ポリフェノールが豊富な食事は、マクロファージ・好中球と腸内細菌叢の相互作用を仲介し、腸の炎症を緩和する

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Cell Death Dis. 2023 Oct; 14(10)： 656. オンライン公開 2023年10月9日. doi: 10.1038/s41419-023-06190-4
PMCID: PMC10562418PMID: 37813835
ポリフェノールが豊富な食事は、マクロファージ・好中球と腸内細菌叢の相互作用を仲介し、腸の炎症を緩和する

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10562418/

Dandan Han,1 Yujun Wu,1 Dongdong Lu,1 Jiaman Pang,1 Jie Hu,1 Xiangyu Zhang,1 Zhenyu Wang,1 Guolong Zhang,2 and Junjun Wangcorresponding author1
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要旨
食餌性フェノール酸は、腸内細菌叢の組成を変化させ、マクロファージの活性化を制御することにより、腸の炎症を緩和する。しかし、個々のフェノール酸が炎症性腸疾患（IBD）において腸内細菌叢とマクロファージの相互作用にどのような影響を及ぼすかは不明である。ここでは、フェノール酸が腸の炎症を緩和するメカニズムを解明することを目的とする。デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）投与後、クロロゲン酸、フェルラ酸、カフェ酸、エラグ酸の4種類のフェノール酸を、マクロファージが減少しているマウスまたは減少していないマウスに投与した。さらに、フェノール酸が介在する保護効果における腸内細菌叢の役割を調べるために、腸内細菌叢の枯渇と糞便微生物叢の移植をマウスで行った。大腸炎の重症度は、組織学的、血清学的、免疫学的測定により評価した。腸内細菌叢とマクロファージの欠如は、黄砂性大腸炎における上皮傷害を悪化させた。クロロゲン酸は、ピルビン酸キナーゼM2（Pkm2）依存的な解糖の抑制とNOD様受容体タンパク質3（Nlrp3）の活性化の抑制を介して、M1マクロファージの分極を低下させることにより、大腸炎を軽減した。しかしながら、フェルラ酸を介した大腸炎の軽減は、好中球細胞外トラップの形成を減少させることによる好中球依存的なものであった。一方、カフェ酸とエラグ酸の有益な効果は腸内細菌叢に依存していた。実際、腸内細菌叢によってエラグ酸から変換される代謝産物であるウロリチンA（UroA）は、IL22依存的に大腸炎を緩和し、腸のバリア機能を高めることがわかった。全体として、フェノール酸が大腸炎を予防するメカニズムは、腸内細菌叢とマクロファージ・好中球の相互作用に起因することが示された。

主題 炎症性腸疾患、粘膜免疫学、細胞極性
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はじめに
炎症性腸疾患（IBD）は、常在細菌叢に対する粘膜免疫応答の亢進と調節異常によって引き起こされ、その結果、腸の炎症、組織損傷、微生物異常症を引き起こす [1, 2]。IBDの正確な病因はいまだ不明であるが、IBDの病態においてマクロファージが中心的な役割を果たしていることを示唆する証拠が増えつつある [3-7] 。マクロファージは、さらなる分化、腸管恒常性の維持、炎症の双方向制御のための顕著な可塑性を有している [5, 8]。マクロファージは、微生物産物や宿主のサイトカインで刺激されると、特定の環境に適応するために、形態や活性化状態を急速に変化させる [9] 。IBDは、腸内細菌叢の変化に応答した、調節不全の炎症性マクロファージ活性化から生じる可能性がある [5] 。マクロファージの炎症性免疫表現型から制御性免疫表現型への移行は、M2分極化を促進し、M1マクロファージにおけるIL-6産生を抑制し、腸内恒常性を変化させることにより、大腸炎の緩和に寄与する [3, 6, 7]。特に最近の研究では、代謝プロファイルとマクロファージの表現型や機能との関連性が示されている [10-12]。したがって、マクロファージの異常な分極化と免疫代謝を正確に制御することは、微生物の排除、損傷細胞の除去、上皮細胞の再生を促進するメディエーターの産生において極めて重要である。

腸内細菌叢は、消化管の完全性の維持、腸粘膜のホメオスタシス、消化管がん、宿主の栄養代謝に決定的に関与していることがよく知られている [13-17] 。最近、腸内微生物の組成および微生物代謝産物の変化がIBDと関連していることが示された [18-21] 。デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）投与マウスやIL-10欠損マウスでは、腸内細菌叢が大腸炎の開始と発症に必要である [22-25]。腸内細菌叢を正常化することで腸の恒常性を回復させることは、IBDの治療介入の有力なターゲットと考えられている。実際、健康なドナーの腸内細菌叢を大腸炎患者に移植すると、マウス大腸炎モデルの炎症反応が緩和されることが示されている [22] 。我々は以前、緑茶ポリフェノールを投与したマウスの糞便微生物叢を移植すると、微生物群集構造と代謝プロファイルが変化することにより、腸管上皮の恒常性が改善し、大腸炎が改善することを報告した[26]。

フェノール酸は、フェノール環とカルボン酸基を含む化合物の大きなグループを構成している。食事性フェノール酸は、腸の炎症を抑え、腸内細菌叢を変化させることにより、腸の機能を改善することが示されている [26-29]。さらに、ポリフェノールと微生物叢は協調して働き、マクロファージの活性化と腸内微生物の代謝産物を調節することにより、腸の炎症に影響を与える [26, 29-31]。特に、クロロゲン酸、フェルラ酸、カフェ酸、エラグ酸を含む食事の摂取は、腸内細菌叢の組成を形成し、免疫恒常性を調節することによって、腸の健康に決定的な影響を与えた [27, 32-35]。現在のところ、フェノール酸を介した腸の炎症緩和における腸内細菌叢とマクロファージの関与については、ほとんど知られていない。微生物叢とマクロファージ間の複雑な相互作用を制御された方法で理解するために、我々は抗生物質処理マウスまたはマクロファージ欠失マウスと4種類のユニークなフェノール酸を併用し、フェノール酸と腸内微生物叢およびマクロファージとの相互作用を調べた。

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結果
腸内細菌叢とマクロファージのクロストークが大腸炎の重症度に影響する
腸内炎症における腸内細菌叢とマクロファージの相互作用を調べるため、WTマウスのBMDMを移植したマクロファージ減少マウスと、SPFマウスの微生物叢を移植した抗生物質投与マウスで、それぞれ大腸炎を誘発した。3％黄砂投与の2日前、および黄砂投与中の1日目と4日目に、クロドロネート担持リポソームをin vivo投与してマクロファージを枯渇させた（図（Fig.1A）.1A）。対照群の28.23±2.41%に比べ、クロドロネート負荷リポソーム注射マウスではF4/80陽性細胞が有意に増加した（57.65±4.84%）（補足図1A）。マクロファージが欠損したマウスはDSS誘発大腸炎に罹患しやすく、疾患活動性指数（DAI）の上昇（図（1C）,1C）により測定されたが、体重減少（図（1B）,1B）および結腸長（図（1D）,1D）は認められなかった。マクロファージ減少マウスにおける大腸炎増加の免疫学的基盤を明らかにするために、大腸におけるサイトカイン産生を解析した。マクロファージ欠乏マウスの大腸では、DSS投与後、TNF-aの分泌が著しく増加したが、IL-6の分泌は増加しなかった。マクロファージ欠損マウスではIL-10レベルの低下が観察された（図（Fig.1E）.1E）。同様に、マルチサイトカイン解析では、マクロファージ切除によりDSS投与マウスで血清炎症因子レベルが高くなることが示された（図（Fig.1F）.1F）。このことは、マクロファージが枯渇したマウスでマクロファージ集団を回復させるとサイトカインレベルは低下するが、疾患の重症度は改善しないことを示している。腸炎症におけるマクロファージの役割をさらに検討するため、DSS投与中の5日目に、健常ドナーのBMDMをマクロファージ枯渇大腸炎マウスに移植した（図（Fig.1A）.1A）。レシピエントはTNF-αとIL-1βの分泌が減少し、IL-10レベルが上昇した（図1E, F）。このことは、マクロファージの不在が腸の炎症を促進していることを示している。

