早期パーキンソン病、レム睡眠行動障害およびその一親等内の腸内細菌叢の異状

発行：2023年5月2日
早期パーキンソン病、レム睡眠行動障害およびその一親等内の腸内細菌叢の異状

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38248-4

ベイ・ホアン
スティーブン・W・H・チャウ
...
ユン・クォック・ウイング
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ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：2501（2023） この記事を引用する
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メトリックの詳細
要旨
微生物叢-腸-脳軸は、パーキンソン病（PD）において重要な役割を果たすことが示唆されている。ここでは、PDの腸脳病期分類モデルを反映する可能性のある、初期PD、レム睡眠行動障害（RBD）、RBDの第一度近親者（RBD-FDR）、健常対照の腸内細菌叢を横断的にプロファイルする研究を実施した。我々は、PDの初期およびRBDにおいて、コントロールおよびRBD-FDRと比較して、腸内細菌叢の組成が著しく変化していることを示した。抗うつ薬、浸透圧性下剤、排便回数などの潜在的交絡因子をコントロールした結果、RBDおよびRBD-FDRでは酪酸産生菌の枯渇と炎症性コリンセラの濃縮が既に出現している。ランダムフォレストモデリングにより、RBDとコントロールの区別に有効な12の微生物マーカーが特定された。これらの知見は、RBDが発症するPDの前駆期においてPD様の腸内細菌異常が発生し、若年層のRBD-FDR被験者で出現し始めることを示唆しています。本研究は、病因論的および診断学的な意味を持つであろう。
はじめに
パーキンソン病（PD）などのα-シヌクレイン病は、中枢神経系（CNS）におけるα-シヌクレイン（α-syn）タンパク質の異常凝集を特徴とする疾患である1、2。しかし、中枢神経系に至る前に腸管神経系（ENS）でα-syn病態が既に生じていることを示唆する証拠が増えており3,4、文献2,5で提案されているα-synuclein症の腸から脳への伝播を強く支持している。2,5. これと並行して、様々な複合疾患のバイオマーカーや介入ターゲットとして注目されている腸内細菌叢障害（腸内ディスバイオシス）が、PD患者において一貫して報告されています6。PDに関連する腸内細菌叢異常、特に短鎖脂肪酸（SCFA）産生菌の枯渇7,8,9と推定病原体の濃縮10は、腸管透過性亢進11、免疫活性化12、病的αsyn凝集11,13と関連していると仮定された。しかし、腸管α-syn病態やENS機能障害、特に便秘はPD発症の数十年前に起こりうることを考えると3,14、明らかな運動症状が現れる前のPDの前駆期における腸内細菌叢とホスト-マイクロバイオーム相互作用を理解することが重要であると考えられます。
レム睡眠行動障害（RBD）は、PDの最も特異的な前駆症状として認識されており、夢幻行動と無緊張のレム睡眠を特徴とします15。ビデオ睡眠ポリグラフ（v-PSG）でRBDが確認された患者では、便秘の有病率が高く16、ENS4でリン酸化α-synの免疫染色が増加することが報告されている。同様に、前運動器RBDの特徴を持つPD患者は、そうでない患者と比較して、末梢神経系の顕著な変性（例えば、便秘や腸管α-syn組織病理の増加）を示すように見え、α-シヌクレイン症の腸脳仮説を反映するパーキンソン病の異なるサブタイプを示唆しています17。一方、RBDの症状が孤立しているが、RBDのv-PSG診断基準をまだ満たしていない場合は、RBDの前駆期やα-synucleinopathyの早期発現を反映している可能性がある18,19。最近の症例対照家族研究では、RBDの第一度近親者（RBD-FDR）は、便秘が増加し、RBDの特徴のスペクトルが、孤立したRBD症状（前駆期RBDを示す）からv-PSG診断のRBDまであることが報告されました。したがって、RBD-FDRには、RBD患者よりもはるかに早い段階でα-シヌクレイン症に罹患した感受性の高い集団が存在する可能性があります20。
先行研究では、v-PSGで診断されたRBD（それぞれn = 21および26）21,22およびスクリーンアンケートで評価されたRBDの可能性（n = 84）23における腸内細菌叢異状が報告されています。しかし、これらの先行研究は、RBDとPDにおける微生物組成の変化の類似傾向を示唆したものの、宿主とマイクロバイオームの相互作用を包括的に検出するには力不足である可能性があります。さらに、RBDの前駆期が認識されつつあり24、さらに早い前駆期における腸内細菌叢の研究の重要性が強調されている。ここでは、前駆期および初期段階における大規模な横断研究を実施し（すなわち、準縦断デザインでBraak病期分類モデルをシミュレート）2、腸内細菌叢とα-シヌクレイン症の進行の関連性を明らかにしました。
結果
社会人口統計学的および臨床的特徴
本研究では、香港のv-PSGで診断されたRBDおよびRBDファミリーのコホートから452人の被験者の便を対象としました。リード数が少ない11検体を除外した後、合計441検体がさらなる解析のために残されました（図1）。すべての早期PD患者は、運動症状の発現が5年未満で、臨床的に確認されたPDでした。コントロール（n = 108、67.3±7.0歳、男性63.9%）は、RBD（n = 170、68.6±7.6歳、男性73.5%）および早期PDグループ（n = 36、67.8±5.6歳、男性86.1%）と年齢および性別が一致した。RBD-FDR（n=127、q値<0.05）と比較すると、3群とも男性が多く、高齢であった。RBDQ-HK質問票によるRBD特徴の重症度は、コントロール、RBD-FDR、RBDおよび早期PDの順に有意に増加した（RBDQ-HKの合計スコア、6.3 ± 7.0 vs 9.2 ± 8.4 vs 39.2 ± 17.7 vs 32.8 ± 16.1, P値＜0.001）。127人のRBD-FDRのうち、11人（8.7%）が構造化臨床面接25に基づき、RBDの可能性が高いと診断された。前駆期PDの総尤度比（LR）は、前駆期PDを有するリスクのある被験者を特定するために用いられる研究基準である。その結果、RBD患者はコントロール（対数変換LR, 1.4 ± 0.98 vs 0.58 ± 0.72, q値<0.001）およびRBD-FDR（1.4 ± 0.98 vs 0.46 ± 0.55, q値<0.001）より前駆期PD（RBD項目除く）のLRが大きく、コントロールおよびRBD-FDRは全LRが同等レベルでした（補足データセット 1）．
図1：被験者の選択と募集のフローチャート。
パーキンソン病の病理学的病期分類を適切に表現するα-シヌクレイン症の病期分類モデル（すなわち、Braak病期分類）の提案に従って、被験者を募集した。臨床病期は、コントロール（Braak病期0-1）、RBD-FDR（病期0-2）、RBD患者（病期2-3）、早期PD（病期3-4）の4種類でした。早期PDとは、運動症状の発現が5年未満で、臨床的に確認されたPDの患者を指す。構造化臨床面接によりRBDの可能性があると診断された対照者は除外された。また、神経変性疾患（早期PDを除く）および重篤な消化器疾患を有する被験者も本研究から除外した。最終的に、合計452名の被験者が便サンプルの採取に成功したが、そのうち11名は、シーケンスデータの品質が低い（すなわち、総リード数が1000未満）ため、その後の解析から除外された。RBD REM睡眠行動障害、RBD-FDR RBD患者の第一度近親者、PD パーキンソン病。
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消化器症状は、Rome-IV diagnostic questionnaire for adultsとScales for Outcomes in Parkinson's Disease-Autonomic26,27 により評価した。機能性便秘の有病率は、コントロール、RBD-FDR、RBDからPD初期患者まで増加傾向を示した（8.3 vs 9.4 vs 45.3 vs 69.4%, P値 <0.001）．機能性便秘の中核的特徴である排便時の緊張は、年齢と性別を調整しても4群間で徐々に増加した（8.8 vs 15.8 vs 45.4 vs 68.6%, P値<0.001）。また、大腸通過時間の指標として、排便回数スコア（BMF、1（排便回数1回/日以上）～6（1回/週以下））と便の硬さ（Bristol Stool Form Scale（BSFS）の逆スコア、高スコアは便が硬いことを示す）を用いたところ、両者とも4群にわたって上昇傾向を示した（p値は0.001未満）。過敏性腸症候群や機能性下痢症など、その他の消化器疾患については、各群間で差はありませんでした。
