アポリポ蛋白質Eε4マウスの脳における全身代謝とサイトカインシグネチャーの予測的関連性

2023年7月4日 16:46

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.11.480074v2.full

View ORCID ProfileRebecca M Fleeman, View ORCID ProfileAmanda M Snyder, View ORCID ProfileMadison K Kuhn, View ORCID ProfileDennis C Chan, Grace C Smith, View ORCID ProfileNicole A Crowley, Amy C Arnold, View ORCID ProfileElizabeth A Proctor
doi: https://doi.org/10.1101/2022.02.11.480074
現在Neurobiology of Agingに掲載中 doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2022.11.015
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アポリポ蛋白E（APOE）のε4変異体は、アルツハイマー病（AD）の最も一般的で強い遺伝的危険因子である。アルツハイマー病の発症機序はまだ十分に解明されていないが、炎症、代謝異常、タンパク質のミスフォールディングや凝集の促進は、アルツハイマー病の発症を促進する一因である。ここで我々は、APOE4遺伝子を持つ若齢（3ヵ月齢）および高齢（18ヵ月齢）の雌雄マウスにおいて、全身の代謝変化と脳の炎症が同時に及ぼす影響を調べた。機能的代謝アッセイと海馬のサイトカインレベルの多変量モデリングを併用することで、脳のサイトカインシグネチャーが、ADの蛋白質異常とは無関係に、全身の代謝の結果を予測することがわかった。雄マウスと雌マウスはそれぞれ、加齢とともに、また全身の代謝表現型が低下するにつれて、異なるサイトカインシグネチャーを産生し、これらのシグネチャーはAPOE遺伝子型に依存している。我々の研究は、全身代謝と脳内の特定の病的サイトカインシグネチャーとの間の定量的かつ予測的な関連を同定した最初の研究である。我々の結果は、APOE4の脳以外への影響を強調し、脳と末梢における危険因子の双方向の影響の可能性を示唆している。
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はじめに
現在、620万人以上のアメリカ人が、認知機能の低下や記憶力の低下として現れる神経変性疾患であるアルツハイマー病（AD）と共存している（Alzheimer's Association, 2021）。加齢はAD発症の最大の全体的危険因子であるが、最も強力で一般的な遺伝的危険因子はアポリポ蛋白E（APOE4）のε4変異体である(Corder et al., 1993)。APOE遺伝子にはε2、ε3、ε4の3つのアイソフォームがあり、米国集団における対立遺伝子頻度はそれぞれ7％、79％、14％である(Lanfranco et al., 2020)。APOE4保因者は、APOE3保因者に比べて、AD発症リスクが用量依存的に3～14倍上昇する(Lanfranco et al., 2020)。しかし、この伝達されるリスクの生理学的メカニズムはまだ完全には解明されていない。
ADの発症と進行を促進することに加えて、APOE4は、低比重リポタンパク質（LDL）コレステロールの増加、心血管疾患の発生率の増加、メタボリックシンドロームの促進を含む、脳と末梢の両方における炎症プロセスと転帰に関連している(Bennet et al., 2007; El-Lebedy et al., 2016; Lagging et al., 2019; Lahoz et al., 2001; Torres-Perez et al., 2016; Tsuang et al., 2013)。遺伝子変異として、APOE4は保因者が出生時から持っている危険因子であり、その影響は生涯にわたって蓄積する可能性がある(Fernandez et al., 2019)。したがって、炎症の亢進（Jofre-Monsenyら、2008；Wangら、2020）や代謝機能障害（Jagustら、2012；Wuら、2018；Zhaoら、2017）など、APOE4に関連する多くの変化は、ADの特徴的なタンパク質異常症であるアミロイドβ（Aβ）斑や神経原線維性タウのもつれが脳に形成される年齢より前に生じている可能性が高い。しかし、APOE AD研究の焦点の大半は、APOE4とAβおよびタウとの相互作用に当てられてきた。APOE4は出生時から存在し、AD発症年齢よりかなり前に免疫機能と代謝に有害な影響を及ぼすことが示されているため（Flowers and Rebeck, 2020）、長期的なAPOE4主導型の全身および脳免疫代謝作用は、Aβやタウとの相互作用とは無関係にADを誘発する環境を引き起こす可能性がある。
APOE4は、脳内の脂質（Lin et al., 2018; Vardarajan et al、 2017)、APOE4(Christensen and Pike, 2019; Jones et al., 2019; Moser and Pike, 2017)の文脈における、全身の代謝機能が脳の分子シグナル伝達ネットワークに及ぼす影響については、まだほとんど知られていない。先行研究では、全身の代謝と海馬の電気生理学的変化との関連性が同定されており(Seto et al., 1983; Tingley et al., 2021)、海馬と末梢とのコミュニケーションには、海馬から膵臓や肝臓、さらには脳の主要な代謝制御中枢である視床下部(Lathe, 2001; Tingley et al., 2021)へのシグナル伝達が関与している可能性がある。Guojun Buのグループによる最近の研究では、マウスの肝臓に発現したAPOEが認知やシナプス機能に影響を及ぼす可能性さえ同定されており(Golden and Johnson, 2022; Liu et al., 2022)、末梢のAPOEが脳に及ぼす影響の重要性を示している。APOE遺伝子型と加齢の複合的な影響下で、全身の代謝機能障害と神経炎症の相互作用によって生じる疾患促進環境を定義するためには、脳と末梢を分離した系として研究するのではなく、全身の代謝機能と神経炎症に対するAPOE4の影響の関係を一緒に同定するアプローチが必要である。
ここでは、海馬における加齢に関連したサイトカインパターンが、若年および加齢したヒト化APOE3およびAPOE4雌雄マウスの全身の代謝転帰を予測できることを明らかにする。具体的には、体脂肪率、耐糖能、インスリン感受性と相関するAPOE3マウスとAPOE4マウスにおけるサイトカインのユニークなパターンを明らかにした。雄マウスと雌マウスでは、末梢代謝機能と相関するサイトカインシグネチャーが異なっており、バイオマーカーの結果における重要な性差が強調されている。我々の結果は、APOE4が海馬におけるサイトカインレベルを変化させ、AD病態の形成を促進する環境を作り出す可能性のあるメカニズムを強調している。APOE遺伝子型に基づく末梢代謝マーカーとサイトカインシグネチャーとの間に新たに見出された相関は、将来のADバイオマーカー開発の貴重な機会を示唆している。
方法
2.1. 実験デザインと統計解析
本研究の目的は、(1)海馬における加齢に関連したサイトカインシグネチャーが、APOE3とAPOE4によってどのように異なる影響を受けるかを明らかにすること、(2)サイトカインレベルが全身の代謝結果を予測できるかどうかを明らかにすること、(3)脳内サイトカインレベルと全身の代謝の関係における遺伝子型特異的な差異を明らかにすることであった。我々は、ヒト化APOE3およびAPOE4マウスを、それぞれn=8の8つの研究グループに分けた： (1) 3ヵ月齢のAPOE3雌、(2) 3ヵ月齢のAPOE4雌、(3) 18ヵ月齢のAPOE3雌、(4) 18ヵ月齢のAPOE4雌、(5) 3ヵ月齢のAPOE3雄、(6) 3ヵ月齢のAPOE4雄、(7) 18ヵ月齢のAPOE3雄、(8) 18ヵ月齢のAPOE4雄である。このサンプルサイズは、APOE4動物対APOE3動物に関する公表された研究から推定された検出力分析(Johnson et al., 2017)に基づいて決定され、80%の検出力と0.05のアルファ値で1.2以上の効果量を観察するには8匹で十分であることを示した。
この研究のすべてのマウスは、生涯を通じて同じ動物舎で飼育された。8週齢から毎週体重を測定した。各動物について、安楽死の8日前、7日前、3日前にそれぞれ24時間食餌摂取量、インスリン感受性、耐糖能を測定した。マウスは指示された年齢で安楽死させ、海馬を解剖し、さらなる解析のために急速冷凍した。
