レジスタントスターチの摂取は腸内細菌叢の再構築によってヒトの体重減少を促進する
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出版：2024年2月26日
レジスタントスターチの摂取は腸内細菌叢の再構築によってヒトの体重減少を促進する
https://www.nature.com/articles/s42255-024-00988-y?utm_source=facebook&utm_medium=organic_social&utm_content=null&utm_campaign=CONR_JRNLS_AWA1_GL_PCOM_SMEDA_NATUREPORTFOLIO&fbclid=IwAR2Et9NtLk_1UzfKSL_KEM9sG9Ymcg5l6EBr2QVu8YleCWXCjAPilEczFkU_aem_AVSVXXxfIissW-zLzkWi0XJvQffuSGw4EKXjgeleDdvSg_BPs1jH5xkkbDJj1i9qkS4
李華亭、張磊、...賈偉平 著者一覧を見る
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指標詳細
概要
食物繊維による腸内細菌叢の調節が、代謝性疾患の解決策となる可能性を示唆する新たなエビデンスが得られている。過体重または肥満の参加者37人を対象とした無作為化プラセボ対照クロスオーバーデザイン試験（ChiCTR-TTRCC-13003333）において、食事補助食品としてのレジスタントスターチ（RS）が肥満に関連する転帰に影響を及ぼすかどうかを検証する。ここでは、8週間のRSサプリメント摂取が、体重超過者において体重減少（平均-2.8kg）を達成し、インスリン抵抗性を改善するのに役立つことを示している。RSの効果は腸内細菌叢組成の変化と関連している。ビフィズス菌（Bifidobacterium adolescentis）の補充は、研究参加者の肥満の緩和と顕著に関連しており、雄マウスを食事誘発性肥満から保護した。メカニズム的には、RSによる腸内細菌叢の変化は、胆汁酸プロファイルを変化させ、腸管バリアを回復させることで炎症を抑え、脂質の吸収を抑制する。我々は、RSがB. adolescentisを介して少なくとも部分的に体重減少を促進することができ、腸内細菌叢がRSの作用に不可欠であることを実証した。
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要旨
世界的な肥満の流行を受け、新たな肥満予防・減量戦略の研究が進められている。これは、肥満が糖尿病や心血管系疾患などの併存疾患を引き起こし、世界的な主要な死亡原因となっていることから、極めて重要である。逆に、減量はこれらの併存疾患を軽減し、これらの疾患の予防と治療における体重管理の重要性を強調している1。
腸内細菌叢は、宿主の生理・病態生理の重要な調節因子であるとの認識が高まっている2。 具体的には、これまでの研究で、腸内細菌叢が炎症、脂肪蓄積、グルコース代謝を調節していることが報告されている3,4。健康なドナーから肥満患者への糞便微生物移植（FMT）の結果は一貫していなかったり短期間であったりしたが5,6、食事介入とFMTを組み合わせることで、レシピエントの微生物叢に好ましい変化が生じ、臨床転帰が改善する可能性がある7。したがって、食事介入によって腸内細菌叢を合理的に操作することは、有望な抗肥満戦略となる可能性がある2,7。
多糖類、オリゴ糖、その他の発酵性食物繊維を含むプレバイオティクスは、有益な腸内細菌叢、特に特定のビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属を増加させる。 これらの細菌は病原体の個体数を減少させ、腸のバリアを強化し、炎症反応を緩和する8。さらに、様々な食物繊維を配合したスナックは、マイクロバイオームの特定の要素に関連する機能を変化させるように調整することができる9。しかし、ほとんどのプレバイオティクス研究は、腸内細菌叢の調節と代謝に観察された有益な効果との因果関係を確立することなく、相関関係に基づいている2。マイクロバイオームの変化と宿主の生物学的反応との因果関係を明らかにするためには、ヒトを対象とした臨床試験と異種動物を用いたメカニズム研究の両方から得られる知見が不可欠である。さらに、これらの研究は、マイクロバイオームの変化とプレバイオティクスやその他の発酵性食物繊維の生理学的利点とを結びつけるメカニズムを理解するために不可欠である2,9,10。
RSは発酵性食物繊維の一種で、小腸ではヒトのアミラーゼで消化されず、大腸に移動して腸内細菌叢による発酵を受ける11。げっ歯類を用いた研究では、RSは消化可能なデンプン食とは対照的に、総体脂肪、特に内臓脂肪の減少につながることが実証されている12。低タンパク高炭水化物食は、炭水化物成分がRSである場合、マウスにおいて最も好ましい代謝結果をもたらす13。しかし、ヒトのデータでは、メタボリックシンドロームの個体にRSを4～12週間摂取させても、総体重には影響がなかった14,15,16。RSを添加した低脂肪食は宿主に有益な効果をもたらしたが、高脂肪食ではRSの発酵と有益な効果が減弱した17,18。これは、上記の臨床試験でRSが体重に影響を与えなかったと思われる理由の1つであると考えられる。さらに、このことは、RSの治療効果におけるRS関連腸内細菌叢の重要な役割を示唆している。しかし、ヒトにおける肥満治療のための機能的で適応性のある食品成分としてのRSの可能性や、RS関連腸内細菌叢の変化による代謝効果の調節については、依然として不明な点が多い。したがって、消費者の多様な生理学的側面に対するRSの影響や必要な摂取量に関する主張を立証するためには、肥満者を対象としたしっかりとした試験が不可欠である9,19。さらに、マルチオミクスアプローチと異種動物モデルを用いて、RSが腸内微生物群集と宿主の代謝に及ぼす影響を系統的かつメカニズム的に関連づける必要がある12,19。
ここでは、肥満やその他の代謝表現型に対する栄養補助食品としてのRSの効果を調べるため、体重過多の人を対象にクロスオーバー無作為化臨床試験を行った。この試験は、等栄養食とバランスの取れたバックグラウンド食を提供する摂食試験である。RSが腸内細菌叢の組成と機能に与える影響を評価するために、メタゲノミクスとメタボロミクス解析を行った。さらに、選択されたヒトドナーから抗生物質投与マウスに移植されたRS改変腸内細菌叢が宿主の脂肪率とグルコース代謝に及ぼす影響を分析し、RSを通じて腸内細菌叢がもたらす代謝上の利点の根底にあるメカニズムも探った。
結果
RS介入は体重減少を促進する
調査はプラセボ対照、二重盲検、クロスオーバーデザインの介入（ChiCTR-TTRCC-13003333）で、37名の参加者（平均年齢33.43±7.71歳）を対象とした。参加者は、体格指数（BMI）≧24kg m-2および/またはウエスト周囲径の増加（男性≧85cm、女性≧80cm）を認めた。慢性疾患、グルコース代謝に影響を及ぼす治療を継続中、抗生物質やプロバイオティクスを最近（3週間以内）使用した者はいなかった。20週間の試験期間には、高アミローストウモロコシ（HAM-RS2）（RS、2.8kcal g-1, 91.2g, 40gのRSを含む）と対照デンプン（CS）（AMIOCA）（3.55kcal g-1, 72g, アミロペクチン、0gのRSを含み、エネルギー供給は等しい）の2つの介入期間（8週間）があり、介入と介入の間には4週間のウォッシュアウト期間があった（図1a）。研究参加者は無作為に2群に割り付けられた：(1)RS-ウォッシュアウト-CS群、または(2)CS-ウォッシュアウト-RS群。澱粉は、300mlの水と混ぜるために、あらかじめ包装された小袋に入った粉末として提供された。参加者は1日2回、食事の10～15分前に1袋を摂取した。ランイン、2回の介入、およびその間のウォッシュアウト期間を含む試験期間中、中国とアメリカの成人過体重および肥満の予防と管理のためのガイドライン（詳細は補足情報の研究プロトコルに記載）20,21に従って、等エネルギーでバランスのとれた背景となる食事（1日3食）を提供した。参加者は、RS介入とCS介入で食事抜きやでんぷん摂取量に差がみられなかったことから、RS介入とCS介入で食事遵守に差がないことが示唆された。食物繊維摂取量の違い（RS対CS、53.84±4.70g対9.97±5.17g、P＜0.001）を除き、RSまたはCS介入期間中の総消費エネルギーおよび大栄養素の割合は同様であった（補足表1）。男性22人、女性15人を含む合計37人が研究を終了し、解析に組み入れられた（表1および拡張データ図1）。本試験は2013年7月3日から2016年10月14日まで中国・上海で実施され、吐き気、嘔吐、腹部膨満感、便通の増加、便回数の変化などの消化器系の副作用は報告されなかった。
図1：体重過多の人に対する8週間のRS介入後の肥満の緩和。
図1
a, 臨床試験の図。登録、無作為化、ランイン期間の後、参加者はRSまたはCSを交互に摂取し、ウォッシュアウト期間を設けた。試験期間中、すべての参加者に同一の食事が提供された。b-d、RS介入により体重（b）、脂肪量（c）、ウエスト周囲径（d）が有意に減少した。g、8週間のRS介入前（左）と介入後（右）の参加者の代表的な腹部MRI。へその高さにおける生（上）とマーク（下）のMRI。h、高インスリン血糖クランプ法で評価したGIRの変化。 i、血清TNFα値の変化。 j、血清IL-1β値の変化。k、RSまたはCSによる8週間の介入後のNEFA、TGおよびTCを含む1日の糞便中脂質排泄量。l、血清ANGPTL4レベルの変化。 m、血清FGF21レベルの変化。RSまたはCSのいずれかについて、n＝37人（b-d,j,l,m）、n＝36人（e,f,i）、n＝35人（h）、n＝17人（k）。ベースライン値で調整した共分散分析（ANCOVA）を用いて、各訪問時のRSとCSを比較した（b-d）。データは平均値（95％信頼区間（CI））で示した。***P < 0.001. データは中央値とIQR（k）で示した。ノンパラメトリックWilcoxon順位和検定は2つの介入間の有意性を評価するために用いられた。***P < 0.001. データは箱ヒゲ図（e,f,h-j,l,m）として示した。箱ひげ図は中央値と四分位数、ひげはデータ範囲。*P = 0.025、0.014、0.046（h-j）、**P = 0.004、0.002（f,m）、***P < 0.001、介入順序で調整した線形混合モデルで評価した群間差。††P = 0.003および0.002（h,l）。介入で調整した線形混合モデルによる群内変化について、Bonferroniの検定に続いて††P < 0.001。
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表1 CSまたはRS介入前後の試験参加者の臨床パラメータの要約
フルサイズの表
介入順序で調整した線形混合モデルを用いて、介入間（RS対CS）の人体計測パラメータおよび生化学的指標の実際の変化と、介入前後の群内変化を比較した（表1および補足表2）。主要アウトカムである体重はRS介入後に有意に減少し、CS介入に対するRS介入後の正味絶対変化量は-2.81kg（95％CI -3.55kg to -2.07kg；P＜0.001）であったが、CS介入後には有意な変化は観察されなかった（図1b）。さらに、脂肪量とウエスト周囲径は、CS介入後に比べてRS介入後に有意に減少した（図1c,d）。RS介入期間中、参加者の体重、ウエスト周囲径および脂肪量は、2週目以降、有意に減少した。腹部磁気共鳴画像法（MRI）で測定した内臓脂肪面積（VFA）および皮下脂肪面積（SFA）は、CS摂取後と比較してRS摂取後の方が低かった（それぞれP < 0.001およびP = 0.004；図1e-g）。RS-ウォッシュアウト-CS群とCS-ウォッシュアウト-RS群のいずれにおいても、RS介入後に体重およびその他の肥満関連転帰の有意な減少が観察された（すべてP＜0.05）。RS-Washout-CS群では、ウォッシュアウト期間後、肥満関連転帰はベースラインレベルに逆戻りを示した（補足表3およびExtended Data Fig.2a-e）。さらに、二元配置分散分析（ANOVA）では、体重と肥満関連アウトカム（脂肪量、ウエスト周囲径、VFA）に介入による有意差が認められ（P＜0.001）、有意な順序効果や介入-順序交互作用は認められなかった。これらの結果から、8週間のRS介入により、体重過多の人の腹部脂肪率が減少することが示された。
さらに、耐糖能はRS介入後に有意に改善した（Extended Data Fig.） RS介入後の参加者における食事負荷試験（MTT）後120分のインスリン濃度は、CS介入後のそれよりも有意に低かった（Extended Data Fig. さらに、高インスリン血性-血糖値クランプによりインスリン感受性を評価したところ、グルコース注入速度（GIR）はCS介入と比較してRS介入後に有意に増加し（中央値1.05mg kg-1 min-1の増加、0.15～2.10）（P = 0.025）（図1h）、インスリン感受性の有意な改善を示した。さらに、RS介入後、血清アディポネクチン値の有意な増加が観察された（Extended Data Fig.2i）。さらに、RS介入後、第1相および第2相のインスリン分泌量はCS介入後と有意な差は認められなかった（補表4）。これらの結果から、8週間のRS介入は、体重過多の人の耐糖能とインスリン感受性を改善することが示された。