臨床的特徴については、RBD患者はコントロールおよびRBD-FDRよりも生涯大うつ病性障害および不安障害を多く報告していた（すべてq値＜0.05）28。糖尿病や脂質異常症など、他の潜在的な交絡ヒト疾患は、4群間で同様に分布していた。薬の使用状況とは、便の採取期間中に服用した薬のことを指した。RBDとPD初期患者の半数以上がベンゾジアゼピン系薬剤を服用しており、PD初期患者の30.6%と13.9%、RBD患者の5.3%と25.3%が浸透性下剤と抗うつ剤を服用していることが判明した。PD特有の薬剤としては、早期PD患者の47.2％がカルビドパ/レボドパを服用しており、次いでモノアミン酸化酵素B阻害剤（41.7％）、ドパミンアゴニスト（8.3％）、塩酸ベンゼコール（5.6％）、カテコールO-メチルトランスフェラーゼ阻害剤（2.8%）の順だった。プレ/プロバイオティクス消費量や主観的な身体活動などのライフスタイルの特徴は、グループ間で有意な差は見られませんでした（Supplementary Dataset 1）。
α-シヌクレイン症の進行に伴う腸内細菌叢組成の変遷
441の糞便サンプルから、合計84科、249属が認識されました。属レベルのα多様性（チャオ1、ジニ・シンプソン、シャノン指数）はグループ間で同等であることが確認された（Supplementary Dataset 2）。微生物叢組成の個人間非類似性（すなわち、β多様性）は、年齢と性別を調整した順列多変量分散分析（PERMANOVA、99,999順列）を用いて各グループのペア間で評価した（Supplementary Dataset 3）。早期PD群は、対照群と比較して微生物叢の明確なクラスタリングパターンを示した（R2 = 0.035, q値 <0.001）。同様に、RBDの微生物叢組成は早期PDのそれと類似していたが（R2 = 0.008, q値 = 0.066）、コントロールおよびRBD-FDRとは有意に異なっていた（すべてq値<0.001）。微生物組成分析では、コントロールとRBD-FDRの間に有意な差は見られなかった（図2b）。分散の均質性検定では、RBDと早期PDはより高いレベルのばらつきがあり（すべてq＜0.05、補足図2a）、特に早期PD群（被験者数が少ない）29のPERMANOVA結果に影響を与える可能性があることが示された。それでもなお、早期PD対RBDおよびコントロールの腸内細菌叢組成は、図2および補足図2c、dにそれぞれ示すように、主成分に沿ったグループ間比較、および主座標（PCoA）解析における明確なクラスタリングパターンによって支持されるだろう。
図2：α-シヌクレイン症の前駆期および初期段階における微生物組成の変化。
a コントロール（n = 108）、RBD-FDR（n = 127）、RBD（n = 170）、およびPD初期（n = 36）にわたる微生物コミュニティの主座標分析（PCoA）を、属レベルでのBray-Curtis距離行列に基づいて示す。各グループのラベルはグループセントロイドを示す。PCoAの軸に沿ったボックスプロットは、PCoA1およびPCoA2のグループ間分布を示した。ボックス内の白線は中央値、下限と上限はそれぞれ第1四分位点と第3四分位点を表し、ひげは四分位点間の1.5倍以内の値まで伸び、外れ値はひげを超えた個々の点としてプロットされる。統計的な差は、ANOVA（両側検定）とポストホックテストを用いて分析した。多重検定のP値はBenjamini-Hochberg法を適用して調整した。 b 70％信頼楕円を用いたグループ間の微生物群集の主座標分析。全体の微生物組成における群間差の有意性は、年齢と性別を調整したPERMANOVAによって算出した（順列＝99,999、両側検定、属レベルのBray-Curtis距離行列に基づく）。R2はPERMANOVA検定においてグループ化要因で説明される個体間変動を示し、一対比較のP値はBenjamini-Hochberg法を適用して調整した。RBD REM睡眠行動障害、RBD-FDR RBD患者の第一度近親者、PD パーキンソン病、PERMANOVA 順列多変量分散分析、ns有意でない。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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α-シヌクレイン症の前駆期および初期段階において、腸内細菌は徐々に変化している。
有病率（10％未満）および存在量（0.05％未満）の低い分類群をフィルタリングした後、合計36科および88属が存在量の差分分析用に残った。属のリードカウント表は、中心対数比（CLR）変換により、組成データにリフレーミングされました。その結果、35.2%（n = 31）の属が4段階のα-synucleinopathyと有意に関連していることがわかった（Kendallのtau-b相関、q値 <0.05, Supplement Dataset 5）。これらの属のうち、ButyricicoccusとFaecalibacteriumは疾患進行と最も強い相関を示し（Kendallのτb = -0.204 and -0.198, q value <0.001, 図3c）、Faecalibacteriumも図3dのように第1主成分の変動に大きく寄与した（スピアマンr = 0.72, P value = 6.4×10-69, Supplementary Dataset6）。
図3：α-シヌクレイン症の前駆期および初期段階における腸内細菌の違い。
a, b エラーバープロットは、コントロールと比較した前駆期および初期のα-シヌクレイン症における分類群のCLR変換存在量の平均差、および平均差の95％信頼区間を示した。プロットの縦軸に沿った青と黄色のバーは、疾患の進行に伴って増加する分類群と減少する分類群を示した（それぞれKendallのτb > 0と<0）。MaAsLin2を用いて、α-synucleinopathyの進行と有意差のある分類群の関連を解析した。 モデルは、グループを固定効果、ファミリークラスタリングをランダム効果として計算された。""、""、""は、それぞれBenjamini-Hochberg法による0.001、0.01、0.05未満の調整P値（q値）を表しました。ファミリーレベルでは、前駆期および初期のα-シヌクレイン症で有意に変化した分類群のみを示した（補足図4およびデータセット8も参照）。 c Kendallのtau-b相関分析では、ButyricicoccusとFaecalibacteriumがα-シヌクレイン症の進行と強い相関があることがわかった。d Faecalibacterium属は、全属の主座標分析から得られた第一主成分の変動を最もよく説明する。黒矢印は、疾患進行の影響（すなわち、コントロール、RBD-FDR、RBDから早期PDへ）を示した。 e Genus Collinsellaは、MaAsLin 2においてコントロール（n = 108）、RBD-FDR（n = 127）、RBD（n = 170）から早期PD（n = 36）へ段階的に増加（両面検定、補足データセット8も参照）した。ノッチ付きボックスプロットパネルは、CLR変換された存在量を示した。ボックス内の太線は中央値を表し、下限と上限の境界はそれぞれ第1および第3四分位を表す；ひげは四分位範囲の1.5倍以内の値まで伸び、外れ値はひげを超えた個々の点としてプロットされる。MaAsLin 2 Microbiome Multivariable Associations with Linear Model、CLR centered log ratio、RBD REM sleep behavior disorder、RBD-FDR RBD患者の第一度近親者、PD Parkinson's disease. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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異なる分類群は、Kruskal-Wallis検定を用いて評価し、16科と26属が4群間で有意に異なることを確認した（q値<0.05、Supplementary Dataset 5および7）。Microbiome multivariable associations with linear model（MAAsLin 2）を適用して、コントロール、RBD-FDR、RBD、早期PD間での差異分類群の関連性をさらに推定した。モデルには、固定効果として4段階（参照＝コントロール）、ランダム効果として家族idを含めた。42種類の差分分類群のうち19種類（45.2%）は、酪酸産生菌（e.g、 Roseburia、Lachnospiraceae_ND3007_group、Lachnospira、 [Eubacterium]_ventriosum_group, Butyricicoccus, Faecalibacterium, family Lachnospiraceae）、硫化水素産生Desulfovibrio．ムチン分解性Akkermansia、Collinsella、Oscillospiraceae_UCG-002および-005は、コントロールと比較してRBDおよび早期PDで有意かつ同様に変化した（未調整MaAsLin 2、すべてのq値<0. 05、図3a、Supplementary Dataset 8）。これらの関連は、MaAsLin 2モデルに固定効果として年齢と性別をさらに含めると、q値<0.1で有意に維持された（調整MaAsLin 2、Supplementary Dataset 9）。