すべてのデータは平均値±平均値の標準誤差で表した。代謝データの統計解析は、Graph Pad Prism 9（v 9.2.0）で行った。 0）を用いて、遺伝子型×年齢による2元配置分散分析（脂肪率、食物摂取量、空腹時グルコース、曲線下面積（AUC）、空腹時インスリン）、遺伝子型×時間による2元配置反復測定分散分析（グルコース負荷試験（GTT）およびインスリン負荷試験（ITT）曲線）、遺伝子型×時間による混合効果分析（体格）、または遺伝子型×年齢×時間による3元配置反復測定分散分析（GTT中のインスリン濃度）を行った。統計的有意性は、p＜0.05の誤差確率レベルを用いて決定した。適切な場合には、Tukeyの多重比較検定またはŠidákの多重比較検定を用いたANOVA分析に従った。外れ値を同定・除去するためにROUTとGrubbsの外れ値検定を行った（外れ値は見つからなかった）。脂肪率とグルコース値を比較する回帰をRで行い、ggplot2を用いて可視化した。
2.2. 動物
すべての手順は、Penn State College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee（PROTO2018800531）の承認を得た。ヘテロ接合体APOE3交配ペア（B6.Cg-Apoeem2(APOE*)Adiuj/J）は、Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USAから購入し、qPCRによりホモ接合性を確認した。ホモ接合体APOE4交配ペア（B6(SJL)-Apoetm1.1(APOE*4)Adiuj/J）もJackson Laboratoryから購入した。マウスには標準的な餌（Teklad 2018, Envigo）を与え、餌と水を自由に摂取させた。12時間明期/12時間暗期サイクルで飼育し、7:00に点灯、19:00に消灯した。8週齢から毎週体重を測定した。体重測定は毎週月曜日の14:00に開始し、毎週同じ順番で同じ秤で測定した。マウスの体重は概日リズムによって変動するため、同じ時間と間隔で体重を測定することは重要である(Kawamura, 2020; Minematsu et al., 1991)。ケージあたりの摂餌量は24時間の摂餌量を測定した。各マウスの摂餌量は、24時間の摂餌量差をマウス数で除し、各マウスの摂餌量を体重で除してg/g摂餌量とした。
2.3. インスリンおよび耐糖能試験
意識のあるマウスを用い、全身のインスリンおよびグルコース作用を評価した。各動物について、それぞれ安楽死の7日前と3日前にITTとGTTを実施した。ITTでは、マウスを4時間絶食させた後、インスリン（生理食塩水で希釈した通常のU-100インスリン0.75 U/kg、ノボリン）を腹腔内注射した。ベースライン時および注射後15、30、60、90、120分に尾静脈採血を行い、グルコメーター（Accu-Chek Performa、Roche）で血糖値を測定した。GTTでは、マウスを4時間絶食させた後、50％ブドウ糖（2g/kg、Hospira）を腹腔内注射した。ベースライン時、注射後15、30、60、90、120分後に尾静脈採血を行い、血糖値を測定した。さらに、ベースライン時、15分後、120分後にマイクロヘマトクリットキャピラリーチューブ（Fisher社製）を用いて採血を行い、血漿中インスリン濃度を測定した。グルコース濃度の概日リズム変動（Tingleyら、2021）のため、すべてのマウスは08:30に絶食を開始し、GTTおよびITTのすべての評価では12:30にプロトコルを開始した。ベースラインの空腹時グルコースに群間で差がある可能性があるため、ITTおよびGTT手順中の血中グルコースの変化をベースラインレベルに対して正規化し、曲線下面積（AUC）としてまとめた。血漿インスリンは、マウス超高感度酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）（ALPCO）を用いて、製造業者のプロトコールに従って測定した。検体は二重測定し、検出限界以下の値は検出限界値 0.115 ng/mL とした。
2.4. 体組成
Bruker Minispec LF50 定量核磁気共鳴分析装置（Billerica）を用い、安楽死の朝、意識のあるマウスの体重と体組成（体液量、脂肪量、除脂肪体重のグラム数）を、製造元のプロトコールに従って測定した。
2.5. 安楽死と組織採取
マウスは無麻酔で頸椎脱臼により安楽死させた。死亡直後に脳を摘出し、解剖用培地（11mM HEPES緩衝化ハンクス平衡塩溶液）に入れ、剃刀で半断した。左半球を4℃で10%リン酸緩衝ホルマリン（Fisher）に入れ、右半球を解剖して海馬を摘出した。海馬をRIPA緩衝液（Boston BioProducts #P8340 ）で100倍に希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル（Millipore Sigma）300uL溶液中でホモジナイズした。海馬ホモジネートを4℃で少なくとも20分間インキュベートした後、5,000 gで5分間遠心した。上清を新しいチューブに移し、液体窒素でスナップ凍結し、サイトカイン分析まで-80℃で保存した。
2.6. APOE濃度
海馬組織ホモジネート中のAPOE濃度は、APOE ELISAキット（Sigma Aldrich）を用いて、製造元の指示に従って測定した。測定範囲は1.64ng/mL～400ng/mLであるため、サンプルは過去の文献（Gee et al., 2006; Riddell et al., 2008; Sullivan et al., 2011; Ulrich et al., 2013; Wahrle et al., 2004）に従って希釈した。
2.7. 免疫組織化学
左半球を10％リン酸緩衝ホルマリンで4℃、1週間、受動的に固定した後、0.1Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（pH7.4）に移し、4℃、1～4週間、パラフィンに包埋した。その後、脳を荷電スライドに5μmの厚さで斜めにスライスし、一晩乾燥させた。スライドをキシレンで3回、100％エタノールで2回、90％エタノール、70％エタノール、ddH2Oで各1回、それぞれ5分間洗浄した。その後、スライドを0.01Mクエン酸緩衝液（pH6.0）で15分間煮沸し、PBS、3%過酸化水素、PBSでそれぞれ5分間、オービタルシェーカーで低速で洗浄した。スライドを10%正常ヤギ血清で20分間ブロックした後、PBSで洗浄した。グリア線維性タンパク質（GFAP；Invitrogen PA110019）およびイオン化カルシウム結合アダプター分子1（IBA1；Invitrogen MA527726）の一次抗体を1:1000で添加し、4℃で一晩、恒温恒湿器でインキュベートした。翌日、スライドをPBSで3回洗浄した後、2次抗体（ヤギ抗マウスAlexa Fluor 555（Invitrogen A21425）およびヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488（Invitrogen A11070））を加え、恒温恒湿器内で1時間インキュベートした。その後、マウント前にスライドをPBSで3回、95％エタノール、100％エタノール、キシレンで各2回洗浄した。スライドは、Olympus BX63蛍光顕微鏡を用いて、全画像にわたって固定スケーリングで画像化した。画像はImageJ（NIH）を用いてGFAPとIBA1の密度を解析した。海馬細胞は、盲検化された科学者がcell counts pluginを用いてカウントし、細胞密度は海馬総面積で割って算出した。
2.8. サイトカイン濃度
各サンプルの総タンパク質濃度は、Pierce™ BCA Protein Assay（Thermo Scientific）を用いて定量した。Luminex分析では、サンプルを氷上で解凍し、PBSで希釈して、ウェルあたりの最終タンパク質含量を40ugとした。これは、このマウスモデルの脳組織で測定した場合、ほとんどのサイトカインの濃度がアッセイの直線範囲に収まるのに十分であることがわかった。32種類のサイトカインのタンパク質濃度は、MILLIPLEX Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (MCYTOMAG-70K)を用いて、Luminex FLEXMAP 3Dプラットフォームで、メーカーのプロトコールに従って評価した。全てのサンプルはテクニカルトリプリケートでアッセイした。
MATLAB（バージョンR2019b）で5パラメータロジスティック回帰（Cardillo, 2021）を用いて標準曲線を作成し、サンプルのサイトカイン濃度を補間した。GitHub（https://github.com/elizabethproctor/Luminex-Data-Cleaning）からダウンロード可能な自動クリーニングパイプラインを使用して、分析用に補間されたサンプルサイトカイン濃度データを準備した。まず、ビーズ数が15以下のオブザベーションをすべて削除し、3つのテクニカルレプリケート間の一対差を計算した。いずれかのレプリカが他の2つのレプリカから、それらの2つの間の距離の2倍より大きく離れていた場合、それを外れ値（outlier）とし、それ以降の解析から除外した（測定値の2%）。サンプルウェルの3連ウェルのすべてが15個未満のビーズを記録した場合、7個以上のビーズを記録したウェルの平均を取った（測定値のわずか1%）。その後、残りのテクニカルレプリケートの平均を算出し、下流の解析に使用した。外挿の範囲外のサンプル濃度が75%以上のサイトカインは除去した（ノイズを最小化するため）。