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図1
腸内細菌叢とマクロファージの欠如はDSS大腸炎における上皮傷害を増強する。
A マウスに200μLのクロドロネート担持リポソームを3日おきに3回、飲料水に3％黄砂を投与する2日前と、黄砂投与中の1日目と4日目に腹腔内注射した。一部のマクロファージ減少マウスには、DSS投与前にWTマウスから単離したBMDMを投与した。B-D 大腸炎の重症度は体重減少、DAI、結腸長として測定した（n = 8）。E, F 結腸ホモジネート中のTNF-α、IL-6およびIL-10のレベル、ならびに血清中のTNF-α、IL-1βおよびIL-6の分泌量。G DSS大腸炎モデルの飲料水に4-ABXカクテルを投与したマウス。個々のドナーからの糞便微生物懸濁液を、飲料水に3％の黄砂を投与する前に、抗生物質投与マウスの一部に移植した。H-K 大腸炎の重症度は、体重減少、DAI、結腸長、MPO活性として測定した（n = 8）。L 結腸ホモジネート中のTNF-α、IL-6およびIL-10のレベル。M, N 結腸組織におけるTnf-α、IL-1β、IL-6、Claudin-4およびZO-1のmRNAレベル。O マクロファージ減少マウスの微生物叢組成。P値はFDR補正。*P < 0.05, **P < 0.01; Wilcoxon順位和検定。P 抗生物質投与DSS大腸炎マウスにおけるF4/80+陽性マクロファージの浸潤。データは3回の実験の平均値±SD。統計は一元配置分散分析、Tukeyの多重比較検定で行った。*p < 0.05、**p < 0.01。

マウスには、4種類の抗生物質カクテルを2週間飲水に混ぜて投与した後、健康なドナー個体から採取した糞便微生物懸濁液を1日おきに1回、4週間経口接種した（図（Fig.1G）.1G）。予想通り、マウスは細菌DNA含量の明らかな減少を示し（補足図1B）、糞便サンプル内の総細菌数は4-log減少した（補足図1C）。抗生物質投与を受けたFMTマウスの糞便中の細菌DNA濃度と総細菌数は、抗生物質投与マウスよりも有意に多かった（補足図1B、C）。抗生物質投与マウスは、体重減少（図（1H）,1H）、疾患活動性指標（図（1I）,1I）、大腸ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性の上昇（図（1K）,1K）に示されるように、DSS誘発大腸炎に対する感受性が亢進していたが、抗生物質投与マウスは、大腸ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性の上昇（図（1K）,1K）に示されるように、DSS誘発大腸炎に対する感受性が亢進していた。 K),1K)を示したが、大腸組織におけるIL-10の分泌低下(図(1L),1L)、Il-6遺伝子レベルの上昇、Tnf-αおよびIl-1β発現の低下(図(1M),1M)などから明らかなように、SPF大腸炎マウスよりも炎症反応を起こしにくかった。一方、微生物叢を欠失させたマウスは、クローディン-4とZO-1のmRNAレベルの低下によって示されるように、腸管バリアが弱くなった結果として、上皮傷害が悪化した（図（Fig.1N）.1N）。大腸炎の進行に関連する腸内細菌叢の存在をさらに明らかにするため、SPFマウスから採取した微生物叢を、微生物叢が枯渇した大腸炎レシピエントに移植した。コントロールからの糞便微生物叢を受けたマウスは、結腸長の増加（図（1J）,1J）、MPO活性の低下（図（1K）,1K）、腸管バリア機能に関連する遺伝子発現の亢進（図（1N）,1N）を示した。また、FMTマウスでは、大腸組織においてIL-6の分泌は低下したが、IL-10の分泌は上昇した（図（Fig.1L）,1L）。しかし、FMTでは体重減少率（図（1H）1H）およびTnf-α、Il-1β、Il-6のmRNAレベル（図（1G）1G）を改善できなかったことから、腸内細菌叢が黄砂大腸炎の発症に関与していることが示唆された。さらに、マクロファージの枯渇がマイクロバイオームの組成を変化させることも示した（図（1I,1I）および補足図2）。F4/80陽性マクロファージの集団増加は、微生物欠失マウスではFMTによって減少した（図（1P）,1P）。このことは、腸内細菌叢がDSS大腸炎におけるマクロファージの浸潤に影響を与えうることを示している。これらの結果から、腸内細菌叢とマクロファージの相互作用が、上皮炎症傷害の維持に関連していることが確認された。

フェノール酸は大腸炎を改善し、マクロファージの表現型を変化させる
腸内細菌叢とマクロファージのクロストークを考慮し、フェノール酸が大腸炎に及ぼす影響と、この影響が腸内細菌叢とマクロファージの存在に依存するかどうかを調べた。フェノール酸の有益な効果を調べるため、マウスに4種類のユニークなフェノール酸を8日間経口投与し、3日目に3％の黄砂を5日間飲水で自由摂取させ、図に示すように急性実験的大腸炎を誘発した。図2A.2A. クロロゲン酸は大腸炎に対して有効であり、体重減少、DAI、大腸長、腸病理および組織学的スコアに影響を与えた（図2B-F）。同様に、カフェ酸、フェルラ酸、エラグ酸も、体重減少、DAIスコアの低下、結腸短縮の緩和、結腸粘膜の炎症細胞浸潤の低下など、大腸炎の重症度を有意に改善することができた（図2B-F）。さらに、フェノール酸を投与すると、全身および大腸の炎症のマーカーにおいて有意な減少が観察された（補足図3A-F）。DSS大腸炎モデルの結果と同様に、フェノール酸を投与すると、TNF-α、IL-1β、IL-6の分泌もLPSに反応して明らかに減少した（補足図3G）。

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図2
フェノール酸はDSS誘発大腸炎を軽減し、潜在的にマクロファージの分極をシフトさせる。
A マウスに4種類のユニークなフェノール酸、クロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸、エラグ酸を8日間投与し、3日目に飲料水中の3％DSSを5日間自由摂取させて急性実験的大腸炎を誘発した。B-D 大腸炎の重症度は体重減少、DAI、結腸長で測定した（n = 8）。E, F フェノール酸経口投与後8日目の結腸組織のH&E染色と組織学的スコア。G, H 炎症性CD11b + CD11c+結腸マクロファージのフローサイトメトリー解析。I 大腸組織におけるM1マクロファージシグネチャー遺伝子Nox2、Cxcl9のmRNA誘導。データは3回の別々の実験の平均値±SDを表す。統計は一元配置分散分析、Tukeyの多重比較検定で行った。*p < 0.05、**p < 0.01。

DSSを投与したマウスの大腸組織では、より多くの炎症細胞の浸潤とTNF-α、IL-1β、IL-6の上昇が観察されたので、次に、特にマクロファージに注目して、大腸炎に関与する細胞成分の変化を調べた。フェノール酸による大腸炎の抑制がマクロファージの極性化の調節を介して達成されたかどうかを検証するために、マウスの大腸におけるM1マクロファージシグネチャー遺伝子の発現とCD11b + CD11c+、M1マクロファージの頻度を解析した。予想されたように、CGAとFAは、結腸のCD11b + CD11c+、M1マクロファージの頻度を有意に減少させた（図2G、H）。RT-PCRでも、Nos-2とCxcl9のmRNAレベルの上昇が、CGAまたはFAの存在下でダウンレギュレートされることが確認された（図（Fig.2I）.2I）。マクロファージ表現型の解析から、炎症性M1マクロファージの顕著な減少が明らかになった。マクロファージの極性化に対するフェノール酸の影響をさらに調べるために、フェノール酸存在下と非存在下の両方で、LPS刺激マウスRAW264.7細胞の特性を評価した。M1特性を示すIl-1β、Il-6、Tnf-a、Nos-2、Cxcl9のmRNA発現も、CGAとFAで前処理した場合はLPSに応答して有意に減少したが、CAやEAでは減少しなかった（補足図3H）。これらのデータは、フェノール酸が潜在的にマクロファージのM1表現型への分極を阻害して腸の炎症を抑制することを示唆している。