興味深いことに、α-シヌクレイン症の前駆期であるRBD-FDRでは、調整モデル（β=0.58、q値=0.035）、未調整モデル（β=0.49、q値=0.038）ともに炎症性コリンセラの濃縮が既に出現している（図3a、e、補足データセット8および9）。また、RBD-FDRでは、対照群と比較して酪酸産生[Eubacterium]_ventriosum_groupの限界的な減少が観察された（β = -0.54, q value = 0.069）。さらに解析の結果、RBDの可能性が高いRBD-FDR（n = 11）は、RBDの可能性が高い特徴を持たない群に比べて、[Eubacterium]_ventriosum_groupがより顕著に減少しているようでした（CLR abundance, -0.36 ± 1.8 vs 0.35 ± 1.7, q value = 0.028, Supplementary Figure 3）。
RBDの診断用バイオマーカーとしての腸内細菌叢の可能性
RBD患者における微生物の変化に基づき、微生物マーカーを用いたRBD状態の予測についてさらに検討した。機械学習モデルは、トレーニングセット（データベース全体の80％）においてランダムフォレストアルゴリズムで構築し、残りのデータ（すなわち、テストセット）においてトレーニングモデルの性能をテストした。特徴量のマトリックスは、フィルタリングされた88属のCLRアバンダンスで構成され、特徴量の選択は、10倍交差検証を25回繰り返した再帰的特徴除去（RFE）アルゴリズムに基づく（補足図5）。トレーニングセットでは、微生物マーカーは、受信者動作特性曲線下面積（AUC）の平均値が0.79（[95% CI] = [0.78, 0.80], 図4b）でRBDとコントロールを区別できた。独立したテストセットでは、予測モデルの平均精度は0.68（[95% CI] = [0.66, 0.70]）、AUCは0.75（[95% CI] = [0.73, 0.78], 図4c）であった。特徴抽出の結果、88属中12属が学習済みモデルの最終特徴量の60%以上(15/25)に出現することがわかった。このうち、Butyricicoccus属、UBA1819属、Lachnoclostridium属、Oscillospiraceae_UCG-002属、Uncultured_Oscillospiraceae_g061属、［Ruminococcus］_torques_group、［Eubacterium］_ventriosum_groupはコントロールとRBDを分類した25種類のモデルのすべてで存在していた（補足データセット 16）．
図4：RBDの状態を予測するランダムフォレストモデル。
a 特徴の選択は再帰的特徴除去（RFE）アルゴリズムに基づき、25個の最終学習済みモデル（RBD［n＝170］とコントロール［n＝108］を分類）すべての少なくとも60％に出現した微生物マーカーを分類特徴として考慮した。 b-dランダムフォレスト分類モデルの受信者動作特性曲線と平均AUC（95％信頼区間付き）．破線の曲線は、ランダムフォレスト-RFEの全過程を25回繰り返した結果（すなわち、25個の再サンプル）を表し、太線の曲線は平均性能を示す。RBD REM睡眠行動障害、ROC動作特性曲線、AUC ROC曲線の下の面積。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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腸内細菌ベースの分類器も、RBDとRBD-FDRの区別において良好な性能を示し、テストセットにおいて平均精度0.67（[95% CI] = [0.66, 0.69] ）とAUC 0.72（[95% CI] = [0.69, 0.74], 図4d）が得られた。このモデルにおける特徴選択の結果を補足図6に示すが、Family_XIII_AD3011_group、Uncultured_Oscillospiraceae_g061、Faecalibacterium、Butyricicoccus、Oscillospiraceae_UCG-002属がベスト5の分類特徴として挙げられる。
宿主因子は前駆期および初期のα-シヌクレイン症における微生物叢に影響を及ぼす
さらに、α-シヌクレイン症の異なる段階における微生物の変化に対する宿主要因の影響を検討した。社会人口統計学的（年齢、性別）、BMFスコア、微生物叢に交絡作用を示す薬物（抗うつ剤、ベンゾジアゼピン系を含む）を評価した。精神疾患は、抗うつ薬の使用と高い相関があったため、共変量には含めなかった（カイ二乗検定、P値 = 5.3 × 10-22）。多変量統計モデル（PERMANOVA、99,999回の順列）は、各群のペアとすべての共変量を含めて構築したが、PD特有の薬剤（カルビドパ/レボドパ、MAO-B阻害剤、ドーパミン作動薬）は、早期PD群を含む比較においてのみ評価した。今回のモデルでも、コントロールと比較して、RBDと早期PDで微生物叢の有意な組成変化が観察された（すべてのq値<0.001、Supplementary Dataset 4）。グループ化因子に加え、BMFスコア、性別、浸透性下剤、プロトンポンプ阻害薬（PPI）使用などの共変量は微生物組成と強い関連を示したが、年齢、スタチン、抗うつ薬、ベンゾジアゼピン、PD特有の薬剤は組成変化への影響が少なかった（図5b）。
図5：前駆期および初期α-シヌクレイン症における宿主-微生物間相互作用。
a 分類群の存在量と宿主因子との関連は、MaAsLin 2を用いて評価した。有意な結果のみをヒートマップに示した（Benjamini-Hochberg調整P値<0.25）。MaAsLin 2の詳細な説明と結果については、Supplementary Dataset 10を参照。 b 全体の微生物組成と宿主因子の相互作用。PERMANOVA検定（すなわち、PERMANOVA R2、順列＝99,999）を用いて、全サンプルにおいて各宿主因子で説明される個体間変動をボックスプロットで表示した。""、""、""はそれぞれBenjamini-Hochberg調整P値<0.001、<0.01、<0.05を表す。ヒートマップは、宿主因子のステージ別（すなわち、各ステージ対コントロール）影響を示した。有意な関連はすべて赤色で強調表示した（PERMANOVAモデルによるq値<0.05）。c MaAsLin 2検定により、BMFスコアと短鎖脂肪酸産生菌Butyricicoccus、および抗うつ剤使用とRBD/早期PD濃縮属Akkermansiaの共起に有意な相関があることがわかった。ベータ値とP値（Benjamini-Hochberg調整なし）はMaAsLin 2（両側検定、Supplementary Dataset 10も参照）から得た。ボックス内の太線は中央値、下限と上限はそれぞれ第1四分位と第3四分位を表し、ひげは四分位間の1.5倍以内の値まで伸び、外れ値はひげを超えた個々の点としてプロットされる。RBD REM睡眠行動障害、RBD-FDR RBD患者の第一度近親者、PD パーキンソン病、PERMANOVA permutational multivariate analysis of variance、BMF bowel movement frequency、PPI proton pump inhibitors、CLR centered log ratio、MaaSLin 2 Microbiome multivariable associations with linear model、ns not significant、NA not applicable. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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分類群存在量と共変量の相関は、MaAsLin 2を適用して検証した。 モデルは、4つのステージ（参照＝コントロール）とすべての共変量を固定効果として、家族IDをランダム効果として含んだ。また、PD初期群における分類群の存在量は、PD特異的な薬剤に対する個々の分類群の反応を評価するために個別にモデル化された。MaAsLin 2検定から得られた有意な関連（q値＜0.25、Supplementary Dataset 10）を図5aにプロットした。その結果、酪酸産生菌（Lachnospira、[Eubacterium]_ventriosum_group、Butyricicoccusなど）の枯渇はRBDおよびPD初期においても有意に残っていた。同様に、RBD-FDRでは、Collinsellaの増加と[Eubacterium]_ventriosum_groupの顕著な減少が対照と比較して観察された。共変量については、BMFスコアと分類群数の関連は広範で、疾患進行のそれと類似していた。特に、BMFスコアが高い（すなわち、大腸通過が遅い）ほど、Butyricicoccus（β＝-0.34、q値＝0.009）およびOscillospiraceae_UCG-005の存在量がそれぞれ低い、高いことと強い相関があった（図5A、C）。薬物の影響については、抗うつ剤、スタチン、浸透圧性下剤の使用が差分分類群に大きな影響を与えるようであった（Supplementary Dataset 10, 11）。特に、抗うつ薬の使用とRBD/早期PDに富む属（AkkermansiaやUBA1819など）の強い共起が我々のデータで確認された（図5c）。