2.9. 偏最小二乗判別分析
部分最小二乗（PLS）分析を行うために、データを平均中心化し、単位分散スケーリングした。サイトカイン濃度をXブロック（予測因子）として、遺伝子型、年齢、耐糖能、または脂肪率をYブロック（出力）として含めた。PLSはR（v.3.6.1）でropls（v.1.16.0）（Thévenot et al.、2015）を用いて実施し、ggplot2（v.3.2.1）（Villanueva and Chen、2019）を用いて可視化した。データの3分の1でクロスバリデーションを行い、我々のモデルのクロスバリデーションの予測精度を100の無作為化モデルのクロスバリデーション精度の分布と比較することでモデルの信頼度を計算した。モデルの精度」はすべてクロスバリデーションの精度を意味する。無作為化モデルは、保存されたXブロックへのクラス割り当てを無作為に並べ替えることによって構築され、これはデータ・ランドスケープを保存し、真のコントロールを提供する。
すべてのPLSモデルは、最初の潜在変数（LV1）上で直交化され、目的のグルーピングに最も相関するパラメータの分散が、LV1上に最大に投影されるようにした。各モデルについて、クロス・バリデーション誤差を最小にする潜在変数の数を選び、無作為化モデルの分布を構築するとき、この潜在変数の数を維持した。モデル全体の予測精度に対する各サイトカインの寄与を定量化するために、投影における変数重要度（VIP）スコアを算出した。ここで、mは予測変数の総数、lは潜在変数、Lはモデル中の潜在変数の数、wljは潜在変数l上の予測変数jの重み（逆負荷）、SSl(Y)は潜在変数lによって説明されるクラスYの変動である。正規化の結果として，VIP スコアの2乗の平均は1であり，したがってVIP > 1が，モデルへの平均より大きい寄与を持つパラメータの我々の基準であることに注意．
結果
3.1. APOE遺伝子型、年齢、性別は海馬のサイトカイン濃度を変化させる
APOE4は、アミロイドとタウの病態が存在するAD患者(Friedberg et al., 2020)とマウスモデル(Litvinchuk et al., 2021; Rodriguez et al., 2014; Shi et al., 2017)の脳における炎症と関連している。APOE4が、アミロイドや神経原線維蛋白質病変とは無関係に、老化の過程で脳内の炎症環境を促進するかどうかを明らかにするために、我々は、若齢（3ヵ月）と高齢（18ヵ月）のAPOE4およびAPOE3ノックインマウスの海馬におけるサイトカイン蛋白濃度を定量化した。マウスのこれらの年齢は、ヒトの20歳と60歳にほぼ等しく(Dutta and Sengupta, 2016)、分子レベルでの疾患関連変化が検出されていない若年成人期と、臨床的AD発症前の前駆期であるがADを促進する分子レベルのプロセスが始まると予想される時期の違いを研究することができる。
加齢はADの最大の危険因子であるため、我々はまず、記憶において重要な役割を果たし、ADにおいて最も早期かつ最も重篤な影響を受ける脳領域の一つである海馬において、加齢のプロセスがどのようにサイトカインレベルを変化させるのか、また、これらの加齢に伴うシグナル伝達の変化がAPOE遺伝子型によってどのように異なるのかを調べた。我々は、教師ありの機械学習ツールである部分最小二乗法（PLS）を採用した。このツールは、測定された変数の集合における相互依存的な変化を、選択した結果やグループ分けに関連して同定することを可能にする。免疫シグナル伝達は非常に複雑で、多くの相互作用経路があるため、個々のサイトカインレベルは互いに独立していない。PLSは、変数（ここではサイトカイン濃度）の線形結合を用いて、定義されたグループ（ここではAPOE遺伝子型と年齢）のメンバーであることを予測し（Geladi and Kowalski, 1986; Wold et al. これらのサイトカイン変化の「シグネチャー」は、ADリスクを促進するAPOE4誘発脳内環境を定義するための予測的、したがって潜在的なメカニズム的価値を持つ、シグナル伝達におけるより微妙な変化を同定するのに役立つ。
予想通り、各遺伝子型および性別において、サイトカインレベルに基づいて若齢マウスと高齢マウスを容易に区別することができた（図1A-1D）。これは、加齢に伴って脳内のサイトカインシグナル伝達が変化することを示している。APOE3雌性マウスにおいて、我々のモデルの予測精度（VIPスコアによる評価、Methods）に最も寄与したサイトカインは、LIX、IP-10（CXCL10）、IL-2、IL-1αのアップレギュレーションであり、IL-10とGM-CSFのダウンレギュレーションであった（図1A）。APOE4雌性マウスでは、VIPはMIGとIP-10が増加したが、MIP2、MIP-1α、IL-1β、IL-13、IFNγは減少した（図1C）。一方、APOE4雄マウスは、高齢になるとIP-10、IL-2、IL-12、INFγの産生を増加させ、MIP-1αの産生を減少させた（図1D）。すべての遺伝子型と性別で見られたIP-10の増加は、「炎症老化」という既知の現象、すなわち加齢に伴う低悪性度の全身性炎症の増加（Bharathら、2020；Franceschiら、2018）における部分的な共通分母を物語っている。
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図1.
老化したAPOE3マウスとAPOE4マウスの海馬でサイトカインレベルが上昇する。APOE3のA）雌（5 LV、精度91.67％、信頼度99.99％）とB）雄の海馬サイトカインを年齢で分離した（4 LV、精度75.89％、信頼度98.19％）の部分最小二乗判別分析（PLSDA）のスコアプロットと負荷量。C)女性（2LV、精度71.01％、信頼度96.87％）とD)男性（4LV、精度66.56％、信頼度89.82％）のAPOE4 PLSDAのスコアプロットと負荷量。3ヵ月E)女性（5LV、精度86.00%、信頼度99.97%）およびF)男性海馬サイトカインを遺伝子型別に分けたPLSDAのスコアプロットと負荷量（2LV、精度66.67%、信頼度86.29%）。PLSDAモデルA-Dでは、ピンクとティールのローディングはそれぞれ、投影スコア（VIP）＞1の負と正の変数重要度であり、ピンクのサイトカインは18ヶ月のマウスで上昇し、ティールのサイトカインは3ヶ月のマウスで上昇する。PLSDAモデルEとFでは、オレンジと青のローディングは、それぞれVIPが負と正＞1であり、オレンジのサイトカインはAPOE3マウスで上昇し、ティールのサイトカインはAPOE4マウスで上昇する。
3.2. APOE4は、若い雄マウスと雌マウスでサイトカインタンパク量に異なる変化を与える。
次に、雄マウスと雌マウスの若齢時と老齢時に、APOE遺伝子型によってサイトカインレベルがどのように影響されるかを調べた。PLSを用いると、若い雌マウスでは、APOE4遺伝子型は、海馬におけるMIP-1α、LIX（CXCL5）、IP-10のレベルが高く、MIP-1β、IL-15、IL-10、GM-CSF、エオタキシンのレベルが低いことによって最も強く規定されることがわかった（図1E）。一方、若い雄マウスでは、APOE4遺伝子型はIL-2、IL-1β、IL-1α、IL-17のアップレギュレーションによって最も強く規定され、海馬ではMIP-2、GM-CSF、エオタキシンのダウンレギュレーションが認められた（図1F）。
18ヵ月齢の雌雄の動物において、海馬のサイトカインに基づく遺伝子型の予測に対するPLSモデルは有意ではなかった（雌の予測精度54％、信頼度59％；雄の予測精度47％、信頼度6.8％）ことから、APOE3マウスとAPOE4マウスのサイトカインシグネチャーは、老齢期において明確に異なるものではないことが示された。以上より、海馬のサイトカイン分泌シグネチャーは、両遺伝子型において加齢過程で変化すること、また、若い年齢では、APOE3マウスとAPOE4マウスの雌雄はサイトカインプロファイルによって容易に区別できるが、高齢になると収束することがわかった。
3.3. APOE3マウスとAPOE4マウスは、若年期でも老年期でもグリオーシスに差はない。
MIP-1αの減少がAPOE4マウスのオスとメスで寿命を通じて観察されたので、次に、これらの遺伝子型の違いがアストロサイトとミクログリアの活性化の減少によって裏付けられているかどうかを調べた。免疫組織化学を用いて海馬のグリオーシスを測定したところ、いずれの年齢においてもミクログリアやアストロサイトの細胞数や活性化に遺伝子型間の有意差は認められなかった（図2A-H）。しかし、GFAP陽性アストロサイトの数は、APOE3マウスでは生後3ヵ月から18ヵ月の間に減少した（図2A）。これは、老化マウスで見られたサイトカインタンパク質シグネチャーの遺伝子型特異的パターンとは正反対の結果であり、サイトカインシグネチャーが脳における免疫機能と活性を研究するために必要な、さらなる詳細なレベルであることを物語っている。
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図2.