RSが体重減少を促進する潜在的な機序を調べるため、肥満22,23と密接に関連する慢性的な低級炎症反応と腸内脂質消化の変化を測定した。血清腫瘍壊死因子（TNF）αおよびインターロイキン（IL）-1βなどの炎症性サイトカインのレベルは、研究参加者において、RS摂取後、CS摂取後と比較して有意に低かった（それぞれP = 0.014およびP = 0.046）が、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、IL-10およびIL-6については、RSおよびCS摂取中に有意差は認められなかった（図1i,jおよび表1）。さらに、試験参加者の糞便脂質を測定したところ、糞便中の非エステル化脂肪酸（NEFA）、トリグリセリド（TG）、総コレステロール（TC）の1日当たりの排泄量は、CS摂取時に比べてRS摂取時に有意に高かった（図1k）。RS摂取時とCS摂取時の脂肪摂取量に有意差がなかったことから（補足表1）、これらの結果は、RS介入により食事からの脂質吸収が減少する可能性を示唆した。腸内環境と脂質代謝3との関連を示唆するアンジオポエチン様因子4（ANGPTL4）の血中濃度は、CS摂取と比較してRS摂取後に有意に上昇した（図1l）。肥満状態で増加することが報告されている血清線維芽細胞増殖因子21（FGF21）は、RS摂取後に有意に減少した（図1m）24。
RS介入は腸内細菌叢を再構築する
介入期間中の腸内細菌叢の動態を調べるために、ショットガンメタゲノムシーケンスが実施された。各サンプルの平均処理量は5.74（s.d.0.87）Gbpであった。サンプル間の平均存在量の上位50種に基づく種レベルの分類学的プロファイルから、Prevotella copri、Bacteroides stercoris、Faecalibacterium prausnitziiがサンプル間で最も優勢であることが明らかになった。その他の種は、ほとんどのサンプルで存在量がかなり少なかった（1種あたり平均1.1％）（Extended Data Fig.） RS介入に反応して腸内細菌叢の組成がどの程度変化したかを評価するため、以下の手順でサンプル間の（8週間介入後の存在量の変化倍率としての）種の変動プロファイルに基づいてBray-Curtis距離を算出した。種の変異のプロフィールは、各生物種の治療後の存在量のlog2倍変化（log2 FC）で構成された。フォールドチェンジ値は、各サンプルで合計を1として0から1の範囲で正規化した。さらに、この種の変異のプロファイルに基づいて、Bray-Curtis距離を計算した。Bray-Curtis距離に基づく非計量的多次元尺度法（NMDS）プロットに示すように、RSサンプルとCSサンプルはある程度分離しており、RS介入後とCS介入後の微生物叢の変動パターンがそれぞれ有意に異なることを示していた（VEGANのAdonis検定によるP < 0.001）（図2a）。この所見から、RS介入は腸内細菌叢の動態に影響を与え、組成を再構築することが示唆される。CSのベースラインとRS介入のベースラインでは、微生物組成に有意差はなかった（Extended Data図3b-e）。7種が全体的な変動プロファイル（RSおよびCSの全サンプル）と有意に相関している（Benjamini-Hochberg（BH）偽発見率（FDR）調整後P＜0.01）ことがわかった（図2a）。その結果、BMIは全体の分類学的変異プロファイルと有意な相関（RパッケージVEGANのenvfit検定でP < 0.001）を示し（図2a）、体重の変化が腸内マイクロバイオームの再構築と関連していることが示唆された。
図2：RS処理に反応した腸内細菌叢と宿主の表現型との関連。
図2
a,種の存在量の変動（介入後の変化倍率）プロファイルに基づくサンプルのNMDS。赤丸と灰色丸は、それぞれRSサンプルとCSサンプルを囲んでいる（95％CI付き）。b, RSとCSの介入間で有意に異なる変動プロファイル（P < 0.05, BH FDR < 0.2 with paired two-sided Wilcoxon signed-rank test）を持つ7つの生物種（P < 0.05, BH FDR < 0.2 with paired two-sided Wilcoxon signed-rank test）。箱ひげ図は中央値とIQRを示す。c,腸内微生物と宿主の表現型との間の関連ネットワーク。RS群とCS群間で異なる変動（P < 0.05、両側ウィルコクソン順位和検定によるBH FDR < 0.3）を有する合計12種を回帰モデルの予測因子として用いた。ノードの色は、表現型（黄色）、RSに反応して存在量が増加した種（緑色）、または減少した種（赤色）のいずれかを反映する。接続線の色は、微生物と表現型の間の正の相関（赤）または負の相関（青）のいずれかを反映している。接続線の幅は、存在量の変動（介入後の変化倍率）と表現型の変動（介入後の変化倍率）の間の統計的線形相関の強さ（モデル平均の重要度）を反映する。重要度は、モデル選択時にそのような変数を含む一般化線形モデルのAIC重みの合計である。d,各表現型に対する関連する種の重要度の要約。a-dでは、RSの前後で27個体、CSの前後で16個体が、メタゲノム解析のために全参加者から無作為に選択された。
出典データ
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RS介入に関連する腸内細菌叢シグネチャーを同定するために、RSおよびCS治療後の各生物種の存在量の変化を比較した（8週間の介入後の存在量の倍数変化として）。その結果、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）の3種は、RS介入後に有意に増加したが、CS介入後は横ばいか減少した。逆に、Alisipes putredinis、Bacteroides vulgatus、Odoribacter splanchnicus、Parabacteroides merdaeの4種は、RS処理後に減少したが（P < 0.05、BH FDR < 0.2、Wilcoxon signed-rank検定）、CS処理後は安定または増加した。上記のうち、R. bromii、A. putredinisおよびB. adolescentisは、CS処理と比較してRS処理後に最も有意に変動した種であった（FDR = 0.05）（図2bおよび補足表5）。その他の分解種は、本研究ではRS介入後に有意な変化は見られなかった（補足表6）25,26。
RSの介入効果に関連する生物種を同定するため、BMI、脂肪量、ウエスト周囲径、VFA、GIRおよび血清ANGPTL4値を含む宿主の6つの有意に変化したパラメータと12種の相関（Wilcoxon順位和検定によるFDR＜0.3）を調べた。一般化線形モデルは、種の存在量の変動と表現型の変動との関連を定量化した。生物種と表現型の間の関連性の強さは、与えられたデータに対して使用された統計モデルの相対的な質／重みを定量化する補正赤池情報量規準（AIC）を用いたモデル選択に基づく線形モデルにおける変数の重要度によって記述された。変数の重要度は、重み付けされたすべての可能な線形モデルの全体的な支持度、またはこの変数を含むすべての可能な線形モデルの総重量の割合を反映する。豊度差のある12種の中で、B. adolescentisは様々な表現型と最も頻繁に関連していた（表現型とのリンクの総数）（図2c）。表現型の中では、BMIとGIRが腸内微生物と最も強い関連（関連する種の平均重要度＞0.5）を示した（図2d）。単一種レベルでは、RSの補給後にR. bromiiの存在量が増加すると、GIRが増加することがわかった（重要度0.67、P < 0.001）。前述のR. bromiiの有意な増加と合わせると、R. bromiiがRS介入に反応する重要な種である可能性が示唆され、先行研究27と一致した。B. adolescentisは、BMI、ウエスト周囲径、VFAの低下（それぞれ重要度0.87、0.47、0.27、P < 0.001）と強い相関があることから明らかなように、肥満の緩和に重要な役割を果たす可能性がある。また、その存在量の増加は、血清ANGPTL4レベルの上昇（重要度0.252、P < 0.001）とも正の相関があり、脂質代謝の潜在的な効果を示唆している。主要なRS分解物質として、ベースラインにおけるR. bromiiとB. adolescentisの存在と主要な結果との関係を調査した。B. adolescentis陽性者の脂肪量はRS介入後にさらに減少し、ANGPTL4値はRS介入後にさらに増加した（いずれもP < 0.05）ことから、腸内細菌叢の初期組成、特にB. adolescentisがRSの有益性と密接に相関していることが示された（Extended Data Fig.4）。代謝に関連するKyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイのうち、RSとCSの介入で存在量が最も異なっていた上位10パスウェイのうち、リノール酸代謝（ko00591）とビスフェノール分解（ko00363）パスウェイはRS治療で減少したが、CS治療では有意に増加した（両パスウェイともFDR = 0.057）（Extended Data Fig.）
RSで変化した腸内細菌叢と代謝産物との関連性
腸内細菌叢の変化が宿主の利益にどのように寄与するかはまだ不明であるが、可能性のあるメカニズムは代謝産物の変化によるものである28。そこでさらに、研究参加者の血清中のノンターゲットメタボロミクスプロファイリングを行った。カルニチンやメチオニン29,30などの肥満に関連する血清代謝物は、CS介入と比較してRS介入後に減少した（補足表7）。一般化線形モデルを用いて、RS介入中の腸内細菌と血清代謝物変動との関係を調べた。RS介入中のB. adolescentisのシフトは、血清カルニチン、エネルギー代謝および脂質代謝物のシフトと負の相関を示した（平均重要度0.15；フィッシャーの複合P < 0.05；拡張データ図6a）。対照的に、RS介入中のB. vulgatusのシフトは、キサンチンや尿酸を含むエネルギー代謝代謝物のシフトと正の相関があった（P < 0.01；拡張データ図6a）。
胆汁酸は腸内細菌叢と宿主をつなぐ重要なシグナル伝達代謝産物であるため、胆汁酸プロファイルの定量分析を行った。グリコデスオキシコール酸（GDCA）は、RSとCSの介入間で統計的に有意な差を示した唯一の胆汁酸であった。他の胆汁酸、例えばグリココール酸（GCA）、デオキシコール酸（DCA）、7-ケトリトコール酸（7-ketoLCA）およびタウロデオキシコール酸（TDCA）は増加傾向を示したが、3β-チェノデオキシコール酸（βCDCA）レベルはRS介入後に減少傾向を示した（補足表8および図3a）。相関分析により、二次胆汁酸であるGDCAとTDCAが代謝表現型と最も近い相関があることが判明した。GDCAとTDCAの変化は、肥満に関連する表現型とは負の相関を示し、インスリン感受性とANGPTL4レベルとは正の相関を示した（図3b）。RS処理後のGDCAとTDCAの変化は、B. adolescentis、B. longum、Dorea longicatena、R. bromiiの4種と有意かつ正の相関を示し、A. putredinis、Bacteroides coprophilus、Bacteroides ovatus、B. vulgatus、Eubacterium eligens、O. splanchnicus、P. merdae、P. copriの8種とは負の相関を示した（図3c）。さらに、GDCA、TDCA、βCDCA、DCA、7-ケトLCAなど、いくつかの代謝産物の変動と強く関連する微生物経路を特定した（図3d）。この結果は、RSの影響を受けた腸内細菌叢が二次胆汁酸の産生を増加させ、肥満やインスリン抵抗性の緩和につながる可能性を示唆している。種が胆汁酸代謝と関連しているかどうかを調べるため、腸内細菌叢と胆汁酸代謝のゲートキーパーであり宿主-微生物間のクロストーク31を担う胆汁酸塩ヒドロラーゼ（BSH；K01442）との関連を調べた。その結果、CS介入と比較してRS介入では、腸内微生物群集レベルにおけるBSH遺伝子の存在量が有意に減少していることが明らかになった（P < 0.05、Wilcoxon順位和検定）。その結果、BSHの発現はB. vulgatusと有意に相関していた（r = 0.561、P < 0.001；補足表9）。
図3：胆汁酸は腸内細菌叢と宿主の表現型との相互作用を媒介する。
図3
a,8週間のRSまたはCS介入後の参加者で評価した血清胆汁酸値の倍数変化。データは箱ひげ図で示してある。各ボックスの中央の水平線は中央値を示し、ボックスの上下の境界線は75パーセンタイルと25パーセンタイルを表し、ひげは最低値と最高値を示す。*b, 胆汁酸と宿主の表現型との間の関連ネットワーク。c, 腸内微生物と宿主の表現型との間の関連ネットワーク。ノードの色は、胆汁酸（青）、表現型（bの黄色）、微生物（cの黄色）のいずれかを反映している。接続線の色は、胆汁酸と表現型、または胆汁酸と微生物間の正の相関（赤）または負の相関（青）のいずれかを反映している。接続線の幅は、胆汁酸の変動（介入後の変化倍率）と表現型の変動（介入後の変化倍率）、または存在量の変動（介入後の変化倍率）と胆汁酸の変動（介入後の変化倍率）の間の統計的線形関連（モデル平均の重要度）の強さを反映する。重要度は、モデル選択中のそのような変数を含む一般化線形モデルのAIC重みの合計である。d, 胆汁酸の変動とKEGGパスウェイの存在量の変動との相関を示すKEGGパスウェイ解析。
