP1bセンサーからのCa2+シグナル（赤）を独立したグラフで示す。420秒に寄生虫が移動していることに注目。(B)寄生虫の動きによるCa2+計測のアーチファクトを最小化するために、Ca2+信号のグラフをGFPに正規化したものです。赤矢印は、寄生虫が脱出した瞬間を示す。(C) H2O2のビヒクル溶媒である水は、Ca2+を動員しない。グラフは、同じ視野から独立した3つの液胞のトレースを表示します。データは4つの独立した実験から得られた15個の感染液胞の代表値である。(D) イオノフォアA23187のビヒクル溶媒であるDMSOは、Ca2+を動員しない。グラフは、同じ視野から独立した4つの感染液胞のトレースを表示する。データは、3つの独立した実験から得られた12個のロゼットの代表値である。(A-D)黒矢印は、薬剤/溶媒添加の時間を示す。

補足図2｜フローサイトメトリーによるRH-GFP-T2A-jCamP1b寄生体の退出量の定量化。(A）Forwardスキャッター（FSC-A）に対するGFP（ブルーレーザー、488nm、フィルター530/30）を用いた代表的なゲーティング。HFFウォーターコントロール：感染していないヒト包皮線維芽細胞（HFF）は主にc区に局在している。溶解したタキゾイト：遊離RH-GFP-T2A-jCamP1b寄生体は主にa区に局在している。(B) 非感染HFFに対する薬剤インキュベーションの影響。グラフは、非蛍光HFFゲート内のイベント数の変化を示す。データは、3つの独立した実験（2つの独立した実験があるDMSO処理を除く）の平均±SEMを表し、それぞれについて6つの技術的複製がある。有意性は、一元配置アノバ、ボンフェローニの多重比較で計算した。

補足図3｜RH-GRX1-roGFP2寄生虫のH2O2に対する酸化還元感度を探る (A) 異なる濃度のH2O2によるGSH/GSSGの変化を追跡した。試験した濃度のうち、10μMは寄生虫の細胞質内の酸化還元変化を誘発しなかった唯一の濃度であった。データは、各濃度から5つの感染液胞の代表値であり、1つの独立した実験である。(B）水（H2O2のビヒクル対照）およびDMSO（A23187のビヒクル対照）は、GSH/GSSGの変化を誘発しない。データは3つの独立した実験から得られた12個の液胞の代表値である。(C) 酸化チャネルに対するA23187薬剤の自家蛍光効果により、このイオノフォアはGRX1-roGFP2センサーのレシオメトリック分析に適さない。A23187によって誘導される出口を描写する広視野顕微鏡画像。A23187の構造を示している。

補足図4｜グルタレドキシン1の触媒ドメインの不活性化により、GRX1-roGFP2酸化還元センサーはGSH/GSSHの変化に対して鈍感になる。GRX1-ser-roGFP2を発現する寄生虫は、H2O2添加時にどちらのチャネル（還元または酸化）でも蛍光変化を示さない。データは12個の感染液胞の代表値、3回の独立実験。黒矢印は、H2O2添加の時間を示す。

補足図5｜トキソプラズマ寄生虫RH-GFP-LucとRHΔku80ΔHXGPRTは、同様の効率でプラークする。6日間のプラークアッセイからのプラークカウントデータを提示する棒グラフ。提示されたデータは、3つの独立した生物学的実験から得られたものであり、それぞれ3つの技術的複製を有する。両側対のスチューデントtテストを用いて、2つの菌株の間に統計的に有意な差は見られなかった。

補足図6｜T. gondii寄生虫の成長に対するレドックスセンサーの影響。各グラフは、20時間の細胞内成長後の寄生虫/バキュール数を示す。平均値は、3つの独立した実験について各バー上に表示される。(A) 1匹の寄生虫を含む液胞の割合(%)。(B) 2匹の寄生虫を含む液胞の割合(%)。(C) 4匹の寄生虫がいる液胞の割合。(D) 8匹の寄生虫がいる液胞の割合。(E）16匹の寄生虫がいる液胞の割合。(F)32匹以上の寄生虫を持つ液胞の割合。有意性は、二元配置のAnova、Bonferroniの多重比較検定を用いて計算した。P値： *< 0.05; **< 0.01, ***< 0.001 and ****< 0.0001.

参考文献
Akerman, S. E., Muller, S. (2005). Toxoplasma Gondiiにおけるヒドロペルオキシドのペルオキシレドキシン連動型解毒作用. J. Biol. Chem. 280 (1), 564-570. doi: 10.1074/jbc.M406367200