APOE遺伝子型は若齢マウスでも老齢マウスでもグリオーシスには影響を及ぼさない。E)APOE3歳3ヵ月、F)APOE4歳3ヵ月、G)APOE3歳18ヵ月、G)APOE3歳18ヵ月における、GFAP（アストロサイト）とIBA1（ミクログリア）によるグリオーシスを示す免疫組織化学染色の代表的定量化（A-D）。海馬脳スライスにおけるAPOE3 18ヵ月、およびAPOE4 18ヵ月。スケールバー、200μm。細胞数の主効果 A）： Page=0.005、Pgenotype=0.788、交互作用P=0.331)、B)Page=0.049、Pgenotype=0.956、交互作用P=0.182)。蛍光強度の主効果 C) Page = 0.211, Pgenotype = 0.516, 交互作用 P = 0.714)、D) Page = 0.477, Pgenotype = 0.443, 交互作用 P = 0.884)。データは平均+/-SEMであり、有意な場合はTukeyの検定による2-way-ANOVAで解析した。グラフ上のP値はすべてpost-hoc解析によるものである。開いている丸は雄、閉じている丸は雌である。
3.4. 雌性APOE4マウスは、APOE3マウスに比べて加齢に伴う体重増加と脂肪増加が少ない。
これまでの研究では、全身の代謝と海馬の変化が関連づけられている（Seto et al., 1983; Tingley et al. したがって、APOE4による全身の代謝変化を測定し、これらの変化を脳と関連づけるために、まずマウスの体重を毎週測定し、3ヵ月齢と18ヵ月齢の体組成を測定した。APOE3およびAPOE4マウスは、寿命を通じて安定した割合で体重が増加した（図3Aおよび3B）。個々の時点における遺伝子型間の体重の有意差は観察されなかったが、混合効果モデルでは、雌マウスでは経時的に体重増加が統計的に有意に減衰することが証明され、APOE4雌マウスは約50週齢からAPOE3雌マウスに比べて体重増加率が減少した（図3A）。
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図3.
APOE4マウスは、APOE3マウスのメスマウスと比較して、加齢に伴う脂肪率の増加が少ないが、オスマウスはそうではない。A)雌（固定効果：Ptime<0.001；Pgenotype=0.496；交互作用P=0.001）およびB)雄（固定効果：Ptime<0.001；Pgenotype=0.311；交互作用P=0.330）における8週齢から77週齢までの18ヵ月齢マウスの1週間の体重。個々の時点では、APOE3とAPOE4で雌雄マウスに有意差は認められなかった。C）メス（主効果：Page < 0.001、Pgenotype = 0.014、交互作用P = 0.028）またはD）オス（主効果：Page < 0.001、Pgenotype = 0.562、交互作用P = 0.133）マウスの体脂肪率（adiposity）をqNMRで測定した。E)雌（主効果：Page < 0.001、Pgenotype = 0.012、交互作用P = 0.081）またはF)雄（主効果：Page < 0.001、Pgenotype = 0.587、交互作用P = 0.572）マウスの除脂肪体重率をqNMRで測定した。G)雌（主効果：Page < 0.001、Pgenotype = 0.217、交互作用P = 0.049）またはH)雄（主効果：Page < 0.001、Pgenotype = 0.207、交互作用P = 0.006）マウスの食物摂取量、体重1gあたりで正規化。データは平均+/-SEMであり、(AおよびB)混合効果モデル(REML)およびŠidákの多重比較検定、(C-H)2-way-ANOVAおよびTukeyの検定によって分析した。グラフ上のP値はすべてpost-hoc解析を反映している。
加齢に伴う体重増加の生理学的分布を理解するために、qNMRを用いて各マウスの除脂肪体重、脂肪体重、体液量を定量化した。その結果、APOE3マウスとAPOE4マウスは、若齢ではほぼ同じ体組成であったが、老化したAPOE4雌性マウスは、APOE3雌性マウスに比べて体脂肪量が有意に低く（約40％低い）（図3C）、除脂肪体重は14％増加していた（図3E）。APOE4雌性マウスにおける体重増加の抑制と体脂肪の低下は、摂餌量の減少の結果ではなかった。各ケージでマウスが消費した食物の粗重量を、体重1gあたりの消費グラム数として定量化した（図3G）ところ、両遺伝子型の老化マウスは、若いマウスに比べて体重1gあたりの食物消費量が少なかったが（老化における食物消費に関する先行研究（Morley, 2001; Pilgrim et al、 2015））、APOE3雌性マウスとAPOE4雌性マウスでは、いずれの年齢においても食物消費量に有意差は認められなかった。雄マウスでは、体重、脂肪率、除脂肪体重の点でAPOE3およびAPOE4対応マウスの間に差は存在しなかったが（図3Dおよび3F）、APOE4雄はAPOE3対応マウスよりも体重1gあたりの摂餌量がわずかに少なかった（18％）（図3H）。
3.5. APOE4は、雌性マウスにおける加齢に関連した耐糖能の低下を予防する
APOE3雌性マウスとAPOE4雌性マウスの間で観察された、加齢に関連した体重および脂肪増加における差は、餌の消費量が同程度であるにもかかわらず、これらの動物が餌を代謝する方法に違いがあることを示唆している。この動物に与えられた餌は脂肪が非常に少なく、炭水化物が主体であることから（脂肪17％、炭水化物60％、タンパク質23％）、グルコース代謝の全身的な変化がそのメカニズムとして考えられる（Martínez-Martínezら、2020）。空腹時血糖は、食べ物がない状態で身体がどれだけグルコースのホメオスタシスを維持しているかを示す指標であり、グルコース、インスリン、グルカゴンのレベルを調節する能力を示す。両遺伝子型の3ヵ月齢と18ヵ月齢の動物で空腹時血糖値を測定したところ、いずれの年齢でも雌の遺伝子型間に有意差は認められず、またいずれの遺伝子型でも加齢に伴う空腹時血糖値の変化は見られなかった（図4A）。また、雄マウスの空腹時血糖値には、若齢でも老齢でも遺伝子型による差は観察されなかった。しかし、APOE4雄マウスでは、3ヵ月齢のマウスに比べて18ヵ月齢のマウスの空腹時血糖値が上昇していた（図4B）。
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図4.
