混合株病原体集団は患者における抗生物質耐性の進化を促進する
オープンアクセス
2023年7月12日発行
混合株病原体集団は患者における抗生物質耐性の進化を促進する
https://www.nature.com/articles/s41467-023-39416-2
フリオ・ディアス・カバジェロ
レイチェル・M・ウィートリー
...
R. クレイグ・マクレーン
著者を表示
ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：4083（2023）この記事を引用する
69 Altmetric
メトリクス詳細
要旨
抗生物質耐性は世界的な健康脅威となっているが、宿主内における耐性の要因はまだ十分に理解されていない。病原体集団は宿主内でクローン化すると仮定されることが多く、耐性はde novo変異体に対する選択により出現すると考えられている。我々は日和見病原体である緑膿菌において、混合株集団が一般的であることを示した。重要なことは、複数の菌株にコロニー形成された患者では、既存の耐性株に対する選択によって耐性が急速に進化することである。一方、単一菌株にコロニー形成された患者では、新規耐性変異の選択により耐性は散発的に進化する。しかし、混合株集団では、耐性と増殖速度の間に強いトレードオフが生じることから、抗生物質による治療がない場合にも、宿主内の多様性が耐性の喪失を促進する可能性があることが示唆される。まとめると、病原体集団の宿主内多様性は、治療に対する耐性の出現を形成する上で重要な役割を果たすということである。
はじめに
病原性細菌における抗生物質耐性は、ヒトの健康にとって根本的な脅威である。抗生物質の使用が耐性の出現と関連していることはよく知られている1,2。しかし、耐性菌の宿主内における促進因子はまだ十分に理解されておらず、個々の患者のスケールで耐性菌の出現を予測することは困難である3,4,5。耐性感染症は患者の予後を悪化させるため、これは解決すべき重要な問題である6,7。
宿主内耐性の出現に関する支配的なモデルは、突然変異や水平遺伝子導入によってその場で獲得される新規対立遺伝子の選択によって耐性が進化するというものである4,8,9,10,11,12。このモデルの暗黙の前提は、伝播中に起こるボトルネックによって遺伝的変異を欠いたクローン性の病原体集団が宿主にコロニー形成されるというものである8,13,14,15,16。しかし、宿主は同じ病原体種の複数の株によってコロニー形成されることもある17,18,19,20,21,22。混合株集団には、その場で獲得される新規の遺伝的変異と、共存する菌株間の違いを反映した既存の変異の両方が含まれている。進化生物学の重要な概念は、混合株集団にこのような遺伝的変異が存在することで、選択が作用する遺伝的多様性が増加し、抗生物質治療に対する進化的応答が加速されるはずだということである23,24,25。この単純な論理は、多様な病原体集団にコロニー形成された宿主において、耐性が急速に進化することを予言する。
本稿では、特に免疫不全患者や重症患者において院内感染の重要な原因である日和見病原体である緑膿菌の多様な集団において、耐性菌が急速に進化するという仮説を検証する7,26,27,28。緑膿菌は幅広い解剖学的部位で感染症を引き起こすが、緑膿菌の最大の問題は肺の感染である7,28,29,30。緑膿菌は他のESKAPE病原体に比べて感染中に非常に高い割合で耐性を進化させ31、耐性は緑膿菌感染症の治療にとって重要な課題である7,31。これまでの研究で、嚢胞性線維症や気管支拡張症に伴う慢性緑膿菌感染に苦しむ患者の肺では、異なる緑膿菌株が共存する可能性があることが示されている21,22,32。われわれは、欧州の病院における緑膿菌感染症の観察試験であるASPIRE-ICUから収集したサンプルを用いて、ICU患者における患者内緑膿菌多様性の影響を検証した33。