クロロゲン酸はマクロファージ-NLRP3軸を介して大腸炎の重症度を調節する
大腸炎に対するフェノール酸の保護作用がマクロファージに依存するかどうかを調べるため、フェノール酸投与2日前、およびフェノール酸投与中の1日目と4日目にクロドロネート担持リポソームをin vivo投与してマクロファージを枯渇させ、3日目に、図に示すように、3％の黄砂を5日間自由摂取させた飲料水で急性実験的大腸炎を誘発した。Fig.3A.3A. しかし、大腸炎の症状はカフェ酸、フェルラ酸、エラグ酸によって顕著に緩和され、組織学的および血清学的な炎症マーカーも顕著に消失した（図3B-F）。注目すべきことに、マクロファージが枯渇したマウスでは、クロロゲン酸による大腸炎の重症度軽減効果は観察されなかった（図3B-F）。これは、クロロゲン酸による保護効果にはマクロファージが必要であることを示している。M1マクロファージの表現型は、Nlrp3の活性化とIL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL9などの炎症性メディエーターの誘導によって特徴づけられる［36, 37］。そこで次に、Nlrp3を標的として、マクロファージの分極を制御することで重症大腸炎を治療できるかどうかを調べた。CGAは、DSSを投与したマウスの大腸組織において、M1シグネチャーサイトカインの発現増加もNlrp3遺伝子の発現増加も抑制した（図3G-J、および補足図4A）。クロロゲン酸によるDSS誘発大腸炎の緩和がNlrp3インフラマソームの介入に依存していることをさらに確認するために、Nlrp3の阻害剤であるCY-09-投与マウスで検証した。CY-09投与マウスのNlrp3 mRNAレベルは、対照マウスのそれに対して有意に減少した（補足図4B）。予想通り、CGAはCY-09投与マウスの黄砂による全身性炎症のマーカーを減少させることができなかったが、CY-09投与マウスは対照マウスよりも炎症因子の遺伝子発現が高いことが示された（図3K, L）。次に、Nlrp3を欠失させると、CGAのM1極性化に対する効果が逆転するかどうかを調べた。その結果、Tnf-α、Il-1β、Il-6、およびCxcl9の転写産物が有意に増加したため、CGAはCY-09投与マウスにおけるDSS誘発炎症性M1-マクロファージ誘導を改善しなかった（図3G-J）。同様に、フローサイトメトリー解析から、大腸炎中のNlrp3欠損マウスの大腸組織において、CD11b＋CD11c＋M1-マクロファージの割合はCGAによって減少しなかった（図（Fig.3M）.3M）。これらのデータは、DSS誘発大腸炎に対するCGAによる防御において、Nlrp3が重要な役割を果たしていることを示している。

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図3
クロロゲン酸はマクロファージ欠失マウスでもNlrp3欠損マウスでも大腸炎を改善しない。
A 実験デザインの概略。B-D 大腸炎の重症度は体重減少、DAI、結腸長として測定した（n = 8）。E, F フェノール酸経口投与後8日目の結腸組織のH&E染色と組織学的スコア。G-J CY-09投与マウスおよび対照同腹子の結腸におけるM1特性化Tnf-a、Il-1β、Il-6、およびCxcl9のmRNA発現。K, L CY-09投与マウスおよび対照同腹子の血清中のTNF-αおよびIL-6の分泌。M 炎症性CD11b + CD11c+結腸マクロファージのフローサイトメトリー解析（n = 6）。データは3回の別々の実験の平均値±SDを表す。統計は非対立二側Student's t testまたは一元配置分散分析、Tukeyの多重比較検定で行った。*p < 0.05、**p < 0.01。

CGAはマクロファージ欠失マウスでもCY-09投与マウスでも大腸炎の重症度を調節しなかったことから、次に、CGAの大腸炎に対する保護効果がマクロファージ-NLRP3軸によって達成される可能性を検討した。Nlrp3欠損マクロファージが腸の炎症にどのように影響するかを理解するために、LPS刺激Caco2細胞をNlrp3-WTまたはNlrp3-KDマクロファージとそれぞれ共培養した（補足図4D）。Nlrp3 siRNAの効率はRT-PCRで確認した（補足図4C）。予想されたように、LPSはCaco2細胞のTEERを有意に低下させたが、共培養系では炎症性サイトカインレベルを上昇させた。さらに、マクロファージにおけるNlrp3の枯渇は、TEERの顕著な低下とサイトカインの高分泌によって証明されるように、このIECバリア欠損を悪化させ、Caco2細胞における腸管バリア完全性の低下と一致した。興味深いことに、CGAは、Nlrp3-KDマクロファージではなく、Nlrp3-WTマクロファージで培養したCaco2で観察されたこれらのバリア破壊作用を逆転させた（図3E-G）。これらのデータを総合すると、マクロファージにおけるNlrp3の欠損が腸管上皮バリア機能を低下させることが確認され、CGAがマクロファージ-Nlrp3軸に依存して上皮の炎症を緩和し、腸管バリア機能を増強する能力を示すことが示された。

クロロゲン酸の抗炎症作用は、PKM2依存的解糖を介する
次に、CGAがどのようにしてNlrp3の活性化を阻害し、その結果、腸の炎症を抑制するのか、そのメカニズムについて理解を深めようとした。最近の研究では、炎症反応と解糖系反応との間に関連性があることが示されており、具体的には、解糖系の亢進によるNlrp3のプライミングと活性化の制御が指摘されている [38]。そこで我々は、CGAがマクロファージの解糖、ひいてはLPSに応答したNlrp3の活性化に対して何らかの調節効果を持つかどうかを調べることを目的とした。LPSに反応させると、ピルビン酸キナーゼM2（Pkm2）、ヘキソキナーゼ2（Hk2）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ1（Pdk1）、乳酸デヒドロゲナーゼA（Ldha）といった解糖に関連するmRNAの発現が強く誘導されたが、CGAはマクロファージにおけるこの発現上昇遺伝子レベルを有意に低下させた（図4A-D）。また、CGAの存在下では、LPSによって誘導されたグルコーストランスポータータンパク質1（Glut1）のmRNA発現の増加と乳酸産生の増加が有意に減少することが観察された（図4E、F）。重要なことに、解糖を示す細胞外酸性化率（ECRA）の亢進は、CGA処理によって回復した（図（Fig.4G）.4G）。さらに、CGAは細胞生存率に影響を及ぼさなかった（補足図5A）。このことから、CGAは解糖を介することで抗炎症作用を発揮している可能性が示唆された。

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図4
クロロゲン酸はマクロファージのPKM2依存性解糖を抑制することにより抗炎症作用を発揮する。
A-E RT-qPCRによるPkm2、Hk2、Pdk1、Ldha、Glut1のmRNAレベルの解析。F、H、I 乳酸産生、カスパーゼ-1およびNLRP3活性のELISA。G ECRAのSeahorse XF-96細胞外フラックスアナライザー。J-M RAW264.7細胞（n = 6）におけるIL-1β、IL-18、IL-6およびTNF-αの分泌。データは3回の別々の実験の平均値±SDを表す。統計は、対応のない両側Student's t testまたは一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、Tukeyの多重比較検定で行った。*p < 0.05, **p < 0.01。

CGAによる防御がマクロファージの代謝表現型と関連しているかどうかを調べるため、解糖系経路の最終律速反応であるPKM2を標的とした。Pkm2をRNAiでノックダウンすると、LPSで刺激したマクロファージにおいて、Hk2、Pdk1、Ldha、Glut1のmRNA発現が減少した（図4B-E、および補足図5B）。さらに、PKM2の阻害は、LPS処理後のマクロファージによる乳酸値、細胞外酸性化率、カスパーゼ-1およびNlrp3の活性化、IL-1β、IL-18、IL-6の増加を有意に抑制したが、TNF-αの放出は抑制しなかった（図4F-M）。しかしながら、CGAは、PKM2-KDマクロファージではなく、PKM2-WTマクロファージにおけるHk2、Pdk1、LdhaおよびGlut1の遺伝子発現のLPS誘導増加を有意に阻害した（図4B-E）。その結果、ECRAおよび乳酸産生に対するCGAの阻害効果は、PKM2の欠失によって回復した（図4F、G）。このことは、PKM2の阻害が、CGAによる解糖のダウンレギュレーションを媒介することを示している。さらに、LPS誘導マクロファージにおけるCGA処理によるカパーゼ-1およびNlrp3の活性化、ならびにIL-1βおよびIL-18の分泌の減少は、PKM2のノックダウンでは抑制できなかった（図4G-K）。これらの所見を総合すると、CGAの抗炎症作用は、PKM依存性の解糖を減少させることで克服できるという証拠となる。次に、PKM2欠損マクロファージにおける上記の解糖系の変化が、ミトコンドリアの機能障害に起因するものであるかどうかを検討した。CGAは、膜電位の低下と高レベルのMitoSOXを特徴とする機能不全ミトコンドリアを緩和する能力を示したが、この保護効果はPKM2欠損マクロファージでは減弱した（補足図5C、D）。以上のデータはすべて、CGAがPKM2依存性の解糖を阻害し、ミトコンドリア機能を維持することによって抗炎症効果を発揮し、それによってマクロファージ-Nlrp3軸を調節してM1極化を防ぐことを効果的に示している。