APOE4は、雄マウスではなく雌マウスにおいて、グルコース刺激によるインスリン分泌とは無関係に、加齢に関連した耐糖能の低下から保護する。APOE3およびAPOE4マウス（A）雌（主効果：Page = 0.212、Pgenotype = 0.309、交互作用P = 0.845）およびB）雄（主効果：Page = 0.046、Pgenotype = 0.910、交互作用P = 0.076）の3ヵ月および18ヵ月の空腹時グルコース値。3ヵ月齢のAPOE3およびAPOE4マウス（C）雌（Pgenotype = 0.012）およびD）雄（Pgenotype = 0.296）の糖負荷試験（GTT）。18ヵ月齢のAPOE3およびAPOE4 E)雌（Pgenotype = 0.096）およびF)雄（Pgenotype = 0.093）マウスのGTT。G)雌（Pgenotype = 0.465、Page = 0.014、交互作用P = 0.017）およびH)雄（Pgenotype = 0.086、Page = 0.328、交互作用P = 0.460）マウスの年齢と遺伝子型によるGTT AUCの比較。データは平均値＋/-SEMで、（A、B、G、H）2元配置ANOVA、必要に応じてTukeyの検定、（C-F）2元配置反復測定ANOVA、有意な場合はŠidákの多重比較検定で解析した。グラフ上のP値はすべてpost-hoc解析によるものである。
空腹時グルコースはAPOE4動物とAPOE3動物の間で変化しなかったが、食物消費量が同程度であるにもかかわらず体重増加と脂肪率に差があるのは、グルコース代謝能力の低下が原因である可能性がある。グルコース負荷試験（GTT）は、グルコースを注射して体内の内因性インスリン機能を測定するもので、GTTの曲線下面積（AUC）値が高い場合には耐糖能異常が示唆される。生後3ヶ月のAPOE4雌性マウスは、APOE3雌性マウスに比べて15分間のピーク血糖値が有意に高かったが、GTTのAUC全体では有意な差は認められず、耐糖能が同程度であることが示された（図4Cおよび4G）。対照的に、老化したAPOE3雌性マウスは、大きなグルコース負荷に対する処理能力が有意に低下した。一方、APOE4雌性マウスは、GTT AUC全体で測定すると、このような老化に関連した耐糖能の低下から保護されていた（図4Eおよび4G）。一方、APOE4雄性マウスは、若齢でも老齢でもAPOE3雄性マウスと異なるGTT反応を示さなかった（図4D、4F、4H）。
3.6. インスリン感受性は、18ヵ月齢の雄マウスでは低下するが、雌マウスでは低下しない。
APOE4雌性マウスでは、APOE3マウスでみられた加齢に伴う耐糖能の低下がみられなかったので、次に、内因性のインスリン作用がこの違いを説明できるかどうかを検討した。APOE3マウスとAPOE4マウスのインスリン感受性を測定するために、インスリン負荷試験（ITT）を用いて、測定したインスリンボーラスに対するグルコース取り込みを定量した。インスリン感受性は、APOE3マウスとAPOE4雌性マウスのいずれの年齢群においても（図5Aおよび5B）、またいずれの遺伝子型の若齢マウスと高齢マウスの間でも有意差はなかった（図5C）。
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図5.
加齢はAPOE4雄性マウスのインスリン濃度を上昇させるが、雌性マウスのインスリン濃度は上昇させない。3ヵ月齢のAPOE3およびAPOE4 A）雌（Pgenotype = 0.389）およびD）雄（Pgenotype = 0.091）マウスのインスリン負荷試験（ITT）。18ヵ月齢のAPOE3およびAPOE4 B)雌（Pgenotype = 0.739）およびE)雄（Pgenotype = 0.770）マウスのITT。C）雌性（Page = 0.286、Pgenotype = 0.582、交互作用P = 0.346）およびF）雄性（Page = < 0.001、Pgenotype = 0.339、交互作用P = 0.203）マウスの3ヵ月および18ヵ月におけるAPOE3およびAPOE4 ITTの曲線下面積（AUC）解析。G）雌（Page = 0.002、Pgenotype = 0.099、交互作用P = 0.367）およびH）雄（Page = 0.002、Pgenotype = 0.198、交互作用P = 0.229）マウスの空腹時インスリン濃度。I)雌（Page < 0.001、Pgenotype = 0.659、Ptime = 0.477、Ptime x age = 0.124、Ptime x genotype = 0.012、Pgenotype x age = 0.676、Pgenotype x age = 0.676、Pgenotype x age = 0.229）のグルコース注射後0分、15分、120分のインスリン濃度。 676, Pgenotype x age x time = 0.593）およびJ）雄（Page = 0.002, Pgenotype = 0.110, Ptime = 0.527, Ptime x age = 0.002, Ptime x genotype = 0.747, Pgenotype x age = 0.180, Pgenotype x age x time = 0.818）マウス。データは平均+/-SEMであり、(A, B, D, E)2元配置反復測定ANOVA、(C, F, G, H)2元配置ANOVA、有意な場合はTukeyの検定により解析した。IとJは3ウェイREMLで解析し、各時間／グループにつきn = 5-8とした。図中のP値はすべてpost-hoc解析によるものである。
次に、老化したAPOE3雌マウスにおいて、内因性インスリン産生の不足が耐糖能低下の原因であるかどうかを明らかにしようとした。我々は、空腹時のベースラインと、グルコース注射後15分と120分の血漿インスリン濃度を測定した。その結果、いずれの年齢においてもAPOE3雌マウスとAPOE4雌マウスの空腹時インスリン濃度に差は認められなかったが、APOE3雌マウスでは18ヵ月齢の3ヵ月齢の雌マウスに比べて増加していた（図5G）。APOE3高齢女性におけるこれらの高い空腹時インスリンレベルは、加齢が空腹時インスリンレベルを増加させるヒトにおける同様の現象を反映している（Johnson et al.）
内因性インスリンが血糖値の急上昇に反応して適切に分泌されるかどうかを明らかにするために、ブドウ糖注射後15分と120分の時点でのインスリンレベルを測定した。インスリン応答が適切に働いていれば、インスリン濃度はグルコースを細胞内に取り込むために急上昇し、120分後にはベースライン濃度まで減少するはずである。雌マウスの年齢と遺伝子型にかかわらず、GTTを経てもインスリン分泌量は変化しなかった（図5I）。このようなインスリンの経時的変化は、グルコースに反応してインスリン濃度が急上昇し、0-15分の間にベースラインに戻るため、我々の時点では観察されなかったと考えられる。
全体として、これらの結果は、雌性APOE4マウスとAPOE3マウスは、加齢中も正常なベースラインのグルコースレベル、インスリン感受性、インスリン分泌を維持しているが、APOE4雌性マウスは、加齢中に耐糖能においてAPOE3と乖離することを示唆している。したがって、加齢は、インスリン感受性やグルコース刺激によるインスリン分泌とは独立した機序によって、APOE3雌性マウスでは耐糖能を損なうが、APOE4雌性マウスではそうではない。
雄マウスでは、ITT AUCはいずれの年齢においてもAPOE遺伝子型間で差はなかったが、APOE3マウスとAPOE4マウスのいずれにおいても3ヶ月齢から18ヶ月齢の間に大きく減少した。雌と同様に、雄でもいずれの年齢においても空腹時インスリンに遺伝子型の差は見られなかった。その代わりに、APOE4の空腹時インスリン値は年齢とともに増加し、APOE3の空腹時インスリン値には年齢による変化は認められなかった（図5H）。女性では加齢に伴い空腹時インスリン値が平均して2倍になったのに対し、男性では3倍になった。雄の加齢に伴う空腹時インスリン値の増加も、特にAPOE4動物では変動幅が大きかった。また、雌マウスと同様に、雄マウスでは年齢や遺伝子型にかかわらず、GTTを経てもインスリン分泌量は変化しなかった（図5J）ことから、グルコースに対するインスリン応答は測定時点間で急上昇する可能性が高いことが示された。
これらの結果は、雌性マウスとは異なり、雄性APOE3マウスとAPOE4マウスは若齢でも老齢でも同様であるが、加齢はインスリン分泌と感受性に大きな有意な影響を及ぼすことを示唆している。加齢は雄性マウスのインスリン産生とインスリン使用に影響を及ぼすが、これらの代謝パラメーターはAPOE遺伝子型には影響されないことを示している。
3.7. 海馬のサイトカインレベルは、APOE3マウスとAPOE4マウスの脂肪率を予測する。
AD領域に残されたギャップは、APOEに関連した全身的影響が脳にどのように影響するか（そしてその逆も同様）である。全身の代謝と海馬のサイトカインタンパク質の発現パターンとの関係の潜在的なメカニズムを調べるために、我々はPLS回帰（PLSR）を行った。PLS回帰は、動物を離散的なカテゴリー（すなわち、遺伝子型や年齢群）に基づいて分離する代わりに、潜在変数が連続的な数値（例えば、脂肪率、GTT AUC、ITT AUC）を持つ測定値を予測することを除いて、我々が以前に行ったPLS解析と同様である。我々の目的は、特定のサイトカインシグネチャーが特定の全身代謝転帰と予測的に関連するかどうかを明らかにすることであり、そうすることで脳内サイトカイン発現と全身代謝の関係における遺伝子型特異的な差異を明らかにすることであった。
まず、海馬におけるサイトカインシグナル伝達のどのような変化が体脂肪率と相関するかを調べるために、APOE遺伝子型をそれぞれ別々に検討した。クロスバリデーションにより、全年齢のマウスの体脂肪率を実測値の5-7％以内で予測できる海馬サイトカインシグネチャーを構築した（図6A-6D）。この予測精度は非常に統計学的に有意であり、すべてのケースでランダムな偶然と比較してモデルの信頼度が99%以上となり、各遺伝子型の雌雄マウスにおいて海馬サイトカインレベルに基づいて全身の代謝転帰を確実に予測できることが示された。
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図6.