ASPIRE-ICU試験に登録された患者は、ICUに入室後すぐにシュードモナスのスクリーニングを受け、その後も定期的に検査を受けた。臨床微生物学プロジェクトでは通常、患者サンプルあたりの分離株数が少ないため、患者内の病原体の多様性の有病率や重要性を評価することが困難である。一方、ASPIRE-ICUでは、偏りのない方法で（すなわち耐性表現型に関係なく）シュードモナス分離株をサンプリングし、シュードモナスを含むすべての患者検体から無作為に選ばれた最大12株を収集した。この試験に登録された患者のほとんどは、ICUに短期間しか入院していなかったが、一部の患者からは縦断的なサンプルが収集され、抗生物質耐性の患者内要因を直接研究することが可能となった8,34。本論文では、患者内の多様性と抗生物質耐性を定量化するために、表現型アッセイ（耐性表現型、増殖率）とゲノム解析を組み合わせて用いる。このアプローチにより、患者の少なくとも1/3は複数のシュードモナス株によってコロニー化されていること、そしてこれらの患者では既存の耐性株に対する選択により耐性が急速に進化することを示した。
研究結果
緑膿菌のゲノム多様性
患者内における緑膿菌の多様性を明らかにするために、12病院のICU患者35人の下気道サンプルから収集した441株のゲノムの塩基配列を決定した（図1A）。病院あたりの患者数は非常に偏在しており、患者の〜50％（n = 17/35人）は、緑膿菌のコロニー形成率が高い単一の病院の患者であった（図1B）（出典データ）。
図1：患者コホート、方法論、分離データセットの概要。
Aサンプル収集の概要。気管内吸引液は35人の患者から採取され、患者サンプルあたり最大12株のシュードモナスが分離された。合計441の分離株が収集され、耐性表現型解析とゲノム配列決定によって特徴づけられた。B 患者サンプルの分布を示す地図。円グラフは、国ごとの混合株（オレンジ）および単一株（青）患者の合計を示す。円グラフの大きさは患者数によって調整され、患者数は対応するグラフの上に「n=」で示されている。図は mapchart.net を用いて作成した。C 緑膿菌の宿主内多様性。棒の高さは分離株数を示し、棒の色は研究コホートの各患者から収集された緑膿菌の配列型（ST）を示す。混合株集団は12/35人の患者で同定された。太字の患者番号は縦断的にサンプリングされた患者を示し、各サンプルからの分離株が順次示されている。* は、複数の異なるST235亜系列からの分離株からなる混合株集団を有する患者を示す。プロットされた点は、Simpson's Indexによって測定された患者内のクローンの多様性を示し、線は2つの検体を持つ患者における検体間のSimpson's Indexの変化を示す。D 本研究で発見されたすべてのSTのコア遺伝子と、各ST82におけるMDR分離株のそれぞれの割合に基づくネイバー接合系統樹。部位ごとのヌクレオチド置換。E ST235分離株のコア遺伝子に基づくネイバー接合系統樹で、3つの異なるST235亜系統（クラスターA、B、C）を示す82。スケール＝塩基置換数。生データはソースデータファイルに記載されている。
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以前の研究35と同様に、緑膿菌は非流行性のクローン性集団構造を持っており、長い分枝によって分離された明確に区別された配列型（ST）から構成されていることがわかった（図1D）。最も流行しているST（ST235）は3つの亜系統に分離しており、これらの亜系統は我々のサンプリング以前に多様化していた（図1E）。この系統樹を考慮し、ST235のSTおよび亜系統は固有の株であると考えた。
大半の患者（n = 23/35）は単一の菌株にコロニー形成されていた（図1C）。しかし、患者の約1/3（n＝12/35）は複数の菌株にコロニー形成されていた（図1C）。複数の菌株にコロニー形成されていた患者のほとんどは、Pseudomonasのコロニー形成率が高い単一の病院の患者であった（図1B）。しかし、病院間で患者のサンプリングにばらつきがあったため、病院間の混合株コロニー形成の有病率のばらつきを調べることは不可能であった（図1B）。これまでの研究で、慢性シュードモナス感染症における混合株集団の証拠が見つかっており21,32、混合株集団はシュードモナス感染歴の長い患者に見られる可能性が示唆されている。しかし、混合株集団の有病率は、ICU入院時にシュードモナス陽性と判定された患者とICUでコロニー形成された患者で差がなかったことから、患者内の多様性の高さは単に慢性感染の結果ではないことが示唆された（対応のない両側t検定；p＝0.9073）（補足表1）。