フェルラ酸は好中球細胞外トラップの形成を抑制することにより大腸炎を緩和する
形態学的に、FAは大腸粘膜における炎症細胞の浸潤を減少させる能力を示した（図（Fig.2E）.2E）。フローサイトメトリー解析により、FAを投与したマウスでは、ビヒクル対照群と比較して好中球の大腸浸潤が有意に減少した（補足図6A）。さらに、FAを投与すると、好中球によるIl-17とIl-22の産生が減少した（補足図6B）。次に、3％DSS投与開始の2日前、およびその後DSS投与期間中の1日目と4日目に特異的Ly6G枯渇抗体をin vivo投与することにより、大腸炎における好中球の役割を直接評価した（図（Fig.5A）.5A）。フローサイトメトリーにより、Ly6G陽性細胞は、対照群の26.25±1.70%に比べ、抗Ly6G抗体注射マウスでは有意に減少した（60.27±2.24%）（補足図7）。好中球を欠失させたマウスをレシピエントとして、FAサプリメントの存在下または非存在下で大腸炎モデルを行った（図（Fig.5E）.5E）。好中球の枯渇は、疾患活動性指標および結腸短縮の増加によって証明されるように、大腸炎の症状を有意に延長したが、体重減少の割合は増加しなかった（Fig.5B-D）。好中球が大腸炎に寄与する機序を明らかにするために、TNF-α、IL-1β、IL-6を含む炎症因子の産生を調べた。TNF-αおよびIL-1βの分泌は、DSS処理後の好中球減少マウスの大腸において著しく減少したが、IL-6の分泌は減少しなかった。しかし、FAは好中球除去マウスにおける炎症性サイトカインの上昇を抑制しなかった（図5F-H）ことから、好中球はFAによる炎症の消失に寄与していることが示された。FAが好中球の機能を調節することによって大腸炎の発症を予防できるかどうかを検討するにあたり、我々はFAが介在する保護効果は好中球細胞外トラップ（NET）の形成に起因するのではないかと仮定した。NET形成はDNA結合MPOの定量により確認した。FA投与は、DSS大腸炎マウスの好中球におけるMPO/DNAシグナルを有意に減少させた（図(5I),5I）ことから、FAは、少なくとも部分的には、NETs形成の阻害を介して、DSS誘発大腸炎を緩和することが示された。

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図5
フェルラ酸は好中球細胞外トラップ形成の阻害を介して、少なくとも部分的にDSS誘発大腸炎を改善する。
A マウスに抗IgG2aまたは抗Ly6Gを3％DSS投与の2日前、およびDSS投与中の1日目と4日目に腹腔内注射した。B-D 大腸炎の重症度は体重減少、DAI、結腸長として測定した（n = 8）。E 実験デザインの概略。F-H 血清中のTNF-α、IL-1βおよびIL-6の分泌。I MPO-DNAシグナルのELISA（n = 6）。データは3回の別々の実験の平均値±SDを表す。統計は、対応のない両側Student's t testまたは一元配置分散分析、それに続くTukeyの多重比較検定で行った。*p < 0.05、**p < 0.01。

カフェ酸とエラグ酸の有益な効果は微生物叢依存的である。
病気の重症度に対するフェノール酸の保護効果が腸内細菌叢に依存しているかどうかを調べるために、野生型マウスをDSS処理前に腸内細菌叢を擾乱するために広域抗生物質カクテルに暴露した（Fig. (Fig.6A).6A）。その結果、DSS大腸炎モデルと比較して、CAとEAの両方が全身および腸の炎症を改善できることがわかった（図（Fig.2）.2）。しかしながら、微生物叢を欠失させたマウスにCAまたはEAを補充しても大腸炎の重症化は抑制されなかったことから、大腸炎の重症化におけるCAおよびEAの影響は微生物叢依存的であることが示された（補足図8）。CAまたはEAの摂取によって変化した微生物叢が、個々に大腸炎モデルの重症度低下に寄与するかどうかを評価するために、CAまたはEAのいずれかを摂取したマウスの糞便をDSSを投与したレシピエントに移植する糞便微生物叢移植（FMT）を行った。しかし、移植後、微生物叢移植のレシピエント間で大腸炎の重症度に有意差は観察されなかった。CAまたはEA投与ドナーの糞便微生物叢を投与されたマウスは、体重減少率の減少、疾患活動性指標の低下、および結腸短縮を示した（図6B-D）。さらに、FMTは、大腸炎モデルマウスの血清および大腸組織における炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1βの上昇を抑制した（図6E、F）。このことは、CA-およびEA-改変微生物叢の両方が、大腸炎の保護を効果的に伝達できることを示している。

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オブジェクト名は41419_2023_6190_Fig6_HTML.jpgである。
図6
カフェ酸およびエラグ酸は微生物叢依存的にDSS誘発大腸炎を緩和する。
A 実験デザインの概略。B-D 大腸炎の重症度は体重減少、DAI、結腸長として測定した（n = 8）。E, F CAまたはEA投与ドナーの糞便微生物叢を投与したマウスの血清および結腸ホモジネート中のTNF-α、IL-1β、IL-6の分泌。エラグ酸の腸内微生物代謝産物をDSSモデルに移植すると、大腸炎を軽減することができた。G-I 大腸炎の重症度は、体重減少、DAI、および結腸長として測定した（n = 8）。J CAまたはEA投与ドナーからの微生物代謝物を投与されたマウスの結腸ホモジネート中のTnf-α、Il-1β、Il-6およびIl-22 mRNAレベルのRT-qPCR分析。データは3回の別々の実験の平均値±SDを表す。統計は一元配置分散分析（one-way ANOVA）、Tukeyの多重比較検定で行った。*p < 0.05、**p < 0.01。

炎症制御における腸内細菌および微生物叢由来のシグナルの重要な効果を考慮し[19, 20]、CAまたはEAを投与したマウスから得られた糞便微生物叢の代謝物をDSS投与マウスに移植した。興味深いことに、EA群の腸内細菌叢が産生する代謝産物を大腸炎マウスに移植したところ、大腸炎コントロールと比較して、体重減少、DAI、大腸短縮、巨視的大腸炎スコアが有意に減少した（図6G-I）。(図6G-I）。さらに、Tnf-α、Il-1β、Il-6、およびIl-22のmRNAレベルも、代謝産物移植レシピエントの大腸において顕著に低下した（図（Fig.6J）.6J）。同様に、大腸炎モデルに対して、腸内微生物の存在下でCAが産生した代謝産物を投与したマウスでは、大腸炎の重症度に有意差は認められなかった（図6G-J）。代謝産物移植実験から、CA投与マウスではなく、EA投与マウスの腸内微生物の代謝産物が抗炎症効果を示すことが示唆され、EAの保護効果は腸内微生物の代謝産物の交代によって達成されたことが示された。

ウロリチンAはIL22依存的に大腸炎を緩和し、腸管バリア機能を高める
これまでの研究から、エラグ酸とその代謝産物であるウロリチンが炎症の有害な影響に対する予防に寄与することが示されている [29]。この情報に基づき、ウロリチンの補充実験を、微生物叢とその代謝物を移植する代わりに行い、ウロリチン産生の増加に起因する可能性があるとして、どのようなEA効果があるかを調べた。その際、DSS大腸炎マウスにUroAとUroBを投与した。図7A.7A. 注目すべきことに、EAをUroAに置き換えても、同様の結果と成果が観察された。大腸炎対照群と比較して、体重減少、DAI、結腸短縮、巨視的大腸炎スコアの減少に代表されるように、UroA投与は、UroB投与ではなく、大腸炎の重症化を抑制した（Fig.7B-F）。さらに、UroA投与は炎症性サイトカインIL-1β、TNF-α、IL-6、IL-22の分泌を抑制した（図7G、H）。微生物の代謝産物が腸上皮に近接していることから、UroAが上皮細胞の機能に直接影響を及ぼす可能性が示唆された。In vitroで、UroA存在下または非存在下でのLPS刺激Caco2細胞の特性を評価した。予想通り、UroAを投与すると、TEERの低下とOccludin、Claudin-4、ZO-1のタイトジャンクション関連遺伝子発現の増加が観察され、バリア欠損が緩和された（補足図9A、B）。これらの観察から、UroAは大腸炎を緩和し、腸管バリアの完全性を促進できることが示された。

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図7
大腸炎に対するウロリチンAの保護作用にはIL-22が必須である。
A 実験デザインの概略。B-D 大腸炎の重症度は、体重減少、DAI、および結腸の長さで測定した（n = 8）。E, F ウロリチン経口投与後8日目の結腸組織のH&E染色と組織学的スコア。G, H 血清中のTNF-α、IL-1β、IL-6およびIL-22の分泌、ならびに結腸ホモジネート中のTNF-α、IL-1βおよびIL-6のレベル。I マウスに抗IgG2aまたは抗IL22を腹腔内注射し、DSS大腸炎モデル3日目にウロリチンAを経口投与した。J-L 疾患の重症度は、体重減少、DAI、結腸長として測定した（n = 8）。M DSSチャレンジ後8日目の、ウロリチンA投与マウスからのRORγ＋IL22＋自然免疫性リンパ球細胞集団のフローサイトメトリー。データは3回の別々の実験の平均値±SDを表す。統計は、無対二側スチューデントのt検定または一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、Tukeyの多重比較検定で行った。*p < 0.05、**p < 0.01。