海馬サイトカインシグナル伝達は加齢雌雄マウスの脂肪率を予測する。APOE3 A)雌（4LV, RMSECV 6.66、信頼度99.98%）およびB)雄の海馬サイトカインを脂肪率で分離（1LV, RMSECV 5.31、信頼度100%）のPLS回帰（PLSR）のスコアプロットと負荷量。APOE4 C)女性(5 LV, RMSECV 4.63、信頼度99.96%)とD)男性海馬サイトカインのPLSRのスコアプロットとローディング、脂肪率で分離(1 LV, RMSECV 6.79、信頼度99.99%)。紫色と黄色のローディングは、それぞれ投影における負の変数と正の変数重要度（VIPs）＞1である。
APOE3雌性マウスでは、脂肪率が増加するにつれて、MIP-2、MIP-1α、IL-6、IL-1β、IL-13、IL-10、INFγのレベルが低下し、IP-10（CXCL10）の産生が増加することがわかった（図6A）。逆に、APOE4女性では、脂肪率の増加とともに、MIP-2、MIP-1α、IL-1β、IL-13はすべて減少し、IP-10、IL-15、エオタキシンは増加した（図6C）。APOE3雌性マウスとAPOE4雌性マウスは、MIP-2、MIP-1α、IL-1β、IL-13が減少する一方で、IP-10が脂肪率の増加とともに増加するという類似した徴候を示した。APOE3とAPOE4雌マウスの主な違いは、APOE4雌マウスは脂肪率が高くなるとIL-15とエオタキシンをより多く分泌する一方、APOE3雌マウスは脂肪率が高くなるといくつかのサイトカインを減少させることである。これらの結果は、海馬のサイトカインレベルと体脂肪率との関係が、APOE4雌性マウスとAPOE3雌性マウスとで根本的に変化していることを示している。APOE4雌性マウスでは、脂肪率が増加するにつれて免疫活性化が強くなり、炎症性サイトカインであるIL-15とエオタキシンのレベルが上昇することが明らかになっている。
APOE3雄性マウスは脂肪率が増加すると、MIP-2とエオタキシンのレベルが低下し、IP-10、IL-2、IL-1α、IL-17の産生が増加する（図6B）。逆に、APOE4男性では、MIP-1α、IL-1α、IL-1β、IL-13は減少し、IL-12とINFγは脂肪率の増加とともに増加した（図6D）。女性とは対照的に、APOE3およびAPOE4遺伝子型の男性では、脂肪率と海馬のサイトカインタンパク質の発現を関連づけた場合、サイトカインプロファイルには共通点がなかった。これらのオスの特徴は、末梢脂肪率と海馬サイトカインレベルの関係がAPOE遺伝子型によって変化し、APOE4オスマウスはAPOE3オスマウスとは異なるサイトカインを活性化するという結論を支持している。
3.8. 海馬サイトカインレベルは、APOE3マウスとAPOE4マウスの耐糖能を予測する。
メスの耐糖能に有意な遺伝子型差が観察され、脂肪率と海馬のサイトカインシグナル伝達との間に異なる遺伝子型依存的な予測関係が観察されたので、次に、脳内のサイトカインレベルが全身の耐糖能を予測できるかどうかを調べるために、若齢および老齢のAPOE3およびAPOE4雌雄マウスのGTT AUC測定値に対して海馬のサイトカインレベルを回帰するPLS解析を行った。
脂肪率と同様に、我々の4つのモデルはそれぞれ高い予測精度とモデルの信頼性（ここではすべて99％以上）を示した。その結果、APOE4雌性マウスでは、耐糖能が低下（GTT AUCが上昇）するにつれて、いくつかの測定サイトカインの海馬レベルが低下し、MIG、LIX、IP-10（CXCL10）、IL-17、IL-12の低下が耐糖能を最も予測することがわかった（図7C）。APOE3雌性マウスでは、IL-10産生は耐糖能の低下とともに減少したが、MIP-2、LIX、IP-10、IL-2、IL-1α、IL-12は増加した（図7A）。APOE4マウスとAPOE3マウスにおける相反する効果、特にLIX、IL-12、およびIP-10シグナル伝達において顕著であったことから、APOE3雌性マウスでは、耐糖能の低下に伴い、正統的な炎症性サイトカインのアップレギュレーションが起こるが、APOE4雌性マウスでは、サイトカイン分泌反応は弱まることが示唆される。
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図7.
海馬のサイトカインシグナル伝達は加齢雌雄マウスの耐糖能を予測する。APOE3 A)雌（2LV、RMSECV 9,672.463、信頼度99.99％）とB)雄の海馬サイトカインのPLSRのスコアプロットと負荷量、耐糖能（GTT AUC）で分離（1LV、RMSECV 6,755.54、信頼度100％）。APOE4 C)女性（1 LV, RMSECV 9,273.22、信頼度99.85%）とD)男性海馬サイトカインのPLSRのスコアプロットと負荷量（1 LV, RMSECV 6,592.83、信頼度100%）。紫色と黄色の負荷は、それぞれ投影における負の変数と正の変数重要度（VIPs）＞1である。
APOE4男性では、耐糖能が低下すると海馬のMIP-1βとIL-10の放出が増加し、MIP-1α、IP-10、IL-2、IL-1β、IL-1α、IL-13は減少した（図7D）。一方、APOE3雄性マウスは、耐糖能の低下とともにMIP-1α、IL-2、IL-1α、IFNγを上昇させ、IL-10とエオタキシンを低下させた（図7B）。雌性マウスと同様に、雄性マウスも、特にIL-10、MIP-1α、IL-2、IL-1αシグナル伝達において、相反するAPOE遺伝子型の違いを示した。さらに、オスのシグネチャーはメスとは異なり、性差とAPOE遺伝子型が炎症を規定するパラメーターであることをさらに強調している。
3.9. 海馬のサイトカインレベルは、APOE3マウスとAPOE4マウスのインスリン感受性を予測する。
雄マウスにおいて、加齢に伴うインスリン感受性とインスリン産生における有意な遺伝子型の違いが観察されたので、次に、海馬サイトカインレベルがインスリン感受性を予測できるかどうかを検討した。PLSRを用いて、海馬のサイトカイン濃度を、APOE3およびAPOE4マウスの雌雄の若齢および老齢マウスのITT AUC値に対して回帰したところ、やはり遺伝子型間および雌雄間で大きな差異が認められた。APOE3雌性マウスは、インスリン感受性が低下するにつれて、LIXとIL-12を減少させ、MIP-1α、MIG、IL-6、IL-17、IL-13を増加させた（図8A）。逆に、APOE4雌性マウスは、インスリン感受性が低下するにつれてIL-10が減少し、MIP-1α、IL-1α、IL-13、IFNγが増加する（図8C）。雄マウスでは、APOE3キャリアは、インスリン感受性が低下するにつれて、エオタキシンを減少させ、IP-10、IL-2、IL-1α、IL-17、IL-15、IL-12を増加させた（図8B）。APOE4男性では、インスリン感受性が低下するにつれて、MIP-2、IL-6、IL-17、IL-12、IFNγ、GM-CSF、およびエオタキシンという海馬のサイトカインの最大範囲のレベルが上昇し、いずれも低下した（図8D）。全体として、これらの結果は、インスリン感受性が低下するにつれて海馬でのサイトカイン分泌が増加すること、およびサイトカイン発現の特異的パターンが性別とAPOE遺伝子型によって規定されることを示唆している。
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図8.