出典データ
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短鎖脂肪酸（SCFA）は、主に食物繊維の腸内微生物発酵によって産生され、腸内および代謝の健康維持に重要な役割を果たしている28。そこで我々は、標的メタボロミクスを実施し、RSおよびCS処理後の糞便および循環SCFAの変化を調べた。その結果、イソ酪酸とバレラートの糞便中濃度は、CS投与と比較してRS投与後に有意に減少したが、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ヘキサン酸などの他の糞便中SCFAは、RS投与後に有意な差は認められなかった（Extended Data Fig.） SCFAの循環レベルには、RS介入とCS介入で有意差はなかった（補足表10）。
RSで形成された腸内細菌叢はマウスの肥満を緩和する
RSに関連した腸内細菌叢が宿主の腹部肥満および糖代謝の改善を誘発する可能性を調べるため、西洋食を与えた抗生物質投与マウスで、RSまたはCS介入後のヒトドナーのサンプルを用いてFMTを行った（介入後の体重の変化は各群平均に近似している；各群n = 4）（図4a）。ドナーおよびFMTを受けたマウスの間で、RSによる変化の一貫した傾向が観察された（Extended Data図7a）。FMTの2週間後、RS微生物叢を投与されたマウスの体重および脂肪量は、CS微生物叢を投与されたマウスのそれよりも低かった（P < 0.001）（図4b,c）。RS微生物叢を投与したマウスの精巣上体白色脂肪組織（eWAT）、腎周囲白色脂肪組織（pWAT）および腸間膜白色脂肪組織（mWAT）のデポ質量割合は、CS微生物叢を投与したマウスよりも有意に低かった（図4d,e）。eWATとmWATの組織学的解析では、RS微生物叢をコロニー形成したマウスでは脂肪細胞のサイズが大幅に減少していた（図4f,g）。包括的な実験動物モニタリングシステムにより、2群のマウスはエネルギー消費量、呼吸交換比、CO2産生量、O2消費量、活動量、摂餌量に有意差を示さなかった（Extended Data Fig.） これらのマウスの耐糖能は、RS介入後にヒト由来の腸内細菌叢を移植することにより、少なくとも部分的に改善した（Extended Data Fig.） RS微生物叢をコロニー形成したマウスの血中アディポネクチン濃度は、CS微生物叢をコロニー形成したマウスよりも有意に高かった（Extended Data Fig.） これらの結果から、RSによる腸内細菌叢の変化は、肥満を緩和し、宿主の糖代謝を改善するのに十分であることが示唆された。
図4：RSの影響を受けた腸内細菌叢は肥満を緩和する。
図4
a, FMTの模式図。8週間のRSまたはCS介入後のヒトドナーの糞便サンプル（各介入につきn＝4）を抗生物質（Abx）処理したC57BL/6マウスに移植した。b,c,FMT後の体重および脂肪量の変化。d,RSまたはCSドナーの微生物叢を14日間コロニー形成したマウスの内臓脂肪の代表写真。e, 14日間微生物叢をコロニー形成させたマウスの鼠径皮下脂肪（iSAT）、eWAT、pWATおよびmWATを含む脂肪沈着量。 f,g,CS（上）またはRS（下）の微生物叢をコロニー形成させたマウスの2群におけるiSAT、eWATおよびmWATのヘマトキシリン・エオジン染色切片の代表画像および定量データ。スケールバーは100μm。データは3つの独立した実験で再現された。データは平均値±s.e.m.で示した。有意性は、対の両側Student's t-test（c）および非対の両側Student's t-test（b,e,g）（正規分布）またはノンパラメトリック両側Wilcoxon順位和検定（非正規分布）によって決定した。*P = 0.02および0.01（g）、**P = 0.002（b）、***P < 0.001（b,c,e）。
ソースデータ
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RS-reshaped腸内細菌叢は腸管バリアを回復させる
臨床試験の所見と一致して、RS-改変腸内細菌叢は全身性炎症を改善した。FMTの2週間後、RS微生物叢をコロニー形成したマウスの循環MCP-1、IL-1βおよびIL-6レベルは、CS微生物叢をコロニー形成したマウスよりも有意に低かった（すべてP < 0.01）（図5a）。RS微生物叢をコロニー形成したマウスでは、抗炎症因子IL-10の血清レベルが上昇した（図5a）。腸間膜脂肪組織では、MCP-1、IL-1βおよびIL-6の発現も有意に低かったが、IL-10の発現はCS微生物叢を投与したマウスに比べてRS微生物叢を投与したマウスで高かった（図5b）。
図5：RSの影響を受けた腸内細菌叢は、腸のバリア機能を回復させ、脂質の吸収を抑える。
図5
a,RSまたはCSドナーの微生物叢をコロニー形成したマウスにおける炎症性サイトカインの血清レベル。 b,mWATおよびRSまたはCSドナーの微生物叢をコロニー形成したマウスにおける炎症性遺伝子の発現。d, 回腸におけるZO-1とオクルディンの発現。 e, 腸絨毛におけるZO-1（赤）とオクルディン（緑）の局在とレベルを免疫蛍光法で可視化し、4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）（青）で対比染色した。f,ZO-1およびオクルディンの陽性染色領域の定量的解析をImageJソフトウェアで行い、全病変領域に対する割合として算出した。 g,h,mWATおよび循環中（血清）のLPSレベル。 i,回腸におけるANGPTL4の発現レベル。j,相対的な腸管内腔リパーゼ活性。k,回腸におけるTGレベル。l,便中TGレベル。m,血清ANGPTL4レベル。データは3つの独立した実験で再現された。データは平均値±s.e.m.で示した。有意性は、対にしない両側スチューデントのt検定（正規分布）またはノンパラメトリック両側ウィルコクソン順位和検定（非正規分布）によって決定した。**P = 0.005（a）、0.001および0.010（b）、***P < 0.001。
出典データ
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代謝性内毒素血症は、腸から循環系へのリポ多糖（LPS）の浸透の増加に起因すると考えられ、肥満が誘発する慢性炎症の極めて重要な要因となっている7。RSによって変化した腸内細菌叢が代謝性内毒素血症とどのように相互作用するかを調べるため、我々はさらに、RSおよびCSの介入後にヒトドナーの微生物叢をコロニー形成したマウスを用いて、in vivoでの腸管透過性を調べた。マウスに6時間の絶食後、フルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン（DX-4000-FITC）を経口投与し、その後、尾静脈から血清サンプルを採取した。血清中のDX-4000-FITC濃度は蛍光分光光度計を用いて測定した。腸管透過性は、RS微生物叢をコロニー形成したマウスでは、CS微生物叢をコロニー形成したマウスに比べて有意に低かった（図5c）。腸管透過性は、病原体や細菌産物の侵入を阻止する腸管タイトジャンクションによって制御されている7。我々は、RSによる腸内細菌叢の変化が、腸の主要なタイトジャンクションタンパク質であるゾナ・オクルデンス・タンパク質（ZO-1）とオクルディンの発現レベルに及ぼす影響を評価した。ZO-1とオクルディンの両遺伝子の発現は、RS微生物叢を摂取したマウスではCS微生物叢を摂取したマウスに比べて有意に増加した（図5d-f）。さらに、RS介入後にドナーの腸内細菌叢をコロニー形成したマウスでは、腸関門の回復により、腸間膜脂肪組織と循環の両方でLPSレベルが有意に減少した（図5g,h）。これらの結果から、変化した微生物叢の有益な作用のひとつは、腸関門を維持することによってLPSの侵入を阻止することであることが示唆された。
RS改変腸内細菌叢は脂質吸収を減少させる
我々の臨床研究では、RS摂取後の参加者において、CS摂取後と比較して、ANGPTL4の循環レベルと便中脂質が有意に増加した。ANGPTL4の増加がRSの微生物叢によって制御されているかどうかを調べるために、FMT実験から得られたマウスの回腸におけるANGPTL4の発現レベルを測定した。CS微生物叢でコロニー形成されたマウスと比較して、RS微生物叢でコロニー形成されたマウスは、有意に高い回腸ANGPTL4発現を示した（図5i）。ANGPTL4はリポ蛋白リパーゼ（LPL）および膵リパーゼの内因性阻害因子であり、主要な腸内リパーゼとして機能している32。我々は、RS微生物叢をコロニー形成したマウスは、CS微生物叢を投与したマウスと比較して、腸管内腔リパーゼ活性が有意に低いことを見出した（図5j）。腸管内リパーゼ活性の抑制に伴い、RS微生物叢をコロニー形成したマウスは、CS微生物叢をコロニー形成したマウスと比較して、回腸中のTG濃度が低く、糞便中のTG濃度が高かった（図5k,l）。循環中のANGPTL4レベルも、CS微生物叢をコロニー形成したマウスと比較して、RS微生物叢をコロニー形成したマウスで有意に上昇した（図5m）。これらの結果から、RSによって誘導された腸内細菌叢の変化は、腸内ANGPTL4の調節を介して脂質吸収を低下させることが可能であることが示された。
肥満に対するB. adolescentisの効果
RSによるB. adolescentisの増加は、腹部肥満の緩和と強い相関があった。このことから、我々はさらに、腸内のB. adolescentisと宿主の肥満との間の潜在的な因果関係を、通常飼育マウスを用いて調べた。マウスを3群に無作為に割り付け、生きたB. adolescentisで強化した滅菌水、加熱死菌したB. adolescentis、または生理食塩水を5週間飲ませた（図6a,b）。生きたB. adolescentisを飲料水に添加したところ、西洋食を与えたマウスの体重増加（図6c）と脂肪増加（図6d）が有意に抑制された。さらに、B. adolescentisが腸におけるANGPTL4の発現を制御しているかどうかを調べた。加熱殺菌したB. adolescentisを添加した飲料水を与えたマウスと比較して、生きたB. adolescentisを添加した飲料水を与えたマウスでは、回腸でのANGPTL4の発現および分泌が有意に高かった（図6e-g）。我々の臨床試験と同様に、B. adolescentisは血清ANGPTL4レベルと正の相関を示した。生きたB. adolescentisを投与されたマウスは、管腔リパーゼ活性が有意に低下した（図6h）。これに対応して、これらのマウスは回腸TGが減少し、糞便TGレベルが上昇した（図6i,j）。循環中のANGPTL4レベルも、生きたB. adolescentisで処置したマウスで有意に増加した（図6k）。この結果は、RSによって誘導される重要な生物種の一つであるB. adolescentisが、腸内のANGPTL4に影響を与えることによって、食事誘導性肥満からマウスを保護する可能性を示唆している。さらに、RS介入後の参加者ではFGF21レベルが有意に減少しており、FGF21感受性の改善が示唆された（図1m）。マウスにB. adolescentisを投与すると、LPS-TLR4-NF-κB経路が抑制され、脂肪組織におけるFGF21感受性が向上することがわかった（Extended Data Fig.8）。
図6：B. adolescentisは食事誘発性肥満から保護し、腸および循環ANGPTL4に影響を及ぼす。
図6
a, B. adolescentis（B.a）補充戦略の模式図。WD誘導肥満C57BL/6マウスに、生きたB.adolescentis（WD + B.a）または加熱死滅させたB.adolescentis（WD + hk-B.a）または生理食塩水（WD）を5週間飲水投与した。iSAT、eWAT、pWATおよびmWATを含む脂肪沈着量（d）。マウスの回腸におけるANGPTL4の局在とレベルを免疫組織化学染色により可視化した（スケールバー、100μm）（e）。各群の代表画像を示す。全回腸粘膜面積に対するANGPTL4+面積の割合（f）。回腸におけるANGPTL4 mRNA発現レベル（g）。相対的腸管内腔リパーゼ活性（h）。回腸におけるTGレベル（i）。糞便中TGレベル（j）。血清ANGPTL4レベル(k). n = 各群8生物学的複製(b-d,g-k)。データは3つの独立した実験で再現された。データは平均値±s.e.m.で示した。有意性は一元配置分散分析（正規分布）後にTukeyのpost hoc検定、またはKruskal-Wallis検定（非正規分布）後にDunnの検定によって決定した。*P = 0.04（c）、0.02、0.04、0.03（d）、0.05、0.05（k）。**P = 0.001、0.004（b）、0.003、0.004、0.002（d）、0.001（f）、0.009（h）、0.002（i）、0.003、0.003（j）。***P < 0.001.
