ウイルスADPリボシルトランスフェラーゼはRNA鎖を宿主タンパク質に結合させる

2023年8月18日 19:56

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公開：2023年8月16日
ウイルスADPリボシルトランスフェラーゼはRNA鎖を宿主タンパク質に結合させる

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06429-2

Maik Wolfram-Schauerte, Nadiia Pozhydieva, ...Katharina Höfer 著者一覧を見る
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概要
ウイルスが感染した細胞の遺伝機構を乗っ取る仕組みは、現在注目されている。バクテリオファージT4が大腸菌に感染すると、3つの異なるアデノシン二リン酸（ADP）リボシルトランスフェラーゼ（ART）を用いて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）を基質とするADPリボシル化によって宿主の転写・翻訳装置を再プログラムする1,2。NADは以前、細胞内RNAの5′修飾として同定されている3,4,5。ここで我々は、T4 ART ModBがNADだけでなくNADでキャップされたRNA（NAD-RNA）も基質として受け入れ、「RNA化」反応でRNA鎖全体をアクセプタータンパク質に結合させることを報告する。ModBはリボソームタンパク質rS1とrL2のArg残基を特異的にRNA化し、大腸菌とT4ファージのRNAはin vivoでrS1に結合する。ModBの不活性変異体を発現するT4ファージは、バーストサイズが減少し、大腸菌の溶解が遅くなる。我々の発見は、NAD-RNAの明確な生物学的役割、すなわちタンパク質への酵素伝達のためのRNAの活性化を明らかにした。特定のRNAをリボソームタンパク質に結合させることで、ファージが宿主の翻訳機構を調節する戦略を提供できるかもしれない。この研究により、RNA修飾と翻訳後タンパク質修飾の直接的な関係が明らかになった。ARTはウイルス感染以外にも重要な役割を担っており6、RNAの修飾は広範囲に及ぶ可能性がある。

主な役割
ARTは、NADから標的タンパク質への1個または複数のADP-リボース（ADPr）単位の転移を触媒する7。細菌や古細菌のARTは毒素として作用し、宿主の防御機構や薬剤耐性機構に関与する8。一方、真核生物のARTは、DNA損傷修復からマクロファージの活性化やストレス応答まで、さまざまなプロセスで役割を担っている9。ウイルスはARTを武器として、宿主の遺伝子発現系を再プログラムする6。機構的には、標的タンパク質の求核残基（通常はArg、Glu、Asp、SerまたはCys）がNADのニコチンアミドリボシド部分のグリコシド炭素原子を攻撃し、N-、O-またはS-グリコシドとして共有結合を形成する7（図1a）。NADのアデノシン部分はこの反応に関与しないので、アデノシンが（通常の5′-3′ホスホジエステル結合によって）長いRNA鎖に伸長することはARTによって許容され、共有結合のRNA-タンパク質結合体の形成につながる可能性があると推測された（図1b）。大腸菌3,10,11を含む細菌、古細菌12,13、真核生物5,14,15,16,17,18,19で、NAD-RNA濃度が1.9から7.4 fmol µg-1 RNA16の範囲で、5′-NADキャップを持つRNAが見つかっている。この修飾は、mRNAやsmall regulatory RNA（sRNA）20を含む様々なタイプのRNAで観察された。しかしながら、このRNAキャップの生物学的機能についてはほとんど知られていない21。

図1：ADPリボシル化のメカニズムとRNA化の提案。
図1
a, ArgのADPリボシル化のメカニズム。最初に、リボースとニコチンアミド間のN-グリコシド結合がARTのGlu残基によって不安定化される。これにより、ニコチンアミドを脱離基とするADPrのオキソカルベニウムイオンが形成される。この求電子性イオンは、Gluを介したプロトン脱離の後、アクセプタータンパク質の求核性Arg残基によって攻撃され、N-グリコシド結合が形成される50。NAD存在下でのADPリボシル化と同様に、ARTはNAD-RNAを使ってRNA化反応を触媒し、それによってRNAをアクセプタータンパク質に共有結合させる可能性がある。赤はNADとNAD-RNAのニコチンアミドリボシド、青はARTの触媒残基、紫はアクセプタータンパク質の求核性Arg残基。

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バクテリオファージT4の感染サイクルは、大腸菌RNAポリメラーゼ（RNAP）によって転写される初期、中期、後期ファージ遺伝子の連続発現に依存している22。大腸菌の転写・翻訳機構を特異的に時間的に再プログラムするために、T4ファージは30以上の宿主タンパク質を改変する3つのARTを使用する。感染すると、これらのARTのひとつであるAltがファージDNAとともに菌体内に注入され、直ちに大腸菌のRNAPをさまざまな残基でADPリボシル化し、その結果、初期プロモーターからファージ遺伝子が優先的に転写されると考えられている23,24。つの初期ファージ遺伝子は、ARTであるModA25とModB1,26をコードしている。ModAはRNAPのADPリボシル化を完成させ、ModBは宿主タンパク質rS1を修飾すると考えられている（参考文献1,26）。しかしながら、ADPリボシル化が標的タンパク質の性質をどのように変化させるのか、あるいはT4感染時に他のタンパク質も修飾されるのかについては、まだわかっていない。

ModBはin vitroでRNA化を触媒する
ARTがNAD-RNAを基質として受け入れるのではないかという我々の考えを検証するために、Alt、ModA、ModBを精製した。自己修飾か標的タンパク質の修飾かを調べるために、合成の部位特異的32P標識5′-NAD-RNA 8塩基オリゴヌクレオチド（8-mer）か、3′-蛍光標識5′-NAD-RNA 10-merとインキュベートした。AltとModAが少量の標的RNA化しか示さなかったのに対し（Extended Data Fig. 対照的に、32P-NAD存在下でのModBを介したADPリボシル化は、両タンパク質（ModBとrS1）を同程度の強度で修飾した（図2bとExtended Data Fig.） ModBまたはrS1のいずれかが欠損している場合や、同じ配列の5′-32P-一リン酸-RNA（5′-32P-RNA）をModBの基質として用いた場合には、シグナルは見られなかった（Extended Data Fig.）さらに、ModBの活性部位（R73A、G74A）を変異させると、rS1のRNA化も阻害された（参考文献1）（Extended Data Fig.）この変異も同様に、ModBのADPリボシル化とRNA化活性の両方に影響を与えた。

図2：in vitroにおけるModBによるrS1の翻訳後タンパク質修飾。
図2
a, ModBによるrS1のRNA化の時間経過（n = 3）。rS1 + 32P-NAD-8-mer + ModBのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲルを示す。b, ModBによるrS1のADPリボシル化の時間経過（n = 3）、rS1 + 32P-NAD + ModBを示す。rS1のRNA化（a）とADPリボシル化（b）は、クマシー染色と重なる放射性シグナルの獲得によって示される。c, RNA化反応におけるRNA二次構造の役割。直鎖の10mer NAD-キャップRNAと、3′オーバーハング、ジヌクレオチド5′オーバーハング、またはブラントエンドを持つ3つの構造化NAD-キャップRNAを含む、4つの異なる3′Cy5-ラベルNAD-キャップRNAを試験した。SDS-PAGE解析をExtended Data Fig.3aに示す。相対変換は、4つの試験すべてで観察された最大RNA化強度に対するRNA化rS1バンドの強度を示す。d, 5′-NAD-100-nucleotide (100-nt) RNAを基質として用いたModBによるrS1のRNA化のin vitro動態（上）。ピンクのアスタリスクはシフトしたRNA化rS1を示し、青のアスタリスクはADPリボシル化rS1を示す。ADPリボシル化rS1は参照（Ref）。100ヌクレオチドの質量は約30kDaであり、RNA化rS1は約100kDa（rS1由来は70kDa、RNA由来は30kDa）である。ネガティブコントロールとして5′-P-100nt RNAを用いた（下、n＝2）。e, ヌクレアーゼP1はRNA化タンパク質rS1を分解する。共有結合した100ヌクレオチド長のRNAは、SDS-PAGEにおいてRNA化タンパク質rS1（約100kDaの質量を持つ）のシフトをもたらす。ヌクレアーゼP1はホスホジエステル結合を切断し、結合したRNAをモノヌクレオチドに分解する。ヌクレアーゼP1はRNA化rS1をADPリボシル化rS1（質量約70kDa）に変換し、これはSDS-PAGEゲル中のダウンシフトしたタンパク質バンドの存在によって見ることができる（n = 1）。赤はRNA化/ADPリボシル化タンパク質のリボース部分；NMPはヌクレオシド一リン酸；放射能記号は32P標識部位を示す；パックマンはヌクレアーゼP1を示す。ピンクと青のアスタリスクはdと同じ。

出典データ

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RNA化はADPリボシル化様機構に従う
ModB触媒によるrS1のRNA化は、ニコチンアミド部分を模倣すると考えられるART阻害剤3-メトキシベンズアミド（3-MB）27によって強く阻害され（Extended Data Fig. さらに、32P標識ADPr部分を持つRNA化rS1タンパク質をリボヌクレアーゼ（RNase）T1で処理し、RNAとタンパク質が共有結合しているかどうかを調べた（Extended Data Fig.2d）。この処理により、RNAがrS1と非共有結合しているか、5′末端以外の位置で共有結合していれば、32P標識は除去される。32P-rS1シグナルはT1で処理しても消失しなかったが、rS1を分解するトリプシンで処理すると完全に消失した（Extended Data Fig.）これらのデータを総合すると、図1bに示すように、RNAはその5′末端でrS1に共有結合していることがわかる。

短い直鎖状またはヘアピン状のNAD-RNAを用いたRNA化アッセイ（図2cおよびExtended Data図3a）により、ModBは基質として非構造化NAD-RNAを好むことが明らかになったが、約100ヌクレオチドのNAD-キャップQβ RNA断片28（図2dおよびExtended Data図3b）のような、生物学的に適切な長いNAD-キャップRNAも基質として受け入れた。NADでキャップされた100ヌクレオチドのRNAでRNA化すると、修飾されたrS1タンパク質は100kDaの見かけの質量で移動した（図2e）。3′-5′ホスホジエステル結合を加水分解するが、5′-ADPrのピロリン酸結合は攻撃しないヌクレアーゼP1でRNA化タンパク質を処理すると、このシフトは逆転し、32P標識産物は未修飾のrS1またはADPr-rS1と同様に移動した（図2e）。

ModBが加水分解によってNAD-RNAからニコチンアミド部分のみを除去し、それによって反応性の高いリボシル部分を生成し、（そのマスクされたアルデヒド基によって）その近傍の求核剤と自発的に反応する可能性を排除するために29、ADPr修飾RNAを調製し、ModBの基質としてテストした。修飾は検出されず（Extended Data Fig.

RNA化の際のRNAの分解を除外するために、3′末端に蛍光色素（Cy5）を持つNAD-RNA 10-merをModBに供給した（Extended Data Fig.） RNA化の時間経過解析から、NADでキャップされた様々なRNAに対して、無傷のオリゴヌクレオチド鎖がrS1に結合したことが示された（Extended Data Fig.）

ModBはrS1のArg残基を修飾する
RNA化の際にRNA鎖が共有結合するタンパク質rS1のアミノ酸残基を同定するために、タンパク質のADPリボシル化を解析するために開発されたツールを用いた。

32P-RNA化タンパク質rS1と32P-ADP-リボシル化rS1の放射性シグナルは、HgCl2（Cys残基のS-グリコシドを切断する）、NH2OH（AspとGluのO-グリコシドを加水分解する）で処理しても変化しなかった（Extended Data Fig. 4a）、あるいは組み換え酵素ARH3（Ser残基に特異的にO-ADPr配糖体を加水分解する）（Extended Data Fig. これらの結果は、ModB触媒によるRNA化の主な生成物は、Arg残基によってN-グリコシドとして結合していることを示している（Extended Data 図4c,d）。

図3: rS1のRNA化部位の同定。
図3
a,b, ARH1によるADPリボシル化とRNA化の特異的除去（n = 3）。反応の模式図はExtended Data Fig. ADPリボシル化（a）またはRNA化（b）タンパク質rS1の存在下でのARH1の酵素動態をSDS-PAGEで解析した。触媒的に重要な残基D55とD56の変異は、ADP-リボシル化とRNA化の除去を無効にした。 c-e、タンデムMSに基づくRNA化rS1ペプチドの同定。c、ADPrとシチジン一リン酸と3′リン酸基を持つRNA化rS1ペプチドAFLPGSLVDVRPVRDTLHLEGKのMS/MSフラグメントイオンスペクトル（スペクトルID：23723）。スペクトルは、アデニン(A′)とシトシン(C′)、アデノシン一リン酸(AMP)、シチジン一リン酸(CMP)、リボース-H2OとADPrのマーカーイオン(MI)を示す。前駆イオン（[M + 2H]2+）およびフラグメントイオンy13-y16、y18-y20、b14、b20は、42.021798 Da（#）の比質量損失を示し、これは修飾されたArg31でのCH2N2の損失によって説明できる。y13、y19およびy20の前駆イオンは、リボース-H2Oの質量分だけシフトしている()。このスペクトルは、アデニンが失われた場合()とそうでない場合()のADPrによってシフトする前駆体イオンとy19も示している。青はMI、赤はプリカーサーイオン、内部フラグメントイオン、b型フラグメント、緑はy型フラグメントイオン。 d: cに示したMS/MSスペクトルのMSプリカーサーイオンスキャンで検出されたプリカーサーイオンの同位体ピークパターン。e,cとdに示したRNA化ペプチドの配列とRNA付加体の表示。シフトしていないフラグメントイオンとアルギニンの消失を示すフラグメントイオン(#)、リボース-H2O()、ADPr()、ADPr-アデニン()の注釈を含む。cに示したMS/MSスペクトルで観察されたADPr + CMP + 3′-リン酸付加体のフラグメンテーション生成物は、構造中に水色（質量損失）と紺色（質量付加体）の線で示されている。