海馬のサイトカインシグナル伝達は加齢雌雄マウスのインスリン感受性を予測する。A）雌性（2LV、RMSECV 3,774.48、信頼度99.98％）とB）雄性（1LV、RMSECV 2,772.86、信頼度100％）の海馬サイトカインをインスリン耐性（ITT AUC）で分離したAPOE3 A）雌性（2LV、RMSECV 3,774.48、信頼度99.98％）のPLSRのスコアプロットと負荷量。APOE4 C)女性（1 LV, RMSECV 2,530.54、信頼度99.97％）とD)男性海馬サイトカインのPLSRのスコアプロットとローディングをITT AUCで分離（1 LV, RMSECV 3,491.79、信頼度99.97％）。紫色と黄色のローディングは、それぞれ投影における負の変数と正の変数重要度（VIPs）＞1である。
3.10. 海馬濃度ではなくAPOE遺伝子型が雌雄マウスの代謝パラメータに影響する
測定した代謝パラメーターにどのような因子が影響しているかをより理解するために、いくつかの回帰分析を行った。雌雄ともに、APOE3またはAPOE4キャリアでは、グルコースと脂肪率は相関していなかった（図9Aおよび9B）。このことは、APOE3およびAPOE4マウスでは、空腹時グルコース値と脂肪率が末梢代謝の2つの独立した変数であることを示唆している。
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図9.
海馬におけるAPOE濃度は代謝パラメータと相関しない。A）APOE3マウスとAPOE4マウスにおける脂肪率と空腹時グルコースの雌雄線形回帰。C）雌性APOE3マウスとD）雄性APOE4マウスにおけるAPOE濃度。雌雄混合、若齢/高齢の海馬APOE濃度とE) GTT AUC、F) ITT AUC、G) 脂肪率との回帰。CとD）のデータは平均値＋/-SEMであり、有意な場合はTukeyの検定による2-way-ANOVAで解析した。(A、B、E、F、G)のデータはRでプロットし、回帰直線とR2値はlm関数で計算した。
APOE3マウスとAPOE4マウスで代謝の結果が異なる理由をさらに明らかにするために、次にAPOE3マウスとAPOE4マウスのオスとメスの海馬におけるAPOEの濃度を測定した。その結果、雌雄ともに遺伝子型の年齢による差は認められなかった（図9C、8D）。次に、APOE濃度が、測定した末梢代謝パラメータと相関するかどうかを計算したところ、APOE濃度は、耐糖能、インスリン感受性、脂肪率と相関しなかった（図9E-9G）。
考察
APOE4は、ADの最も強力かつ最も一般的な遺伝的危険因子であるが、AD蛋白病態との相互作用以外の疾患環境を促進するAPOE4の影響については、まだ十分に理解されていない。APOE4は全身の代謝を阻害することが知られており(Martínez-Martínez et al., 2020; Torres-Perez et al., 2016)、一方、全身の代謝障害はADのリスクを増加させることが知られている(Martínez-Martínez et al., 2020; Razay et al、 Castellanoら, 2011; Huynhら, 2017; Litvinchukら, 2021; Liuら, 2017; Shiら, 2017）にもかかわらず、これら3つの変数は別々に調査・分析され続けている。APOEが全身の代謝と脳の免疫シグナル伝達に及ぼす影響は相互に依存しているため、脳と全身の病態を別々に研究することは不利である。この関係を無視することは、APOE4が関与する病態に対する治療的介入や予防的介入を行うための重要な道を閉ざすことになる。脳内サイトカイン・プロファイルの変化と共変化するAPOE4関連の全身代謝変化を同定するために、我々は、若年および老齢のヒト化APOE4およびAPOE3ノックインマウスにおいて、全身代謝の機能的測定値と海馬のサイトカイン・シグナル伝達経路の幅広いサンプルとの関係を定量化した。重要なことは、この研究が、脳内にタウやアミロイドβの病態が存在しない状態で行われたことであり、APOE4が、蛋白病発症に先立ち、またそれとは無関係に、疾患を促進する環境を作り出していることの重要性を強調している。我々は、APOE3マウスとAPOE4マウスの末梢代謝と脳内サイトカインレベルが異なること、末梢代謝と脳内免疫系の関係がAPOE遺伝子型と性別によって明確に異なることを示した。
APOEは脂質トランスポーターとしての機能で最もよく知られているが、脂質代謝とグルコース代謝の両方に影響を与えている。脳では、APOE4はインスリンシグナル伝達とグルコース代謝を低下させる(Ong et al., 2014; Perkins et al., 2016)。末梢においては、APOE4は耐糖能を低下させるか、インスリン抵抗性を増加させるか、あるいは影響を及ぼさないことが示されており、ヒトにおけるエビデンスはまちまちである(Martínez-Martínez et al., 2020)。APOE自体は血液脳関門を通過することができないが、APOE遺伝子型による全身的な代謝の変化は、血液脳関門を通過する能力を持つ他の多くの免疫・代謝変化分子のレベルを制御しており、その結果、脳に重大な影響を及ぼす可能性がある。我々は、海馬におけるサイトカインレベルが、脂肪率、耐糖能、インスリン感受性を高い精度で予測できることを発見した。新しい研究では、末梢肝臓で発現しているAPOE4が、マウスの脳における認知能力の低下やシナプス可塑性と関連していることが明らかになった(Golden and Johnson, 2022; Liu et al., 2022)。これまでの研究では、全身の代謝と海馬との関連も同定されており、海馬の電気生理学的パルス（鋭い波紋）が末梢のグルコース濃度を調節している(Tingley et al., 2021)。海馬と全身の代謝の間のコミュニケーションには、海馬から膵臓や肝臓への自律神経シグナル伝達、あるいは海馬から脳の主要な代謝制御中枢である視床下部へのシグナル伝達が関与している可能性がある(Tingley et al., 2021)。さらに、海馬の電気刺激は、全身のグルコースとインスリンレベルを調節することが示されている(Lathe, 2001; Seto et al., 1983)。海馬機能のこれらの側面から、海馬のサイトカインシグネチャーと全身の代謝との間に見いだされた関連は、一方向的なものなのか、双方向的なものなのかという疑問が生じた。グルコース代謝を制御する役割として提唱されている海馬の免疫シグナル伝達の変化が、APOE変異体特異的な脂肪率と耐糖能の違いの刺激となる可能性がある。あるいは、脂肪率、耐糖能、インスリン感受性における末梢の変化は、血液脳関門を通過できる因子のアップレギュレーションを通じて、あるいは血管の完全性に影響を与え、末梢の免疫細胞やシグナル伝達分子の浸潤を可能にすることを通じて、海馬のサイトカインレベルに影響を与えるかもしれない。最後に、そしておそらく最も可能性が高いと思われるのは、方向性の両側面を示す証拠があることから、これらのシナリオの両方が同時に起こっている可能性である。今回観察された性差のメカニズムや、これらの共変化経路間の情報伝達の方法や方向性を明らかにするためには、今後の実験が必要である。
ヒトのAPOE4キャリアは、メタボリックシンドロームのリスクが高いことが知られており、そのリスクは体脂肪率と関連している(Torres-Perez et al., 2016)。しかし、低脂肪食を与えた場合、APOE4雌性マウスはAPOE3マウスよりも加齢に伴う体重および脂肪の増加が少ないことがわかった。したがって、既存の肥満がない場合、APOE4雌性マウスは、APOE3マウスとは対照的に、加齢に関連した耐糖能とインスリン感受性の障害から保護されている。実際、これまでの研究で、APOE4は、高脂肪食のシナリオであっても、ヒトやマウスにおいてAPOE3と比較して体重増加に対する保護効果を有することが示されている(Arbones-Mainarら、2016, 2008; Segevら、2016; Tejedorら、2014)。これらの保護効果にもかかわらず、APOE4キャリアではAD発症率が有意に高いことから、APOE4によってもたらされるADリスクは、メタボリックシンドロームによるリスクとは別のメカニズムであることが示唆される。