複数の菌株にコロニー形成されている患者では、菌株の多様性が高い傾向にあった（平均Simpson's index = 0.37, st.dev = 0.15）（図1C）。この患者内多様性の指標は、サンプリングされた分離株数に依存しないが、混合株コロニー形成の有病率の推定値は保守的なものとして扱われるべきである。例えば、塩基配列が決定された分離株が6株ある患者において、5％の頻度で存在する希少株を検出する確率は、二項サンプリング分布を仮定するとわずか26％である。しかし、10株以上の分離株を持つ患者では、希少株を検出する確率は40％以上に上昇する。混合株集団を検出するためのサンプリングの検出力を推定するため、混合株患者集団の希少化分析を実施した。その結果、1サンプルあたり6株（これは単一株患者サンプルの分離株数の中央値である）の分離株では、8/9株の混合株患者のサブサンプルの99％以上で複数株が検出された（補足図1）。
患者内の多様性とAMR
患者内の多様性が抗菌薬耐性（AMR）に及ぼす影響を理解するために、最小発育阻止濃度（MIC）測定法を用いて、シプロフロキサシン、メロペネム、ゲンタマイシン、アズトレオナム、セフタジジム、ピペラシリン／タゾバクタムを含む抗生物質パネルに対する分離株の耐性を測定した。このパネルには、主要な抗生物質ファミリーの代表的なものがすべて含まれていたが、シュードモナス感染症の治療における臨床的関連性から、β-ラクタム系抗生物質に偏っていた36。合計で441株の6種類の抗生物質に対する耐性を測定し（図1A）、耐性表現型の分布に関する大規模なデータセットを作成した（出典データ）。
MICアッセイを用いて抗生物質耐性を測定すると、耐性に関する定量的データが得られる。しかし、我々は2つの理由から、各抗生物質に対する各分離株の耐性を二値形質（すなわち感受性／耐性）として分析することにした。第一に、臨床的ブレイクポイント濃度を超えるMICスコアの量的変動が選択的に与える影響は明らかではない。さらに、一部の細菌分離株は、感受性アッセイで使用した最大用量の抗生物質に耐性であり、このような場合、定量的耐性スコアは未定義である。
約半数の患者（n=16/35）については、1つの患者検体のみから分離株を得た。このような患者からの分離株は、宿主内の多様性についての洞察を与えてくれるが、AMRの進化的要因についての洞察は限られたものであった。この問題を解決するために、緑膿菌に有効な抗生物質による治療前後に患者から採取したサンプルからの分離株を用いて、耐性の変化を測定した（図2A）。縦断的にサンプリングされた13人の患者のこのサブセットには、単一株（n＝7人）および混合株（n＝6人）の緑膿菌集団の患者が含まれていた。残りの6人の縦断的サンプリング患者は、サンプリング時点の間に緑膿菌に対して活性のある抗生物質による治療を受けていなかった。重要なことは、初回サンプリングから最終サンプリングまでの日数は、単一株集団の患者と混合株集団の患者で差がなかったことである（対応のない両側t検定；p＝0.3211）（補足表2）。
図2：混合株集団は耐性の出現を加速する。
A シュードモナスに対して活性のある抗生物質で治療された、縦断的にサンプリングされた13人の患者のサブセットから分離された株の耐性表現型。B 単一株（青）と混合株（オレンジ）集団の患者における抗生物質耐性分離株の有病率の変化。6種類の抗生物質に対する耐性を測定し、各時点で各抗生物質に耐性を示した分離株の割合を算出した。データは、患者1人当たり最小n＝5株の分離株から、最初のサンプリング時点における各抗生物質に耐性を示した分離株の割合（初期有病率）およびサンプリング時点間の差（有病率の変化）の平均値として示した（ソースデータファイル）。エラーバーは、抗生物質間の初期耐性（x軸；n＝6抗生物質）と耐性の変化（y軸；n＝6抗生物質）の標準誤差を示す。Cバーは、初期耐性の影響を補正した後の、単一株（n＝7患者；青）および混合株（n＝6患者；オレンジ）集団における耐性分離株の有病率の平均（±s.e.）の変化を示す。混合株集団は、抗生物質治療に対する耐性の大きな増加と関連していた（主効果の多様性、F1,52 = 15.03, P = 0.0003）。このデータの解析に使用した統計モデルは方法に記載されており、モデル出力は補足表3に示されている。生データはソース・データ・ファイルに記載されている。