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ModBを介したADP-リボシル化またはRNA化もin vivoでArg残基で起こることを証明するために、非感染またはT4感染大腸菌からゲノムHisタグ化rS1を単離した。液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析計（LC-MS/MS）を用いた解析の結果、rS1のArg残基がADPrで特異的に修飾されていることが確認された。これらのADPr修飾は、T4感染サンプルにのみ存在した（Extended Data Table 1およびSupplementary Table 1）。rS1(R139K)およびrS1(R139A)変異体をT4感染大腸菌で発現させ、精製し、分析した結果、これらの変異がこれらの位置での修飾を防いでいることが明らかになった（拡張データ表2および補足表2）。

LC-MS/MS分析によるRNA化の検証
上記のLC-MS/MS分析では、rS1の修飾がRNA化またはADPリボシル化rS1に由来することを明確に示すことはできなかった。そこで我々は、rS1へのRNAの共有結合を検出するためにLC-MS/MSを最適化した。この分析のために、in vitroでRNA化され、切断されたrS1タンパク質をRNase A/T1とトリプシン消化にかけた。得られた混合物を直接LC-MS/MS分析に供し、RNA化rS1ペプチドにはまだトリヌクレオチド（ADPr-シチジン）が結合していると仮定して、RNPXLソフトウェアツール30を用いてMSデータを評価した。今回のLC-MS/MS分析では、アミノ酸位置129-150を含むrS1ペプチドにトリヌクレオチド（ADPr-シチジン）が共有結合していることが示された。前駆体の質量（[M + 3H]3+、質量電荷比(m/z)=1,115.81、予想分子量=3,344. 41 Da）に加え、CH2N2（修飾されたArg31由来）またはリボース、ADPrまたはADPr-A′付加体の特徴的な中性消失を示す気相b型およびy型フラグメンテーションパターンから、RNAがR139および/またはR142にN-グリコシド結合で結合していることが明らかになった（図3c-e、Extended Data Fig.5および補足表3）。それぞれのフラグメントイオンの強度が低く、異なる部位で修飾された同じペプチド種のイオン断片を含む混合スペクトルが出現したため、修飾されたArgを明確に特定できなかった（図3c-e）。

rS1は生体内でRNA化およびADPリボシル化される
生体内でのADPリボシル化とRNA化を定量的に区別するために、ADPリボシル化タンパク質を特異的に認識するが、ヌクレアーゼP1で処理した後にのみRNA化タンパク質を検出する抗体様ADPr結合試薬（pan-ADPr）を用いたイムノブロッティングを行った（Fig. rS1を非感染またはT4感染大腸菌で発現させ、アフィニティー精製し、pan-ADPrを用いてADPリボシル化を解析した。その結果、T4感染サンプルでのみrS1の広範なADPリボシル化が見られた。ヌクレアーゼP1で処理した後、rS1バンドのpan-ADPrシグナル強度が増加し（図4bおよび拡張データ図6b）、rS1のRNA化を示した。このように、rS1は生体内でADPリボシル化とRNA化の両方を受けており、RNA化は修飾の約30％を占めていることがわかった。しかし、この2つの修飾が相互に排他的なのか、あるいは同一分子内の異なる部位で同時に起こりうるのかは不明なままであった。さらに、ADPrのシグナルはARH1処理後に消失し、RNA-タンパク質結合の性質がさらに確認された（図4bおよびExtended Data Fig.） rS1のADPリボシル化とRNA化は、in vivoで並行して起こっていることがわかった。

図4：ADPリボシル化とRNA化のin vivoでの特徴。
図4
a, ヌクレアーゼP1消化とウェスタンブロット解析を用いたrS1のRNA化の定量。緑色の円はタンパク質を表す。 b, 生物学的3連データ（n = 3）に基づくin vivoでのrS1のRNA化の定量。データは平均値（グレーのバー）および個々のデータポイントで示す。c,RNAylomeSeqを用いたModBのRNA基質の同定。MAプロットは、3つの生物学的複製（n = 3）のうちの1つのデータを示している。さらなる詳細はExtended Data Fig. e, ModBによるタンパク質rS1、RNase E、不活性NudC変異体（NudC*: V157A, E174A, E177A, E178A）およびウシ血清アルブミン（BSA）のRNA化のSDS-PAGE解析（n = 2生物学的に独立した複製）。

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ModBは選択されたRNAでタンパク質をRNA化する
T4ファージによる感染中、ModBによってrS1に連結されるRNAを同定するために、ゲノム的にHisタグを付けたrS1をT4感染大腸菌から単離し、Ni-NTAビーズに捕捉するRNAylomeSeqアプローチ（Extended Data 図6c）を開発した。NAD captureSeq32と同様の方法で、RNAを「オンビーズ」で逆転写し、得られたcDNAをPCRで増幅し、次世代シーケンサーを用いて解析した。

このワークフローを、野生型（WT）T4ファージで処理した大腸菌に適用した。ネガティブコントロールとして、CRISPR-Cas9技術を用いて、触媒的に不活性な変異体ModB(R73A, G74A)を発現するT4ファージを作製した（文献33）。個々のRNA種にマップされたリードの存在量を比較し、WT T4ファージサンプルに濃縮された特定の大腸菌およびT4ファージRNAを同定した（図4c、拡張データ図6d,e、補足表4、補足図3）。大腸菌の転写産物（mRNAとsRNA）のいくつかは、acpP、glmY、mcaS、oxyS、aspA、rob遺伝子のRNAを含め、5′-NADキャップされていることが報告されており3,34、ModBの基質として適している。また、ipIII（内部頭部タンパク質III）のようなファージ転写産物も、我々のデータセットで濃縮されていた（図4c、拡張データ図6d,e、補足表4）。濃縮されたRNAには、転写開始部位のアデノシン（+1A）を除けば、共通した特徴は見られない。このアデノシンは、生体内でNADキャップRNAの生合成に不可欠である35。

ModBはOBフォールドタンパク質をRNA化する
ModBがどのようにして標的タンパク質を特定するのかを理解するために、既知の標的タンパク質の構造的特徴を分析した。rS1はオリゴヌクレオチド結合（OB）フォールドドメインを持つ28。OBフォールドの構造変異のひとつにS1ドメインがあり、rS1には配列の異なる6つのコピーが存在する（Extended Data Fig.） RNA化されたR139とR142はrS1のドメイン2に位置している。我々は、S1ドメインがModBによる基質認識に重要かもしれないと推測した。異なるS1ドメインに対するModBの特異性を明らかにするため、rS1の各S1ドメイン（D1-D6）をクローニング、発現、精製し、RNA化アッセイで試験した（図4dとExtended Data図7b）。質量分析（MS）データ（Extended Data Table 1およびSupplementary Table 1）と一致するように、rS1 D2およびD6には強いRNA化シグナルが検出されたが、rS1 D1、D3、D4およびD5はそれほど修飾されていなかった。rS1 D2とD6、そして大腸菌PNPaseのS1ドメインの多重配列アラインメントから、これらのS1ドメインは、βバレルの鎖3と4をつなぐループの一部としてArg残基を共有していることが明らかになった36（Extended Data Fig.）このループはβ-バレルの上部にあり、ModBがアクセスできる可能性がある。rS1 D2では、R139とR142残基がMSによって同定されたRNA化部位である（図3e-gと補足表1-3）。変異解析の結果、R139をAlaまたはLysに置換すると、D2のRNA化レベルが著しく低下することが確認された（Extended Data Fig.）大腸菌RNase Eもまた、鎖3と鎖4の間のループにArgを持つS1ドメインを活性部位に持っている。in vitroのRNA化アッセイでは、RNアーゼEはModBによって修飾されたが、S1ドメインを持たない対照タンパク質（BSAやNudC不活性変異体など）は修飾されなかった。これらのデータは、Argが埋め込まれたS1ドメインのようなOBフォールドが、RNA化の標的モチーフであることを示唆している（図4e）。

rL2はModBによるRNA化の標的である
ModBのさらなるRNA化標的タンパク質を発見するために、指数関数的に増殖している大腸菌から調製した細胞溶解液を、精製ModBと蛍光3′Cy5ラベルをつけたNAD-10-mer RNAとインキュベートした（図5aおよびExtended Data図8c）。タンパク質、核酸、そしてNAD37を含む様々な低分子の存在に関して、細胞内条件を近似した。

図5：リボソームのRNA化とModB変異T4ファージの表現型。
図5
a, ModBの基質特異性の特徴。細胞溶解液と70Sリボソームアセンブリー（n = 3）における2つのリボソームタンパク質（rS1とrL2）のRNA化。 c-e, T4 ModB R73A, G74A変異体表現型の特徴。WT T4ファージとT4 ModB(R73A,G74A)のバーストサイズ(c)、大腸菌溶解(d)、ファージ吸着(e)を示す（n = 3生物学的に独立した各レプリケート）。灰色の点線枠は、バーストサイズ（c, 感染後140分; 両側スチューデントのt検定, Psignif < 0.05でP = 0.0015）とファージ吸着（e, 感染後8分; t検定, 両側, Psignif < 0.05でP = 0.029）で統計的有意性を評価するために使用した時点を示すが、dでは統計的検定なしで遅延溶解を示す。

ソースデータ

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これらの溶解液におけるModB活性の速度論的解析から、rS1（マーカーとして加えたRNA化rS1と同様の方法で移動する）や約35 kDaの質量を持つタンパク質を含む、いくつかの大腸菌タンパク質がRNA化されていることが示された（Extended Data Figs. このパターンは、5′-モノリン酸化RNA-Cy5の存在下では観察されなかった。同じ溶解液で同時にADP-リボシル化も特徴付けたところ、ModBのADP-リボシル化ターゲットとRNA-リボシル化ターゲットは異なるパターンを示した（Extended Data Fig.9b）。大腸菌では、NAD-RNA濃度は約5μM（文献4）であるのに対し、NADは約700倍過剰（2.6mM；文献37）である。ライセートアッセイにおけるNAD-RNAに対するNADのこのモル過剰をシミュレートするために、我々はライセートにNADを加えた。その結果、NADが700倍過剰でも、RNA化は約67％の効率で起こることがわかった（Extended Data Fig.）次に、プロテオミクスによって、大腸菌タンパク質に対するModBの強度を評価したところ、標準的なアッセイ条件に対して100倍希釈すると、感染時の相対的なModB強度に類似する可能性があることが明らかになった38（Extended Data Table 3）。ModB濃度が細胞内条件に近い溶解液では、標準条件下と同様のADPリボシル化およびRNA化パターンが観察された（Extended Data Fig.）

これらの結果は、NADがNAD-RNAよりもはるかに豊富な細胞内条件下で、ModBが特定の標的タンパク質をRNA化することを示している（Extended Data Fig.） ModBは以前、翻訳に関与するタンパク質を優先的にADPリボシル化すると考えられていたので1、単離した大腸菌リボソームのRNA化パターンをモニターしたところ（図5a）、溶解液と同様のパターンが観察された（Extended Data Fig.）

RNA化タンパク質を同定するため、40ヌクレオチド長のNAD-RNAで大腸菌リボソームをRNA化し、RNA化リボソームタンパク質のゲルシフトを得た。単離されたゲルバンドのMS分析から、リボソームタンパク質L2（rL2）がModBによるRNA化の標的であることが同定された（Extended Data Fig. 進化的に高度に保存されており、30Sサブユニットと50Sサブユニットの会合に必要で、A部位とP部位の両方へのtRNA結合に関与し、ペプチド転移酵素活性に重要である39。rS1、PNPase、RNase Eと同様に、rL2にはOBフォールドと相同なRNA結合ドメインがある40。In vitro RNA化アッセイでは、NAD-RNAの存在下で、rL2の約80％がModBによってRNA化されることがわかった（Extended Data Fig.10c）。rL2のin vitro RNA化部位は、上述のように、RNPxlによるMSデータ検索を含むLC-MS/MSアプローチを用いて同定した。トリヌクレオチド（ADPr-C）がR217とR221に結合していることがわかった（Extended Data Fig.） R221はリボソームペプチド転移酵素活性に不可欠なH229の近く（11Å離れている）に位置している39。rL2とrS1のRNA化がリボソームの翻訳効率に影響するかどうかは、今後の研究で明らかになるだろう（図5b）。

ModBはファージ感染に重要である
ファージ感染におけるModBの機能的役割を調べるため、WT T4とT4 ModB(R73A, G74A)の表現型を比較した。その結果、T4 ModB(R73A, G74A)のバーストサイズ（感染した大腸菌細胞1個あたりに放出されるビリオンの数）は、感染後50分までに、WT T4（60 ± 32子孫/細胞）に比べて4倍減少した（15 ± 3子孫/細胞）（図5c）。感染後140分までに、WT T4が産生したファージ（6.6×105±1.3×105子孫）は、T4 ModB(R73A, G74A)からの子孫数（5.5×104±3.1×104）を大幅に上回った（図5cおよび補足図4a）。感染後140分で、T4 ModB(R73A, G74A)の子孫数は、WT T4ファージに比べて12倍減少した。このように、ModBの不活性化はファージの増殖特性に顕著な影響を与える。

また、変異ファージ存在下で培養した大腸菌の溶菌に約20分の遅れが観察された（図5d）。ModBが感染の細胞内あるいは細胞外段階での感染サイクルに影響を与えるかどうかを調べるために、ファージの細胞への吸着の動態を測定した（図5e）。その結果、変異型ファージの吸着速度が有意に低いことが観察された。感染後8分で、T4 ModB(R73A, G74A)変異体の約61.3±7.3%が大腸菌への侵入に成功したのに対し、WT T4ファージでは85.3±2.4%であった（図5eおよび補足図4b）。これらの結果は、不活性化ModB存在下で生成されたファージは、感染の最初の段階、すなわち宿主への付着と侵入において効果が低いことを示している。この発見は、宿主の溶解が遅れることと一致する。