重要なことは、我々の知見は、サイトカイン・プロファイルを高度に連結したネットワークとして考慮することの重要性を強調していることである。このような多変量解析的アプローチがなければ、脳の免疫状態の変化に関する意味のあるシグネチャーを同定することも、これらのシグネチャーと全身の代謝との定量的関係を明らかにすることもできなかったであろう。我々が発見した特定のAPOE4サイトカインシグネチャーと、それらに対応する全身代謝の変化は、APOE4がアミロイドβ（Liu et al. オスとメスのAPOE4動物は、寿命を通じてMIP-1αの有意でモデル定義となる減少を示した。MIP-1αは、脳のマクロファージ細胞であるミクログリアを引き寄せるために細胞から分泌されるケモカインであり、ミクログリアはプラークや損傷したシナプスを除去し、ニューロンの健康を保護・維持する。APOE3動物では観察されなかったが、MIP-1αの著しい減少は、ミクログリアのリクルート不足による脳からの疾患傷害の除去能力の低下を示唆している可能性があり、その結果、神経細胞の回復力が失われる可能性がある。女性では、APOE4マウスとAPOE3マウスの海馬で観察された対照的なサイトカインシグネチャーは、海馬から視床下部へのシグナル伝達を変化させ、APOE3マウスで観察された加齢に関連した体重増加、脂肪率の増加、耐糖能の低下、およびベースラインのインスリン分泌の増加を改善する可能性がある。脳におけるこれまでのトランスクリプトーム研究は、年齢がAPOE遺伝子型よりも遺伝子発現に大きな影響を及ぼすことを見出している（Zhao et al., 2020）が、我々は逆に、タンパク質レベルがAPOE遺伝子型に大きく依存することを見いだし、遺伝子型と表現型の間の様々なレベルの制御の寄与を強調した。我々は、APOE3およびAPOE4の男女において、インスリン感受性が低下するにつれてIL-17、IL-6、IFNγのタンパク質レベルが上昇することを見出した。同様に、脳に浸潤し、高レベルのIL-17、IL-6、IFNγを産生することができるTヘルパー17（Th17）細胞は、インスリン抵抗性および1型糖尿病および2型糖尿病においてアップレギュレートされる(Ip et al., 2016; Nicholas et al., 2019; Tesmer et al., 2008; Zhang et al., 2019)。APOEノックイン動物の視床下部におけるサイトカインタンパク質レベルを評価する今後の研究によって、脳の代謝制御中枢に対する直接的な影響についてよりよく理解できるようになるだろう。
寿命を通じて、APOE3雌マウスはAPOE4雌マウスよりも体重と体脂肪が増加した。この体脂肪の増加は、体重に対するカロリー摂取量とは無関係であった。我々の研究の限界の一つは、脂肪量の種類と場所を定量化しなかったことである。重要なことは、皮下脂肪、内臓脂肪、褐色脂肪はそれぞれ異なる代謝的価値と機能を有するということである。内臓脂肪は心血管障害や代謝障害と関連しているが、褐色脂肪は代謝的に活発で有益であることが知られている（Antonopoulos and Tousoulis, 2017）。実際、以前の研究でAPOE4マウスは脂肪酸酸化と褐色脂肪量が増加していることが示されており(Arbones-Mainar et al., 2016)、したがってAPOE3マウスで測定された脂肪の増加は内臓脂肪である可能性が高い(Arbones-Mainar et al., 2016)。この可能性は、老化したAPOE3マウスで観察された耐糖能の低下と空腹時インスリン値の上昇によってさらに支持されるが、この仮説を確認するためにはさらなる研究が必要である。
我々は、APOE4雌マウスは、APOE3雌マウスが経験する加齢に伴う耐糖能の低下から保護されていることを見出した。すべての雌性群において、GTT中のインスリン感受性およびインスリン分泌反応に変化がなかったことと、加齢雌性APOE3マウスにおける空腹時インスリンレベルの上昇が相まって、APOE4が雌性における加齢に伴う耐糖能低下から保護する機序は、インスリン非依存的であることが示唆された。しかし、より細かい時間分解能で、15分間のGTT時点よりも早い時点のグルコースレベルを観察することで、インスリンスパイクのピークや形状にそれ以前の変化が生じるかどうかが明らかになるだろう。なお、体重の多いマウスに高用量のグルコースを投与すると、総質量に基づいて計算するためGTTの結果に影響を及ぼす可能性があるが、肥満マウスにおける投与方法の比較で以前に見られたように、除脂肪体重に基づく投与と同様の結果が得られる可能性が高い(Jørgensen et al., 2017)。我々の結果は、両遺伝子型の雄およびAPOE3雌マウスが、ヒト(Janssen, 2021)に見られる影響と同様に、加齢とともに高インスリン血症に向かう傾向があることを示唆している。若いAPOE3雌マウスは最も耐糖能が高く、老齢のAPOE3マウスは最も耐糖能が低かった。男女ともにAPOE4マウスは寿命を通じて耐糖能を維持したが、グルコースレベルのピークのタイミングが変化した。APOE4マウスにおける加齢に関連した耐糖能の低下に寄与する他の潜在的機序としては、腸管でのグルコース吸収の変化(Ussar et al., 2017)、グルコースの有効性（肝臓での生成と世界的な利用を調節するグルコースの能力）(Hu et al., 2021)、グルコーストランスポーター(GLUT)の発現と活性(Chadt and Al-Hasani, 2020)、循環代謝産物の変化(Chadt and Al-Hasani, 2020; Williams et al., 2016)などが挙げられる。
APOE4雌性マウスとAPOE3雌性マウスの間の耐糖能と空腹時インスリン値の差は、18ヵ月齢では統計的に有意ではなかったが、老化したAPOE4マウスは、より低いGTT AUCとより低い空腹時インスリン値に向かっているようであった。このことは、今回の実験を24ヵ月齢まで延長すると、APOE遺伝子型間でより大きな統計的に有意な差が観察される可能性があることを示唆している。しかし、この研究で用いられた18ヵ月齢のマウスは、60歳のヒトとほぼ同等である。従って、この研究をより高齢の動物に拡大することで、AD発症と進行の研究に対するADリスクの意味合いや関連性が変わる可能性がある。特筆すべきは、AD蛋白病変が存在しない健康な老化の状況下でマウスを研究したことである。したがって、本研究の結果は、心血管疾患、脂質異常症、脳卒中、その他の認知症など、老化に関連する他の疾患にとっても重要である。本研究では、オスとメスのマウスをプロファイリングしたが、その結果は質的に異なるため、直接比較はしなかった。現在のAD研究環境は、がん分野と同様に個別化医療に向かっており、性別は、病状や治療方針の結論を導き出すために考慮しなければならない重要な変数である。具体的には、女性は加齢や疾患において女性が経験する重大な免疫調節異常のレベルを高めており、この現象は女性のAD患者（Guo et al.、2022年）でもADでない場合（Angum et al.、2020年；Klein and Flanagan、2016年）でも観察される。さらに、認知症に関連した死亡の約3分の2は女性であり(Oh and Rabins, 2019)、ADのAPOE4関連リスクは女性でより強い(Bretsky et al., 1999; Farrer et al., 1997)。今後の研究では、女性と男性を直接比較し、女性の代謝と海馬のサイトカインシグナル伝達が男性に比べて異なるかどうかを見極める必要がある。
情報開示
著者らは、申告すべき競合利益はない。
謝辞
本研究は、National Institute on Aging（EAP）のR01AG072513、National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism（NAC）のR01AA209403、およびPenn State College of Medicine（EAP）の脳神経外科および薬理学部門のスタートアップ資金により支援された。RMFはNational Institute on AgingからNIH NRSA predoctoral fellowship F31AG071131の支援を受けている。MKKとDCCは、米国国立神経疾患・脳卒中研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke）の研修フェローシップT32NS115667の支援を受けている。Lynne Beidlerにはマウスのハンドリングとコロニーの管理を手伝ってもらい、Marianne Klingerには脳の包埋、スライス、サンプルのマウントを手伝ってもらった。このプロジェクトで使用したMetabolic Phenotyping Core (RRID:SCR_022565)のサービスおよび機器は、ペンシルバニア州立大学医学部研究・大学院副学部長室およびペンシルバニア州保健局から、タバコ和解基金（CURE）を通じて一部資金提供を受けた。内容はあくまで著者の責任であり、必ずしも大学や医学部の公式見解を示すものではない。Pennsylvania Department of Healthは、いかなる分析、解釈、結論に対しても責任を負わない。本コアはまた、S10OD026980を通じたNIHからの支援にも謝意を表する。
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2022年11月11日掲載
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bioRxiv の臨床研究パイロットプロジェクトが終了し、健康科学専用サーバー medRxiv (submit.medrxiv.org)が開設されたことに伴い、Clinical Trials と Epidemiology のサブジェクトカテゴリーは新規投稿を締め切りました。臨床試験の結果を報告する新規論文は、medRxivへの投稿が必須となりました。ほとんどの疫学論文もmedRxivに投稿されるべきですが、論文に健康に関する情報が含まれていない場合、著者は他のbioRxivの主題カテゴリー（例えば、遺伝学や微生物学）に投稿することもできます。
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