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抗生物質治療に対する反応を測定するために、患者と抗生物質の組み合わせごとに、各抗生物質に耐性を示す分離株の割合の経時的変化を計算した。一連の抗生物質に対する耐性を測定することで、各患者について、治療に使用された抗生物質に対する直接的な反応と、治療に使用されなかった抗生物質に対する耐性の付随的な変化とを区別することができた（出典データ）。意外なことに、抗生物質治療に対する直接的な反応は付随的な反応よりも大きくはなく、全体的に交差耐性の傾向を示唆していた（主効果反応タイプ：F1,52 = 0.029, P = 0.86）（補足表3）。このことから、治療に対する耐性の変化の解析には、パネルに含まれるすべての抗生物質を含めた。このアプローチの重要な意味は、患者と抗生物質のそれぞれの組み合わせが独立した反応であると仮定したことである。
平均耐性レベルが低い集団では、抗生物質は耐性に対して強い選択を課すはずである。この仮説と一致して、耐性分離株の初期有病率が低い患者では耐性が急速に増加した（図2B；主効果初期耐性、F1,52 = 32、P < 0.0001）。重要なことに、この初期耐性の効果は病原体集団の多様性には依存しなかった（初期耐性多様性の交互作用：F1,52 = 0.018, P = 0.894）（補足表3）。初期耐性の影響を補正した後でも、抗生物質治療に対する反応は患者間で異なっており、宿主／病原体／治療の個々の組み合わせが耐性の進化に重要な役割を果たしていることが示唆された（患者の入れ子効果：F11,52 = 3.91, P = 0.0004）（補足表3）。重要なことは、混合株でコロニー形成された患者では、どのような初期耐性レベルであっても、単一株と比較して耐性の増加が約20％大きかったことである（図2C；多様性の主効果、F1,52 = 15.03, P = 0.0003）（補足表3）。
混合株感染における耐性の促進要因
混合株集団の患者における耐性の出現は、既存の耐性株に対する選択、または新規変異株に対する選択のいずれかによって引き起こされる可能性がある。既存の菌株に対する選択を調べるために、各分離株を多剤耐性（MDR；3種類以上の抗生物質に耐性）または非MDR（Source data）に分類して、抗生物質耐性の表現型データを簡略化した。これは交差耐性の全体的な傾向から耐性の適切な指標であり、この指標を用いることでその後の解析が簡略化される。
混合株集団の構成の変化を調べると、非MDR分離株と関連していたSTが、ST235とST654に繰り返し置き換わっていることが明らかになった（図3A-F）。これらの株はいずれも、欧州南東部の病院でよくみられる緑膿菌38のMDR株であり、よく特徴づけられ、疫学的にも成功している39。治療に反応して耐性が増加した患者の3/5では、治療前にすでに耐性株が検出されていた（図3A、C、D）。患者15（図3B）では、抗生物質治療後に検出されたST654耐性株は、最初の時点ではサンプリングされていなかった。しかし、抗生物質治療後にサンプリングされたST654分離株には多型が認められた（補足図2）。サンプリング間隔が7日と短く、重症患者における緑膿菌の宿主内進化率が低いこと（10〜20SNP/ゲノム/年8,34）を考慮すると、これらの既存の多型は、抗生物質治療前にST654が低い頻度で存在していたことの十分な証拠となる。残りの患者（患者8；図3F）では、抗生物質治療後に新たに2株のST235 MDR株が検出された。これらの菌株はそれぞれ分離株数が少ないため（n＝2）、これらの菌株が抗生物質投与前に存在していたかどうかを検証することは困難であった。しかし、この患者を解析から除外しても、結論に変更はなかった（補足表3）。
図3：既存の耐性株に対する選択により耐性が出現する。