考察
RNAとタンパク質間の相互作用のほとんどは非共有結合である41が、いくつかの例外もある42。例えば、タンパク質の生合成におけるペプチジルtRNA中間体43（これはエステルである）や、アデノウイルスのVPgタンパク質がヌクレオチドと（チロシンOH基によって）ホスホジエステル結合を形成し、これが転写を開始するのに使われる44,45。ここで我々は、ARTがグリコシド結合を形成することにより、NADでキャップされたRNAを転写後に標的タンパク質に結合させることができることを示した。この発見は、細菌におけるRNA上のNADキャップの明確な生物学的機能、すなわちアクセプタータンパク質への酵素的転移のためのRNAの活性化を示している。我々は、標的タンパク質のRNA化（これまで報告されていなかった翻訳後タンパク質修飾）が、バクテリオファージT4による大腸菌の感染に関与していることを発見した。我々は、ModBが翻訳装置の一部であるタンパク質をRNA化する標的特異的ARTであることを発見した。その結果、rS1とrL2はRNA結合領域の特定のArg残基でRNA化されることがわかった。さらに、T4ファージ感染時にrS1に結合する大腸菌転写産物が主に同定された。ModBを不活性化すると、ファージ感染時の細菌の溶解が遅れ、放出される子孫の数が減少した。ModB（非カプシドタンパク質）の変異が宿主細胞へのファージ吸着にどのように影響するかはまだ不明である。今後の研究で、ファージの組成と構造を正確に定義すれば、この現象を説明できるかもしれない。

今回の発見は、T4ファージが宿主の翻訳機構を標的とする分子メカニズムを紹介し、バクテリオファージの病原性にRNA化が関与している可能性を示すものである。しかしながら、ADPリボシル化とRNA化のどちらがModBの重要な機能であるかは、まだ明らかにされていない。T4変異体ModB(R73A, G74A)は、RNA化だけでなくADPリボシル化活性も消失させた。このため、観察されたT4感染に対する影響が、RNA化に特異的なものなのか、ADPリボシル化活性の消失によるものなのかを判断することは困難である。

ModBは、T4感染時にNADを基質として宿主タンパク質をADPリボシル化する酵素であることが知られていた。この研究の過程で、ModBは基質としてNADだけでなくNAD-RNAも受け入れることが明らかになった。酵素は通常、基質に対して高い特異性を持ち、限られた化学修飾しか許容しない。それゆえ、ModBが標的タンパク質の特定のサブセットを修飾するために、NAD（NAD-RNA）の3′OH基に嵩高いRNA鎖を結合させることを許容することは驚きであった。驚くべきことに、今回ModBのRNA化標的として同定された4つのタンパク質（rS1、rL2、RNase E、PNPase）はすべて、RNAと相互作用することがよく知られている。従って、ModBが基質としてNAD-RNAを受け入れる能力と、標的タンパク質のRNA親和性の両方が、RNA化の特異性を決定すると考えられる。我々は、ADPリボシル化またはRNA化のみを行うModBの変異体を作製することに成功しなかった。RNA化は、ADPリボシル化と同じ触媒残基が関与するADPリボシル化類似のメカニズムで起こるが、標的タンパク質のRNA親和性がRNA化の特異性を決めるのかもしれない。

我々は、なぜファージARTが翻訳に関与するタンパク質に特定のRNAを結合させるのかを考えた。T4ファージが大腸菌に感染すると、宿主のリボソームを再プログラムして、そのmRNAを翻訳させようとする46。これを達成する一つの方法は、T4 mRNAの翻訳に関与しないリボソームを制御して停止させることであろう。重要なリボソームタンパク質であるrS1とrL2がRNA化の標的として発見されたことから、RNA化はペプチド転移酵素活性の調節など、それらの機能を損なうのではないかと推測される。大腸菌の転写産物のほとんどがin vivoでrS1に結合しているという事実は、宿主の望ましくない遺伝子発現イベントがRNA化によって阻止されていることを示唆している。このように、ファージはRNA化を利用して、宿主の異なるリボソームを不活性化するのかもしれない。

今後の研究で、大腸菌の転写産物を翻訳するリボソームがRNA化によって阻害されるかどうかを明らかにできるだろう。この提案されているメカニズムにより、ファージは感染サイクルを通してリボソームの活性を制御し、宿主タンパク質の翻訳を停止させることが可能になる。

既知の3つのT4 ARTのうち、なぜ1つだけが効率的なRNA化を行うのかは分かっていない。ModAとModBはともに、活性部位モチーフR-S-EXE1など、Arg特異的ARTの特徴的な機能を有している。従って、基質特異性の違いは、おそらく配列の違いによるものであろう（ModAとModBは25％同一で、47％のアミノ酸が相同である）1。

ARTはファージに限らない。ADPリボシル化タンパク質は、インフルエンザ、コロナウイルス、HIVなど様々なウイルス感染後の宿主から検出されている。ウイルスがARTを武器として使うだけでなく、哺乳類の抗ウイルス防御システムも、宿主のARTを使ってウイルスタンパク質を不活性化する。さらに、哺乳類のARTとポリ（ADPr）ポリメラーゼは、重要な細胞内経路の制御因子であり、RNAと相互作用することが知られている47。このように、ARTはさまざまな生物でRNA化反応を触媒する可能性があり、RNA化は生物学的に広範に関連する現象である。

最後に、RNA化は翻訳後のタンパク質修飾であると同時に、転写後のRNA修飾であるとも考えられる。われわれの発見は、RNAとタンパク質がどのように相互作用するかについての既成概念を覆すものである。異なるクラスの生体高分子の構造的・機能的境界がますます曖昧になりつつあるこの時期に、このような未記載のRNA-タンパク質複合体が発見されたのである48,49。

方法
一般的方法
試薬はSigma-Aldrichから購入し、精製せずに使用した。オリゴヌクレオチド、DNA、RNAはIntegrated DNA Technologies社から購入した（補足表7-10）。DNA と RNA の濃度は NanoDrop ND-1000 分光光度計を用いて測定した。放射性標識タンパク質および核酸は、蓄積性蛍光体スクリーン（GE Healthcare）およびTyphoon 9400イメージャー（GE Healthcare）を用いて可視化した。トリミングしていないゲルとブロットの画像を提供する（補足図1）。

in vitro転写による5′ppp-RNA、5′p-RNAおよび5′-NAD-RNAの調製
Qβ RNA（100ヌクレオチドRNA）および大腸菌RNAIのDNA鋳型をPCRで増幅し（プライマー配列を補足表9に示す）、PCR産物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し、QIAquick PCR精製キット（QIAGEN）を用いて精製した。5′-三リン酸（ppp）Qβ RNAおよびRNAIは、1×転写バッファー（40mM Tris、pH8.1、1mMスペルミジン、10mM MgCl2、0.01％ Triton X-100）、5％ DMSO、10mM DTT、各NTP 4mM、20μg T7 RNAポリメラーゼ（2mg ml-1、当研究室で精製）および200nM DNA鋳型の存在下でin vitro転写により合成した。2mMのATPと4mMのNADを用いて同様の条件でNAD-RNAIを作った。α-32P標識5′-NADとpppQβ RNAの混合物の合成も、4mM ATPの代わりに2mM ATP、80μCi 32P-α-ATP、4mM NADを用いた以外は同じ条件で行った。in vitro転写反応を37℃で4時間インキュベートし、DNase I（Roche）で消化した。RNAは変性PAGEで精製し、イソプロパノールで沈殿させ、ミリポア水に懸濁した。RNA配列を補足表7に示す。

5′ppp-RNAを5′-一リン酸-RNA（5′p-RNA）に変換するために、250pmolのQβ RNAを1×ポリホスファターゼ反応緩衝液中60U RNA 5′-ポリホスファターゼ（Epicentre）で37℃、70分間処理した。タンパク質をフェノール-クロロホルム抽出によって5′p-RNAから除去し、残留フェノール-クロロホルムを3ラウンドのジエチルエーテル抽出によって除去した。5′p-RNAをイソプロパノール沈殿させ、ミリポア水に再懸濁した。

5′-一リン酸およびNAD-キャップRNAの5′-ラジオラベリング
120pmolの5′p-Qβ RNAまたは6.25nmolの5′p-RNA 8-mer（補足表7）を、1×反応緩衝液B中50UのT4ポリヌクレオチドキナーゼと1,250μCiの32P-γ-ATPで処理した。得られた5′-32P-RNA 8-merおよび5′-32P-Qβ RNAはフェノール-クロロホルム抽出により残留タンパク質から分離した。残りの32P-γ-ATPは、3カラム容量のミリポア水で洗浄し、10kDa（Qβ RNAについて）または3kDa（8-merについて）アミコンフィルター（Merck Millipore）で14,000rpm、4℃で4回遠心分離することにより除去した。RNA配列を補足表7に示す。精製した5′-32P-RNAを5′-32P-NAD-キャップRNAに変換するために、800pmolの5′-32P-RNA 8-merまたは30pmolの5′-32P-Qβ RNAを、記載52のように合成したニコチンアミドモノヌクレオチドホスホリミダゾリドのスパチュラチップの存在下、50mM MgCl2中、50℃で2時間インキュベートした。RNAは、ミリポア水で洗浄し、10 kDa（Qβ RNA）または3 kDa（8-mer） Amiconフィルターで14,000 rpm、4℃で4回遠心分離することにより精製した。5′-32P-RNAの濃度は、NanoDrop ND-1000分光光度計を用いて測定し、イミダゾリド反応のおおよその収率を50％と仮定して、収量された5′-NAD-キャップされた32P-RNAのおおよその濃度を計算するのに用いた（参考文献52）。5′-32P-ADPr-RNA 8-merは、8μMの5′-32P-NAD-RNA 8-merと0.08μMのADP-リボシルシクラーゼCD38（R&D Systems社製）を1×分解バッファー中、37℃で4時間インキュベートすることにより合成した。反応は、P/C/I-ジエチルエーテル抽出と3kDaフィルターによる濾過、4カラム容量のミリポア水による洗浄により精製した。

ADP-リボース転移酵素、ADP-リボースヒドロラーゼおよび標的タンパク質のクローニング
バクテリオファージT4遺伝子modA（GeneID: 1258568; Uniprot: P39421）、modB（GeneID: 1258688; Uniprot: P39423）およびalt（GeneID: 1258760; Uniprot: P12726）を増幅するために、バクテリオファージT4活性化からの単一のプラークをミリポア水に懸濁し、バクテリアコロニーPCRに類似した「プラーク」PCRに使用した。ADP-リボシルヒドロラーゼARH1をコードする遺伝子（GeneID: 141; Uniprot: P54922）は、gBlockとしてIDT社から購入し、PCRで増幅した。rS1（GeneID：75205313；Uniprot：P0AG67）、rL2（GeneID：947820；Uniprot：P60422）およびPNPase（GeneID：947672；Uniprot：P05055）をコードする大腸菌遺伝子は、GenElute Bacterial Genomic DNA Kit（Sigma-Aldrich）を用いて単離した大腸菌K12のゲノムDNAからPCR増幅した。塩基配列を補足表8に示す。XhoIおよびNcoI制限部位は、適切なプライマーを用いて増幅中に導入した（補足表9）。得られたPCR産物をXhoIとNcoI（Thermo Fisher Scientific）で消化し、pET-28cベクター（Merck Millipore）にクローニングした。サンガー配列決定後、得られたプラスミドを大腸菌One Shot BL21 (DE3) (Life Technologies)に形質転換した。ARH1 D55,56A、ModB(R73A)およびrS1変異体は、Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit (Thermo Scientific)に基づいた手順を用いた部位特異的変異誘発によって作製した。得られたプラスミドの塩基配列を決定し、大腸菌One Shot BL21（DE3）に形質転換した。本研究で使用し、作製したすべての菌株を補足表10にまとめた。

rS1、rS1ドメインおよびバリアント、rL2、PNPase S1ドメイン、RNase E(1-529)、Alt、NudC、NudC*(V157A、E174A、E177A、E178A)およびNudC(E178Q)の精製
それぞれのプラスミド（補足表10）を含むイソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）誘導大腸菌ワンショットBL21（DE3）をLB培地で37℃で培養した。タンパク質の発現は、600nmの光学密度（OD600）が0.8で誘導され、37℃で3時間遠心分離した後に細菌を回収し、HisTrap緩衝液A（50mM Tris-HCl、pH7. 8、1M NaCl、1M 尿素、5mM MgSO4、5mM β-メルカプトエタノール、5％グリセロール、5mM イミダゾール、500mlあたり1錠の完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche））中で超音波処理（50％出力で5回）した。溶解液を遠心分離（37,500g、30分間、4℃）して上清を1mlのNi-NTA HisTrapカラム（GE Healthcare）にかけた。タンパク質をHisTrap緩衝液B（HisTrap緩衝液Aに500mMイミダゾールを加えたもの）の類似勾配を用いたイミダゾール勾配で溶出し、SDS-PAGEで分析した。

さらなるタンパク質の精製は、0.5 M NaClと25 mM Tris-HCl、pH 8を含むSEC緩衝液を用い、Superdex 200 10/300 GLカラム（GE Healthcare）を通したサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により達成された。目的のフラクションはSDS-PAGEで分析され、プールされ、Amicon Ultra-4遠心フィルター（分子量カットオフ（MWCO）10 kDa、遠心分離2,000 rpm、4℃）で濃縮された。タンパク質濃度はNanoDrop ND-1000分光光度計で測定した。最後に、タンパク質は50％グリセロールを加えたSECバッファー中、-20℃で保存した。

ARH1およびARH1(D55A, D56A)の精製
大腸菌BL21 DE3 pET28-ARH1およびBL21-pET28-ARH1 D55A、D56A（補足表10）を37℃、175rpmでOD600＝0.6まで増殖させた。その後、室温まで30分間冷却した。発現を1 mM IPTGで誘導し、最終的に175 rpmで振とうしながら室温で一晩培養した。菌体を遠心分離で回収し、rS1変異体と同様の方法でタンパク質を精製した。