便秘（排便回数）はαシヌクレイン症に対する微生物群の影響を媒介する
先行研究では、腸内細菌異常症と便秘の間に双方向の因果関係があることが示唆されている30。便通回数調整後もRBDおよびRBD-FDRにおける明確な微生物変化が持続することから、我々はさらに、便秘は完全に交絡因子として働くのではなく、腸内細菌叢とα-シヌクレイン症をつなぐ潜在的な因果経路の媒介因子である可能性を仮説として考えた。そこで、コントロール、RBD-FDR、RBD患者（n = 405）において媒介分析を行った。アウトカムとして前駆期PD（RBDと便秘の項目を除く）の総尤度比、エクスポージャーとして第一主成分の値（PCoA分析から導出）、メディエーターとしてBMFスコアをそれぞれ用いて、モデルを構築しました。その結果、PD前駆期に対する腸内細菌叢の影響全体の約30％がメディエーター（BMFスコア）を経由しており、腸内細菌叢異常、便秘からαシヌクレイン症への因果関係の方向性が示唆された（図6）。
図6：便通頻度の媒介効果。
コントロール、RBD-FDR、RBD患者（n = 405）の間で、それぞれマイクロバイオータ（青矢印）、BMFスコア（黄矢印）をメディエーターとして一般化線形モデルの調停分析を行った。媒介効果の割合（①③、実線）は、全効果に対する間接効果（媒介者を経由する）の割合を示し、直接効果（②④、破線）は、媒介者を制御した後に結果に直接影響する曝露の割合を記述する。間接効果/直接効果の有意性はブートストラップ法を用いて評価した（両側検定、P値は調整せず）。前駆期PD（アウトカム）の尤度比（LR）に対する腸内細菌叢（曝露）の効果は、排便回数（メディエーター）を介して部分的に介在した（介在効果の割合＝0.31、P＝0.0004）。""、""、""はそれぞれ0.001、0.01、0.05より小さいP値を表す。RBD REM睡眠行動障害、RBD-FDR RBD患者の第一度近親者、PD パーキンソン病、BMF 排便回数、PCoA1 主座標分析による第一主成分、LR 尤度比．ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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前駆期および初期のαシヌクレイン症における微生物叢の代謝の変化
最後に、PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）解析を用いて、α-synucleinopathyの前駆期と初期で異なるMetaCycパスウェイを特定しました。Kruskal-Wallis検定により、18の代謝パスウェイが4つのグループ間で有意に異なることが示されました（q値<0.05、Supplement Dataset 12）。PD患者における過去の知見9と一致して、短鎖脂肪酸代謝（乳酸、エタノール、酢酸への発酵）と炭水化物生合成経路が濃縮され、一方、補酵素とビタミン生合成（B1、B2、B12）は前駆期および初期のαシヌクレイン症（すなわちRBDまたは初期PD）で減少していた（MaaSLin 2、q値<0.05、補足データセット13および14）。
さらに多変量関連解析では、前駆期および早期α-シヌクレイン症における糖質生合成の濃縮は、BMFスコア、年齢、スタチン使用によって顕著な影響を受けるようであった。同様に、ビタミンB群の合成経路の枯渇は、性別、ベンゾジアゼピン、浸透圧性下剤の使用と強く関連していた（図7、Supplementary Dataset 15）。それにもかかわらず、RBD-FDR、RBD、早期PDにおける微生物の脂肪酸代謝（SCFAから乳酸とエタノール）およびpreQ0生合成（7-deazapurine生合成）の変化は、すべての潜在的共変量を調整しても、対照に対して有意なままであった。さらに、ビタミンB12生合成のサルベージ経路とデノボ経路は、RBD-FDR群よりもコントロールの方が有意に濃縮されていた。
図7：前駆期および初期α-シヌクレイン症における微生物叢代謝の変化。
MaAsLin 2を用いてパスウェイ存在量と宿主因子との関連を評価し、有意な結果のみをヒートマップに示した（Benjamini-Hochberg調整P値＜0.25）。短鎖脂肪酸代謝（例：Bifidobacterium shuntやヘテロ乳酸発酵）およびpreQ0生合成に関連する経路は、すべての潜在的共変量を調整した後でも、α-シヌクレイン症の前駆期および初期段階でそれぞれ一貫して増加および減少した。MaAsLin 2の詳細な説明と結果については、Supplementary Dataset 15を参照されたい。RBD REM睡眠行動障害、RBD-FDR RBD患者の第一度近親者、PD パーキンソン病、MaAsLin 2 Microbiome多変量線形モデルによる関連性、TCA トリカルボン酸(Tricarboxylic acid). ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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考察
腸内細菌叢の乱れは、パーキンソン病を含むα-シヌクレイン病において確立されている。しかし、PDの長い前駆期における微生物変化の出現は、ほとんど不明である。ここでは、初期PD、RBD（前駆期PD）、RBD-FDR、コントロールにわたって腸内細菌叢を調査しました。その結果、RBD患者では、全体の微生物叢組成がPD初期に近い形で変化し、酪酸産生菌が枯渇し、Collinsella、Desulfovibrio、Oscillospiraceae UCG-005が過剰に存在することがわかった。さらに前駆期で若年層であるRBD-FDRでは、炎症性Collinsellaの増加と酪酸産生菌[Eubacterium]_ventriosum_groupの枯渇に関して、RBD/PD様の微生物変化が出現していた。予測された機能プロファイルでは、RBD-FDR、RBD、PD初期において、乳酸とエタノールへの脂肪酸発酵が全体的に増加し、デアザプリンの生合成レベルが低くなった。最後に、宿主因子、特に便通頻度（メディエーターとしても作用）、性別、年齢、薬剤使用（例：抗うつ剤、スタチン、浸透圧性下剤）が、RBD-FDR、RBD、初期PDにおける微生物の変化を部分的に混乱させる可能性があることを確認しました。まとめると、腸内細菌異常はRBDやPDの発症に先立つ、より早い段階ですでに存在しており、α-シヌクレイン症の病因における腸内細菌叢の役割の可能性が強調された。
我々の発見は、PDの前臨床前駆期における顕著な微生物変化（すなわち、腸内細菌異常症）を示唆している。v-PSGでRBDと診断された患者およびスクリーニング質問票で定義されたRBDの可能性のある患者における先行報告21,23と同様に、RBD患者ではコントロールと比較して微生物群集のシフトが観察されました。また、疾患期間が5年未満のRBD患者や、PD発症リスクが低いとされるRBD患者（前駆期PDの確率≦80%）においても、腸内細菌叢の変化が有意に残っていることが示されました（補足図8）。個々の分類群の観点から、PD様腸内細菌異常症の特徴であるSCFA産生菌（LachnospiraやButyricicoccusなど）の枯渇が、前駆期PD（RBDおよびRBD-FDR）で既に生じていることがわかりました。この発見は、おそらくRBD患者のサンプルサイズが限られていたため、先行研究では捉えられていなかった21,22。特に、酪酸産生[Eubacterium]_ventriosum_group31の減少は、RBD-FDRですでに見られ、RBDおよびPD前期の患者でより顕著になった。短鎖脂肪酸、特に酪酸は、大腸の上皮細胞でエネルギー源として利用され、隣接する上皮細胞間のタイトジャンクションの調節因子として作用する32。酪酸産生菌が減少すると、腸管バリアが破壊され、腸管透過性亢進、腸管免疫反応の活性化、それに伴う腸管α-synの凝集につながる可能性があります11,13。また、[Eubacterium]_ventriosum_groupは、血漿中のインターロイキン-6（IL-6）、IL-8およびC反応性タンパク質のレベルと負の相関を持つ抗炎症性細菌として長い間認識されてきた33,34。これらの炎症性サイトカインは、血液脳関門を介して中枢神経系に侵入し、神経炎症反応やPDの病態を引き起こす可能性がある35,36.