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さらに、B. adolescentisを投与した従来型飼育マウスを用いて、標的メタボローム解析を行った（Extended Data Fig.9a-c）。タウロβムリコール酸（TβMCA）、タウロヘノデオキシコール酸（TCDCA）、タウロコール酸（TCA）などの一次胆汁酸は、B. adolescentis介入後に有意に減少し、二次胆汁酸のタウロリトコール酸は有意に増加した（Extended Data Fig.） SCFAに関しては、イソ酪酸とバレラートの糞便レベルもB. adolescentis介入後に有意に減少した（Extended Data Fig.） さらに、バリンとロイシンを含む血清分岐鎖アミノ酸（BCAA）レベルは、B. adolescentis介入後に有意に減少した（拡張データ図9c）。
RSはB. adolescentisを介して部分的に体重減少を促進する
RSの効果が腸内細菌叢に依存するかどうかを調べるため、無菌マウスを用いてRSおよびCS介入を行った（図7a）。雄性無菌マウスにC35飼料（RS 20％またはCS 20％由来の炭水化物35％）を10週間与えた。一方、これらのマウスにPBSまたは生きたB. adolescentisを8週間投与した。腸内容物および腸管内腔の厚さは、RS投与後に有意に増加したため、体重減少の影響を評価するために、一般的に割腹体重が用いられた12。従来の環境における食事誘発性肥満に対するRSの保護効果33とは異なり、RS投与は無菌マウスにおけるCS投与と比較して、割腹体重、耐糖能、インスリン感受性に有意な変化を示さなかった（図7c-f）。さらに、B. adolescentisを添加した場合と添加しない場合のRSの効果を検討するために、無菌マウスにRSとB. adolescentisを一緒に与えた。これらのマウスは、B. adolescentis無添加のマウスと比較して、割腹体重および脂肪量が有意に減少し、耐糖能およびインスリン感受性も改善した（図7c-f）。B. adolescentisは、無胚芽マウスにおいて腸透過性を低下させ、ANGPTL4の腸内産生を増加させたが、これは従来の環境で得られた知見と一致していた（図7g-k）。また、B. adolescentisを投与した無菌マウスでは、糞便中TG濃度の上昇とともに、管腔リパーゼ活性および回腸TG濃度が低下した（図7l,m）。これらの結果は、腸内細菌叢がRSの食事誘発性肥満に対する保護作用に不可欠であることを示していた。RSは、少なくとも部分的には、B. adolescentisを介して、腸バリアを回復させることによって炎症を軽減し、腸におけるANGPTL4産生を調節し、それによって脂質の吸収を阻害することによって、体重減少を促進する役割を果たした。
図7：B. adolescentisを摂取した無菌マウスと摂取していない無菌マウスにおけるRSの効果。
図7
a, B. adolescentis（B.a）補充戦略の模式図。B.adolescentisまたはPBSを、タンパク質20％、脂肪45％、炭水化物35％（CSまたはRS20％、残り80％はマルトデキストリン）の飼料を給与した無胚芽（GF）マウスに8週間経口接種、 c.f.u.はコロニー形成単位。 c.は割腹体重。 d.は腹腔内糖負荷試験（GTT）の糖負荷曲線。 e.は腹腔内インスリン負荷試験（ITT）の糖負荷曲線。 adolescentisを8週間摂取させた後、経口摂取1時間後の血清中のDX-4000-FITC濃度を測定することにより、in vivoでの腸管透過性を決定した。データは平均値±s.e.m.（n = 5生物学的複製/群）。*P = 0.04および0.03（d）、0.02（e）、0.05、0.04（f）および0.03（k）、**P = 0.002（c）、0.002（e）および0.004（l）、**P < 0.001は、一元配置分散分析（正規分布）後のDunnett検定、またはKruskal-Wallis検定（非正規分布）後のDunn検定に基づく。 はRS + B.aとRS + PBSの比較(d,e)。
出典データ
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さらに、無菌マウスの一次胆汁酸の血清レベルは、従来の環境よりも高く、二次胆汁酸のレベルは比較的低かった34。共役胆汁酸の一種であるGCAと二次胆汁酸の一種であるDCAは、ヒトではRS介入後に増加する傾向を示す。GCAとDCAは、無菌マウスのB. adolescentis介入後に有意に増加した。TβMCA、TCDCAおよびTCAを含む一次胆汁酸は、無菌マウスのB. adolescentis介入後に有意に減少した（Extended Data Fig.） 血清BCAAおよび糞便中イソ酪酸レベルは、B. adolescentis介入後に低下した（Extended Data Fig.）
考察
このプラセボ対照二重盲検クロスオーバーデザイン試験は、体重過多の人を対象に実施された。我々は、RSサプリメントと等エネルギー食およびバランス食を併用することにより、ヒトの体重が有意に減少し、インスリン感受性が改善することを見出した。RS投与はマイクロバイオームの構造を再構築し、代謝物を変化させた。腸内細菌叢はRSの減量効果に重要な役割を果たしている。ヒトにおけるRSの効果に関連するB. adolescentisをマウスに単コロニー化すると、マウスの食事誘発性肥満が予防された。メカニズム的には、RSによって誘発された腸内細菌叢の変化は、胆汁酸代謝に影響を与え、腸管バリアの回復を通じて炎症を抑え、ANGPTL4を調節することによって脂質吸収を抑制し、FGF21感受性を改善した（Extended Data Fig.10）。RSは、少なくとも部分的にはB. adolescentisを介して体重減少を促進する役割を果たした。具体的には、本研究は、RS（40g d-1、2型）を8週間栄養補助食品として摂取させることで、体重過多の人の体重減少を達成できるという証拠を提供した。この摂食試験では、試験期間中、参加者にバックグラウンド食を提供した。等エネルギーでバランスの取れた背景食20は、CS投与後に観察されたように、8週間にわたって体重や脂肪含量に影響を与えなかった。RSを用いた過去の試験では、RSの摂取量が比較的不十分（脂肪：繊維の比≒53：27 g d-1）35、または高脂肪摂取（脂肪：RSの比≒77：40 g d-1）14の場合、体重減少を伴わずにインスリン抵抗性または脂肪率が減少した。他の試験では、背景となる食事が規定されておらず、脂肪摂取量が多すぎるか、評価されていない15,16。高脂肪食は腸内細菌叢の変化を誘発し、腸の健康を損なう36。微生物に基づく治療では、有効性を高めるために背景となる食事が重要である7。げっ歯類では、RSを添加した低脂肪食（エネルギーの18%）は宿主に有益な効果をもたらすが、高脂肪食（エネルギーの42%）はRS発酵と有益な効果を減弱させた18。40g d-1 のRSは比較的高用量であり、有害な影響を与えることなく摂取できると考えられた37。われわれの研究は、RSをサプリメントとして用いた効果的な食事推奨（脂肪25～30％を含むバランスのとれた背景食で40g d-1）を提供し、大幅な体重減少を達成するのに役立つ可能性がある。背景となる食事のデザインと良好なアドヒアランスにより、腸内細菌叢とメタボロームに影響を及ぼすことが知られている重要な交絡変数の影響を軽減することができた。
本研究は、RS2介入後の特異的な微生物叢シグネチャーを報告した数少ない研究である。RS2摂取後に一般的に濃縮される分類群には、R. bromii、B. adolescentis、Faecalibacterium prausnitzii、Eubacterium rectaleが含まれる。主要なRS2分解菌として働くR. bromiiは、以前のRS2介入で濃縮された38。本研究では、R. bromiiとB. adolescentisは体重過多の個体においてRS介入後に顕著に増加した。B. adolescentisの存在量の増加は、BMIおよびVFAの減少と強い相関があり、RSの体重減少効果における役割が示唆された。ベースライン時に腸内細菌叢にB. adolescentisが存在していた参加者は、RS治療後に脂肪量がより減少した。さらに、ヒト微生物叢の移植を介して、宿主の肥満とグルコース代謝に対するRSの有益な効果をマウスに伝達し、RSによる微生物叢の変化が宿主に有益な結果をもたらすという我々の仮説を補強した。さらに、腸内細菌叢はRSの有益性に不可欠であり、これは無菌マウスへのRS介入によって検証された。
微生物叢由来の代謝産物の産生は、プレバイオティクスの機能に関与している7。胆汁酸は、腸内細菌叢と宿主をつなぐ重要なシグナル伝達代謝産物である28。ここでは、二次胆汁酸であるGDCAがRS処理後に有意に増加し、DCA、7-ケトLCA、TDCAなどの他の二次胆汁酸も増加傾向を示した。二次胆汁酸は肝脂肪症を改善し、インスリン感受性を増強することが報告されている39,40,41。BSHは胆汁酸の脱共役を行う31。我々の研究では、BSH遺伝子の存在量は減少し、B. vulgatusと有意な相関を示した。BSH活性を阻害することは、脂質とエネルギーのホメオスタシスを調節し、共役胆汁酸を増加させる有益なアプローチである可能性が浮上した31,34。我々のコホートでは、GCA、GDCA、TDCAを含む共役胆汁酸は、RS治療後に増加傾向を示した。ヒトでの所見と一致して、GCAおよびDCAは、無菌マウスにおけるB. adolescentis介入後に有意に増加した。GCAおよびDCAは、それぞれFXRおよび武田Gタンパク質共役型受容体5（TGR5）に対するアゴニストであり、グルコース、脂質およびエネルギー代謝を調節する受容体として知られている42。バリンおよびロイシンを含むBCAAsの血清レベルは、従来型環境および無菌環境の両方において、B. adolescentis介入後に有意に低下した。非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の参加者では、RS介入後にBCAAの血清レベルが低下した43。バリンのタンパク質分解による微生物産物である糞便中イソ酪酸44,45は、我々の研究ではRS介入後に減少した。
エネルギー調節と炎症の間の相互作用は、腸内細菌叢によって調節され、腸管透過性に影響を与え、代謝の健康に様々な効果を示す炎症性因子を生成した7。腸粘膜の完全性は、細胞間のタイトジャンクションを介して維持されており、このタイトジャンクションは腸透過性の重要な調節因子である22。RS誘導微生物叢を摂取したマウスでは、2つのタイトジャンクションタンパク質であるオクルジンとZO-1のレベルが回腸で上昇し、循環LPSが減少したことから、RSによって変化した腸内細菌叢が腸管バリアを保護する新たなメカニズムが示唆された。慢性的な低級炎症と免疫系の活性化は、肥満とインスリン抵抗性の発症に関与している22。また、腸内細菌叢の影響を受けた体重管理は、エネルギー利用と恒常性維持に関与する分泌タンパク質の調節を介している可能性がある7。メタゲノム解析の結果、RS処理後のB. adolescentisの存在量の増加が、血清中のANGPTL4と正の相関があることが示された。ANGPTL4は、腸内細菌叢との関連で大きな関心を集めている。無菌マウスは、通常飼育のマウスと比較して、腸内のANGPTL4発現が上昇していた3。ANGPTL4レベルの低下は、脂肪組織におけるLPL活性の亢進を通じて、通常飼育時の脂肪蓄積の増加に寄与している3。無菌マウスに酢酸産生菌Bacteroides thetaiotaomicronまたはメタン産生菌Methanobrevibacter smithiiをコロニー形成させると、腸内のANGPTL4発現が低下したが、酪酸産生菌Clostridium tyrobutyricumをコロニー形成させると、腸内のANGPTL4発現が有意に上昇した46。この結果の説明として考えられるのは、腸内ANGPTL4の調節は、形成される微生物代謝産物の混合物を決定する腸内細菌叢の組成に依存しており、基質の供給も関係しているということである46。FMTを用いて、RSによる腸内細菌叢の変化が、腸内ANGPTL4の調節を通じて脂質吸収を低下させることを観察した。さらに、通常の環境と無菌環境の両方で飼育した食事誘発性肥満マウスにB. adolescentisをコロニー形成させると、腸内のANGPTL4レベルが著しく上昇した。このように、腸内細菌叢の調節を通じて、脂質吸収の重要な調節因子であるANGPTL4を介して膵リパーゼ活性を操作することは、体脂肪蓄積を変化させる重要な方法かもしれない。B. adolescentisのサプリメントは、肝臓のFGF21感受性を高めることにより、NAFLDを緩和する可能性がある47。また、B. adolescentisの投与は、LPS-TLR4-NF-κB経路を抑制することにより、脂肪組織におけるFGF21感受性を高めることも明らかになった。FGF21類似体および模倣品の複数の臨床試験では、脂質プロファイルの改善、アディポネクチンの増加、体重の減少が認められた24。脂肪組織における肥満誘発性FGF21抵抗性を逆転させることが、肥満と関連疾患を治療するための代替的アプローチとなりうることが明らかになった48。