A-F株集団が混在する縦断的にサンプリングされた患者におけるMDR分離株（3種類以上の抗生物質に耐性）の有病率と株構成の変化。MDR分離株の割合は、最初のサンプリング点と最後のサンプリング点の間で示されている。これらのサンプリングポイント間のカラーブロックは、患者の抗生物質使用を示す。挿入円グラフは、各時点におけるSTの割合（内側のリング）と、これらのSTのMDRへの寄与（外側のリング）を示している。各挿入円グラフには、対応するサンプリング日のラベルが付けられている。A 患者8、B 患者15、C 患者17、D 患者10、E 患者16、F 患者18。G 耐性が増加したこれら5つの混合株集団患者について、MDR分離株の有病率の増加を、ST組成の変化と株内の多剤耐性の変化に分割した。数字は患者IDを示す。生データはソースデータファイルに記載されている。
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要約すると、混合株集団を有する患者に対する抗生物質投与は、明らかに既存の耐性株の選択と関連していた。この効果を定量化する1つの方法は、耐性が増加した5人の患者におけるMDR分離株の有病率の増加を、既存の変異を反映していると考えられるST組成の変化と、感染中に獲得された新しい変異株の影響を反映していると考えられる株内のMDRの有病率の変化に分解することである（図3G）。患者の4/5では、耐性増加のすべてがST組成の変化によってもたらされ、残りの患者では、ST組成の変化がMDR増加の80％近くを占めた（図3G）。これらのデータを組み合わせると、菌株が混在する患者におけるMDRの増加の90％以上は、既存の耐性株に対する選択によってもたらされたものと推定される。この非常に明確な結果は、病原体の多様性が耐性の急速な出現と関連していることを示唆している。なぜなら、多様な病原体集団は既存の耐性株を含む可能性が高いからであり、多様性そのものが菌株内の耐性出現を促進するからではない。
de-novo耐性進化の検証
菌株の多様性が耐性のde novo進化に及ぼす影響を直接推定するために、縦断的にサンプリングされた患者のゲノムデータを用いて耐性獲得のシグネチャーを検証した。緑膿菌における抗菌薬耐性の遺伝的基盤は複雑かつ多因子的である40,41,42,43,44。例えば、染色体上のampCβ-ラクタマーゼの発現を増加させるペプチドグリカン生合成遺伝子（ampD、ampDh2、dab、mpl）の変異や、多剤排出ポンプMexAB-OprMおよびMexXY-Zの発現をそれぞれ増加させるnalDおよびmexR変異などである。染色体変異はまた、フルオロキノロンの標的部位を変更するgyrAやparC変異のように、抗生物質の標的を変更することによって耐性を増加させることもある。最後に、カルバペネム系抗生物質に耐性を示すoprD変異のように、変異は抗生物質の細胞内への侵入を制限することができる。
耐性の変異進化を調べるために、我々は45によって構築されたデータベースを用いて、耐性に関与している遺伝子の多型を検索した。この方法は既知の耐性遺伝子のみを対象としているため、耐性遺伝子の存在を控えめに推定することができる。例えば、既知のゲノム耐性決定基に基づいて耐性表現型を予測する能力は、メロペネムのようないくつかの抗生物質では低く、重要な耐性遺伝子がまだ発見されていないことを示唆している。この解析では、これらの変異は患者のコロニー形成後に生じたde novo変異を反映していると仮定し、宿主内多型のみを考慮した。各患者と菌株の組み合わせに対する耐性多型の数を、感染タイプ（単一菌株対混合菌株）と、サンプリング強度のばらつきを考慮した配列決定された分離株数の関数として、負の二項回帰を用いてモデル化した。単一株集団と混合株集団の間でde novo耐性バリアントの数に有意差はなかった（図4A、補足表4a）。対照として、ゲノムワイド多型のレベル、すなわち耐性とは関係のない他のバリアントも測定した。同様に、感染タイプによるde novoバリアントへの有意な影響は見られず、de novoバリアントはどちらの感染タイプでも同じような割合で生じることを示す良い証拠となった（図4B、補足表4b）。