ModAの精製
大腸菌BL21 DE3 pET28-ModA（補足表10）を37℃で175rpmで振盪しながらOD600＝1になるまで増殖させた。タンパク質の発現を0.5mM IPTGで誘導し、37℃で3時間後に遠心分離して細菌を回収した。ペレット化した細菌を50 mM NaH2PO4, pH 8, 300 mM NaCl, 1 mM DTTに再懸濁し、500 mlあたり1錠の完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を加え、超音波処理(5%出力で3×1分)で溶解した。溶解物を3,000g、4℃で20分間遠心した。沈殿物を30mlの50mM Tris-HCl、pH7.5、2mM EDTA、100mM NaCl、1M尿素、1mM DTTおよび1錠のEDTAを含まないプロテアーゼインヒビター（Roche）で再懸濁することにより洗浄し、10,000g、4℃で20分間遠心した。封入体を含むペレットを40 ml 100 mM Tris, pH 11.6, 8 M ureaに再懸濁し、12-14 kDa MWCO透析バッグ（Roth）に移し、50 mM NaH2PO4, 300 mM NaClに対して一晩透析した。タンパク質溶液を20,000g、4℃で30分間遠心分離した。上清は、2mlのNi-NTAアガロース（イエナバイオサイエンス社製）を充填し、10容量の50mM NaH2PO4（pH 8）、300mM NaClで平衡化した使い捨て10mlカラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてバッチ精製した。50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、15 mM イミダゾールのカラム30容量でカラムを洗浄し、5 mlの50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、300 mM イミダゾールで溶出し、Amicon（Merck Millipore）フィルターで濃縮することでタンパク質を精製した（2,000 rpm、4℃で遠心分離し、MWCO 10 kDa）。最後に、rS1について記述したように、SECによってタンパク質を精製した。

ModBおよびModB(R73A, G74A)の精製
大腸菌BL21 DE3 pET28-ModBおよび大腸菌BL21 DE3 pET28-ModB(R73A、G74A)(補足表10)を、37℃で185rpmで振盪しながらOD600=2.0まで増殖させ、160rpmで少なくとも30分間振盪しながら4℃まで冷却した。タンパク質の発現は、1 mM IPTGの添加によって誘導した。その後、培養物を160rpmで振とうしながら4℃で120分間インキュベートし、遠心分離（4℃で4,000rpm、25分間）によって細菌を回収した。ModBタンパク質は、rS1変異体について述べたように、上清から精製した。

ModB構造のAlphafold予測
AlphaFold2.ipynb（v.1.3.0、https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb）を用い、デフォルトのパラメータ（use_templates = false, use_amber = false; msa_mode = MMseqs2 (UniRef+Environmental), model_type = "AlphaFold2-ptm", max_msa = null, pair_mode = unpaired+paired, auto advanced settings）でModB構造のAlphafold予測を行った。ModBタンパク質の配列はUniprotから取得した（primary accession: P39423）。Rank_1からのModB構造予測モデルはさらにPyMolを用いて評価した。

32P標識NAD、NAD-8-mer、NAD-Qβ RNAまたはNAD-10-mer-Cy5を用いたrS1とrL2のin vitroでのADPリボシル化とRNA化
rS1（0.3μM）を0.25μCi μl-1 32P-NADの存在下でADP-リボシル化するか、0.6μM 32P-NAD-8-mer, 0.03μM 32P-NAD-Qβ RNA, 0.8μM NAD-10-mer-Cy5 (Supplementary Table 7)のいずれかの存在下で1. 4 µM ModB、1×トランスフェラーゼバッファー（10 mM Mg(OAc)2, 22 mM NH4Cl, 50 mM Tris-acetate pH 7.5, 1 mM EDTA, 10 mM β-メルカプトエタノール、1%グリセロール）中、15℃で少なくとも120分間。ModB添加前、1、2、5、10、30、60、120分後にサンプル（5μl）を採取し、5μlの2×Laemmliバッファーと混合して反応を停止させた。反応は12％SDS-PAGEで評価し、ゲルをInstant Blue溶液（Sigma-Aldrich）で10分間染色した。放射性シグナルは、蓄積性蛍光スクリーンとTyphoon 9400イメージャーを用いて可視化した。放射性バンドの強度はImageQuant 5.2（GE Healthcare）を用いて定量した。NADキャップしたCy5標識RNAによるRNA化は、ChemiDoc（Bio-Rad）のCy5チャンネルを用いて可視化した。その後、ゲルをクマシー溶液で染色し、同じシステムで画像化した。場合によっては、2,2,2-トリクロロエタノール（TCE）をゲル中に取り込ませて、SDSゲル中のタンパク質の無染色イメージングを行った。TCEはタンパク質のトリプトファン残基に結合し、紫外線下で蛍光を増強するため、タンパク質の検出が可能になる53。

LC-MS/MS測定のために、6.4 µM NADまたは6.4 µM NAD-8-merを基質として、4.6 µM rL2を1.57 µM ModB存在下で4時間修飾するために、同じ設定でrL2をADPリボシル化またはRNA化した。シフトアッセイでは、6 µM NAD-8-mer存在下、538 nM rL2を2.61 µM ModBでRNA化した。12%SDS-PAゲルを40%エタノールと10%酢酸の溶液で一晩固定し、Flamingo蛍光タンパク質色素（Bio-Rad）で最大6時間染色し、ChemiDoc（Bio-Rad）で画像化した。シグナル強度はImageLab（Bio-Rad）で定量した。統計学的検定は、ggpubrパッケージ(v.0.6.0)で実装されたR(v.4.2.2)で有意水準0.05の両側t検定を用いて行った。

大腸菌RNAポリメラーゼのNAD-10-mer-Cy5によるin vitro RNA化
0.8μMのNAD-10-mer-Cy5（補足表7）と0.5μMのタンパク質大腸菌RNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、3μMのAltまたはModAを1×トランスフェラーゼバッファーの存在下、15℃で60分間インキュベートした。サンプルはAltまたはModAの添加前と60分間のインキュベーション後に採取した。反応は1容量の2×Laemmliバッファー添加で停止させた。NAD-10-mer-Cy5を参照タンパク質として、ModBによってRNA化されたrS1を用いて、反応を10% SDS-PAGEで分析した。RNA化タンパク質はChemiDoc（Bio-Rad）のCy5チャンネルを用いて可視化した。その後、ゲルをクマシー溶液で染色し、同じシステムで画像化した。

タンパク質rS1の自己RNA化の解析
20μlの反応液中で、3.6μMの32P-ADPr-8-mer（補足表7）を、1×トランスフェラーゼ緩衝液中で、2.6μMのrS1、3.9μMのModB、または2.59μMのrS1と3.9μMのModBの両方とインキュベートした。ポジティブコントロールとして、同量のタンパク質rS1とModBを0.6 µM 32P-NAD-8-mer とインキュベートした。すべての反応は15℃で60分間インキュベートした。サンプルはModB添加前または60分後に採取し、1容量の2×Laemmli bufferを加えて反応を停止させた。反応物は12% SDS-PAGEとオートラジオグラフィーイメージングで分析した。

Qβ RNA（100ヌクレオチド-RNA）によるタンパク質rS1のRNA化と5′-NADキャップに対する特異性
0.05 µM 32P-NAD-Qβ RNA、0.15 µM 5′-32P-Qβ RNAまたは0.15 µM 5′-32PP-Qβ RNA（補足表7）を、1×トランスフェラーゼバッファーの存在下、2.3 µM rS1および1.4 µM ModBとともに15℃で60分間インキュベートした。サンプルはModB添加前と60分後に採取し、1容量の2×Laemmli緩衝液を加えて反応を停止させた。反応は10% SDS-PAGEで分析し、参照として1×Laemmli緩衝液中のrS1-32P-ADPrを適用し、その後オートラジオグラフィーでイメージングした。

酵素処理のためのRNA化およびADPリボシル化rS1の調製
ADP-リボシル化またはRNA化反応を放射性標識基質で行い、洗浄後、1×トランスフェラーゼまたは1×分解バッファーで平衡化し、さらに酵素処理を行った。反応は、10 kDa Amicon (Merck Millipore)フィルター中、4℃で10,000gの遠心分離により、対応するバッファー4カラム容量で洗浄した。Cy5標識RNAでRNA化したタンパク質は、Zeba Spin脱塩カラム（7 kDa MWCO、0.5 ml）（Thermo Fisher Scientific）を用いて、同じバッファーで製造元の指示に従って平衡化した。

100-ヌクレオチド-RNAでRNA化したタンパク質rS1のヌクレアーゼP1消化物（rS1-100-ヌクレオチド-RNA）
rS1-100-ヌクレオチド-RNA（32P）混合物（19μl）を1×トランスフェラーゼバッファーで平衡化し、1μlのヌクレアーゼP1または1μlのミリポア水とともに37℃で60分間インキュベートした。サンプルは最初と60分後に採取し、1容量の2×Laemmli緩衝液を加えて反応を停止させた。反応物は、1×Laemmliバッファー中のrS1-32P-ADPrをリファレンスとして、10％SDS-PAGEで分析し、その後オートラジオグラフィーでイメージングした。

32P標識rS1-8-merとrS1-ADPrのトリプシン消化物
1×分解バッファー中のrS1とrS1-8-mer（32P）、およびrS1とrS1-ADPr（32P）の混合物（19μl）を、0.2μgのトリプシン（Sigma、EMS0004、質量分析グレード）、または陰性対照としてミリポア水のいずれかと37℃でインキュベートした。サンプルはトリプシン/ミリポア水添加前と120分後に採取した。反応は、サンプルに1容量の2×Laemmli緩衝液を加えることで停止させ、12% SDS-PAGEとオートラジオグラフィーイメージングで分析した。

in vitroでのADPリボシル化とRNA化の化学的除去
洗浄し平衡化したADP-リボシル化（1μl）およびRNA化（2μl）（32P）rS1のアリコートを、37℃で1時間、10mM HgCl2または500mM NH2OH（参考文献54,55）のいずれかで処理した。

in vitroでのADPリボシル化とRNA化の酵素的除去
洗浄し平衡化した（1×分解バッファー中）ADPリボシル化（1μl）およびRNA化（2μl）rS1（32P）のアリコートを、0.5UエンドヌクレアーゼP1（Sigma-Aldrich）56または0. 95μMのARH1またはARH3（ヒト組換え体、Enzo Life Science）57を、10mM Mg(OAc)2, 22mM NH4Cl, 50mM HEPES, 1mM EDTA, 10mM β-メルカプトエタノールおよび1%(v/v)グリセロール存在下、総容量20μlで37℃、1時間処理した。

3-メトキシベンズアミドによるRNA化およびADPリボシル化の阻害
1.4μMのModBおよび2.3μMのタンパク質rS1と、1μMの32P-NAD-8-merまたは3μMの5′-32P-8-mer（補足表7）との反応（20μl）を、2mMの3-MB（DMSO中の50mMストック）または阻害剤の非存在下（DMSOのみ）で、15℃でインキュベートした（参考文献58）。サンプルはModB添加前と60分後に採取した。反応は1容量の2×Laemmliバッファー添加で停止し、12%SDS-PAGEで分析した。

RNA二次構造がRNA化効率に及ぼす影響
1.1μMのNAD-RNA-Cy5（直鎖、5′オーバーハング、3′オーバーハング、鈍端；補足表7）を0.9μMのrS1および0.4μMのModBとともに1×トランスフェラーゼ緩衝液中でインキュベートした。5μlのサンプルを、ModBタンパク質の添加前と、反応開始の2、5、10、30、60、120分後に採取した。サンプルを1容量の2×Laemmliバッファーと直接混合し、反応を停止させた。基質の変換は、ChemiDoc（Bio-Rad）のCy5チャンネルで可視化した後、12% SDS-PAGEで分析した。RNA化されたrS1タンパク質の最大シグナル強度を用いて、それぞれの時点における各基質の相対的変換率を求めた。

大腸菌B株の培養とT4ファージによる感染
大腸菌B株pTAC-rS1（補足表10）の前培養を、100 µg ml-1 アンピシリンを添加したLB培地で、37℃、185 rpmで一晩培養した。主培養では、100 µg ml-1 アンピシリンを添加した 150 ml の LB 培地を OD600 = 0.1 になるように前培養した。OD600 = 0.4で、1 mM IPTGの添加によりタンパク質発現を誘導した。OD600 = 0.8で、培養液にバクテリオファージT4を感染多重度(MOI)10で感染させた（20mlのファージ液）（DSM 4505、Leibniz Institute DSMZ）か、代わりに20mlのLB培地を加えて感染させなかった（陰性対照）。培養は、37℃で20分間、240rpmで振とう培養した。室温で4,000g、15分間の遠心分離により細菌を回収した。ペレットは-80℃で保存した。

感染大腸菌B株pTAC-rS1からのHisタグ付きrS1の精製
細菌ペレットを10mlの緩衝液Aに懸濁し、超音波処理（1×5分、50％出力で2サイクル）で溶解した。溶解液を37,500g、4℃で30分間遠心した。上清を0.45μmフィルター（Sarstedt）で濾過し、バクテリオファージT4感染株または非感染大腸菌B株由来のrS1を重力Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーで上清から精製した。Ni-NTAアガローススラリー（1ml、Thermo Fisher Scientific）を10mlプロピレンカラムに加え、バッファーAで平衡化した。カラムを、29.75mMイミダゾールを含む95%緩衝液Aと5%緩衝液Bの混合液で洗浄した。タンパク質を10mlのバッファーBでカラムから溶出した。

T4感染または未感染の大腸菌B株pTAC-rS1由来のHisタグ付きタンパク質rS1を、フィルター2容量分の1×分解バッファー（12.5mM Tris-HCl、pH7.5、25mM NaCl、25mM KCl、5mM MgCl2）で、10-kDa Amiconフィルター中、5,000g、4℃で遠心分離して洗浄し、最終容量120μlまで濃縮した。画分を12% SDS-PAGE分析で分析し、ゲルをInstant Blue溶液で10分間染色し、直ちに画像化した。