一方、α-シヌクレイン症の前駆期および初期段階において、ある種の腸内細菌が一貫して増加していることが観察された。先行研究21でRBDに濃縮された細菌として同定されたAkkermansia属やOscillospiraceae UCG-005に加え、PD発症に潜在的に関連する細菌（CollinsellaやDesulfovibrioなど）がRBD患者において既に増加していることがわかりました37、38。特に、Desulfovibrioは硫化水素（H2S）およびリポ多糖（LPS）産生菌である37. 前臨床試験において、LPSを投与したマウスは、腸管透過性が高く、病的なα-synの蓄積を示すことがわかった13。また、H2Sの生成は、α-シヌクレイン障害の初期段階であるα-シンのオリゴマー化37を誘導し39、消化管運動を阻害する可能性があった40。興味深いことに、コリンセラは水素還元菌であり、Desulfovibrioとクロスフィードする可能性がある41。コリンセラの濃縮は、低繊維食や代謝性疾患（例：2型糖尿病）42,43で広く報告されている。関節リウマチを対象とした研究では、コリンセラは上皮タイトジャンクションの発現を低下させることにより、腸管透過性亢進を引き起こす可能性があることが示されている44。さらに、コリンセラは炎症性IL-17Aの高レベルと関連しており、PD齧歯類モデルにおいて神経炎症、特にミクログリア活性化を悪化させる可能性がある44、45。Oscillospiraceae UCG-005（すなわち、Ruminococcaceae UCG-005）のヒト疾患への影響は、日本人および我々のRBDコホートで着実に増加しているにもかかわらず、ほとんど知られていなかった21。最近の研究では、オシロイバナ科UCG-005と低レベルの身体活動（PDの危険因子）46との関係が示唆されたが、この相関関係は今回の研究では把握できなかった（補足図9a）。最後に、RBDおよびPD初期において、ムチン分解酵素（すなわち、潜在的な腸管バリア破壊因子）であるAkkermansiaの増加が観察されたが、Akkermansiaの存在量は、抗うつ薬の使用など他の共変量に有意に影響されることが示された。以前の研究では、ムチン分解酵素（Prevotellaceae科）がうつ病や不安症の患者に濃縮されていることが示されており47、本研究のさらなるサブグループ解析でも、抗うつ剤を使用していない患者と比較して、抗うつ剤を使用している非患部のコントロール（n = 5、P値 = 0.056）において、ほぼ有意にAkkermansiaが増加していた（補足図9b）ことが確認されています。興味深いことに、アッカーマンシアや他のムチン分解物質の破壊作用は、高繊維食に切り替えることで逆転する可能性があり、特に不安障害やうつ病を併発する患者の前駆期や初期のα-シヌクレイン症における腸内細菌異常に介入する食事介入の可能性が示された48。
本研究では、16S rRNA遺伝子配列データから腸内細菌叢の機能プロファイルを予測し、前駆期および初期のα-シヌクレイン症では、脂肪酸代謝の増加、preQ0およびビタミンB12の生合成の減少が示唆された。乳酸生成経路の濃縮は、PD患者における乳酸菌（LAB）の増加と一致する9。しかし、PDの病態における乳酸の役割は、LABの健康増進作用と相反するように思われるため、依然として不明である49。一つの可能性は、乳酸が他の細菌（例えば、非酪酸産生乳酸利用菌）によってさらに代謝され、最終的に腸の健康に有害な（例えば、腸のバリアを破壊する）生成物に変換されるかもしれないということである50。同様に、PD患者におけるビタミンB12生合成の低下も報告されている9。血清B12値の低下は、PDの初期によくみられ、PD患者の神経障害に関連している51。しかし、PDにおけるB12欠乏は、腸内代謝の変化に起因するものではなく、食事摂取量の減少や消化器系の障害に関連していると考えられる52。しかし、ビタミンB12は腸内細菌の組成と代謝の重要な調節因子であり、B12の補給が保護的な酪酸の産生を促進することが判明している52。最後に、前駆期および初期のα-シヌクレイン症では、preQ0生合成が一貫して減少していることを発見した。PreQ0は、7-Deazapurineヌクレオシドの生合成の重要な中間体であり、後者は抗生物質や抗がん作用のある様々な化合物を形成することができます53。7-Deazapurineの役割はまだ解明されていないが、preQ0生合成の多さは、酪酸産生菌でありPD進行の指標となるFaecalibacterium属と強く共起しているようだ（図3dおよび補足図7）。
先行研究と同様に、我々のデータは、便秘症状、特に排便回数が腸内細菌叢の強い交絡因子であることを示した23,54。しかしながら、前駆期および初期のα-シヌクレイン症で同定された腸内細菌の特徴の大部分は、BMFスコアを調整した後でも強固に残っており、腸内細菌の異常のいくつかの特徴は、α-シヌクレイン症に特有で、腸の習慣が変わる前に現れることを示していた。さらに、調停分析により、α-シヌクレイン症の前駆期における腸内細菌異常と便秘をつなぐ因果経路の可能性が示唆された。この観察は、プロ/プレバイオティクスを投与したパーキンソン病患者が自発的な排便を有意に増加させたという、パーキンソン病における先行臨床試験からも支持される可能性がある55。しかし、今回の研究では、便秘の治療を定期的に受けているRBDおよび初期PD患者の50％以上が、依然として便通が減少していた（すなわち、3～4日おき）ことが判明した。したがって、疾患の前駆期（RBDやRBD-FDRなど）における便秘や特定の微生物への介入は、将来のα-シヌクレイン症の予防や疾患修飾療法に有望な戦略となりうるだろう。
本研究にはいくつかの限界がある。まず、本研究は、α-シヌクレイン症の進行と微生物相の相関をシミュレーションするためにステージングの概念を適用したものの、横断的な研究であることである。腸内細菌異常とα-syn病態の因果関係を検証するために、今後の前向き研究が保証される。第二に、初期PDのサンプルサイズは比較的控えめであった。しかしながら、先行研究9と同様に、PDにおける腸内細菌叢の有意かつ一貫した変化が観察された。第三に、本研究はPDの腸から脳への病期分類モデル（「身体優先型」）に焦点を当てたため、他のPDサブタイプの前駆期（「脳優先型」等）17に一般化するにはさらなる研究が必要である。第四に、RBD-FDRは、より早い前駆期を反映し、より若く、より女性の被験者で構成されている。しかし、これらの社会人口統計学的な差異を調整しても、重要な知見は揺るぎないものであった。また、RBD/早期PDとその近親者（RBD-FDR）における腸内細菌の同様の変化は、遺伝、食習慣の共有、早期生活への曝露など、測定されていない他の要因によって影響を受ける可能性がある。これらの要因を組み込んだ今後の解析は、前駆期および早期α-シヌクレイン症における腸内細菌異常の発症の理解に役立つかもしれない。最後に、本研究は16S rRNA遺伝子配列データに基づく腸内細菌叢の組成プロファイルと機能予測に限られており、その後の研究において、メタゲノムやメタボロミクスによる腸内細菌叢（種・株レベル）および腸内代謝の包括的調査が必要である。
結論として、本研究では、v-PSGで診断されたRBD患者とその一親等の近親者において、PDの前駆期においてPD様の腸内環境異常が生じることが示唆されました。α-シヌクレイン症の病因における腸内細菌叢の役割を十分に理解するためには、腸内代謝、炎症マーカー、腸管α-シヌ病態の調査と組み合わせた今後の前向き研究が必要である。
方法
被験者の募集