バリア機能亢進の根底にある機序をより深く理解するために、次に、IL-22の分泌が大腸炎時のUroAの保護効果に必要であるかどうかを調べた。DSS大腸炎実験のUroA処理を、IL-22に対する中和抗体を含めて繰り返した（図（Fig.7I）.7I）。フローサイトメトリーに基づくと、IL22陽性細胞は、対照群の6.75±1.99％と比較して、抗IL22抗体注射マウスでは有意に減少した（18.50±3.66％）（補足図10A）。興味深いことに、中和抗体によるUroA処理では、大腸炎に伴う体重減少、DAI、結腸短縮、結腸の損傷を防ぐことはできなかった（図7J-L）。さらに重要なことに、IL-22中和後の大腸炎では、自然リンパ球（ILC3）数の減少を誘導するUroAの能力が失われていることがわかった（図7M,7M、および補足図10B）。この結果は、IL-22がUroAの大腸炎予防効果に関与している可能性を示した。

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考察
本研究の目的は、フェノール酸が腸の炎症に及ぼす影響に腸内細菌叢とマクロファージが関与しているかどうかを解明することである。これに向けて、我々はマクロファージ欠失マウスまたは微生物叢欠失マウスに4種類のユニークなフェノール酸を投与した大腸炎DSSモデルを用い、大腸炎の重症度を調節するマクロファージと微生物叢の相互作用に食事ポリフェノールがどのように影響するかを明らかにした。その結果、フェノール酸が様々な異なる様式で大腸炎を予防することが支持された。具体的には、クロロゲン酸はマクロファージ依存的なメカニズムで大腸炎を緩和した。しかし、フェルラ酸を介した大腸炎の軽減は、少なくとも部分的には好中球依存的に達成された。さらに、カフェ酸とエラグ酸は、腸内細菌叢に依存した抗炎症効果を発揮した。IL-22は、腸内微生物の存在下でエラグ酸が産生する代謝産物であるウロリチンAの、腸管バリアの完全性と炎症に対する緩和作用に関与していた。

マクロファージの可塑性により、マクロファージは変化する微小環境の手がかりに反応することができ、その結果、マクロファージは炎症性（M1）マクロファージと抗炎症性（M2）マクロファージなど、異なる表現型に偏向する [9] 。M1/M2マクロファージ分極のバランスは、炎症の解消と腸の恒常性維持に重要であると考えられている [4, 8]。そのため、マクロファージの分極を再プログラムするか、M1マクロファージをM2表現型に偏らせることで、マクロファージの分極と機能に焦点を当てた治療アプローチが、IBDにおける臨床的な有望性を示している [10, 39]。食事由来のポリフェノールは、大腸炎の緩和において、M1マクロファージからM2マクロファージへの表現型転換を促進することができた [40]。このことから、クロロゲン酸による保護にはマクロファージが必要であることが示された。NLRP3インフラマソームは、M1マクロファージ極性の再プログラミングとIL-1β産生の誘導において決定的に重要である [37]。NLRP3はクロロゲン酸の大腸炎改善作用に必要であるが、NLRP3のノックダウンはクロロゲン酸の逆転作用を弱めた。マクロファージの細胞代謝プロファイルがマクロファージ分極化の重要な構成要素であり、炎症解消におけるマクロファージの機能に不可欠であることを考えると [11, 12]、ここで示されたデータは、PKM依存的解糖を減少させることにより、CGAの抗炎症効果を克服できることを示している。PKM2の欠損は、NLRP3インフラマソームの阻害を介してIL-1β放出を減少させた。最近の研究によると、PKM2によって駆動される解糖が、NLRP3インフラマソームを活性化することによってIL-1β放出の制御に寄与していることが示された[41, 42]。我々は、クロロゲン酸がPKM2依存性の解糖を阻害することにより、大腸炎を緩和し、大腸炎に起因するディスバイオシスを予防し、それによってNlrp3の活性化を阻害して、炎症性M1マクロファージを抗炎症性M2表現型に移行させるという最初の証拠を提供する。フェルラ酸はM1マクロファージの極性化を防ぐことができたが、マクロファージ欠損マウスでは、大腸の炎症マーカーの上昇もフェルラ酸によって抑制された。好中球とマクロファージの異なるサブセットとの協調的相互作用は、組織修復過程に不可欠である [43, 44]。好中球は最近、NETを放出することによってマクロファージにIL-1βの転写を促すだけでなく、マクロファージの分極を修復的表現型に向かわせることに関与していることが証明された [45]。好中球とマクロファージの協力と炎症消失への影響を考慮すると、フェルラ酸による大腸炎の改善は好中球依存的であり、部分的にはNETの形成を阻害することで達成されることが初めてわかった。これは、in vivoでNETの放出を阻害することで大腸炎が抑制されることを示した最近の研究と一致している [47]。

蓄積された証拠から、腸の健康維持におけるフェノール酸の有益な効果は、腸内微生物の変化を通じて克服されることが確認された [25, 30, 31]。我々は、フェノール酸による微生物叢の調節と大腸炎緩和効果の因果関係を明らかにするために研究を行った。カフェ酸もエラグ酸も、微生物叢を欠失させたマウスおよびDSS誘発マウスにおいて大腸炎の重症度を調節しなかったことから、ポリフェノールと腸内微生物叢の相互作用が腸の炎症を緩和する上で中心的な役割を果たしていることが支持された。これらの知見は、フェノール酸によって変化した腸内微生物とその代謝プロファイルが抗大腸炎活性に及ぼす因果関係についての理解を深めるものであり、IBDをターゲットとした治療アプローチの今後の開発の指針となるものである。ポリフェノールを介した健康効果における腸内細菌叢とその関連代謝産物の役割をさらに理解するために、我々はFMTを採用し、ポリフェノール投与による疾患予防に腸内細菌叢の調節がどのように影響するかを探った。以前、黄砂誘発大腸炎モデルにおいて、大腸炎誘発マウスに緑茶ポリフェノールを摂取させたドナーの糞便を投与したところ、大腸炎の症状が改善された[26]。ここで、カフェ酸またはエラグ酸を投与したマウスの糞便微生物叢を大腸炎レシピエントに移植すると、大腸炎が抑制されることを報告したが、このことは、カフェ酸およびエラグ酸が介在するDSS大腸炎からのマウスの保護において、腸内微生物が不可欠である理由を説明する一助となる。腸内微生物が産生する代謝産物は、炎症の中心的な制御因子として、炎症反応を引き起こし、炎症関連疾患と相関することがますます認識されつつある [8, 47, 48]。ポリフェノールの腸内細菌叢を介した異化作用によって生成される代謝産物は、抗炎症効果を示し、腸管バリアの完全性を促進するため、大腸炎に対抗する上で重要な役割を果たす [18, 29, 49]。カフェ酸ではなく、食餌エラグ酸から細菌が産生した代謝物を投与したマウスのデータでは、大腸炎の軽減と腸管バリア機能の亢進が認められた。これらの知見は、細菌由来の代謝産物が重要なシグナルとして機能することを理解する上で重要であり、上皮バリアを効果的に機能させることで大腸炎を緩和することに光を当てるものであった。腸内細菌がエラグ酸をウロリチンAとウロリチンBに代謝できることが確認された。今回の知見は、ウロリチンBではなくウロリチンAを直接投与することで、腸管バリア保護作用と抗炎症作用が高まることが証明され、健康効果が得られることを示した以前の研究と一致している[29]。とはいえ、ウロリチンAがどのようにして宿主の腸の炎症を緩和するのかはまったく不明である。この点に関して、我々はまた、ウロリチンAが介在する腸管バリア保護にIL-22が必要であることを証明した。最近の報告では、腸内細菌叢由来の代謝産物が免疫細胞のIL-22産生を促進し、腸を炎症から保護することが示されている[50]。