LC-MS/MS分析のためのHisタグ付きrS1およびrL2の精製
内在性HisタグrS1を有する大腸菌B株、およびHisタグrS1 WT、R139AまたはR139Kを発現する大腸菌B株を、上記のようにMOI 5.0になるようにT4で8分間感染させた。 5 mlの15 mMイミダゾールを含むNi-NTA緩衝液A（50 mM Tris-HCl、pH 7.8、1 M NaCl、1 M 尿素、5 mM MgSO4、5 mM β-メルカプトエタノール、5% グリセロール、15 mM イミダゾール、500 mlあたり1錠の完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche））に懸濁した。超音波処理（80％出力で2分間×3回）により細胞を溶解し、17,000g、4℃、30分間の遠心分離により上清を除去した。上清を15mMイミダゾールを含むNi-NTA緩衝液Aで平衡化した75μlのNi-NTA磁気ビーズ（イエナバイオサイエンス）と4℃で1時間インキュベートした。磁気ビーズを15mMイミダゾールを含む1mlのNi-NTAバッファーAで7回、イミダゾールを含まず4M尿素を含むNi-NTAバッファーで3回洗浄した。最後に、Ni-NTA溶出バッファー（50 mM Tris-HCl、pH 7.8、1 M NaCl、1 M Urea、5 mM MgSO4、5 mM β-メルカプトエタノール、5% グリセロール、300 mM イミダゾール、500 mlあたり1錠の完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製））を加えてタンパク質を溶出した。タンパク質をZebaカラム（7 kDa MWCO、0.5 ml）を用いて1×トランスフェラーゼバッファー中で製造者の指示に従って平衡化し、37℃で3時間、1:20の比率（w/w）でトリプシンで消化した。ペプチドは、50 mMトリエチルアミン-酢酸（pH 7.0）バッファーと0-90%アセトニトリル、Chromabond C18 WPスピンカラム（20 mg、Macherey Nagel）を併用してC18精製した。精製ペプチドはHPLCグレードのH2Oに溶解し、LC-MS/MS分析に供した（下記参照）。

1×トランスフェラーゼバッファー中のin vitro RNA化rS1（D2）反応は、1μg RNase A（Thermo Fisher Scientific）および100U RNase T1（Thermo Fisher Scientific）を用いて37℃で1時間直接消化し（さらなる精製は行わず）、次いでトリプシン（Promega）を用いて同じバッファー中で37℃で3時間、サンプルあたりの総タンパク質含量に対して1：30の比率（w/w）でトリプシン消化した。ペプチドは上記のようにChromabond C18 WPスピンカラムで精製し、LC-MS/MS分析に用いた（下記参照）。

NAD-8-merを用いたrL2のin vitro RNA化反応およびADP-リボシル化反応は、T4ファージ感染大腸菌由来のタンパク質と同様の設定で精製した。ここで、反応液（200μl）を、10mMイミダゾールと40UマウスRNアーゼ阻害剤（New England Biolabs）を含む800μlのNi-NTA緩衝液Aで平衡化した100μlのNi-NTAビーズと4℃で1時間インキュベートした。ビーズを室温で1mlのストレプトアビジン洗浄緩衝液（50mM Tris-HCl、pH7.4、8M尿素）で8回洗浄し、130μlのNi-NTA溶出緩衝液でタンパク質を溶出した。精製したタンパク質は、Zebaスピン脱塩カラム（7 kDa MWCO、0.5 ml）を用いて、メーカーの指示に従って100 mM NH4OAcで再沈殿させた。rL2サンプルは、50 mM Tris-HCl（pH7.5）中の4 M尿素に溶解し、室温で30分間インキュベートした後、50 mM Tris-HCl（pH7.5）で1 M尿素に希釈した。10 μg RNase A（Thermo Fisher Scientific）と1 kU RNase T1（Thermo Fisher Scientific）を加え、37℃で4時間インキュベートした。タンパク質消化のために、0.5μgのトリプシン（Promega）を各サンプルに加え、37℃で一晩消化を行った。サンプルは1%アセトニトリル(ACN)とギ酸を用いてpH3に調整した。サンプルは、C18カラム（Harvard Apparatus）を用いて、製造元の指示に従って洗浄した。

Hisタグ付きin vitro RNA化rS1およびrL2のLC-MS/MS分析
洗浄したrS1およびrL2ペプチドサンプルを2% ACN、0.05% トリフルオロ酢酸に溶解し、Orbitrap Exploris 480質量分析計(Thermo Fisher Scientific)とDionex Ultimate 3000 RSLCnanoシステムを用いてLC-MS/MS分析を行った。ペプチドをPepmap 300 C18トラップカラム（Thermo Fisher Scientific）（流速、10 µl min-1）にバッファーA（0.1%（v/v）ギ酸）中でロードし、バッファーAで3分間洗浄した。バッファーB（80%(v/v)ACN、0.08%(v/v)ギ酸）のリニアグラジエントを適用することにより、ペプチド分離を社内充填C18カラム（30 cm; ReproSil-Pur 120 Å, 1.9 µm, C18 AQ; 内径75 µm; 流速300 nl min-1）で行った。メインカラムを5%緩衝液Bで18秒間平衡化した後、サンプルを添加し、カラムを5%緩衝液Bで3分間洗浄した。

溶出したrS1とrL2ペプチドは、データ依存のトップ20取得メソッドを用いて、ポジティブモードで58分間分析された。MS1とMS2の分解能はそれぞれ120,000と30,000の半値全幅に設定され、自動ゲインコントロール（AGC）ターゲットは106（MS1）と105（MS2）に設定された。MS1のスキャン範囲はm/z = 350-1,600に設定した。前駆体は、28%正規化、高エネルギー衝突誘起解離フラグメンテーションを用いてフラグメンテーションした。その他の分析パラメータは以下のように設定した：分離幅、1.6 m/z；ダイナミック排除、9秒；MS1およびMS2の最大注入時間、それぞれ60 msおよび120 ms。

すべての測定において、内部キャリブレーションにはロックマスオプション（m/z 445.120025）を使用した。

in vitro RNA化rS1およびrL2 MSデータの解析
MSデータは、OpenMSパイプラインRNPxlとOpenMS TOPPASViewer30を使用して手動で解析および検証した。プリカーサーの質量許容差は6 ppmに設定した。MS/MSの質量許容差は20ppmに設定した。Arg残基における42.021798 Da (C1H2N2)のニュートラルロスと、リボースからH2Oを除いた付加体(78.010565 Da, C5H2O)、ADP-リボース(541.06111 Da, C15H21N5O13P2)、アデニンを除いたADPr(485.97295 Da; C10H17O16P3)31が定義された。結果は、ペプチドスペクトルのマッチングレベルにおいて、1%の偽発見率でフィルタリングされた。rS1ペプチドのイオンクロマトグラムは、Skyline（v.21.2.0.369）59を用いて抽出し、可視化した。

T4-ファージ感染大腸菌から単離したHisタグ付きrS1のLC-MS/MS分析
タンパク質消化物のLC-MS/MS分析は、エレクトロスプレーイオン源（Thermo Fisher Scientific）に接続したExploris 480質量分析計で行った。ペプチド分離は、パックインC18樹脂カラム（Magic C18 AQ 2.4 µm、Dr. Maisch）を装備したUltimate 3000 nanoLC-system（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。ペプチドはプレカラムからバックフラッシュモードで、98%溶媒A（0.15%ギ酸）と2%溶媒B（99.85%ACN、0.15%ギ酸）から35%溶媒Bへのグラジエントで、それぞれ40分と90分かけて溶出した。流速は300nl min-1に設定した。ラベルフリー定量用のデータ依存の取得モードは、分解能60,000（m/z 200）の高分解能MSスキャンを1回取得するように設定し、スキャン範囲は350～1,650 m/zとした。MS/MSスキャンは、20個の最も強いイオン（90分のグラジエント）と、2秒以内に検出された最も強いイオン（1秒サイクル、40分のグラジエント）について取得した。MS/MSの試行効率を上げるため、荷電状態スクリーニングモードを調整し、未同定のイオンと単一荷電イオンを除外した。イオン蓄積時間は、MSでは25ms、MS/MSスキャンでは「auto」に設定した。AGCは、MSサーベイスキャンでは300%、MS/MSスキャンでは200%に設定した。

MaxQuant（v.1.6.17.0およびv.2.0.3.0）を用いて、標的タンパク質と一般的な汚染タンパク質のファスタデータベースを用いて、生のMSスペクトルを解析した。以下の検索パラメータを使用した：完全なトリプシン特異性が必要（LysまたはArg残基の後の切断）；3回の切断ミスが可能；カルバミドメチル化（C）を固定修飾として設定；酸化（M；+16 Da）、脱アミド化（N、Q；+1 Da）およびADPリボシル化（K；+541 Da）を可変修飾として設定。MaxQuantはデフォルト設定で実行した。すべてのMaxQuantパラメータを補足表1および2に示す。MSプロテオミクスデータはProteomeXchange ConsortiumのPRIDEパートナーリポジトリにデータセット識別子PXD041714で寄託された。

内在性HisタグrS1を持つ大腸菌B株の作製
HisタグrS1を内在性に持つ大腸菌B株は、pRET/ETプラスミドを用いた直鎖形質転換DNA（tDNA）の相同組換えにより大腸菌B株中に作製された。直鎖tDNAは、4つの断片を融合PCRで整列させることにより作製された：すなわち、pET28 rS1ベクターから増幅したHisタグを付加したrpsA遺伝子の156塩基対（bp）（左相同フランクとして機能する）、ネイティブrpsAターミネーターの70bp断片、pKD4からのFlp-flankedカナマイシンカセット、およびrpsA遺伝子の3′フランキング領域の140bp（右相同フランク）である。使用したプライマーは補足表9に示した。その後の組換えの手順は、RET/ET組換えによる大腸菌遺伝子欠失キット（ジーンブリッジ社）のプロトコールに基づく。簡単に説明すると、pRED/ETプラスミドを含む大腸菌B株を、100μg ml-1 アンピシリンを添加したLB培地で30℃で培養した。OD600=0.35で、L-アラビノースを0.33%(w/v)まで添加し、37℃、1時間の増殖中にRED/ET組換え系の発現を誘導した。次に、1.4mlの培養液を3,000g、4℃、1分間の遠心分離で回収し、細胞を1mlの冷10%グリセロールで2回洗浄し、最後に50μlの10%グリセロールに再懸濁した。MicroPulser Electroporator（Bio-Rad）を用い、標準設定（Ec1）で1μgのtDNAを細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞は、直ちに1mlの予熱したLB培地に懸濁し、37℃で600rpmで3時間振盪培養した。細胞は2日で回復し増殖した。組換えの成功はサンガー配列決定で評価し、正しいタンパク質発現はプルダウンとプロテオミクスで検証した。

RNAylomeSeq
1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、30μg ml-1のカナマイシンを添加したLB培地で、内因性にHisタグを持つrS1（補足表10）を持つ大腸菌B株の培養液（100ml）を、250mlのバッフル付き三角フラスコでOD60が約0.8になるまで37℃で培養した。T4ファージWTまたはT4ファージModB(R73A, G74A)をMOI 5.0になるように添加した。未感染の陰性対照には、同量のLB培地を加えた。その後、培養液を37℃で8分間インキュベートし、3,000gで13分間遠心分離して大腸菌を回収した。乾燥ペレットは-80℃で保存した。

WT T4ファージ、T4ファージ ModB(R73A、G74A)、または非感染コントロール（LB）のいずれかに感染させた100 ml培養のペレットを、2 mlのNi-NTA洗浄バッファー（10 mMイミダゾール、50 mM Tris-HCl、pH 7. 5、1 M NaCl、1 M 尿素、5 mM MgSO4、5 mM β-メルカプトエタノール、5％グリセロール、pH 8.0、EDTA不含プロテアーゼ阻害剤（Roche、500 ml当たり1錠））に氷上で懸濁し、超音波処理（6分間、50％出力、0.5秒パルス）で溶解した。溶解液を21,000g、4℃、30分間の遠心分離で細胞残屑を除去した。上清（1.9 ml）、50μlのNi-NTAアガロースビーズ（Jena Bioscience社製、Ni-NTA洗浄バッファーで平衡化）、80UのマウスRNase阻害剤（New England Biolabs社製）、NADキャップRNAIでRNA化した4.72μgのrS1 D2を合わせ、ロータリーミキサーで4℃で30分間インキュベートした。全サンプルをMobicol mini spin columns (MoBiTec)に移した。ビーズを200μlのNi-NTA洗浄バッファーで4回洗浄し、続いて200μlのストレプトアビジン洗浄バッファー（50mM Tris-HCl、pH7.5、8M尿素）で8回洗浄した。ビーズを標準ライゲーションバッファー（10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4）で平衡化し、ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックしてから、標準ライゲーションバッファー、50 mM β-メルカプトエタノール、0. 05 µg µl-1 BSA、15% (v/v) DMSO、5 µM アデニル化RNA-3′-アダプター、0.5 U µl-1 T4 RNL1（New England Biolabs）および10 U µl-1 T4 RNL2, tr. K227Q（New England Biolabs）の存在下で4℃で一晩ライゲーションした。タンパク質は、NaClを1.5Mまで添加し、20℃で400rpmで20分間振とうしてリバウンドさせた。その後、ビーズをストレプトアビジン洗浄バッファーで6回洗浄し、ファーストストランドバッファー（50mM Tris-HCl、pH8.3、3mM MgCl2、75mM KCl）で平衡化し、BSAでブロックした。タンパク質結合RNAの逆転写は、5μM RTプライマー、第一鎖バッファー、25mM β-メルカプトエタノール、0.05μg µl-1 BSAおよび0.5mM dNTPs存在下、10U µl-1 Superscript IV Reverse Transcriptase（Invitrogen）を用いて、30µlスケールで40℃、1時間行った。インキュベーション後、NaClを1.5Mまで添加し、溶液を20℃で400rpmで1時間振とうしながらインキュベートし、RNA-cDNAハイブリッドを再結合させた。その後、ビーズを0.25×ストレプトアビジン洗浄バッファー（2M尿素、50mM Tris-HCl、pH7.5）で5回洗浄し、ExoIバッファー（10mM Tris-HCl、pH7.9、5mM β-メルカプトエタノール、10mM MgCl2、50mM NaCl）で平衡化し、BSAでブロックした。残存するRTプライマーは、ExoIバッファー中1U µl-1 E. coli ExoI（New England Biolabs）を用いて、37℃で少なくとも30分間ExoI消化することにより除去した。最後に、ビーズを200μlの0.25×ストレプトアビジン洗浄バッファーで5回洗浄し、続いて200μlの固定化バッファー（10mM Na-HEPES、pH7.2、1M NaCl）で3回洗浄した。ビーズを100μlの150mM NaOH中で55℃、25分間インキュベートし、100μlのMQ水で洗浄することにより、cDNAを溶出した。溶出液のpHは、0.05容量の3M NaOAc, pH 5.5の添加により中和した。cDNAはフェノール-クロロホルム抽出により残留タンパク質から除去し、0.3M NaOAc, pH 5.5の存在下、2.5容量のエタノールで一晩沈殿させた。沈殿したcDNAは、1.25 mM CTPと1×TdTバッファー存在下、37℃で30分間、1 U µl-1 TdT（Thermo Fisher）を用いてC-tailし、その後70℃で10分間不活化した。5μMのcDNAアンカー（フォワードアンカーとリバースアンカーのハイブリダイゼーション、補足表9）を標準ライゲーションバッファー中、10μMのATPと1.5U µl-1 T4 DNA Ligase（Thermo Fisher Scientific）の存在下、4℃で一晩、C-tail cDNAにライゲーションした。ライゲーション反応を70℃で10分間不活性化し、cDNAをエタノール沈殿させた。