本研究は、CUHK-NTEC合同臨床研究倫理委員会（CRE-2017.670）により承認され、clinicaltrial.govにNCT03645226として登録されました。ヘルシンキ宣言に基づき、すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントを取得した。図1は、本試験の募集とフローを示したものである。被験者の募集と便サンプルの採取は、2018年から2021年にかけて、香港中文大学（CUHK）精神科のLi Chiu Kong Family Sleep Assessment Unitで実施されました。
RBD患者およびRBD-FDRは、現在進行中のRBDコホート15,20から募集しました。対照は、地域や当院の睡眠クリニックから募集した神経学的に健康な被験者とした15,20。すべてのRBD患者は、睡眠障害の国際分類（3rd）に従い、ビデオ睡眠ポリグラフ（v-PSG）により診断されました。RBDの可能性が高いという診断は、睡眠パターンと障害のための診断面接（DISP）25を使用して行われ、v-PSG検査がない場合にRBDまたは孤立したRBDの特徴を持つ可能性が高い対照とRBD-FDR被験者をスクリーニングしました。より明確に区別されたステージングモデルを得るために、v-PSGで確認されたRBDと神経変性疾患20を持つRBD-FDRを除外しました。同様に、神経変性疾患、RBDの可能性が高い、v-PSGで診断されたRBD、またはRBD症状の陽性家族歴を持つコントロールも、ステージングモデルから除外しました。本研究では、これらの神経学的に健康な被験者を表すために、コントロールという用語を使用しました。
早期PD患者は、(1)我々のRBDコホート15から変換されたPD（n = 17）、および(2)神経科医から紹介されたRBDの先行歴を持つPD患者（n = 19）から募集しました。早期PD群の除外基準は、(1)神経科医が標準診断基準56を参照してPDと診断したこと、(2)パーキンソニズムが5年未満であること、(3)認知症がないこと（すなわち、香港版モントリオール認知評価［HK-MoCA］>21または臨床認知症評価［CDR］<1］の合計点）、(4)v-PSG診断のRBDであること、(5)パーキンソン病に続いてRBD特徴があることなど。
その他の除外基準は以下の通りである： (1) RBD患者と同居するRBD-FDR、(2) 1ヶ月以内の抗生物質使用、(3) 腸内細菌叢に顕著な影響を与える既存の消化器疾患、例えば、炎症性腸疾患や肝硬変（補足図1）。
質問票と臨床評価
一般質問は、社会人口統計学的特徴、ライフスタイル（例：喫煙、コーヒー飲用、運動）、日中の過度の眠気（Epworth sleepiness scale, ESS）、自律神経機能（Scales for Outcomes in Parkinson's Disease-Autonomic, SCOPA-AUT）で構成されていた。生物学的性別は自己申告に基づき、さらに香港の病院の臨床管理システムから情報を確認した。さらに、2つの要素からなるRBD質問票香港（RBDQ-HK）を用いて、全対象者のRBD特徴の重症度を評価しました： (1)夢に関連する要因(要因1)と(2)行動の現れ(要因2)の2つの要素からなる57。機能性便秘、過敏性腸症候群、機能性下痢などの腸疾患は、成人用Rome-IV診断質問票27に基づき診断した。さらに、便の硬さ（BSFS、範囲1～7）、排便回数スコア（Q："過去3ヶ月の排便回数は？"）を記録した。1=">1/日"、2="1/日"、3="隔日"、4="3-4日毎"、5="5-6日毎"、6="<1/週"）。嚥下障害（嚥下/窒息など）、唾液漏出、早期満腹感などの上部消化器症状は、SCOPA-AUTから得た。
パーキンソン病は、Unified Parkinson's Disease Rating Scale part III（UPDRS-III）58を用いて算出し、UPDRS-III（動作性振戦を除く）の合計スコアが359より大きいものを閾値未満パーキンソン病と定義しました。起立性低血圧は、立位での収縮期血圧（SBP）≧20mmHgまたは拡張期血圧（DBP）≧10mmHgの低下で定義した60。被験者が仰臥位高血圧（SBP≧140mmHgまたはDBP≧90mmHg）である場合、SBP低下≧30mmHgまたはDBP低下≧15mmHgは起立性低血圧とみなされた。嗅覚機能は、嗅覚識別テスト（Olfactory Identification Test：OIT）61を用いて評価した。OITの正答率合計が3点未満を嗅覚障害とした20。精神疾患は、精神科医によるMINI International Neuropsychiatric Interview（M.I.N.I.）62で問診を行った。認知機能の推定には、香港版モントリオール認知機能評価（HK-MoCA）を適用した63。HK-MoCAの総スコアが21以下の被験者は、グローバルな認知機能障害を有するとみなされた63。さらに、運動障害学会（MDS）研究基準（2019）の更新版に従って、総尤度比（LR）と前駆期PDの確率を計算した64。前駆期PDの確率＞80％、30～80％をそれぞれ前駆期PDの可能性が高い、可能性があるとみなした。
便サンプルの採取と16S V3-V4 rRNAのデータ処理
新鮮な便サンプルは、臨床面接の日、一晩の睡眠評価中、または自宅で採取された。採取当日、サンプルは滅菌容器に保存され、4時間以内に便キット（アイスジェル、ポリスチレンボックス、保温バッグを含む）で実験室に移送された。その間、被験者は、採取時間、BSFS、プロバイオティクス、3日以内に服用した薬などの情報を報告した。サンプルはラボに到着後、1-2個のバイアルに分注し、将来の分析のために-80℃のフリーザーに保管した。
DNA抽出は、DNeasy PowerSoil Pro DNA Kit (Cat. No.: 47014, Qiagen)を用いて行った。抽出液の濃度は、NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。DNAライブラリーは、16SリボソームRNA遺伝子の標的超可変領域V3-4にまたがるプライマー（341 F: 5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3', 806 R: 5'-GGA CTA CNV GGG TWT CTA AT-3' ）と、アダプター配列、フォワードおよびリバースプライマーにインデックスした独自の12 bpバーコードを使って構築した。PCRアンプリコンは、ペアエンド300bpリードを使用してIllumina MiSeqプラットフォームで配列決定した。シーケンスリードは、QIIME2ソフトウェア（v2021.4）のDADA2（q2-dada2プラグイン）65を使用してアンプリコン配列バリアント（ASV）にノイズ除去されました。Phredの品質スコアが著しく低下する288位と272位でフォワードリードとリバースリードをそれぞれ切り捨てた。総頻度が低いサンプル（すなわち、総リード数が1000未満）は、q2-feature-tableでフィルターにかけた。SILVA v138 99% 16 S rRNA データベース67に対して、q2-feature-classifier66 classify-sklearn naïve Bayes taxonomy classifierを使用してASVに分類を割り当てた。その後、分類表を属、科、門のレベルで折りたたみ、マージされた存在量表を下流の解析に使用した。
臨床的特徴分析