全体として、我々の結果は、フェノール酸が様々な異なる様式でDSS誘発大腸炎から保護することを示した。具体的には、クロロゲン酸はPKM2依存性の解糖を減少させ、マクロファージの分極化をシフトさせるNLRP3の活性化を阻害することにより、大腸炎を緩和した。むしろ、フェルラ酸はNETsの形成を阻害することによって、少なくとも部分的に大腸炎を軽減する。カフェ酸とエラグ酸は腸内細菌叢に依存して大腸炎の重症度を調節する。エラグ酸の腸内微生物代謝産物をDSSモデルに移植すると、大腸炎を軽減できる。特に、エラグ酸が腸内微生物の存在下で産生する代謝産物であるウロリチンAは、IL-22依存的に大腸炎を軽減する。動物へのフェノール酸の経口投与は、マクロファージ-好中球と腸内細菌叢の相互作用から、腸管バリアーの完全性を改善し、マクロファージの偏向やNETs形成の阻害に関連する炎症性分子の減少、有益な細菌とその代謝産物の増加を促進する腸内細菌叢の組成に関連するタイトジャンクションタンパク質の発現の改善など、様々な異なる様式で腸管炎症を軽減する。しかし、フェノール酸の保護作用がIBD患者に関与しているかどうか、また、フェノール酸が腸内細菌叢とマクロファージとの相互作用に影響を及ぼす可能性があるかどうか、あるいは、腸炎症に対するフェノール酸の有益な作用に他の因子が関与しているかどうかについては、さらなる調査が必要である。さらに、腸の炎症に対するフェノール酸の保護作用の基礎となるメカニズム（例えば、下流シグナルの物質の受容体）を探るために、さらなる研究が必要である。

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材料と方法
マウス
動物実験では、雄性野生型C57BL/6マウスを特定病原体フリー（SPF）条件下で飼育し、標準的なチャウ食と飲料水を自由に摂取できるようにした。すべてのマウス実験は、中国農業大学動物飼育使用委員会（China Agricultural University Animal Care and Use Committee）の承認を得た（プロトコル番号AW51211202-1-3）。

DSS誘発大腸炎
急性実験的大腸炎を誘発するため、3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS；36-50 kDa；MP Biomedicals、米国カリフォルニア州）を5日間自由摂取させた後、さらに3日間通常の水を飲ませた。大腸炎の重症度は、体重、組織学的スコア、DAI、結腸長の変化を観察することで評価した。各マウスの結腸全体を摘出し、結腸長を記録した。

抗生物質投与と糞便移行試験
腸内細菌叢を枯渇させるため、4週齢のマウスを1週間の順応期間中に選別し、1g/Lのストレプトマイシン、0.5g/Lのアンピシリン、1g/Lのゲンタマイシン、0.5g/Lのバンコマイシンを含む4種類の抗生物質（ABX）カクテルを飲料水に2週間投与した。細菌枯渇の効率は、［51］の記述に従って確認した。15%グリセロール（v/v）を含む5倍の滅菌PBSを用いて、指示したマウスから採取した新鮮な糞便を希釈した。糞便サンプルを再懸濁し、滅菌ガーゼおよび0.22μmフィルターでろ過し、それぞれ糞便微生物懸濁液および滅菌糞便ろ液を得た。

フェノール酸介入試験では、7週齢のマウスに、50 mg/kg体重のCAおよびEAを含む100 μLのPBSを1日1回、2週間経口投与した。糞便移行実験では、PBSまたはCA-およびEA-処置マウスのいずれかを受けた個々のドナーからの200μLの糞便微生物懸濁液および滅菌糞便濾液を、指示された期間、1日おきに1回マウスに経口投与した。

マクロファージ/好中球減少およびフェノール酸処理
マクロファージ枯渇のため、マウスに200μLのクロドロネートリポソーム（オランダ、アムステルダム）を3日に1回、3回腹腔内注射した[52]。好中球減少のために、マウスに200μgの抗Ly6G（クローン1A8、BD Biosciences）、アイソタイプコントロールIgG2a抗体（クローンRTK2758；BioLegend）、またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を3日に1回、3回腹腔内投与した［45］。フェノール酸処理については、フェノール酸処理の2日前に200μLのクロドロネートリポソームまたは200μgの抗Ly6Gのいずれかを3日に1回、50mg/kg体重で3回、フェノール酸処理中の1日目と4日目にマウスに腹腔内注射した。

骨髄由来マクロファージ（BMDM）の単離と分化
6週齢のC57BL/6マウスから、大腿骨と脛骨からBMDMをフラッシュした。単離されたBMDMは、10％FBSと20ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子（MCSF）を添加したRPMI-1640培地で5日間分化させた。DSS投与中の5日目に、マクロファージが減少したマウスに、1匹あたり100μLのPBSに5×105個のBMDMを入れたものを腹腔内注射した。

IL-22中和
IL-22中和のために、抗IL22特異的mAb（マウス1匹あたり50μg；クローン2G12A41、BioLegend）をマウスに2日ごとに2回腹腔内注射し、アイソタイプコントロールIgG2α mAbを対照群とした［53］。

組織学
マウスの大腸を採取し、標準的なプロトコールに従って、それぞれヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色と免疫蛍光染色を行った。組織学的解析については、前述のように組織学的スコアを決定した。

フローサイトメトリー
結腸組織の一部をミンチにして、5mMのエチレンジアミン四酢酸と1mMのジチオスレイトールを含むマグネシウムとカルシウムを含まないHank's Balanced Salt Solution中で37℃、30分間振盪しながらインキュベートした。次に、結腸片を、0.05%コラゲナーゼD、0.05%DNase I、および2%新生仔牛血清を含むRPMI-1640培地で、穏やかに振盪しながら45分間消化した。100μmのナイロンメッシュのセルストレーナーで濾過し、単一細胞を得た。12,000rpmで5分間遠心後、細胞を回収し、抗CD11b（クローンM1/70、BioLegend）、抗CD11（クローンN418、BioLegend）とインキュベートした、 抗Gr-1（クローンRB6-8C5、BioLegend）、抗Ly6G（クローン1A8、BioLegend）、抗RORγt（クローン4F3-3C8-2B7、BioLegend）、抗IL22（クローン2G12A41、BioLegend）と30分間インキュベートした。3回の洗浄後、BD FACS Aria II Cell Sorter（BD Biosciences, New Jersey, USA）を用いてフローサイトメトリーで細胞を選別した。取得されたデータはFlowJoソフトウェアでゲーティングされ、解析された。

細胞培養と共培養
腸管上皮Caco2細胞、マウスマクロファージRAW264.7細胞、BMDMを、10%(v/v)熱不活性化FBS添加完全DMEM中、37℃、5%CO2で培養した。共培養系では、透過性トランスウェルインサート上で増殖させたIECを、12ウェルプレートに播種したRAW264.7細胞と指示された時間共培養した後、上清を回収し、その後のアッセイに用いた[54]。

RNA干渉およびRT-PCR
トランスフェクション後、TRIzol試薬（TransGen, Beijing, China）を用いて全RNAの抽出を行い、続いてiScript first-strand cDNA synthesis kit（TransGen, Beijing, China）を用いてRNAをcDNAに変換した。リアルタイム定量PCRには、ABI ViiATM 7 Real-Time System（Thermo Fisher Scientific、米国）を用いてSYBR Greenを利用した。閾値サイクル数の正規化は、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンとGapdhを用いて行った。プライマー配列を表S1に示す。

細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、Dojingdo Laboratories社（熊本、日本）のCell Counting Kit-8（CCK-8）溶液を用い、メーカーの提供するガイドラインに従って評価した。その後、Bio-Rad社（米国カリフォルニア州）のマイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。

ミトコンドリアメンバー電位とMitoSOXアッセイ
RAW264.7細胞におけるミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドの評価は、各製造元の推奨に従い、それぞれMitochondrial Membrane Potential Assay Kit（Abcam, Cambridge, USA）および細胞透過性色素MitoSOX（Thermo Fisher Scientific Inc. シグナル強度の分析は、蛍光マイクロプレートリーダー（Tecan, Mannedorf, Switzerland）を用いて行った。

乳酸産生
細胞上清中の乳酸濃度は、ML BIO Biotechnology Co., Ltd（中国、上海）のLactate Assay Kitを用い、メーカーの指示に従い定量した。

解糖アッセイ
RAW264.7細胞の細胞解糖は、Seahorse XF-96 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, USA)を用いて評価した[55]。トリプシン処理後、合計104個の細胞を80μLの増殖培地とともにSeahorse XF-96プレートのウェルに播種し、一晩培養した。その後、細胞外酸性化率（解糖を示す）を評価するため、10 mMグルコース、0.5 μMオリゴマイシン、100 mM 2-デオキシ-グルコースを含む混合液を、メーカーのプロトコールに従って導入した。