この研究の主な限界は、サンプル数が比較的少ないことと、参加者の組み入れ基準が厳しく、結果の一般化可能性が制限されていることである。データベースに依存した分類群ベースの解析は、分類学的分類のための包括的でよく注釈された情報を提供する一方で、分類が困難な配列を除外したり、菌株レベルの機能的多様性を見落としたりするなどの限界もある。メタゲノム配列の統合は、微生物生態学の理解を深め、臨床応用のための強固なバイオマーカーの同定を向上させる可能性がある。今回の結果をより広く一般化するためには、より大規模で多様なコホートにおいてさらなる検証を行う必要がある。今後の研究では、RS補給における微生物叢の個体動態と機能的反応に特に注意を払う必要がある。RSによって変化した胆汁酸と腸内細菌叢との間のクロストーク、および宿主の代謝への影響に関する詳細な洞察は、さらなる調査によって保証される。他の集団への適用性はまだ確認されていないが、本研究は、栄養補助食品としてのRS（40g d-1、タイプ2）が体重過剰の個人の体重減少を促進するという証拠を提供する。本研究はまた、腸内細菌叢に影響を及ぼす主要な交絡変数の影響を緩和するために、RSとともに効果的な食事デザインを提供する。RSによる腸内細菌叢の変化は、その効果に不可欠であった。腸内細菌叢はこの体重減少メカニズムにおいて極めて重要な役割を果たし、低悪性度炎症との相互作用やエネルギーバランスに関連した分泌タンパク質の制御を通じて肥満を調節する可能性があった。クロスオーバーデザインにより、体重はウォッシュアウト期間中に元に戻ることがわかった。体重の再増加は、減量治療における最大の課題の一つであり、GLP-1作動薬などの薬物投与を中止した後や肥満手術後にも起こる49。マイクロバイオームの組成を維持するために、RSを多く含む食事パターンを長期的に継続することは、体重維持にとって極めて重要である。RSは食品中に自然に存在し、毎日の食事に加えることもできるため、今回の発見は、肥満とそれに関連する代謝障害を治療するための実用的なライフスタイルを提供するものである。食事を通して腸内微生物の組成を操作することは、健康を促進するために宿主のエネルギーバランスを修正する戦略である可能性がある。
研究方法
研究参加者
組み入れ基準は、(1)年齢18～55歳、(2)BMI≧24kg m-2またはウエスト周囲径≧85cm（男性）、≧80cm（女性）と定義される過体重または肥満20。除外基準は、急性疾患、過去3週間以内の抗生物質またはプロバイオティクスサプリメントの使用、甲状腺機能亢進症または甲状腺機能低下症の診断、糖尿病、現在の全身性コルチコステロイド治療またはグルコース代謝に影響する薬物、試験前4週間以内の他の臨床試験への参加であった。
本研究は、上海第六人民病院の倫理委員会の承認を得ており、ヘルシンキ宣言に準拠している。参加者全員から書面によるインフォームド・コンセントを得た。完全な臨床試験登録はChinese Clinical Trial Registry（ChiCTR-TTRCC 13003333）に登録された（Extended Data Fig.1）。
治験実施計画書
詳細な臨床試験実施計画書は中国臨床試験管理公共プラットフォームに提出され、補足情報に掲載されている。体重過多の患者は、トウモロコシ由来のRS（HAM-RS2、Hi-Maize 260レジスタントスターチ、22000B00、Ingredion社提供）またはエネルギーマッチCS（AMIOCAコーンスターチ、04400110、同じくIngredion社提供）を交互に8週間摂取し、4週間のウォッシュアウト期間を置いた。独立した研究者が、CS-ウォッシュアウト-RSまたはRS-ウォッシュアウト-CS介入スキームへの無作為化と参加者の割り付けを1：1の割り付け比で行った。無作為化スケジュールは、SASソフトウェアのSAS PROC PLANにより作成された。RSとCSは同一の外見で同一の密封袋に包装され、二重盲検期間中、参加者と調査者は群割り付けについて盲検化された。無作為化計画は研究デザイナーだけが知っており、参加者、研究者、臨床スタッフ、結果評価者は盲検化されていた。盲検化は、腸内細菌叢がRSの生理学的効果をもたらす潜在的なメカニズムを探るためのバイオインフォマティクス解析の際に解除された。
この摂食試験の間、参加者は中国とアメリカの成人の過体重と肥満の予防とコントロールのためのガイドライン20,21に従って、均一な背景となる食事を受けた。参加者は全員、運動量が少ないか、座りっぱなしの生活をしていた。食事は毎日25kcal kg-1 理想体重（理想体重（kg）＝身長（cm）-105）、炭水化物50-60％、脂肪25-30％、蛋白質15-20％であった。参加者は毎日果物を1品食べることが許可され、余分な糖分の多い飲料や間食は控えるようアドバイスされた。参加者は、ベースライン時および各介入期間の開始時と終了時に、24時間連続3回（平日2回、週末1回）の食事摂取を記録した日記をつけ、食事の逸脱があればそれを記録した。訓練された栄養士が来院時にでんぷん消費量と食事療法の遵守状況を評価した。食事データから、RSとCSの介入期間の平均摂取カロリーと大栄養素の割合は同程度であることが明らかになった（補足表1）。
参加者は訪問（V）1～10のために研究所に出席した（図1a）。各介入の開始時と終了時（V1、V5、V6、V10）に、参加者は高インスリン血性-血糖クランプ、MTT、MRI検査、サンプル採取を受けた37。各訪問時に人体計測と生化学的評価が行われた。主要評価項目は体重で、副次的評価項目はVFAとSFA、体脂肪、ウエスト周囲径、脂質プロファイル、インスリン感受性、メタボローム、腸内マイクロバイオームであった。
人体測定と生化学的評価
一晩10時間以上の絶食後、朝、試験プロトコールに従って、人体計測検査と検体（静脈血、尿、糞便）採取を行った。
遠心分離後の血清検体は、AST、ALT、GGT、HDL-C、LDL-C、インスリン37を測定するまで-80℃で保存した。血清A-FABP（AIS、HKU、31030）、アディポネクチン（AIS、HKU、31010）、炎症性サイトカイン（Ebiosciense、TNFα、BMS223HS；MCP-1、BMS281；IL-1β、BMS224HS； IL-6、BMS213HS；IL-10、BMS215HS）、ANGPTL4（BioVendor、RD191073200R）およびFGF21（AIS、HKU、31180）を、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によって定量した。血清LPSレベルは、高感度リムルスアメーバサイト溶解物（LAL）アッセイ（Hycult Biotechnology、MAK109）により測定した。
MTT実験
グルコース代謝を評価するために、標準的な食事（315.2kcal、68.4gの炭水化物および10.4gのタンパク質を含む）（China Oil & Foodstuffs Corporation）後の実験室検査のために、空腹時および食後状態で連続血液サンプルを採取した。
高インスリン血症-血糖値クランプ
高インスリン血症-血糖クランプによりインスリン感受性を評価した。インスリンのプライム連続注入により、インスリン濃度を約100μU ml-1に維持した。血漿グルコース濃度を基礎レベルに維持するために、負のフィードバック原理に従った可変グルコース注入が行われた。グルコースクランプ法は既述のように行った50。
糞便DNA抽出と塩基配列決定
糞便サンプルはDNA安定化剤（STRATEC Molecular）を入れたチューブで採取し、-80℃で保存した。ヒトおよびヒトドナーからFMTを受けたマウスの糞便ゲノムDNAは、PSP Spin Stool DNA kit（STRATEC Molecular、1038100）を用いて、製造元の指示に従って抽出した。86サンプル（RS前後で27サンプル、CS前後で16サンプル）の糞便DNA抽出物を、ショットガンメタゲノムシーケンス用に全参加者から無作為に選択した。香港大学ゲノム科学センターで、ヒトサンプルの100-bpペアエンドショットガンメタゲノムシーケンスにHiSeq 1500を使用した。マウスサンプルの150bpペアエンドシーケンスには、Novogene社でIlluminaプラットフォームNovaseq 6000を使用した。生配列はNational Center for Biotechnology (NCBI) Sequence Read Archive (project ID PRJNA414688)に保存された。
メタゲノム解析
メタゲノムデータの品質管理
前述のように、一連の品質管理ステップを用いて低品質リード/塩基を除去した51。簡単に説明すると、すべてのイルミナのプライマー/アダプター/リンカー配列を除去し、低品質領域（品質スコア<20）とリードをトリミングした。その後、BWA v.0.7.4（文献52）を用いてすべてのリードをヒトゲノムにマッピングした。同一性95%以上、カバレッジ90%以上のリードはヒトDNAコンタミネーションとして除去した。
分類学と機能プロファイリング
リードの分類はMetaPhlAn53で決定した。全サンプルの平均存在量（最小平均存在量 > 0.3%）に基づいて、最も存在量の多い上位50種を抽出し、各サンプルの平均相対存在量全体の91%を占めた。未分類のリードの割合は、全サンプルで8.06±6.71%（平均±s.d.）であった。グループ内の個体間のベースラインの違いによる潜在的なバイアスを克服し、グループ間の比較を容易にするために、2つのグループ間の生の群集構造（種の相対存在量に基づく）の代わりに、群集レベルの変動パターン（種の存在量の変化率に基づく）を比較した。それぞれの種について、処理後の存在量のlog2FCを計算した。フォールドチェンジ値は（各グループの全サンプル内で）0から1の範囲で正規化し、正規化されたフォールドチェンジの合計が1になるようにさらにリスケーリングした。さらに、種の存在量の正規化された倍数変化のプロファイルに基づいて、Bray-Curtis距離を計算した。
RSまたはCSで処理した後に差異が生じた種は、FDRカットオフを0.2として、ウィルコクソンの符号順位検定を用いて検定した。上述の種レベルの存在量倍数変化の正規化Bray-Curtis非類似度に基づくNMDS順序解析は、RパッケージVEGAN54を用いて行った。ネットワークの可視化はCytoscape 3（文献55）を用いて行った。
IDBA-UD56は、k-merサイズが20から100 bpの範囲でde novoアセンブリーを採用した。KEGGパスウェイの機能アノテーションとアバンダンスの計算方法は、我々が開発したオンラインサーバーに記載されている57。微生物遺伝子の予測にはMetaGeneMark58を用いた。メタゲノムから得られたリードをアセンブルしたコンティグにマッピングし、遺伝子レベルのDNA量を100万個あたりのリード数（reads per kilobase per million: RPKM）で算出した。KOBAS59を使用して、アノテーションされた遺伝子に基づいてKEGGオルソログとパスウェイをアノテーションした。各パスウェイの集計 RPKM を計算するために、当社の公開サーバー57 のスクリプトを使用した。
メタゲノム関連解析