データは、Shapiro-Wilk検定により統計解析を行う前に正規分布の評価を行った。カテゴリーデータの単変量解析は、該当する場合、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定によって行われる。正規分布のある連続データについては、ANOVAに続いてポストホックテストが用いられ、そうでない場合は、クラスカル・ワリスHテストが用いられた。同じ家族の被験者間の潜在的な関連を考慮し、消化器系の特徴、臨床的特徴、神経変性マーカーのグループ間比較において、家族のクラスタリングを調整するために一般化推定式（GEE）モデルを適用した20。GEEモデルは、家族idをクラスタ因子、被験者idをクラスタ内因子とし、独立した相関構造を用いて構築した。モデルの種類は、従属変数の分布に基づき、Linear（連続変数）またはBinary logistic（二値変数）に指定した。検定は、IBM SPSS Statistics for Windows, Version 26.0 (Armonk, NY: IBM Corp)を用いて実施した。両側P値0.05未満を統計的に有意とみなした。GEEモデルにおけるポストホック多重比較（すなわち、各対のグループ間）については、Benjamini-Hochberg False Discovery Rateを用いてP値を調整し、偽陽性率5％未満（すなわち、q値＜0.05）を認め、統計的有意性を表示した。
微生物叢のコミュニティ構成
各サンプルのα多様性（Chao 1、Gini Simpson、Shannon指数）は、Rプロジェクトバージョン4.2.1を用いてvegan Rパッケージ（バージョン2.6-2）を用いて評価し、統計的有意性は、ポストホック分析によるクラスカル・ワリス（KW）検定を用いて検定した。各群間の組成差は、vegan Rパッケージ（"adonis2 "関数）の順列多変量分散分析（PERMANOVA、99,999順列）を用いて分析し、全属の相対存在量のBray-Curtis距離に基づいて "adonis2 "関数用の距離行列を作成した（"vegdist "関数）。また、グループ間の分散の均質性を調べるために、グループ分散の多変量均質性（Leveneの検定の多変量拡張）を使用した（"betadisper "関数、vegan）。前駆期および初期α-シヌクレイン症での組成シフトは、同じ距離行列に基づく主座標分析を用いてさらに可視化した（Rパッケージveganの「wcmdscale」関数）。
存在量の差分解析
QIIME2（qiime feature-table filter-features-conditionally経由）で、存在量が少ない（0.05%未満）、または有病率が低い（10%未満）属と科を分類表でフィルタし、249属中88属、84科中36科を存在量の差異分析用に保持しました。前処理として、compositions R package (version 2.0-4)のclr関数を用いてcentered log-ratio (CLR) 変換を行い、リードカウント表を組成データに変換した（仮数値1を適用した後）。コントロール、RBD-FDR、RBDからPD初期までの分類群存在量の変化の一致性を調べるために、SPSS（バージョン26.0）に実装されているノンパラメトリックKendallのtau-b相関係数を使用しました。グループ間の属の差は、Kruskal-Wallis test (SPSS 26.0)を用いて行った。有意差のある分類群（q値閾値0.05、Kruskal-Wallis検定）とα-シヌクレイン症の異なるステージの相関は、Microbiome multivariable associations with linear model（MAAsLin 2）68（「Maaslin2」関数、MaAsLin 2 Rパッケージのバージョン1.8.0）の適用によってさらに検証された。このモデルでは、家族のクラスタリング（例えば、同じ家族からのRBD-FDR）の変動を取り入れるために、ランダム効果として家族IDを含めた。多重比較はBenjamini-Hochberg法を用いて調整した。入力データがCLR変換された存在量であることを考慮し、MaAslin2関数に実装されているデフォルトの正規化および変換方法をオフにしました。
ランダムフォレストによる分類
クロスバリデーションのランダムフォレスト機械学習アルゴリズムを実施し、RBDとコントロールおよびRBD-FDR群の識別における腸内細菌叢の精度を推定した。予測因子は、上記の差分存在量解析で説明したように、フィルタリングされた属（n = 88）のCLR変換存在量とした。各予測モデルについて、データセット（例：コントロールとRBD）をトレーニングセット（データセット全体の80%）とテストセット（20%）に分割した。サンプリングエラーを減らすため、層別サンプリングにより、元の症例/対照の比率を新しいデータセットに保持した。トレーニングセットから予測因子を選択するために、caret Rパッケージ（バージョン6.0-92）の「rfe」関数（10倍クロスバリデーションを25回繰り返す）を用いて、再帰的特徴除去（RFE）アルゴリズムを採用した。学習済みモデルに残す予測因子の最終リストは、予測精度によって決定され、モデルの性能は、ホールドアウトテストセットでさらに評価された。データ分割、特徴選択/モデルフィッティング、予測評価までの全プロセスを25回繰り返した（すなわち、25回のリサンプリング、補足図5）。受信者動作特性（ROC）曲線と曲線下面積（AUC）は、Rパッケージ「pROC」（バージョン1.18.0）を用いて計算した。
宿主とマイクロバイオームの相互作用の解析
群間で有意または有意に近い差を示した宿主因子は、潜在的な交絡因子とみなした。宿主因子とグローバル微生物組成の関連は、全属のBray-Curtis距離に基づいてPERMANOVAで計算した（順列＝99,999）。また、前駆期および初期のα-シヌクレイン症で同定された分類群の違いに対する宿主因子の寄与を明らかにするためにMaAsLin 2を使用し、このモデルは4段階およびすべての共変量を固定効果として、家族IDをランダム効果としてトレーニングされました。PERMANOVAとMaAsLin 2検定による多重比較で生じたP値の調整にはBenjamini-Hochberg法を用い、MaAsLin 2の誤発見率の閾値は0.2568とした。
媒介分析
媒介効果の統計的有意性は、Rパッケージ「mediation」（バージョン4.5.0）を用いて解析した。解析力を向上させるため、前駆期PDの総LR（すなわち、前駆期PDの発症リスク）をアウトカムとし、微生物叢（第1主成分）と便秘（排便回数スコアで表す）のいずれかを媒介または暴露とした。平均因果媒介効果（ACME）は媒介者を介した間接効果を示し、平均直接効果（ADE）は曝露の結果に対する直接効果を示した。この間接／直接効果の有意性をブートストラップ（10,000再標本）手順で検証した。結果に対する曝露の効果のうち、メディエーターを経由する割合は、ACMEを総効果（ACME＋ADE）で割ることで評価した。
16Sマーカー配列からの機能予測
最後に、PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）ソフトウェア（https://github.com/gavinmdouglas/q2-picrust2/releases/tag/2021.11_0）69 を用いて微生物群集の機能可能性を予測した。代謝経路は、MetaCycデータベース70を使用してアノテーションした。同様に、低有病率（<10%）および存在量（<0.05%）のパスウェイをフィルタリングし、存在量データをCLR法で変換して、さらに分析を行った。パスウェイの存在量の差は、Kruskal-Wallis検定を用いて同定し、上記の分類群の存在量の差の解析で詳しく説明したように、α-synucleinopathyの異なるステージと差分パスウェイの相関を、MaAsLin 2を適用して評価した。
統計学と再現性