イルミナRNAylomeSeqライブラリーを調製するために、cDNAを5% (v/v) DMSO、200 µM dNTPs、および2,500 nM New England Biolabs Next UniversalとIndex Primer各々（Primer Set 1, New England Biolabs）の存在下で、2 U Phusion Polymerase（Thermo Fisher Scientific）を用いてPCRで増幅した。PCR産物をネイティブPAGEで精製し、エタノール沈殿させた。二本鎖DNA(dsDNA)濃度はQuantus fluorometer (Promega)を用いて決定し、ライブラリーサイズはBioanalyzer (Agilent)を用いて決定した。各ライブラリーの等モル量を、MiniSeq High-Output Kit（150サイクル、Illumina）を用いてMiniSeqシステム（Illumina）でシーケンスし、2,000万個の151bpシングルエンドリードを生成した。

次世代シーケンスデータの解析
次世代シーケンス（NGS）データは、bcl2fastq（v.2.20.0、Illumina）を用いてデマルチプレックスした。FastqファイルはFastQC（v.0.11.9）を用いて評価し、イルミナシーケンスアダプターはcutadapt（v.1.18）を用いてリードからトリミングした。大腸菌K12 (U00096.3)、バクテリオファージT4 (NC_000866.4)、およびRNAI (当社デザイン)からなる参照ゲノムに、hisat2 (v.2.2.1)を用いてリードをアライメントした。一次アラインメントはsamtools (v.1.7)を用いて選択し、ゲノムフィーチャーごとのリードはfeatureCounts (Subreadパッケージのv.2.0.1)を用いてカウントした。得られたcounts tableをR (v.4.1.2)でさらに解析し、データを可視化した。リードカウントは、サンプルあたりのマップされたリードの全体数、およびRNAIスパイクインのそれぞれのリードカウントに対して、以下のように正規化した：

$${{\rm{n}}{\rm{o}}{\rm{r}}{\rm{m}}{\rm{r}}{\rm{e}}{\rm{a}}{\rm{d}}{\rm{c}}{\rm{o}}{\rm{u}}{\rm{n}}{\rm{t}}}{i,j}=\frac{{{\rm{r}}{\rm{e}}{\rm{a}}{\rm{d}}{\rm{c}}{\rm{o}}{\rm{u}}{\rm{n}}{\rm{t}}}{i, j}\times {\rm{r}}{\rm{e}}{\rm{a}}{\rm{d}}{\rm{c}}{\rm{o}}{\rm{u}}{\rm{n}}{\rm{t}}({{\rm{R}}{\rm{N}}{\rm{A}}{\rm{I}}}_{j})}{\sum {i}{{\rm{r}}{\rm{e}}{\rm{a}}{\rm{d}}{\rm{c}}{\rm{o}}{\rm{u}}{\rm{n}}{\rm{t}}}{i, j}}$$
データの可視化はカスタムRスクリプト60で行い、アラインメントはIntegrative Genomics Viewer (IGV v.2.4.9)で手動で検査した。ヒットは以下の基準に基づいて同定された：WT T4とT4 R73A,G74A変異体を比較したlog2-transformed fold change (LFC) ≥ 1.5、および1つのレプリカのWTとR73A,G74Aサンプルのlog2-normalized mean expression ≥ -0.5。

定量的PCRによるNGSデータの検証
RNAylomeSeqからのcDNAをミリポア水で1:30に希釈した。定量的PCRは、1 µlの希釈cDNAを10 µlのスケールでテクニカルデュプリケートし、iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）を用いて、補足表9に示したプライマーを用いて、製造元の指示に従って100-150 bpの領域を増幅した。WT T4とT4 R73A,G74A感染サンプルの対応する複製からのサイクル閾値の差をlog2変換して計算し、LFC≧1をcDNA濃縮の閾値として設定した。

リボソームのRNA化とRNA化タンパク質のプロテオーム解析
70S リボソーム（4.3 µg µl-1）をトランスフェラーゼバッファー中、1 µM NAD-10-mer-Cy5 または 1 µM NAD-40-mer-Cy5 存在下（補足表7）、0.05 µg µl-1 ModBで15 °C、90分間RNA化した。RNA化および非RNA化コントロールサンプルを12% SDS-PAGEで分析した。RNA化タンパク質を同定するために、SDS-PAGEで分離したタンパク質のバンドを切り出し、既述のようにゲル中でタンパク質を消化した61。LC-MSは、Proflowアップグレードとnanospray flexイオン源を備えたUltimate 3000 RSLCnanoシステムに接続したExploris 480質量分析計で行った（すべてThermo Scientific）。ペプチド混合物は、C18樹脂（2.4 μm、Dr. Maisch）を充填した逆相HPLCカラム（75 μm × 42 cm）で分析した。ペプチドは、加熱キャピラリー温度275℃、ファンネルRFレベル40、スプレー電圧2.3kVでイオン化した。MSサーベイスキャンは、m/z 200で120.000の分解能、フルMS AGCターゲット300%、最大IT50 msで取得した。質量範囲は350-1,650に設定した。フラグメントスペクトルは、四重極分離窓をm/z = 1.5、AGC目標値を200%、分解能を15.000とし、データ依存取得モードで取得した。フラグメンテーションは、正規化高エネルギー衝突誘起解離衝突エネルギーを27%として誘導した。MS生データは、Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Scientific)に組み込まれたSEQUESTを用いて、バクテリオファージT4タンパク質ModBを含むUniprot E. coliタンパク質データベースに対して検索した。スペクトルカウントは、Scaffold Viewerからエクスポートされ、サンプルあたりの総スペクトルカウントは、Microsoft Excel 2016で除算することによって他のすべてのタンパク質のスペクトルカウントを正規化するために使用され、修飾バンドと非修飾バンドからの正規化スペクトルカウントの比が計算された。

大腸菌溶解液中のタンパク質のRNA化
40mlの大腸菌B株培養からOD600が約0.8の新鮮なペレットを2mlのトランスフェラーゼバッファー（10mM Mg(OAc)2, 22mM NH4Cl, 50mM Tris-acetate, pH 7.5, 1mM EDTA, 10mM 2-メルカプトエタノール, 1% グリセロール）に再懸濁した。細胞を超音波処理（50%出力で3×2分、0.5秒パルス）により溶解し、溶解液を27,670g、4℃で30分間遠心分離して細胞残屑を除去した。上清はRNA化アッセイに使用した。

溶解液（100 µl）を0.93 µM NAD-10-mer-Cy5（NAD-capped を基準として0.47 µM）または0.93 µM P-10-mer-Cy5（Supplementary Table 7）、0.37 U murine RNase inhibitor（New England Biolabs）、および0.69 µM ModBの存在下、15℃でインキュベートした。ModB添加前、2、5、10、20、30、60分後に10μlのサンプルをとり、直ちに1容量の2×Laemmli緩衝液に懸濁した。サンプルは、同じリファレンス（NAD-10-mer-Cy5でRNA化したrS1）を各ゲルに適用し、12％SDS-PAGEで分析した。Cy5シグナルは、ChemiDoc Imaging SystemのCy5 blotオプションを使用し、90秒のマニュアル露光で記録した。

様々な濃度のModBを添加した大腸菌ライセートを、既述のように処理し、プロテオミクスで分析した38。

大腸菌溶解液中のNAD濃度の測定
大腸菌細胞溶解液の希釈系列をPBSで調製した。NAD を 100 mM のストックから PBS で希釈し、1,000 nM から 3.125 nM の NAD 溶液を調製した。NAD溶液、ライセート希釈系列、およびPBSブランクを、NAD/NADH-Gloアッセイ（プロメガ社製）を用いて、製造業者の説明書に従い、3連でNAD濃度を評価した。発光測定は、Tecanプレートリーダー（Spark社製）を用い、384ウェルフラットホワイトプレートで行った。NAD 濃度が 400 nM から 4 nM の間で、強度に対して直線的な相関を示す直線フィット（R2 = 0.9836）が行われた。この式を用いて、大腸菌溶解液のNAD濃度をテクニカルトリプリケートの平均値として算出した。

ウェスタンブロッティング
タンパク質は10% SDS-PAGEで分離し、ゲルはトランスファーバッファー（25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM glycine, 20 % (v/v) methanol）で平衡化した。孔径0.2μmのポリフッ化ビニリデン膜（GE Healthcare）をメタノール中で1分間活性化し、トランスファーバッファーで平衡化した。タンパク質は、特に指示がない限り、300 mAで1.5時間、セミドライでゲルからメンブレンに転写した。転写後、膜はメタノールに浸して脱水し、TBS-Tween（TBS-T; 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20）で2回洗浄した。その後、10mlのブロッキングバッファー（TBS-T中5%(w/v)粉乳）を膜に加え、室温で1時間インキュベートした。ADPリボシル化タンパク質を検出するため、膜を10mlの洗浄バッファー（TBS-T中1%(w/v)粉乳）中1:10,000希釈の抗-pan-ADPr結合試薬MABE1016（Merck）と4℃で一晩インキュベートした62。膜を洗浄し、洗浄バッファーで1:10,000に希釈した10mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ-ヤギ-抗ウサギIgG二次抗体（Advansta）と室温で1時間インキュベートした。ADPリボシル化タンパク質は、製造元の指示に従って、SignalFire ECL試薬またはSignalFire Elite ECL試薬（Cell Signaling Technology）を用いて化学発光により可視化した。

SDS-PAGEゲル中のタンパク質をブロッティング前に可視化する必要がある場合は、TCE染色法53を用いた。溶解ゲルには0.5%(v/v)のTCEを添加した。可視化のために、ゲルを紫外線透過照明（波長300 nm）で60秒間活性化した。

RNA化の定量
rS1タンパク質は、未感染またはバクテリオファージT4に感染した大腸菌B株pTAC rS1菌（補足表10）から単離した。rS1（1.5μM）を、12.5mM Tris-HCl、pH7.5、25mM NaCl、25mM KCl、5mM MgCl2の存在下、1μM ARH1で処理した。あるいは、rS1 (1.5 µM)を100 mM Mg(OAc)2, 220 mM NH4Cl, 500 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM EDTA, 100 mM β-メルカプトエタノールおよび10%グリセロール中、0.5 UエンドヌクレアーゼP1で処理した。消化物を37℃で2時間インキュベートした後、9容量のエタノールを加えて沈殿させ、4℃で1時間遠心分離（14,000 pm）して沈殿させた。ADPr修飾は、上記のように一次抗体MABE1016（Merck）によって検出された。ADPリボシル化rS1の汎ADPrシグナルは、TCE染色における対応するバンド強度に対して正規化した。未処理rS1の正規化強度をP1処理rS1の強度で割ると、2つの修飾に対するADPリボシル化rS1とRNA化rS1のフラクションが得られた。

ファージ突然変異誘発
CRISPR-Cas9スペーサープラスミドは、DS-SPCasプラスミド（Addgene、48645）にmodBスペーサー配列を導入して作製した（補足表10）。modBを導入したベクターpET28_ModBは、CRISPR-Cas9を介した突然変異誘発における相同組換えのドナーDNAとして用いた。pET28_ModBプラスミドは部位特異的突然変異誘発によって改変され、その際に点変異R73AとG74AがmodBに露出した。R73A変異はADPリボシルトランスフェラーゼ活性の不活性化につながった。G74A変異はプロトスペーサー隣接モチーフに位置し、Cas9ヌクレアーゼによるドナーDNAの切断を防ぐのに必要であった。適用したプライマーを補足表9に示す。得られたプラスミドの塩基配列を決定し、大腸菌BL21（DE3）に形質転換した。

CRISPR-Cas9を介した変異導入は、以前の研究に基づいている33。標的スペーサー配列を持つDS_SPCas_ModBプラスミドとドナープラスミドpET28a_ModB_R73A/G74Aを大腸菌DH5αに共形質転換した。この細胞をさらにバクテリオファージT4で感染させ（1:10,000ファージ:細胞）、プラークアッセイを行った。プレートを37℃で一晩培養し、得られたプラークを変異体についてスクリーニングした。単一プラークを滅菌ピペットチップで摘み取り、2μlのCCl3Hを加えた200μlのPi-Mg緩衝液（26mM Na2HPO4, 68mM NaCl, 22mM KH2PO4, 1mM MgSO4, pH7.5）に移した。次に、2μlのサンプルを新しいPCRチューブに移し、95℃で10分間加熱した。このサンプルをさらにPCRを用いたDNA増幅に使用した（使用したプライマーは補足表9に記載）。増幅されたDNAはアガロースゲル電気泳動で精製し、サンガー配列決定に供した。

プラークアッセイ
目的の大腸菌培養液をOD600が0.8-1.0程度になるまで増殖させた。次に、300μlの培養液を100μlのWT T4ファージまたはT4 ModB(R73A, G74A)変異体（補足表10）に感染させた。細菌-ファージ懸濁液を37℃で7分間インキュベートした後、4 mlのLB寒天培地（0.75%）に移し、混合してLB寒天培地プレート（1.5% LB寒天培地）に注いだ。プレートは37℃で一晩培養し、翌日バリデーションした。