図4：患者における耐性進化のゲノムドライバー。
単一株（青）および混合株（オレンジ）患者における、サンプリング深度（すなわち分離株数）の関数としての抗生物質耐性に関連するA遺伝子およびB全バリアントにおけるバリアントの存在量。各データ点は、STと患者のユニークな組み合わせを表す。感染タイプ、分離株数、およびそれらの間の相互作用の可能性（n.variants ～ 感染タイプ分離株数）を考慮した負の二項回帰を用いて、バリアントの数をモデル化した。STごとの分離株数は、耐性バリアントの増加（追加分離株1株あたり0.13±0.05バリアント；z＝2.57、p＝0.01）およびその他のバリアントの増加（0.13±0.03；z＝4.17、p＜0.001）と正の相関があった。A耐性バリアントやB遺伝的多様性の点で、単一株患者からのSTと混合株患者からのSTの間に有意差はなかった（補足表4a、4b）。例外的に耐性バリアントの数が多い単一株集団（グレーのデータポイント、「方法」参照）を除外したが、それを含めてもこの結論は変わらなかった（補足表4c、4d）。生データはソースデータファイルに記載されている。
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緑膿菌の耐性に関する研究は突然変異耐性に焦点が当てられがちであったが、スペクトラム拡張型β-ラクタマーゼ、カルバペネマーゼ、アミノグリコシド修飾酵素など、緑膿菌が可動性耐性遺伝子を獲得していることを示す証拠が増えつつある44,46。私たちは、獲得した耐性遺伝子の有病率の増加を検索することによって、水平的遺伝子転移による新たな耐性遺伝子の獲得を検証した（ここでも文献45のデータベースを使用）。その結果、新規耐性獲得に関する証拠は見つからなかったことから、シュードモナスは肺において低い割合で耐性遺伝子を獲得していることが示唆された（文献47も参照）。
患者内の多様性と適性のトレードオフ
抗生物質治療後の患者内における耐性菌の安定性には、抗生物質耐性と体力とのトレードオフが重要な役割を果たしている。抗生物質治療では感受性の強い細胞を根絶できないことが多く8,34,48、抗生物質治療後に感受性の強い細胞と抵抗性の強い細胞の間で競争が起こる。耐性がトレードオフの関係で低いフィットネスと関連している場合、競争によって耐性が失われ8,34、将来の抗生物質治療に適応する集団の能力が制限される可能性がある48。
突然変異による抗生物質耐性の獲得は、一般的にコストと関連している49,50。このことは、de novo耐性突然変異の選択により耐性が進化した患者では、トレードオフが一般的であることを示唆している。時間の経過とともに、耐性系統は代償変異51,52,53,54を獲得することで、耐性のフィットネスコストを相殺するように進化する可能性がある。そのため、代償変異を獲得する機会が多い既存の耐性株に対する選択によって耐性が進化した場合、耐性とフィットネスの間のトレードオフは弱くなると予想される。
耐性に関連するフィットネス・コストを調べる最も一般的な方法は、抗生物質を含まない培養液中での増殖速度を測定することである49。培養液は宿主組織の物理的・化学的な複雑さを再現しておらず、宿主由来の抗菌剤など、生体内で重要な役割を果たすと思われるストレス因子を欠いている。このような明確な制限があるにもかかわらず、培養液中で測定された増殖速度の推定値は、動物モデルから得られたin vivoでの適合度の推定値と中程度の相関があり（r = 0.81；文献49）、ASPIRE-ICU研究から、in vitroでの増殖速度が重症患者における緑膿菌の適合度を予測できることを示す説得力のある例がある8,34。
耐性のコストを調べるために、MDRと非MRの緑膿菌が混在する全患者の分離株の増殖率を測定した（図5A；ソースデータファイル）。この患者のサブセットには、単一株患者（n＝6）と混合株患者（n＝4）の両方が含まれていた（図5B）。MDR表現型は増殖抑制と関連しており、耐性とトレードオフの関係にあることが示された（主効果MDR：F1,167 = 5.42, P = 0.021）（図5B）（補足表5）。我々の仮説とは対照的に、トレードオフは単一株集団よりも混合株集団の方が強かった（MDR多様性の交互作用：F1,167 = 11.24; P = 0.0010）（図5B）（補足表5）。