本研究のサンプルサイズは、食品衛生局保健医療研究基金（Ref No.：05162876、2017年）および香港中文大学医学部腸内細菌叢研究センターの助成による研究提案であらかじめ決定されていた。PDとコントロールの間の微生物叢の存在量の違いについて計算された効果量（コーエンのd）は、2.68でした。RBD、RBD-FDR、コントロールの患者間の差の効果量はより小さいと予想されたため、サンプルサイズの推定には、Cohenのdが0.80の効果量を採用した。この図に基づき、分子の自由度を6として、4群の分散分析（ANOVA）でI型誤差0.05、検出力0.90を達成するには、少なくとも各群36名のサンプルサイズが必要である。 データ収集については、臨床面接と生体試料処理において、すべての研究者はグループ割り当てを盲検化した。前述のように、DNA抽出、増幅、塩基配列決定を繰り返しても、塩基配列データの質が低いため、合計11検体をその後の解析から除外した。さらに、本研究の再現性・複製性をさらに向上させるために、以下のような統計解析手法（例：Mann-Kendall傾向、Kruskal-Wallis検定、MaAsLin 2）を適用し、特定の研究課題、すなわち、「腸内細菌叢の変化」を検証しました、 (2)機械学習分類器によるネステッドクロスバリデーションと反復処理により、RBDとコントロール、RBD-FDRの鑑別における微生物マーカーの平均性能を算出した。Rプロジェクトにおける訓練-試験分割とランダムフォレストモデルのシードセットはGitHubリポジトリで提供された。（3）多重比較のために、Benjamini-Hochberg偽発見率を使用して、偽陽性所見をさらに制御した。
データの入手
本研究で生成されたすべてのシーケンスリードは、EMBL-EBIのEuropean Nucleotide Archive (ENA) にアクセッション番号PRJEB52086で寄託されています。本研究で生成または解析されたすべての処理済みシーケンスデータ、社会人口統計学的および臨床特性データは、GitHubリポジトリ（https://github.com/Joannehb/Gut-microbiota-across-early-synucleinopathy）で入手できます。アライメントに使用したSilva 16S rRNAデータベースは、https://data.qiime2.org/2020.6/common/silva-138-99-nb-classifier.qza で入手可能です。ソースデータは本論文に添付されています。
コードの利用可能性
本研究のデータ処理および解析に使用したカスタムコードは、Zenodoリポジトリ（https://doi.org/10.5281/zenodo.7783875）に寄託されており、GitHub（https://github.com/Joannehb/Gut-microbiota-across-early-synucleinopathy）でも利用可能です。
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謝辞
本研究に参加されたすべての被験者に感謝いたします。本研究は、中国香港の食品衛生局保健医療研究基金（Ref No.：05162876、Y.K.W.へ）および研究助成委員会（RGC-CRF Ref No.：C4044-21GF 、Y.K.W. ）、香港中医薬大学腸微生物研究中心（To Y.K.W.and S.H.W. ）により資金提供されています。B.H.とJ.W.は、香港中文大学医学部のFaculty Postdoctoral Fellowship Schemeによる支援を受けた。
著者情報
著者および所属
香港中文大学医学部精神医学教室リ・チュウ・コン・ファミリー睡眠評価ユニット、香港特別行政区、中国
Bei Huang, Steven W. H. Chau, Yaping Liu, Joey W. Y. Chan, Jing Wang, Jihui Zhang, Li Zhou & Yun Kwok Wing
香港中文大学医学部精神科、中国
Bei Huang, Steven W. H. Chau, Yaping Liu, Joey W. Y. Chan, Jing Wang, Suk Ling Ma, Jihui Zhang, Li Zhou, Hei Ming Lai and Yun Kwok Wing
広州医科大学附属脳病院睡眠・概日医学センター（中国・広東省広州市
劉彌平、王静、張季慧
香港中文大学医学部 微生物学教室
ポール・K・S・チャン、ユン・キット・ヨー、ジグイ・チェン
中国香港中文大学医学部腸内細菌研究センター
ポール・K・S・チャン、ジグイ・チェン、カ・ファイ・トー、サイモン・ン、フランシス・K・L・チャン、ユン・クォック・ウイング
香港中文大学医学部 消化器病研究室
サニー・ヘイ・ウォン、カ・ファイ・トー、サイモン・ウン、フランシス・K・L・チェン
香港中文大学医学部医学治療学教室
サニー・ヘイ・ウォン、ヴィンセント・C・T・モク、ヘイ・ミンライ、フランシス・K・L・チャン
南洋理工大学リー・コン・チアン医学部マイクロバイオーム医学センター（シンガポール、シンガポール
サニー・ヘイ・ウォン
香港中文大学医学部李嘉誠健康科学研究所（中国、香港、シャティン市
ヴィンセント・C・T・モク、ヘイ・ミンライ、フランシス・K・L・チャン
マーガレット・K・L・チャン パーキンソン病管理研究センター、香港中文大学医学部医学・治療学教室、香港特別行政区、中国
ヴィンセント・C・T・モク
香港中文大学医学部解剖学・細胞病理学教室
カ・ファイ・トウ
香港中文大学医学部 外科学教室
サイモン・ウン
ゲオルク・アウグスト大学ゲッティンゲン校大学医療センター脳神経外科クリニック（ドイツ・ゲッティンゲン市
クラウディア・トレンクヴァルダー
パラケルスス・エレナ病院パーキンソン病・運動障害センター（ドイツ、カッセル市
クラウディア・トレンクヴァルダー（Claudia Trenkwalder
貢献度
Y.K.W.、J.Z.、Y.L.、P.K.S.C., S.H.W., V.C.T.M., K.F.T., S.N., and F.K.L.C. contributed to conception and design of the study; B.H..、 S.W.H.C.、Y.L.、J.W.Y.C., J.W., S.L.M., Y.K.Y., Z.C., H.M.L., L.Z..、 およびY.K.W.がデータの完全性と原稿作成に責任を持ち、B.H., J.Z., S.W.H.C., J.W.Y.C., Y.K.Y., C.T., Y.K.W が原稿作成と図作成に貢献した。
対応する著者
Yun Kwok Wingに対応する。
倫理的宣言
競合する利益
Y.K.W.はEisai Co., Ltd.から講演料、Lundbeck HK Limitedから出張費、J.W.Y.C.はEisai Co., Ltd.のエキスパートパネル会議への参加で個人的報酬を得ているが、提出研究とは別である。香港中文大学は、前駆期PD（RBDおよびRBD-FDR）の早期発見のための微生物マーカーの使用に関する米国仮特許（出願番号63/446,304、2023年2月16日出願）を出願しており、Y.K.W、H.M.L、B.H、P.K.S.C., V.C.T.M. および F.K.L.C が発明者です。B.H.とJ.W.は、CUHK医学部のFaculty Postdoctoral Fellowship Schemeの支援を受けている。残りの著者は、競合する利害関係を宣言していない。
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Huang, B., Chau, S.W.H., Liu, Y. et al. 初期パーキンソン病、レム睡眠行動障害およびその第一度近親者にわたる腸内細菌叢異変. Nat Commun 14, 2501 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38248-4
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2022年1月29日受領
2023年4月21日受理
2023年5月02日発行
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