T4を介した大腸菌溶解の時間経過
LB培地（500mlのバッフル付きフラスコに100ml）に大腸菌B株をOD600 = 0.1になるまで一晩植菌し、37℃でOD600 = 0.8になるまで180rpmで振盪培養した。培養液を室温まで冷却し、WT T4ファージまたはT4 ModB(R73A, G74A)変異体（補足表10）をMOI 5になるように感染させた。培養はさらに室温で150rpmで振盪しながら行った。細胞溶解は、異なる感染時間（感染後0-200分）のOD600を測定することで追跡した。実験は生物学的3反復で行った。

バーストサイズの決定
LB培地（500mlのバッフル付きフラスコに100ml）に大腸菌B株をOD600=0.1になるまで一晩植菌し、その後、上記と同様にOD600=0.8になるまで180rpmで振盪しながら37℃で培養した。この培養液を、WT T4ファージまたはT4 ModB(R73A, G74A)変異体（補足表10）にMOIが0.01になるように感染させ、さらに37℃で振盪せずに培養した。

感染5分後の感染中心総数T0（未吸着ファージと既に吸着しているファージからなる）を測定するために、感染培養液100μlを用いて300μlの大腸菌B細胞（OD600 = 1.0）に再感染させ、その後のプラークアッセイを行った。1mlの感染培養液を50μlのCCl3Hに移し、未吸着のファージ数（U）を測定した。このようにして大腸菌細胞を破砕し、未吸着のファージをそのままプラークアッセイに用いた。T0-Uは、最初に感染した中心数を示す。未吸着ファージの数（Uxmin）は、感染中連続的に追跡され、T4-ファージの子孫数の計算に用いられた（T4-ファージの子孫数＝Uxmin／（T0-U5min））。ファージ数の最初の増加が観察された時点を最初のバースト時点として扱い、ファージバーストサイズ（バーストサイズ = Uburst1/(T0-U5min)）の計算に用いた。

データはOriginPro 2020bソフトウェアを使ってプロットした。エラーバーは3生物学的反復の平均のs.d.を表す。選択された時点について、統計検定はR(v.4.2.2)のggpubrパッケージ(v.0.6.0)で有意水準0.05の両側t検定として行った。

ファージ吸着速度論
LB培地（500mlバッフル付きフラスコに100ml）に大腸菌B株をOD600 = 0.1になるまで一晩植菌し、上記と同様にOD600 = 0.8になるまで180rpmで振とうしながら37℃で培養した。培養液を室温まで冷却し、WT T4ファージまたはT4 ModB(R73A, G74A)変異体（補足表10）をMOI 0.1になるように感染させた。感染直後、100μlの培養液をプラークアッセイで全感染中心数T0を測定した。次に、感染の異なる時点（感染後0～25分）で100μlの培養液を取り、5μlのCCl3Hを加えて大腸菌細胞を破砕した。この懸濁液を用いて、プラークアッセイにより未吸着のファージ数（Uxmin）を測定した。吸着率の計算は次のように行った：吸着率(%)=100%-(Uxmin/T×100%)。

データはOriginPro 2020bソフトウェアを使ってプロットした。エラーバーは3生物学的反復の平均のs.d.を表す。選択された時点について、統計検定はR (v.4.2.2)にggpubrパッケージ(v.0.6.0)を実装し、有意水準を0.05として両側t検定を行った。

報告の要約
研究デザインに関する詳細は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
本研究で作成および/または解析されたデータセットは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。NGSデータはGEOレコードGSE214431から入手できる。rS1 ADP-ribosylation in vivoの測定、ゲル内消化、ModB存在量の推定に関するLC-MS/MS生データは、PRIDEにアクセッションコードPXD041714で寄託されている。in vitroでのADPリボシル化およびRNA化されたrS1およびrL2のLC-MS/MS生測定データをPRIDEに寄託した（アクセッションコード PXD038910）。大腸菌(U00096.3)とT4ファージ(NC_000866.4)のリファレンスゲノムはNCBIから取得した。タンパク質構造（2MFI, 2MFL, 2KHI, 5XQ5, 2KHJ, 7K00 and 6H4N）は、PDBから指定のアクセッションコード（https://www.rcsb.org/）を用いてダウンロードした。E. coli K12 pan proteome (UP000000625) および選択したタンパク質配列はUniprot (https://www.uniprot.org/) から取得した。生のゲルおよびブロット画像を含む補足情報あり。ソースデータは本論文とともに提供される。

コードの利用可能性
RNAylomeSeqデータの解析に使用したカスタムRコードはZenodo60で公開されている。

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N. Beumer、J. Hoff、S. J. Keding、J. Kahnt、J. Koch、N. Lichti、P. Mann、N. Moskalchuk、M. Raabe、E. Tamerler、M. Viering、M. Weberの実験協力に感謝する。このプロジェクトは、欧州連合（EU）の研究革新プログラム「Horizon 2020」（助成金882789 RNACoenzyme、A.J.に授与）の下、欧州研究会議（European Research Council）から、またドイツ研究会議（DFG、プロジェクト439669440、TRR319、プロジェクトA02、A.J.に授与）から資金援助を受けている。M.W.-S.はStudienstiftung des Deutschen VolkesおよびJoachim Herz Stiftungの支援を受けている。K.H.はMax Planck Society、Baden-Württemberg Stiftung、Carl-Zeiss-Stiftung、German Research Council（助成金DFG-SPP2330）の支援を受けている。H.U.はマックス・プランク学際科学研究所およびドイツ研究評議会（助成金DFG-SPP1935、DFG-SFB1286、DFG-SFB1565（プロジェクト番号469281184））の支援を受けている。

資金提供
マックス・プランク協会によるオープンアクセス資金提供。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Maik Wolfram-Schauerte, Katharina Höfer

著者および所属
マックス・プランク陸域微生物学研究所（ドイツ、マールブルク

Maik Wolfram-Schauerte, Nadiia Pozhydaieva, Timo Glatter & Katharina Höfer

ハイデルベルク大学薬学・分子バイオテクノロジー研究所（ドイツ・ハイデルベルク

マイク・ウォルフラム＝シャウアーテ、ユリア・グラウェンホフ、フランツィスカ・A・ビラウ、アンドレス・イェシュケ＆カタリーナ・ヘーファー

バイオ分析質量分析、マックス・プランク多元科学研究所、ゲッティンゲン、ドイツ

ルイザ・M・ウェルプ、イヴァン・シルバーン、アレクサンダー・ヴルフ、ヘニング・ウルラウプ

ドイツ・ゲッティンゲン大学医療センター臨床化学部門

ルイザ・M・ウェルプ、イヴァン・シルバーン、ヘニング・ウルラウプ

クラスター・オブ・エクセレンス「マルチスケールバイオイメージング：分子機械から興奮性細胞のネットワークへ」（MBExC）、ゲオルク・アウグスト大学、ゲッティンゲン、ドイツ

ヘニング・ウルラウプ

合成微生物学センター（SYNMIKRO）、マールブルク・フィリップス大学、マールブルク、ドイツ

カタリーナ・ヘーファー

貢献
K.H.とA.J.が研究をデザインした。K.H.、M.W.-S.、J.G.、F.A.B.およびN.P.は、ARTおよびその標的タンパク質のクローニング、発現、精製および解析を行った。K.H.、I.S.、L.M.W.、A.W.およびM.W.は、質量分析用のサンプルを調製した。I.S.、L.M.W.、A.W.およびH.U.は、ADPリボシル化とRNA化を研究するためのLC-MS/MSパイプラインを開発し、データを解析した。T.G.はrS1の質量分析を行った。M.W.-S.はRNAylomeSeqパイプラインを開発し、データを解析した。N.P.がModB変異ファージの作製と特性解析を行った。K.H.、H.U.、A.J.が研究を監督した。K.H.、M.W.-S.、A.J.は第1稿を執筆し、著者全員が原稿の校閲、編集、追加テキストの提供に貢献した。

対応著者
Andres JäschkeまたはKatharina Höferまで。

倫理申告
利害関係
マックス・プランク協会とハイデルベルク大学は、K.H.とA.J.を発明者とするRNA化に関する特許（PCT/EP2021/071295）を出願中である。残りの著者は、競合する利害関係はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature誌は、本研究の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。

追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図における管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

図表
Extended Data 図1 T4 ARTによるADPリボシル化とRNA化。
a,NAD-10mer-Cy5存在下（1）、10当量のNAD追加（2）、またはそれぞれのART非存在下（3）でのART AltまたはModAによるRNAポリメラーゼ（RNAP）のRNA化の特徴（n = 3）。RNAPはAltとModAのよく確立された標的タンパク質であるため、AltとModAによるRNA化を評価するために選ばれた。Altはin vitroでRNAPをわずかにRNA化するが、これはNAD-10mer-Cy5に対して10当量のNADの存在下で消失する。タンパク質の負荷はクマシー染色で可視化され、RNA化されたタンパク質は蛍光Cy5チャンネルで可視化される。b,c, SDS-PAGEで分析したrS1のModBを介したRNA化（b）とADPリボシル化（c）の時間経過分析（各n = 3）。RNA化またはADPリボシル化されたタンパク質は、放射能スキャンによって可視化し、タンパク質負荷はクマシー染色によって確認した。RNA化アッセイは、NAD-capを欠く32P-RNAの存在下（上のパネル）、rS1（-rS1）（真ん中のパネル）またはModB（-ModB）（下のパネル）の非存在下で行った（n = 3）。これらの実験では、SDS-PAGEゲルの放射性スキャンでRNA化は検出されなかった。

Extended Data 図2 ModBによるタンパク質rS1のRNA化の特徴。
a, 触媒活性ModBおよび触媒不活性ModB R73A, G74A存在下での、NAD-10mer-Cy5を用いたrS1のRNA化（n = 3）。触媒的に重要な残基R73に加えて、G74も変異させた。G74の変異により、T4ファージゲノムのCRISPR-Cas9遺伝子編集に重要なPAM領域が変化する。R-S-EXEモチーフ1の活性部位残基は赤でハイライトされている。c,ART阻害剤3-MBを介したModBによるタンパク質rS1のin vitro RNA化阻害。反応は32P-NAD-RNA 8mer（32P-NAD-8mer）と32P-RNA 8mer（ネガティブコントロール）を用いて行った（n = 3）。3-MBはRNA化rS1の収量を減少させる。 d, RNase T1によるRNA化およびADPリボシル化タンパク質rS1のin vitro消化。RNase T1の非存在下で行った反応（-）はネガティブコントロールとして機能する。32P-NAD存在下でADPリボシル化されたタンパク質rS1をリファレンス（S1-ADPr）として適用した（n = 2）。T1消化により、rS1の100nt-RNAは短縮し、RNA化rS1の分子量は減少する。e,ADPリボシル化およびRNA化タンパク質rS1のトリプシン消化物（n = 2）。タンパク質はトリプシン存在下で分解され、RNA化とADPリボシル化のシグナルは失われる。すべてのサンプルは12 % SDS-PAGEで分析され、タンパク質はクマシー染色で可視化され、RNA化は放射能スキャンで評価された。

Extended Data Fig. 3 in vitroにおけるModBを介したRNA化の特徴。
a, RNA化反応におけるRNA二次構造の役割の解析。4種類の3′-Cy5標識NAD(NppA)キャップRNAを試験した。これには、直鎖状（緑色）のNADキャップRNA（10mer）と、3′-オーバーハング（青色）、5′-オーバーハング（赤色）または鈍端（黒色）のいずれかを持つ3種類の構造化RNAが含まれる（n = 3）。RNA化の時間経過のSDS-PAGE解析を示す。リファレンスに対するシグナル強度（Cy5スキャン）の定量化を図2cに示す。ModBはNADでキャップされたRNAの5′末端が直線状であることを好む。b, RNAの5′-NAD-キャップの存在に対するRNA化依存性の解析。5′-NAD-キャップ（NAD-RNA）、5′-一リン酸（5′-P-RNA）または5′-三リン酸-100nt-RNA（5′-PPP-RNA）のいずれかの存在下でのModBによるタンパク質rS1のin vitro RNA化の10 % SDS-PAGE分析（n = 2）。放射性標識RNAによるRNA化は放射能スキャンによって検出され、タンパク質負荷はクマシー染色によって可視化される。rS1のin vitroでのRNA化はNAD-RNAの存在下でのみ観察される。RNA化されたrS1は感度が低いため、クマシー染色では検出できない。 c, ModBの基質としてのADPr-RNA（NAD-RNAに比べてニコチンアミド部分を欠く）の特性（n = 2）。陽性対照としてNAD-8merを用いた。全ての反応は12 % SDS-PAGEで分析した。放射性標識RNAによるRNA化は放射能スキャンで検出し、タンパク質の負荷はクマシー染色で可視化した。ADPr-RNAはin vitroではModB触媒によるRNA化の基質として認められない。

Extended Data 図4 化学的および酵素的処理によるRNA化の特異的除去。
a, HgCl2および中性ヒドロキシルアミン（NH2OH）存在下で、さまざまなADP-リボース-タンパク質結合が安定または不安定であることが示されている。NH2OHで処理すると、グルタミン酸／アスパラギン酸とADPリボースの間の結合が加水分解される。HgCl2はチオール-グリコシド結合を特異的に切断する。ADPリボシル化およびRNA化タンパク質rS1をNH2OHまたはHgCl2で処理した。これらの化学物質によってADPrまたはRNAが除去されると、プロテインrS1の放射性シグナルが減少する。全サンプルを12 % SDS-PAGEで分析し、クマシー（タンパク質ローディングコントロール）で染色し、RNA化を放射能として評価した。コントロール（未処理）と比較した放射性シグナルの減少は認められなかった（n = 1）。 b, ARH3存在下でのrS1 ADPリボシル化の安定性のin vitro時間経過を12 % SDS-PAGEで分析した（n = 1）。オートラジオグラフィースキャンを示す。c-d、ARH1によるrS1のADPリボシル化（c）とRNA化（d）の除去の反応図。