カスパーゼ-1とNLRP3の活性化
大腸および細胞溶解におけるCaspase-1およびNLRP3の活性化は、それぞれCaspase-1 Assay Kit（ab39412, Abcam, Cambridge, MA, USA）およびNLRP3 ELISA Kit（ab279417, Abcam, Cambridge, MA, USA）を用いて、製造元の指示に従って測定した。

サイトカイン測定
マウス血清、大腸組織ホモジネートおよび細胞培養上清中のTNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18およびIL-22の濃度は、BD Biosciences社製の市販の酵素結合免疫吸着測定（ELISA）キットを用いて測定した。定量は各メーカーの説明書に従って行った。

MPO-DNA複合体（NET）ELISA
末梢血から一次好中球を分離した。細胞溶解上清中の可溶性NETを検出・定量するために、MPO-DNA複合体ELISA法を採用し、各製造元の説明書に従った。簡単に説明すると、96ウェルELISA Maxisorpプレート（Thermo Fisher）にマウス抗マウスMPO抗体を5 mg/mLの濃度でコートし、その後1％BSAでブロックした。3回洗浄した後、80μLのインキュベーションバッファー、20μLの組織溶解上清、4μLのペルオキシダーゼ標識抗DNAモノクローナル抗体の混合液を各ウェルに加え、2時間インキュベートした。1回の洗浄後、100μLのペルオキシダーゼ基質を加えた。20分間のインキュベーション後、Bio-Rad（米国カリフォルニア州）のマイクロプレートリーダーを用いて405 nmの吸光度を測定した。

統計分析
定量データは平均値±標準偏差で示した。統計解析は、SPSSバージョン21.0（SPSS Inc. すべての解析において、有意閾値はP < 0.05とした。

報告概要
研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryを参照されたい。

補足情報
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報告概要(1.8M, pdf)
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謝辞
本研究は、中国国家重点研究開発計画（第2022YFA1304201号、第2021YFD1300201号）、中国国家自然科学基金（第32172750号、第32125036号、第31902170号、第32330100号）、北京市自然科学基金（第6232024号）、四川省動物病害抵抗性栄養学重点実験室公開プロジェクトプログラム（SZ202301-01）、中国農業研究システム（CARS-35）、111プロジェクト（B16044）の助成を受けた。

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著者貢献
DH、YW、DL、JP、JH、XZ、ZWが実験を行い、データを解析した。DHとJWは研究を構想し、原稿を執筆した。JWとGZは原稿を修正した。著者全員が最終版を承認した。

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データの利用可能性
本研究に関連するすべてのデータは、論文に含まれるか、補足情報としてアップロードされている。

研究目的
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

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倫理承認
すべての実験プロトコールは、中国農業大学動物飼育使用委員会（承認番号AW51211202-1-3、中国・北京）の承認を得た。

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脚注
編集：Wei Jia教授

出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

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補足情報
オンライン版には、10.1038/s41419-023-06190-4で入手可能な補足資料が含まれています。

参考文献
参考文献

  1. Lee M, Chang EB. 炎症性腸疾患（IBD）とマイクロバイオーム-犯行現場から手がかりを探る。Gastroenterology. 2021;160:524-37. doi: 10.1053/j.gastro.2020.09.056. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  2. Ni J, Wu GD, Albenberg L, Tomov VT. 腸内細菌叢とIBD：因果関係か相関関係か？Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2017;14:573-84. doi: 10.1038/nrgastro.2017.88. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  3. Zhou X, Li W, Wang S, Zhang P, Wang Q, Xiao J, et al. YAPは、M1/M2マクロファージの分極化と腸内微生物のホメオスタシスを制御することにより、炎症性腸疾患を悪化させる。Cell Rep. 2019;27:1176-89. doi: 10.1016/j.celrep.2019.03.028. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  4. Na YR, Stakenborg M, Seok SH, Matteoli G. Macrophage in intestinal inflammation and resolution: a potential therapeutic target in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2019;16:531-43. doi: 10.1038/s41575-019-0172-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  5. De Schepper S, Verheijden S, Aguilera-Lizarraga J, Viola MF, Boesmans W, Stakenborg N, et al. 自己維持腸マクロファージは腸の恒常性に必須である。Cell. 2018;175:400-15. doi: 10.1016/j.cell.2018.07.048. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  6. ECM1は、LPS刺激に応答するIBDにおけるM1マクロファージ極性の決定に不可欠な因子である。Proc Natl Acad Sci USA. doi: 10.1073/pnas.1912774117. [PMCフリー論文] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  7. Ip WKE, Hoshi N, Shouval DS, Snapper S, Medzhitov R. マクロファージの代謝リプログラミングによるIL-10の抗炎症効果。Science. 2017;356:513-9. doi: 10.1126/science.aal3535. [PMCフリー論文] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  8. Bain CC, Mowat AM. 腸の恒常性と炎症におけるマクロファージ。Immunol Rev. 2014;260:102-17. doi: 10.1111/imr.12192. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  9. Murray PJ. マクロファージの極性化。Annu Rev Physiol. 2017;79:541-66. doi: 10.1146/annurev-physiol-022516-034339. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  10. El Kasmi KC, Stenmark KR. マクロファージの可塑性と機能に対する代謝再プログラミングの寄与。Semin Immunol. 2015;27:267-75. doi: 10.1016/j.smim.2015.09.001. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  11. グリコーゲン代謝はマクロファージを介した急性炎症反応を制御する。Nat Commun. 2020;11:1769. doi: 10.1038/s41467-020-15636-8. [PMCフリー論文] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  12. Artyomov MN, Sergushichev A, Schilling JD. 免疫代謝とマクロファージの多様性の統合。Semin Immunol. 2016;28:417-24. doi: 10.1016/j.smim.2016.10.004. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  13. 腸内細菌叢と宿主代謝の機能的相互作用。Nature. 2012;489:242-9. doi: 10.1038/nature11552. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  14. 炎症性腸疾患におけるヒト腸内細菌叢の動態。Nat Microbiol. 2017;2:17004. doi: 10.1038/nmicrobiol.2017.4. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  15. Ağagündüz D, Kocaadam-Bozkurt B, Bozkurt O, Sharma H, Esposito R, Özoğul F, et al. Microbiota alteration and modulation in Alzheimer's disease by gerobiotics: The gut-health axis for a good mind. Biomed Pharmacother. 2022;153:113430。DOI：10.1016/J.Biopha.2022.113430。[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  16. Ağagündüz D, Cocozza E, Cemali Ö, Bayazıt AD, Nanì MF, Cerqua I, et al. 胃腸がんにおける腸内細菌叢の役割の理解： 総説。Front Pharm. 2023;14:1130562. doi: 10.3389/fphar.2023.1130562. [PMC無料論文] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  17. Rooks MG, Garrett WS. 腸内細菌叢、代謝産物および宿主免疫。Nat Rev Immunol. 2016;16:341-52. doi: 10.1038/nri.2016.42. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  18. ホロビオントを理解する：微生物の代謝産物がどのようにヒトの健康に影響を与え、免疫系を形成するか。Cell Metab. 2017;26:110-30. doi: 10.1016/j.cmet.2017.05.008. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  19. 動物の健康と病気における腸内細菌叢生成代謝産物。Nat Chem Biol. 2014;10:416-24. doi: 10.1038/nchembio.1535. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  20. 微生物叢の代謝産物である酪酸は、炎症性腸疾患において好中球の機能を抑制し、粘膜の炎症を改善する。Gut Microbes. 2021;13:1968257。DOI：10.1080/19490976.2021.1968257。[PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  21. 食事と腸内細菌叢の相互作用は、マウスの腸管透過性と大腸炎の重症度を変化させる。Gastroenterology. 2018;154:1037-46. doi: 10.1053/j.gastro.2017.11.030. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  22. Britton GJ, Contijoch EJ, Mogno I, Vennaro OH, Llewellyn SR, Ng R, et al. 炎症性腸疾患のヒト由来微生物が腸管Th17とRORγt+制御性T細胞のバランスを変化させ、マウスの大腸炎を悪化させる。Immunity. 2019;50:212-24. doi: 10.1016/j.immuni.2018.12.015. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  23. Gao X, Cao Q, Cheng Y, Zhao D, Wang Z, Yang H, et al. Chronic stress promotes colitis by disturbing the gut microbiota and triggering immune system response. Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115:E2960-9. doi: 10.1073/pnas.1720696115. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  24. 大腸炎における微生物叢および粘膜炎症に対する炎症性マクロファージの活性化を抑制する。Gut. 2021;70:2261-72. doi: 10.1136/gutjnl-2020-321094. Google Scholar] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  25. 微生物叢はDNAメチル化をプログラムし、腸の恒常性と炎症を制御する。Nat Microbiol. 2020;5:610-9. doi: 10.1038/s41564-019-0659-3. Google Scholar] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  26. 緑茶ポリフェノール投与マウスの腸内細菌叢は腸管上皮の恒常性を改善し、実験的大腸炎を改善する。Microbiome. 2021;9:184. doi: 10.1186/s40168-021-01115-9. [この論文では、腸管上皮細胞における腸管上皮細胞間脂質代謝を解析し、腸管上皮細胞間脂質代謝を解析した。