Rパッケージglmultiを用いて一般化線形モデリングを行った。各表現型について、応答変数は表現型の倍数変化であった；独立変数は、ウィルコクソン順位和検定を用いて、差次的に変化した分析においてFDR < 0.3の12種の倍数変化のサブセットから得られたものであった。線形モデルは'PHENOTYPE ~'から開始し、特徴選択で最良のモデルに到達するために、すべての可能なモデルを生成した。特定の種の変数の重要度は、補正AICに基づく自動モデル選択中に、その変数を含むモデルの総重量/確率の割合として計算された。この重要度指数は、すべての可能な重み付き線形モデルの全体的な支持を反映する。一般化線形モデルの主効果のみが考慮された。特定の種の変数のP値は、上位10モデル間のP値を組み合わせるために、フィッシャーの方法を用いて計算された。
(1)表現型と代謝産物、(2)腸内細菌と血中代謝産物、(3)腸内細菌パスウェイと血中代謝産物の関連を定量化するために、RのmixOmicsパッケージ60を用いた部分最小二乗判別分析（PLS-DA）を採用した。
ヒト血清サンプルのメタボロミクスプロファイリング
血清の非標的メタボロミクスデータは、CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical ChemistryのLTQ Orbitrap Velos装置（Thermo Fisher Scientific）に島津製作所製Prominence HPLCシステム（島津製作所）を接続して定量した。分析条件の詳細は、以前の研究61に記載されている通りであった。胆汁酸プロファイルの定量は、Metabo-Profile62,63,64を用いて行った。
ヒト糞便サンプルのメタボロミクスプロファイリング
ヒト糞便サンプルのメタボロミクスデータは、GC-TOF-MS（Agilent 6890N GCとLECO Pegasus HT TOF-MSの組み合わせ）により定量した。分析条件の詳細は、以前の研究65 に記載されている。
糞便脂質の評価
公表されている方法66,67を用いて、8週間のRSまたはCS介入後の参加者の糞便から糞便脂質を抽出した。約100mgの凍結乾燥糞便を100μlのエタノールと500μlの8N塩酸で酸性化し、80℃の水浴中で40分間保持した。その後、脂肪酸を1,250μlのジエチルエーテルと1,250μlの石油エーテルで抽出した。エーテル-脂肪上相をろ過した後、透明なエーテル溶液を集め、ロータリーエバポレーターで40℃で1時間保持した。脂肪酸をエタノールに再溶解し、酵素アッセイ（Jiancheng、A042-1-1、A111-1-1、A110-1-1）を用いてNEFA、TC、TGを測定した。
マウスモデル
香港大学のCommittee on the Use of Live Animals for Teaching and Researchおよび上海第六人民病院の動物倫理委員会が動物実験手順を承認した。健康なC57BL/6J雄マウスは、特定病原体フリーバリア施設において、温度（23±2℃）、湿度（60～70％）に制御された12時間の厳格な明暗サイクルのもと、餌と水に自由にアクセスできる状態で、1ケージあたり最大4匹のマウスを個々に換気したケージで従来通り飼育した。FMT実験では、10週齢の雄性C57BL/6J抗生物質処理マウス（GemParmatech、N000013）にWD（Research Diet、D12451）をコロニー形成前およびコロニー形成中2週間与えた。通常飼育マウスにB. adolescentisを投与する場合は、8週齢の雄マウスに同様にWDを8週間与えてからB. adolescentisを投与した。GF環境で飼育したマウスにRSにB. adolescentisを介入させるため、5週齢の雄性C57BL/6Jマウスをアイソレーター（GemParmatech社製、N000295）で飼育し、C35飼料（脂肪45％、タンパク質20％、炭水化物35％をRSまたはCS20％、残り80％をマルトデキストリンから摂取）を10週間摂取させた。一方、残りの8週間、マウスにB. adolescentisまたはPBSを経口接種した。
FMT実験
微生物叢が枯渇した抗生物質投与マウスに、毎日200μlの抗生物質カクテル（アンピシリン1g l-1、ネオマイシン1g l-1、メトロニダゾール1g l-1、バンコマイシン0.5g l-1）を7日間経口投与し、その後4日間の抗生物質洗浄期間をおいてからFMTを行った。FMTについては、新鮮な便サンプルの調製とその後のマウスでの操作は、以前に記載されたとおりに行った43。
体重は3～4日ごとに測定した。便サンプルは糞便移植の前後に採取し、さらに分析するまで-80℃で即座に保存した。体組成は、Minispec LF90 体組成計（Bruker）を用いて測定した。In vivoでの腸管透過性、GTT、ITT、および全身の酸素消費量は、包括的な実験動物モニタリングシステム（Columbus Instruments）68を用いて測定した。鼠径皮下脂肪組織、精巣上体脂肪組織、腎周囲脂肪組織および腸間膜白色脂肪組織の脂肪量は、湿重量測定により死亡後に測定した。さらなる生化学的評価のために血液と各種組織が採取された。本試験では、研究者に群配分の盲検化は行われず、除外されたマウスはいなかった。
細菌株
B. adolescentis strain E 298 b (Variant c) (DSMZ no. 20086)をDSMZから購入した。培地はDSMZのウェブサイトに従って調製し、B. adolescentisは嫌気性ワークステーション（Gene Science AG300）で培養した。B. adolescentisは、カゼインペプトン（トリプシン消化物、Sigma-Aldrich）、酵母エキス（Sigma-Aldrich）、肉エキス（Sigma-Aldrich）、バクトソイトーン（BD）、グルコース（Sigma-Aldrich）、K2HPO4、MgSO4×7 H2O、MnSO4×H2O、Tween 80、NaCl、システイン-HCl×H2O（Sigma-Aldrich）、食塩水および0. 025% レサズリン（Sigma-Aldrich）。培養物の純度はグラム染色でモニターし、c.f.u.は連続希釈液を寒天プレートにプレーティングしてカウントした。
B. adolescentisの投与
B. adolescentisを1,500g、30分間、4℃で遠心分離し、滅菌PBSで2回洗浄した後、20％グリセロールを含む2mlの嫌気性滅菌PBSに懸濁した。この懸濁液を-80℃で保存した。マウスの飲料水に添加する前に、生きたB. adolescentisのストックを4℃で解凍し、100mlのオートクレーブ水で希釈した。平均して、各マウスは1日あたり少なくとも4×1010c.f.u.を摂取した。B. adolescentisを121 °C、225 kPaの圧力下で15分間加熱死滅させた。培養による生菌確認試験を行ったところ、加熱死菌は増殖しなかったが、生菌のB. adolescentisは良好に増殖した。実験期間中、3群で毎日飲料水を交換した。さらにGFマウスには、PBSまたは200μlの滅菌嫌気性PBSに1×109c.f.u.の生きたB. adolescentisを8週間にわたり週3回経口投与した。
マウスの生化学的および免疫学的アッセイ
血清中のTCおよびTG、ならびに肝内、腸内および糞便中のTG濃度を酵素分析（Stanbio Laboratory, 2100430および1100430）により測定した。血清NEFAは酵素分析で測定した（Roche Diagnostics）。血清アディポネクチン（AIS、HKU、32010）、ANGPTL4（Abcam、ab210577）、炎症性血清分子（eBioscience、MCP-1、BMS6005；IL-1β、BMS6002；IL-6、BMS603-2；IL-10、BMS614INST）およびFGF21（Immunodiagnostics Limited、32180）は、ELISAを用いて測定した。腸間膜白色脂肪組織および血清中のLPSレベルは、LALアッセイ（Hycult Biotechnology, HIT302）を用いて測定した。
マウスサンプルのメタボロミクスプロファイリング
アミノ酸プロファイリング
標的アミノ酸は、Waters AccQ-Tag誘導体キットを用い、血清20μlをトリプル四重極8050（島津製作所製）搭載A Nexera X2 ultra HPLCで定量した。分析条件の詳細は以前の研究61に記載されている。
胆汁酸プロファイリング
標的胆汁酸は、Vanquish UPLC-Q Exactive（Thermo Fisher Scientific）システムで分析した。血清サンプル（50μl）中の胆汁酸は、内部標準物質を含む200μlのメタノールで抽出した。ピーク検出と積分はTrancefinder（Thermo Fisher）を用いて行った。標準曲線で定量した結果を特徴解析に用いた。サンプル調製と分析条件の詳細は、以前の研究69 に記載されている。
SCFA プロファイリング
試料の前処理として、30μlの血清を、内部標準物質0.3μg ml-1酪酸-d7を含む60μlのアセトニトリルと混合した。ボルテックスと遠心分離の後、上清を吸引し、その後の分析に使用した。糞便サンプルについては、粉砕ボールで40 mgの糞便を、内部標準抽出物、内部標準酪酸-d7酸20 μmol l-1を含むアセトニトリル200 μlと混合した。粉砕および遠心分離後、上澄み液を吸引し、その後の分析に使用した。
分析測定には、MSDガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）システム（Agilent）を装備したAgilent 5977A装置をSCFA分析に使用した。GC分離にはDB-FFAPカラム（30 m×250 μm×0.25 μm、Agilent）を採用した。初期温度は50℃で1分間維持した後、10℃min-1で180℃まで昇温し、直ちに30℃min-1で250℃まで昇温し、2分間維持した。ヘリウムキャリアガスの流量は40 cm s-1に保った。インジェクター、イオン源、四重極およびインターフェースの温度は、それぞれ250、230、150および250 °Cであった。選択イオンモニタリングモードでは、酢酸とイソ酪酸はm/z 43、プロピオン酸はm/z 74、その他のSCFAはm/z 60でプロトン化分子を検出した。ピークの検出と積分は定量分析（Agilent）を用いて行った。標準曲線で定量した結果を特徴解析に使用した。マウスのメタボロームプロファイルはすべて CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry で行った。
FGF21応答試験
8週間のB.adolescentis介入期間後、通常飼育マウスでFGF21反応試験を行った。全身麻酔下で皮下脂肪生検を行い、液体窒素で瞬間凍結した。その後、2mg kg-1の組換えマウスFGF21またはビヒクルを下大静脈から静脈内注射した。15分後、2回目の皮下脂肪生検を行い、遺伝子発現とErk1/2リン酸化を評価した。
定量的PCRアッセイ
組織サンプルの全RNAをTRIzol（Invitrogen）で抽出し、ImProm-II逆転写酵素（Promega）を用いて相補的DNAに逆転写した。逆転写による定量的PCR（RT-qPCR）反応は、Quantifast SYBR Greenマスターミックス（QIAGEN）を用いて、Light Cycler 480システム（Roche）で行い、マウスGAPDHで標準化した。各遺伝子およびB. adolescentis70のプライマーは補足表11に示す。
組織学的検査
回腸切片をZO-1またはオクルディン抗体（Abcam, 1:500希釈, ab96587; 1:100希釈, ab216327）で処理した後、Alex Fluor-596またはFITC標識二次抗体（Life Technologies）でインキュベートし、DAPIでカウンター染色した。回腸切片をANGPTL4抗体（Proteintech, 1:500希釈, 18374-1-AP）で処理した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（DAKO）とインキュベートし、製造元の推奨に従ってDABで現像した。画像定量には、個々の切片の異なる領域から無作為に5フィールドを選択した。ImageJソフトウェアを用いて陽性染色の強度を分析し、各フィールドにおける病変または絨毛の総面積に対するパーセンテージで表した。