図5：患者内の適性トレードオフ。
A 耐性表現型データに基づき、35人の患者コホート全体からMDRと非MDRの両方を分離した10人の患者を選択。B ポイントは、単一株集団（n＝6）または混合株集団（n＝4）を有する患者からの179のMDRおよび非MDR分離株の、抗生物質を含まない培養液における平均増殖率（±s.e.m.）を示す。線の色はキーに示した患者番号に対応する。MDRは増殖率の低下と関連し（P = 0.021）、MDRに関連するトレードオフは混合株集団で最も強かった（P = 0.001）。このアッセイからのデータはANOVAを用いて分析され（モデルの詳細については「Methods」を参照、モデルの出力については補足表5を参照）、生データはソースデータファイルに示されている。
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しかし、このトレードオフの遺伝的基盤は明らかではない。緑膿菌のMDR/XDRに成功した株は、一般的に一連の染色体耐性変異と水平方向に獲得された耐性遺伝子38,55を保有しているのに対し、単一株でコロニー形成された患者では耐性遺伝子のSNP数が少ない。この耐性遺伝子の含有量の非対称性により、既存の耐性株に関連する大きなコストが説明できる可能性がある。あるいは、既存のMDR株の体力が低いのは、抗生物質耐性そのものとは無関係な他の遺伝子に関連する体力コストを反映している可能性もある。
考察
抗生物質耐性を理解し、それに対抗するために、進化的アプローチが用いられるようになってきている56,57,58,59。本研究の重要な発見は、多様な緑膿菌集団にコロニー形成された患者において、既存の耐性株に対する淘汰により耐性が急速に進化することであり、宿主内の多様性と耐性との間に明確な関連があることを示している。臨床微生物学研究室で使用されている従来の方法は、病原体の多様性の検出に対して系統的に偏っており、細菌病原体間の耐性における既存の多様性の重要性を評価することを困難にしている。患者において耐性が進化する速度は病原体によって大きく異なり60、宿主内の多様性が高いことが、シュードモナスなどの一部の病原体が患者の抗生物質治療に迅速に適応する理由を説明しているのではないかと推測している60。
我々はまた、以前に耐性に関与しているとされた遺伝子の変異の証拠を発見した。これらの多型が、治療開始時に（例えば過去の抗生物質治療の結果として）常在する遺伝的変異として存在していたのか、あるいは抗生物質治療中に自然変異の結果としてこれらの多型が生じたのかを明らかにすることが、未解決の課題である48。これは、患者検体から抽出したDNA中の治療前後の耐性多型の存在量を定量化するアンプリコンシークエンシングや、耐性系統の起源を年代測定する系統遺伝学的アプローチを用いて行うことができる8,34。最近の研究では、アンプリコンシークエンシングを用いて、緑膿菌の宿主内多様性が嚢胞性線維症患者における肺疾患の進行とどのように関連しているかが示されている61。
耐性と増殖速度のトレードオフにより、耐性の異なる菌株が長期にわたって同じ患者内で安定的に共存できることを理解するのは困難である。したがって、コロニー形成が繰り返され感染率が高い環境11,22,32や、抗生物質への曝露が宿主組織間で変動する患者では、患者内の多様性が高くなり、耐性が高い株と低い株が空間的に異なるニッチを占めることで共存できるようになると推測される62,63。さらなる課題は、混合株集団が単独のコロニー形成の結果として生じるのか、あるいは重複感染によって生じるのかを明らかにすることである64。例えば、緑膿菌の伝播性株は、患者に重複感染する可能性があり、 CF患者において、患者内の株の多様性が高い22,32,64,65。最後に、細菌コロニー形成に対する感受性の違いにより、患者が複数の菌株にコロニー形成されやすくなる病状がある可能性がある。