Extended Data 図5 LC-MS/MSデータから抽出した未修飾rS1とin vitro RNA化rS1のイオンクロマトグラム。
三重および四重に荷電した前駆体イオン（それぞれモノアイソトピック質量1115.8096および837.1090）の抽出イオンクロマトグラム（XIC）。XICは、ターゲットプロテオミクス実験の作成と解析のためのオープンソースドキュメントエディターであるSkyline59を用いて抽出した。質量は、ADPr-シチジンが結合したrS1ペプチドAFLPGSLVDVRPVRDTLHLEGKに対応する。リコンビナントS1ドメイン2を、ModBおよび以下の成分の1つとインビトロでインキュベートした：a, 他のサプリメントなし、b, キャップなしRNA-8mer、c, NAD-RNA-8mer、d, RNase AとT1で処理したNAD-RNA-8mer（結果はADPr-シチジン付加体）。42.3分の溶出ピークがdで観察され、ADPr-シトシンで修飾されたペプチドに対応する。cには偽強度が観察され、分解産物である可能性がある。dには40分後の汚染ピークも観察される（dとa-cの強度スケールの違いを考慮）。

Extended Data Fig. 6 ウェスタンブロットとRNAylomeSeqによるRNA化のin vivo特性解析。
a, 汎ADPr抗体の基質特異性の解析。in vitroで調製したADPリボシル化またはRNA化タンパク質rS1を抗体の特異性の評価に用いた（n = 3）。pan-ADPr抗体はADPリボシル化タンパク質rS1とModBを検出した（レーン1）。一方、RNA化rS1はpan-ADPrでは検出されなかった（レーン2）。しかし、ADPリボシル化ModBのシグナルは、その発現宿主である大腸菌における自己ADPリボシル化により観察された（レーン2）。 b, ヌクレアーゼP1消化とウェスタンブロットによるタンパク質結合ADPリボースの検出を組み合わせたRNA化の定量。TCE染色によるタンパク質負荷の可視化。ARH1処理によるADP-リボースシグナルの除去。ADP-リボシル化rS1のpan-ADPrシグナルは、TCE染色における対応するバンド強度に対して正規化した。未処理のrS1の正規化強度をP1処理rS1の強度で割ると、2つの修飾のうちADPリボシル化rS1とRNA化rS1のフラクションが得られた。対応するドットプロットを図4bに示す（n = 3生物学的に独立した複製）。 c, RNAylomeSeqプロトコルの概略図：生体内でrS1に共有結合しているRNA化RNAの同定。簡単に説明すると、内在性のHisタグ付きrS1をT4ファージ感染大腸菌からNi-NTAビーズで単離する。NAD-RNAIでRNA化したrS1ドメイン2のスパイクイン（RNAIスパイクイン）を、RNAylomeSeqワークフローで濃縮する予定の溶解液に添加する。NAD captureSeq32と同様に、RNA 3′-アダプターが共有結合したRNAにライゲーションされ、RNAは「オンビーズ」で逆転写される。cDNAはその後、RNAのアルカリ消化によって溶出され、さらにアダプターがcDNAの3′-末端にライゲーションされる。重要なことは、RNAIスパイクインはどのサンプルにも濃縮されているわけではなく、むしろ各サンプルに同程度の量が含まれていることである。これにより、リードカウントを各サンプルのRNAIカウントに正規化し、比較することができる。 d, レプリケート2（n = 3生物学的レプリケートの合計）について、RNAylomeSeqによって同定されたT4ファージModB R73A、G74Aコントロールと比較した、T4ファージWT感染サンプルに濃縮されたRNAを示すMAプロット。サンプルあたりのリードカウントは、各サンプルの濃縮コントロールとして機能するRNAIスパイクインリードカウントに対して正規化されている。従って、RNAIはT4 WTとT4 ModB R73A, G74Aを比較して濃縮されていない。平均発現値（T4 WTおよびT4 ModB R73A、G74A条件）は、各レプリケートについて別々にLog2（x軸）で正規化した。T4 WTとT4 ModB R73A, G74Aのリードカウントは、log2 fold change（y軸）で比較した。IGVで解析された同定されたRNA化RNAのリードカバレッジを、T4 WTサンプル（緑）とT4 ModB R73A、G74Aサンプル（赤）のリードを描いた下のパネルにacpPについて例示的に示す。RNAylomeSeqはmRNAの5'-末端、または200nt以下の場合はsRNA配列全体を同定するだけである。これは、シングルエンドIllumina-Seqを適用することにより、それぞれのリード/転写産物の5'末端のみを自動的に捕捉するためである。 e, T4ファージWTとT4 ModB R73A、G74Aを比較したRNAylomeSeqにより同定されたRNAの選択ヒット。しかし、いくつかの転写産物は1つまたは2つの複製でのみ検出された。濃縮度はqPCRによってcDNAレベルでさらに検証された。(+)：濃縮されている；-：濃縮されていない；(+)：濃縮されているが、Log2 fold change <= 1；n.d.：定義されていない。

Extended Data 図7 ModBによるin vitroでのPNPaseのrS1ドメインD1〜D6とS1モチーフのRNA化。
a, ドメイン1 (2MFI), 2 (2MFL), 4 (2KHI), 5 (5XQ5) and 6 (2KHJ)の結晶構造(PDB)とドメイン364のNMR構造に基づくrS1のrS1モチーフの図。 b, 32P-NAD-8merを用いたModBによるS1ドメインとPNPaseのin vitro RNA化。ModBとS1ドメイン（D1-6）は黒い矢印で示されている。RNA化されたrS1ドメインは、非修飾タンパク質と比較してシフトしていることが特徴で、赤い矢印でハイライトされている。反応は16 % Tricine-SDS-PAGEで分析し、クマシーで染色し、オートラジオグラフィーのイメージング（Radioactivity）でRNA化を記録した。 c, T-coffee expresso65を用いたrS1 D2とD6、およびPNPaseのS1ドメインのローカルアライメント。D2のR139（矢印で強調）はPNPaseとD6で保存されている。

Extended Data 図8 ModBのRNA化標的タンパク質の特性と同定。
a, 16 % Tricine-SDS-PAGEによるrS1ドメイン2およびその変異体R139AおよびR139Kのin vitro RNAylationの解析。陰性対照として不活性NudC変異体（NudC*; V157A, E174A, E177A, E178A）を用いた（n = 3）。放射能はRNA化を示し、クマッシースキャンはタンパク質の負荷を可視化する。 b, 16 % Tricine-SDS-PAGE分析における放射能に基づくrS1ドメイン2およびその変異体R139AおよびR139KのRNA化の相対強度の定量化。複製ごとに、強度はrS1 D2 WTバンド強度で正規化した。両側t検定をpsignif. < 0.05は、rS1ドメイン2のR139変異体のRNA化が有意に減少していることを示している（p値=0.0003（WT対R139A）および0.0074（WT対R139K））。c, 3′-Cy5標識NAD-RNAを用いたModBによる大腸菌細胞溶解液のRNA化（上パネルに模式的に示す）。5′-モノリン酸化RNA 10mer（P-10mer-Cy5、中央のパネル）または5′-NAD-キャップRNA 10mer（NAD-10mer-Cy5、下のパネル）の存在下でのModBによる大腸菌細胞溶解液のRNA化の時間経過であり、それぞれ3′-蛍光（Cy5）標識を有する。溶解液のRNA化の時間経過を12 % SDS-PAGEで分析し、タンパク質をクマシー染色で可視化し、RNA化を蛍光（Cy5）で記録した。溶解液中のNAD濃度は、利用されるNAD-10mer濃度を48倍上回る。NAD/NADH-Gloアッセイ（Promega）を用いて、溶解液中のNAD濃度22.5μM（n = 1生物学的に独立した複製、n = 3技術的複製）を測定した。cの模式的なタンパク質とチューブはBioRender (https://biorender.com)を用いて作成した。

出典データ

Extended Data 図9 大腸菌溶解液におけるModBを介したRNA化の特異性の特徴。
a, ModB WTまたは不活性ModB R73A,G73Aの存在下、あるいはModB非存在下での大腸菌細胞溶解液のRNA化を、3′-Cy5標識NAD-10merまたはP-10merを用いて行った。時点0はModB添加前の溶解液、60分はModB添加60分インキュベーション後のRNA化を示す。反応は12％SDS-PAGEで分析し、クマシー染色でタンパク質を可視化し、蛍光（Cy5）でRNA化を記録した。 b, Cy5標識5′-NAD-または5′-P-10mer（Extended Data Fig. 8c）添加前（0分）およびModB存在下（60分）でのインキュベーション後のサンプルを、10％SDS-PAGEによって分析し、蛍光（Cy5、ここでは赤で示す）によってRNA化をモニターした。その後、ウェスタンブロッティングを行い、汎ADPr結合試薬（MABE1016、グレースケールで表示）を用いてADPリボシル化を検出した。大腸菌ライセートにおいて、ModBが介在するRNA化とADPリボシル化で異なるバンドパターンが観察され、ModBのRNA化の標的特異性が異なることが示された。溶解液中のNAD濃度は、利用されたNAD-10mer濃度を48倍上回った。22.5μM（n=1生物学的に独立した複製、n=3技術的複製）のライセート中のNAD濃度は、NAD/NADH-Gloアッセイ（Promega）を用いて決定された。 c, NAD-10mer-Cy5に対して48倍（ネイティブライセート）から追加スパイクインNADを介して1000倍（n=2）までの様々なモル過剰のNAD存在下でのModBによるライセートRNA化。Cy5はRNA化を示す。TCE染色はタンパク質の負荷を示し、これはゲル中のトリクロロエタノールがタンパク質中のトリプトファン残基に結合することで可能となる。700倍モル過剰のNADは、"native "溶解液と比較して、RNA化を67%まで減少させた（n = 2生物学的に独立した複製）。各レーンの全Cy5シグナルを定量し、RNA化レベルを決定し比較した。 d, 様々なModB濃度（850, 85, 8.5nM）存在下でのライセートのRNA化とADPリボシル化を、蛍光（RNA化にはCy5）およびウェスタンブロット（ADPリボシル化にはpan-ADPr）でモニターした。TCE染色はタンパク質量を示す。平均して、RNA化は8.6%に、ADPリボシル化は6.9%に、細胞内条件に近いModB濃度（85 nM）の溶解液で減少した。各レーンの全Cy5またはpan-ADPrシグナル（ModB ADPリボシル化シグナルを除く）を定量し、それぞれRNA化またはADPリボシル化レベルを決定し比較した。

Extended Data 図10 大腸菌におけるModBのRNA化標的の範囲。
a,ModBによる大腸菌リボソームのRNA化。RNA化されたタンパク質は、NAD-10merに比べてNAD-40merとのインキュベーションでシフトする。RNA化標的タンパク質の相対的濃縮度は、RNA化タンパク質のバンドと、RNA非存在下で生成したそれぞれのコントロールバンドをゲル内消化およびLC-MS/MS分析にかけることで評価した（n = 2）。濃縮度は、NAD-10mer（A/C）またはNAD-40mer（B/D）によるRNA化について、Scaffold（n = 2）からのスペクトルカウントに基づくそれぞれの非RNA化対照バンドに対する相対値で計算されている。RNA化されたrL2タンパク質は、SDS-PAGE中の電気泳動移動度が減少している。タンパク質は蛍光タンパク質染色（Flamingo）で可視化し、タンパク質ラダーはクマシー染色で可視化した。シグナルをImageLabで定量した結果、rL2の約80％がin vitroでModBによりRNA化されていることがわかった（n = 3）。d-f、RNA化rL2ペプチドのタンデムMSベースの同定。 d、ADP-リボース＋シチジン一リン酸および3′-リン酸基を有するRNA化rL2ペプチドWRGVRPTVRのMS/MSフラグメントイオンスペクトル（スペクトルID：8679）。スペクトルは、アデニン（A'）およびシトシン（C'）、AMPおよびCMPのマーカーイオンを示す。プリカーサーイオン([M+xH]x+)は、ADPリボースの質量(*)とアデニンを失ったADPリボース(**)によってシフトして検出される。また、前駆体イオンは42.021798 Daの特異的な損失を示しているが、これは修飾アルギニンでのCH2N2の損失によって説明できる。 f, dとeに示したRNA化ペプチドの模式的な配列とRNA付加体の表示。dに示したADP-リボース+CMP+3′-リン酸付加体のMS/MSスペクトルで観察されたフラグメンテーション生成物は、構造中に水色（質量損失）および紺色（質量付加体）の線で示されている。gは、LC-MS/MSによって同定されたrL2の選択されたRNA化残基である。触媒的に重要なH229はR221から11.1Å離れている。rL2構造は1.98Åの低温電子顕微鏡構造（7K00）66に由来する。cの模式図はBioRender (https://biorender.com)を用いて作成した。

ソースデータ

Extended Data 表1 T4ファージ感染における内因性Hisタグ付きrS1のADPリボシル化
フルサイズの表
Extended Data 表2 T4ファージ感染におけるrS1-WT、-R139Kおよび-R139AのADPリボシル化
フルサイズの表
Extended Data 表3 ライセートアッセイとプロテオミクスによるin vivoでのModBタンパク質強度の比較
フルサイズの表
補足情報
補足情報
このファイルには、補足図1-4、補足表1-6の凡例（別ファイル）、補足表7-10が含まれています。

報告概要
補足表1
T4ファージ感染大腸菌B株由来の内因性Hisタグ付きrS1のLC-MS/MS分析におけるMaxQuant出力。

補足表2
T4ファージ感染大腸菌由来のHisタグ付きrS1 WT、rS1(R139A)およびrS1(R139K)変異体のLC-MS/MS分析のMaxQuant出力。

補足表3
LC-MS/MS分析によって同定されたrS1タンパク質のin vitroでのADPリボシル化およびRNA化部位。

補足表4
RNAylomeSeqによってRNAylomeに寄与すると同定された遺伝子。

補足表5
様々な濃度のModBを添加した大腸菌細胞溶解液のLC-MS/MS分析におけるMaxQuant出力。

補足表6
LC-MS/MS分析によって同定されたrL2タンパク質におけるin vitroのADPリボシル化およびRNA化部位。

ソースデータ
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソース・データ拡張データ図10
権利と許可
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この記事の引用
ウイルスADPリボシルトランスフェラーゼはRNA鎖を宿主タンパク質に結合させる。Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06429-2

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受領
2021年06月04日

受理
2023年7月12日

出版
2023年8月16日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-023-06429-2

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