腔内リパーゼ活性
小腸の管腔内容物と氷冷PBSの混合物を十分にボルテックスした後、15,000g、4℃で10分間遠心分離した。上清を回収し、PBS で 1:100 に希釈し、リパーゼ活性測定キット（Sigma, MAK109）を用いて、製造元のプロトコールに従ってリパーゼ活性を測定した。
ウェスタンブロッティング
プロテアーゼ阻害剤（ST505, Beyotime Biotechnology）とホスファターゼ阻害剤（P1082, Beyotime Biotechnology）を含む溶解バッファーでWATタンパク質を抽出した。タンパク質サンプルをSDS-PAGE（8%）で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜にイムノブロットした。細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ1/2（Erk1/2）（Cell Signalling Technology、1:1,000希釈、9102）およびリン酸化Erk1/2（Thr202/Tyr204）（Cell Signalling Technology、1:1,000希釈、9101）を用いてイムノブロットを行った。免疫反応性は、enhanced chemiluminescent autoradiography（Millipore）を用いて検出した。バンドの定量はImageJソフトウェアを用いて行った。
統計解析
本研究の統計解析計画は、補足情報に掲載されている。EpiData v.3.1により臨床データの入力と文書化が容易になった。特に断りのない限り、統計解析にはSPSS v.17およびR v.3.3.2ソフトウェアを使用した。正規分布の臨床データは平均値±s.d.で示した。コルモゴロフ・スミルノフ検定により検証された非正規分布データは中央値とIQRで示した。転帰に対する介入の効果は、年齢、性別、介入順序で調整した線形混合モデルを用いて分析し、多重検定補正のためのBonferroni調整を行った。動物実験では、Shapiro-Wilk検定とLevene検定を用いてデータの分布と分散の等質性を評価した。2群間比較では、両側Studentの無対t検定（正規分布）またはノンパラメトリックWilcoxon順位和検定（非正規分布）を適用した。複数群間では、一元配置分散分析（正規分布）後にTukeyのpost hoc検定、またはKruskal-Wallis検定（非正規分布）後にDunnの検定を行った。臨床試験では、文献および予備データに基づいて、RS介入後の体重の予想変化量およびそのs.d.を2±2.8kgと推定した。有意水準0.05、検出力80％の両側検定では、最小サンプルサイズ31が必要であった。無作為化後に予想される17％の脱落を考慮して37人の参加者を募った。動物実験では、サンプルサイズは過去の研究とアッセイのばらつきに基づいて推定された。両側P値＜0.05を統計的に有意とみなした。
報告概要
研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
個人レベルの患者データは、データ管理委員会の同意があれば各施設からアクセス可能であり、一般には公開されていない。データ管理委員会は全ての要請を検討し、アクセスを許可する（成功した場合）。承認時には正式なデータ移転契約が必要となる。通常、データへのアクセスに関するすべての要請は1ヶ月以内に回答される。共有されるデータはすべて非識別化される。メタゲノムRawシーケンスデータは、NCBI Sequence Read ArchiveにアクセッションID PRJNA414688で寄託されており、公開日現在、一般に入手可能である。本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、主担当者のW.J. (wpjia@sjtu.edu.cn)から要請があれば入手可能である。ソースデータは本論文とともに提供される。
コードの利用可能性
本論文ではカスタムコードは使用していない。データ解析に使用した一般公開されているコードとツールは、すべてMethodsで報告し、参照している。
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謝辞
本試験に参加した医療スタッフおよび試験参加者に感謝する。貴重な示唆をいただいたJ. WuとR. Zengに感謝する。本研究は、中国国家重点研究開発計画（2022YFA1004804）、上海市重点臨床専門、上海内分泌代謝疾患研究センター（2022ZZ01002）、中国国家自然科学基金（NSFC）主要国際（地域）共同研究プロジェクト（81220108006）によりW.J.に助成された。 L.にNSFC優秀若手科学者基金（82022012）、NSFC一般基金（82270907）、NSFC主要プログラム（92357305）、上海ハイレベル地方大学革新的研究チーム（SHSMU-ZDCX20212700）、香港奨学生プログラム（XJ2013035）、上海交通大学医学部200人プログラム。 L.、香港研究助成委員会（AOE/M/707-18）からA.X.、マリー・スクロドフスカ・キュリー・アクションズ・アンド・イノベーティブ・トレーニング・ネットワークス（H2020-MSCA-ITN-2018 813781）からG.P.、 DFG under Germany's Excellence Strategy (EXC 2051) project ID 390713860 to G.P. and Y.N.; Shenzhen Basic Research Program (JCYJ20190808182402941) and Guangdong Basic and Applied Research Major Program (2019B030302005) to J.L.. NSFC重点基金（21934006）、中国科学院戦略重点研究プログラム（B）（XDB38020200）をG.X.に、中国科学院青年創新推進協会（2021186）をX.Liu.に、香港理工大学（P0042740）をP.L.に授与。
著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Huating Li, Lei Zhang, Jun Li, Qian Wu.
著者および所属
上海交通大学医学部附属上海第六人民病院内分泌代謝科糖尿病研究所上海糖尿病臨床センター上海糖尿病重点実験室（中国、上海市
Huating Li, Lei Zhang, Qian Wu, Lingling Qian, Yueqiong Ni, Mingliang Zhang, Liang Wu, Qichen Fang, Xiaoxue Long, Jianping Ye, Yuqian Bao & Weiping Jia
香港大学医薬生物工学国家重点実験室、香港、中国
李華亭・徐愛民
中国・香港大学医学部
李華亭・徐愛民
中国・上海交通大学医学部医学科
レイ・チャン、チアン・ウー、リンリン・チエン、リャン・ウー、シャオシュエ・ロン
香港城市大学感染症・公衆衛生学部、香港、中国
Jun Li & Junsheng He
ドイツ・イエナ、ライプニッツ天然物・感染生物学研究所マイクロバイオームダイナミクス部門
Jun Li, Yueqiong Ni, Kang Kang & Gianni Panagiotou
クラスター・オブ・エクセレンス・バランス・オブ・ザ・マイクロバース、フリードリヒ・シラー大学イエナ、ドイツ・イエナ
ユエキオン・ニー & ジャンニ・パナギオトゥ
ヴュルツブルク大学分子感染生物学研究所（ドイツ・ヴュルツブルク
ペティア・コヴァチェヴァ・ダッチャリー
中国・上海海洋大学食品科学技術学院
袁瑞、劉双博、趙岳亮
中国・上海交通大学医学部付属上海第六人民病院臨床栄養部
リー・シェン
中国・上海交通大学コンピューター科学・工学部
ビン・シェン
香港理工大学計算機学部（中国・香港
ピン・リー
香港理工大学デザイン学部（中国・香港
ピン・リー
中国科学院大連化学物理研究所・分析化学分離科学CAS重点実験室（中国・大連
王暁林、李延利、葉耀瑞、徐国王、劉信宇
中国・鄭州大学附属鄭州中央病院代謝疾患研究センター
葉建平
中国・上海交通大学医学部公衆衛生学院
趙岳亮
フリードリヒ・シラー大学生物科学部（ドイツ・イエナ
ジャンニ・パナギオトゥ
香港大学李嘉誠医学部微生物学科（中国・香港
ジャンニ・パナギオトゥ
貢献
W.J.、A.X.、G.P.、H.L.およびX.Liuがプロジェクトの構想および設計を行った。H.L.、L.Z.、J.L.、Q.W.が研究を管理した。H.L.、L.Z.、L.Q.は臨床診断、参加者の募集、介入を行った。L.S.は臨床栄養士として研究を支援した。L.Z.、L.Q.、L.W.はサンプルと臨床表現型を収集した。G.P.、J.L.、Y.N.、K.K.およびJ.H.はバイオインフォマティクス解析を行った。X.Liu.、G.X.、P.K.-D.、X.W.、Y.L.、Y.Y.がメタボロミクスプロファイリングとデータ解析を行った。L.Z.、Q.W.、L.Q.、X.Long.、M.Z.、Q.F.、R.Y.、S.L.、Y.Z.が動物実験を行った。B.S.とP.L.は医用画像解析を行った。H.L.、L.Z.、J.L.、Q.W.が原稿を執筆。W.J.、A.X.、G.P.、P.K.-D.、J.Y.、Y.B.が査読・編集を行った。この多地域共同研究において、貢献と著者の基準は慎重に検討された。
該当著者
Huating Li、Xinyu Liu、Gianni Panagiotou、Aimin XuまたはWeiping Jiaまで。
倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Metabolism誌は、本研究の査読にご協力いただいた匿名査読者に感謝する。主担当編集者：Yanina-Yasmin Pesch、協力：Nature Metabolismチーム。
その他の情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権主張および所属機関に関して中立を保っています。
拡張データ
図1 CONSORT図。
本試験の登録、介入割り付け、追跡調査、データ解析の手順を示すCONSORTフロー図。RSはレジスタントスターチ、CSはコントロールスターチ。
Extended Data 図2 体重過多者における8週間のRS介入後の肥満および糖代謝の改善。
(a-e)介入2週間ごとの(a)体重、(b)脂肪量および(c)ウエスト周囲径、ならびに介入4週間ごとの(d)内臓脂肪(VFA)および(e)皮下脂肪面積(SFA)の動的変化を示す箱ひげ図（中央値付き）。線は各時点における結果の平均を結ぶ。横線は、連結エンドポイントを比較するために実施された線形混合モデル解析とボンフェローニの検定の結果を示す。RS-ウォッシュアウト-CS群、n=19人。CS-ウォッシュアウト-RS群、n=18人。*** P < 0.001. (f-h)標準化食事負荷試験（MTT）をベースライン（0週）および8週間のRSまたはCS介入後に実施した。(f）血糖値。(g）血糖の曲線下面積（AUC）の変化と解析。(h) 血清インスリン。(i) 8週間のRSまたはCS介入前後のELISAによる血清アディポネクチン値の変化。f-hは各群n=36人、iは各群n=37人。データは平均値±s.e.m.で表した（f、h）。データは箱ひげ図（g, i）で示す。各ボックスの中央の水平線は中央値を、ボックスの上下の境界線は75パーセンタイルと25パーセンタイルを、ひげは最低値と最高値を示す。介入順序で調整した線形混合モデルによるRS介入とCS介入の差について、* P = 0.023および0.020（f）、0.016（g）、0.036（h）、および0.038（i）、および† P = 0.022、† P = 0. 001 (f) and 0.001 (g), †† P < 0.001 (f) for the difference before and after RS intervention (RS 0W vs. RS 8W) by linear mixed model adjusted by intervention order followed by Bonferroni's test.