  27. 腸管障害を軽減し、腸管バリアの完全性を向上させるフェノール化合物の効果を探る：in vivo動物実験のシステマティックレビュー（Sandoval-Ramírez BA, Catalán Ú, Pedret A, Valls RM, Motilva MJ, Rubió L, et al. 2021;40:1719-32. doi: 10.1016/j.clnu.2020.09.027. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  28. アミロイド-ポリフェノールハイブリッドナノフィラメントが大腸炎を緩和し、腸内細菌異常症を制御する。ACS Nano. doi: 10.1021/acsnano.9b09125. Google Scholar] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  29. Nrf2経路を介した微生物代謝産物による腸管バリア完全性の強化。Nat Commun. 2019;10:89. doi: 10.1038/s41467-018-07859-7. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  30. Duda-Chodak A, Tarko T, Satora P, Sroka P. Interaction of dietary compounds, especially polyphenols, with the intestinal microbiota: a review. 2015;54:325-41. doi: 10.1007/s00394-015-0852-y. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  31. ポリフェノールと腸内細菌叢の相互作用による大腸炎の緩和と大腸炎関連大腸がんの予防。また、ポリフェノールと腸内細菌叢の相互作用は、大腸炎を緩和し、大腸炎に伴う大腸がんを予防する。[PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  32. クロロゲン酸サプリメントは、高尿酸血症を改善し、腎臓の炎症を緩和し、腸のホメオスタシスを調節する。Food Funct. 2021;12:5637-49. doi: 10.1039/D0FO03199B. [PubMed][CrossRef][Googleスカラー]。

  33. ルチノシル化フェルラ酸。ルチノシル化フェルラ酸はマウスモデルにおいて制御性T細胞をアップレギュレートすることにより食物アレルギー反応および大腸炎を抑制する。J Agric Food Chem. 2017;65:10730-7. doi: 10.1021/acs.jafc.7b03933. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  34. Kalthoff S, Paulusch S, Rupp A, Holdenrieder S, Hartmann G, Strassburg CP. コーヒー成分のカフェ酸およびカフェ酸フェニルエチルエステルは、イリノテカン誘発白血球減少および酸化ストレス反応から保護する。Br J Pharmacol. 2020;177:4193-208。[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  35. エラグ酸は、腸内細菌異常症と酸化ストレスを抑制することで、暴飲暴食によるリーキーガットと肝障害を予防する。Antioxidants. 2021;10:1386。[PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  36. 痛風および偽痛風関連結晶は、マクロファージ上のNLRP3およびインターロイキン-1β活性化を支配するGLUT1を介した解糖を促進する。Ann Rheum Dis. doi: 10.1136/annrheumdis-2020-217342. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  37. NLRP3 インフラマソームは、炎症性歯根吸収における M1 マクロファージの分極化と IL-1β 産生を媒介する。J Clin Periodontol. doi: 10.1111/jcpe.13258. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  38. Wen H, Ting JP, O'Neill LA. 代謝性疾患におけるNLRP3インフラマソームの役割-ウォーバーグは炎症を見逃したのか？Nat Immunol. 2012;13:352-7. doi: 10.1038/ni.2228. [PMC無料論文] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  39. SLC15A4はマクロファージにおけるM1-prone代謝シフトを仲介し、代謝ストレスから免疫細胞を守る。Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118:e2100295118. doi: 10.1073/pnas.2100295118. [PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  40. マクロファージの可塑性、極性化、および免疫調節剤としての食事由来ポリフェノールであるクルクミンに応答する機能。J Nutr Biochem. 2019;66:1-16. doi: 10.1016/j.jnutbio.2018.12.005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  41. Kumar A, Gupta P, Rana M, Chandra T, Dikshit M, Barthwal MK. 酸化LDLによるマクロファージ泡沫細胞形成と炎症におけるピルビン酸キナーゼM2の役割。2020;61:351-64。doi: 10.1194/jlr.RA119000382。[PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  42. PKM2依存性解糖は、NLRP3およびAIM2インフラマソームの活性化を促進する。Nat Commun. 2016;7:13280. doi: 10.1038/ncomms13280. [PMCフリー論文] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  43. Uderhardt S, Martins AJ, Tsang JS, Lämmermann T, Germain RN. マクロファージは好中球による炎症性損傷を防ぐために組織の微小病変を覆う。Cell. 2019;177:541-55. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.028. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  44. 好中球の治癒力。Trends Immunol. 2019;40:635-47. doi: 10.1016/j.it.2019.05.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  45. 好中球は、活性酸素を介した修復マクロファージの発生を促進し、肝臓の修復を制御する。Nat Commun. 2019;10:1076. doi: 10.1038/s41467-019-09046-8. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  46. Chen L, Zhao Y, Lai D, Zhang P, Yang Y, Li Y, et al. Neutrophil extracellular traps promote macrophage pyroptosis in sepsis article. Cell Death Dis. 2018;9:597. doi: 10.1038/s41419-018-0538-5. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  47. Dinallo V, Marafini I, Di Fusco D, Laudisi F, Franzè E, Di Grazia A, et al. Neutrophil extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. J Crohns Colitis. 2019;13:772-84. doi: 10.1093/ecco-jcc/jjy215. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  48. Song X, Sun X, Oh SF, Wu M, Zhang Y, Zheng W, et al. Microbial bile acid metabolites modulate gut RORγ+ regulatory T cell homeostasis. Nature. 2020年;577:410-5. doi: 10.1038/s41586-019-1865-0. [この論文では、胆汁酸代謝産物が腸内RORγ+制御性T細胞の恒常性を調節することを明らかにした。

  49. Bajic D, Niemann A, Hillmer AK, Mejias-Luque R, Bluemel S, Docampo M, et al. 腸内細菌叢由来のプロピオン酸はReg3粘膜レクチンの発現を制御し、マウスの実験的大腸炎を改善する。J Crohns Colitis. 2020;14:1462-72. doi: 10.1093/ecco-jcc/jjaa065. [PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  50. 腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸による免疫細胞IL-22産生と腸管免疫の制御。Nat Commun. 2020;11:4457。doi: 10.1038/s41467-020-18262-6。[PMCフリー論文] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  51. 腸内細菌叢由来のウルソデオキシコール酸は、M2マクロファージの分極化を促進することで低出生体重児誘発大腸炎症を緩和する。Microbiome. 2023;11:19. doi: 10.1186/s40168-022-01458-x. [PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  52. Kostovcikova K, Coufal S, Galanova N, Fajstova A, Hudcovic T, Kostovcik M, et al. 動物性タンパク質を多く含む食事は、炎症性マクロファージ応答を促進し、マウスの大腸炎を悪化させる。Front Immunol. 2019;10:919. doi: 10.3389/fimmu.2019.00919. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  53. Indole-3-carbinol prevents colitis and associated microbial dysbiosis in an IL-22-dependent manner. JCI Insight. 2020;5:e127551。doi: 10.1172/jci.insight.127551。[PMCフリー論文] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  54. Ptpn1欠損マクロファージ由来の小細胞外小胞は、ラクタドヘリン濃縮を介してマクロファージ分極を再プログラムすることにより、腸の炎症を緩和する。この論文では、Ptpn1欠損マクロファージ由来の小胞が、ラクタドヘリン濃縮を介してマクロファージの極性化を再プログラムすることにより、腸の炎症を緩和することを明らかにした。[この論文では、マクロファージがラクトヘリンを濃縮することにより、マクロファージの極性を変化させることを明らかにした。

  55. Xu F, Guo M, Huang W, Feng L, Zhu J, Luo K, et al. アネキシンA5はPKM2を直接標的として肝マクロファージの極性を制御し、NASHを改善する。この論文では、アネキシンA5がPKM2を直接標的として肝マクロファージ極性化を制御し、NASHを改善することを明らかにした。[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  56. Dömer D, Walther T, Möller S, Behnen M, Laskay T. 好中球細胞外トラップはヒト好中球の炎症性機能を活性化する。Front Immunol. 2021;12:636954。doi: 10.3389/fimmu.2021.636954。[PMCフリー記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
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