Extended Data 図3 腸内細菌叢の分類学的プロフィールとベースライン組成。
(a)RSおよびCS介入による全サンプルの腸内細菌叢の種レベルでの分類学的プロフィール。サンプル名は「介入（RSまたはCS）個々のID_時点（0週目または8週目）」のルールを用いて命名した。(b-e）RS介入ベースラインとCS介入ベースラインの間のベースライン微生物組成の分析。(b) Bray-Curtis距離法を用いたCS-Washout-RS群のβ多様性。(c) Bray-Curtis距離法を用いたRS-Washout-CS群のβ多様性。(d) CS-Washout-RS群に対するweighted-Unifrac距離法によるベータ多様性。(e) 加重ユニフラック距離法によるRS-ウォッシュアウト-CS群のベータ多様性。すべてのβ-多様性プロットでは、種の存在量の組成プロファイルに基づくNMDS（Non-metric multidimensional scaling）が用いられた。ANOSIMの結果は、微生物組成のベースライン比較可能性を支持した（P > 0.05）。
出典データ
Extended Data 図4 RSの2つの主要な分解微生物叢のベースライン存在量と臨床転帰との関係。
(a-d）（a）B.adolescentisとR.bromiiのベースライン存在量間の両側ピアソン相関。(b) B. adolescentisのベースライン存在量とR. bromiiの存在量変化。(c) R. bromiiのベースライン個体数とB. adolescentisの個体数変化。(d) B. adolescentisとR. bromiiの存在量の変化。B. adolescentisとR. bromiiの変化は処理後のlog2倍変化で計算した。ベースラインの存在量値は、相関分析の前に中心対数比（CLR）変換を行った。線とグレーのゾーンは、95％信頼区間付きの適合線形回帰線を示す。(e)主要種（B. adolescentisとR. bromii）の存在とRS処理後の主要結果の変化の関係。主要な結果の変化は、処理後のlog2倍変化で示した。バイオリンプロットはデータ分布のカーネル密度推定を示し、埋め込まれたボックスプロットは中央値と四分位範囲を示す。ヒゲはIQRの1.5倍まで伸びている。R. bromii陽性個体ではn = 16、R. bromii陰性個体ではn = 11、B. adolescentis陽性個体ではn = 9、B. adolescentis陰性個体ではn = 18。陽性群と陰性群間の統計的差異は、両側ウィルコクソン順位和検定を用いて評価し、P値はプロットの上に表示した。* 脂肪量とANGPTL4(e)のP = 0.033と0.046。色は主要種の存在（陽性、オレンジ）または非存在（陰性、シアン）を示す。
出典データ
Extended Data 図5 RS介入とCS介入の代謝関連KEGGパスウェイのトップ10。
データは治療後のlog2倍変化で示され、平均±s.e.m.で表される（RSの前後で27個体、CSの前後で16個体）。介入間の統計的差異は、両側Wilcoxon順位和検定を用い、Benjamini-Hochberg法を用いて多重比較のためにPを調整して評価した。
出典データ
Extended Data 図6 RS処理に対する宿主のメタボロミクス。
(a)種の存在量変動（介入後の変化倍率）と循環代謝産物の変動（介入後の変化倍率）の間の線形相関の強さ（モデル平均した赤池情報量規準[AlC]重要度）。重要度は、モデル選択時に当該変数を含む線形モデルのAlC重みの合計である。(b-g）8週間のRSまたはCS介入後の糞便SCFAの変化（各群n = 16人）。(b）酢酸塩。(c）プロピオン酸。(d）酪酸。(e）イソ酪酸。(f) バレレート。(g) ヘキサン酸塩。データは中央値と四分位範囲。* P = 0.030 (f), ** P = 0.006 (e) for the difference between RS and CS intervention by linear mixed model adjusted by intervention order and † P = 0.047 (f), † P = 0.004 (e) for the difference before and after RS intervention (RS 0W vs. RS 8W) by linear mixed model adjusted by intervention order followed by Bonferroni's test.
出典データ
Extended Data 図7 FMT後の微生物種、エネルギー代謝、糖代謝の変化。
(a)RSまたはCS介入後に採取したドナーからの糞便スラリーを投与されたマウスの盲腸内容物サンプルについて、全ゲノムショットガンメタゲノムシークエンシングを行った。ドナーと糞便微生物移植（FMT）を受けたマウスの間で、RSによる変化の類似傾向を示す種を示した。データはlog10（RS/CS）で示した。RS/CSは、RS介入後（マウスに対するRSドナーからのFMT）の相対的微生物量の、CS介入後（マウスに対するCSドナーからのFMT）の相対的微生物量の比として定義した。(b-i)マウスをグループ分けし、図4と同様に処置した（1グループあたりn = 8生物学的複製）。(b)24時間エネルギー消費量、(c)呼吸交換比（RER）、(d)酸素消費量、(e)二酸化炭素産生量、(f)活動量、および(g)摂餌量は、実験終了時に総合実験動物モニタリングシステムを用いて測定した。(h)グルコース負荷試験(GTT)は、RSまたはCSドナーの微生物叢をコロニー形成させたマウスで行った。(i)GTTの曲線下面積（AUC）分析。 (j)血清アディポネクチン濃度を糞便微生物叢移植終了時に測定した（各群n = 15生物学的複製）。データは3つの独立した実験で再現された。データは平均値±s.e.m.で示した。有意性は両側スチューデントのt検定により決定した。* P = 0.03 (h)、*** P < 0.001 (j)。
出典データ
Extended Data Fig. 8 ビフィズス菌は脂肪組織におけるFGF21の感受性を増強した。
マウスにB. adolescentisを投与する前に8週間西洋食を与え、B. adolescentisを強化した滅菌水（WD+B.a）、加熱殺菌したB. adolescentis（WD+hk-B.a）またはPBS（WD）を5週間飲ませる3群に無作為に割り付けた。8週間のB.adolescentis介入期間後、マウスを用いて線維芽細胞増殖因子21（FGF21）応答試験を行った。(a)血清リポ多糖（LPS）レベル。 (b)白色脂肪組織（WAT）における分化クラスタ14（CD14）の転写。(c) WATにおけるtoll-like receptor 4 (TLR4)の転写。(d）FGF21の血清レベル。(e）WATにおける線維芽細胞増殖因子受容体1（FGFR1）の転写。(f）WATにおけるβklotho（KLB）の転写。(g）WATにおける初期成長応答因子1（EGR1）の転写。(h）rmFGF21（2mg/kg、i.v.）投与前後におけるin vivoでの細胞外シグナル調節キナーゼ1/2（Erk1/2）のリン酸化（Thr202/Tyr204）および総Erk1/2のリン酸化をウェスタンブロット解析により検出した。(i) Erk1/2リン酸化の倍数変化の定量分析。サンプルは同じ実験に由来し、ゲルは並行して処理された。データは平均値±s.e.m.である。WD+B.a、n=5生物学的複製；WD+hk-B.a、n=5生物学的複製；WD、n=6生物学的複製。* P = 0.04 (b), 0.01 (f), and 0.02 (i), ** P = 0.004 (a), 0.009 (c), 0.001 (d), 0.002 (f), and 0.002 (g), *** P < 0.001, based on one-way ANOVA (normal distributed) followed by Tukey's post hoc test or Kruskal-Wallis test (non-normally distributed) followed by Dunn's test.
出典データ
Extended Data 図9 Bacteroides adolescentisのサプリメント摂取により、マウスの代謝物が変化した。
(a-c)SPFマウスはExtended Data Fig.7と同様にグループ分けし、処理した（WD+B.a, n = 5 biological replicates; WD+hk-B.a, n = 5 biological replicates; WD, n = 6 biological replicates）。(d-f)無菌マウスはFig.7と同様にグループ分けし、処理した（各グループn = 5 biological replicates）。(a）血清中のGCA、DCA、TDCA、TβMCA、TCDCA、TCA、およびTLCAのレベル。(b）糞便中のSCFAsレベル。(c）血清中のバリン、イソロイシン、ロイシンの濃度。(d）無菌マウスの血清中のGCA、DCA、TβMCA、TCDCAおよびTCAレベル。(e）無菌マウスの糞便中のSCFAsレベル。(f）無菌マウスの血清中のバリン、イソロイシン、ロイシンのレベル。データは箱ひげ図で示してある。各ボックスの中央の水平線は中央値を、ボックスの上下の境界線は75パーセンタイルと25パーセンタイルを、ひげは最低値と最高値を示す。一元配置分散分析（one-way ANOVA）、Tukeyのpost hoc検定（a-c）、両側Studentのunpaired t検定（d-f）で解析。* P = 0.05, 0.03, 0.04 (a), 0.02 (c), 0.016, 0.024 (d), 0.015 (e), 0.034, 0.028, 0.025 (f), ** P = 0.006, 0.003 (a), 0.008 (b), 0.006 (c), 0.002, 0.005 (d), *** P < 0.001. SPF, specific pathogen-free; GCA, glycocholic acid; DCA, deoxycholic acid; TDCA, taurodeoxycholate; TβMCA, tauro-β muricholic acid; TCDCA, taurochenodeoxycholic acid; TCA, taurocholic acid; TLCA, taurolithocholic acid.
出典データ
Extended Data 図10 レジスタントスターチの摂取は、腸内細菌叢を再構築することにより、ヒトの体重減少を促進する。
レジスタントスターチ（RS、40 g d-1）を等エネルギー食とバランス食に併用すると、体重が明らかに減少し、インスリン感受性が改善し、メタゲノミクスとメタボロミクスも変化した。糞便微生物叢移植（FMT）は、RSの利点が腸内細菌叢組成の再構築と関連していることを示した。マウスにB. adolescentisを単コロニー化したところ、ヒトにおけるRSの効果と密接に相関し、マウスは食事誘発性肥満から保護された。メカニズム的には、RSによる腸内細菌叢の変化は、腸内細菌叢の代謝物に影響を与え、腸内環境の改善により慢性的な低悪性度炎症を抑制し、アンジオポエチン様4（ANGPTL4）を調節することにより脂質吸収を抑制し、脂肪組織における線維芽細胞増殖因子21（FGF21）の感受性を改善した。SPF、specific-pathogen-free；LPS、lipopolysaccharide；BCAAs、branched-chain amino acids；Erk1/2、extracellular signal-regulated kinase 1/2；FGFR1、fibroblast growth factor receptor 1。BioRender.comで作成。
補足情報
補足情報
研究プロトコールおよび統計解析計画。
報告概要
補足表1
補足表1-11
ソースデータ
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
出典データ Fig.
統計的出典データ。
ソースデータ Fig.
統計的出典データ。
ソースデータ Fig.
統計的出典データ。
ソースデータ Fig.
統計的出典データ。
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ 拡張データ 図3
統計的ソースデータ。
ソースデータ 拡張データ 図4.
統計的ソースデータ。
ソースデータ拡張図5.
統計的ソースデータ。
ソースデータ拡張図6
統計的ソースデータ。
ソースデータ拡張図7.
統計的ソースデータ。
ソースデータ拡張図8.
統計的ソースデータ。
ソースデータ 拡張データ 図8
未処理のウェスタンゲル。
ソースデータ 拡張データ 図9
統計的ソースデータ。
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Li,H.、Zhang,L.、Li,J.他、レジスタントスターチの摂取は、腸内細菌叢を再形成することにより、ヒトの体重減少を促進する。Nat Metab (2024). https://doi.org/10.1038/s42255-024-00988-y
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2023年01月08日
受理
2024年1月17日
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2024年2月26日
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