結論として、本研究は、AMRを理解するための宿主内細菌多様性の重要性を強調している4,5,8,10,66,67。細菌分離株を用いて宿主内多様性を測定したため、本研究に含めることができた患者数は限られており、患者検体から直接抽出したDNAまたは分離株プールから塩基配列を決定して細菌の多様性を測定すれば、より大規模な患者コホートにおいて多様性とAMRの関連を評価することが可能になるはずである。我々の知見は、がん細胞集団における多様性の測定が化学療法の成功を予測するのに有益であったのと同様に、病原体集団の多様性を測定することで、個々の患者レベルでの治療失敗の可能性をより正確に予測できるようになるかもしれないことを示唆している68,69。
方法
臨床データ
被験者は、観察的、前向き、多施設の欧州疫学コホート研究ASPIRE-ICU（The Advanced understanding of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa Infections in Europe-Intensive Care Units、NCT02413242 ClinicalTrials.gov）33の一部として募集された。この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に従い、人を対象とする医学研究法および参加国の現地ガイドラインに従って実施された。研究プロトコールは、各国または参加病院の研究倫理委員会の承認を得た。参加者またはその法的に認められた代理人から、研究登録時に書面によるインフォームド・コンセントを得た。成人被験者は2015年6月から2018年10月の間に、ICU入院後3日以内に登録された。対象となるには、ICU入室時に機械的人工呼吸を受けており、予想される入院期間が48時間以上33であることが必要であった。参加者は、肺炎の発症を評価するためにICU滞在中追跡された。ICU入室前2週間およびICU滞在中の抗生物質の使用に関するデータが報告された。ICU入院中、最初の1週間に3回、その後の3週間に2回、プロトコル肺炎と診断された日とその7日後に下気道サンプルを採取した。本解析の対象となった35人の人口統計学的および臨床的ベースライン特性を補足表6に示す。
検体の採取と分離
本研究で使用した下部呼吸器検体は、ASPIRE-ICU研究33内で採取した。未処理の呼吸器検体は、アントワープ大学の中央研究室で出荷され、さらに分析が行われるまで、-80℃で保存された。サンプルを混合し（30,000 rpm、プローブサイズ8 mm、10秒ステップ、合計最大60秒）、Lysomucil（10％アセチルシステイン溶液）（Zambon S.A、ベルギー）で1：1 v/vに希釈し、37℃で30分間、15分ごとに10秒間ボルテックスしながらインキュベートした。その後、CHROMID P. aeruginosa寒天培地および血液寒天培地に10倍希釈液を接種し、スパイラルプラターEddyJet（IUL、スペイン）を用いて定量培養を行った。プレートを37℃で24時間培養し、CFU/mLを算出した。Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF MS）を用いて、サンプルあたり最大12個の緑膿菌コロニーを同定した。
耐性表現型解析
すべての緑膿菌分離株は、グリセロールストックからルリアベルタニ（LB）ミラー寒天培地プレート上で37℃で一晩培養した。その後、シングルコロニーをLBミラーブロスに接種し、37℃で18～20時間、225rpmで振盪しながら一晩培養した。一晩の懸濁液を5×105 CFU/mLまで連続希釈した。耐性表現型判定は、EUCAST 勧告70,71 で規定されているブロス微量希釈法による最小発育阻止濃度（MIC）試験として行った。シプロフロキサシン（0.125～16 µg/mL）、アズトレオナム（1～128 µg/mL）、セフタジジム（1～256 µg/mL）、メロペネム（0.25～64 µg/mL）、ピペラシリン/タゾバクタム（2～256 µg/mL）、ゲンタマイシン（0.5～128 µg/mL）の間で、以下の2倍希釈系列に沿って抗生物質を測定した。増殖阻害はOD595＜0.200と定義した。各抗生物質について、441株の緑膿菌それぞれについて、生物学的に独立した単一のMICを算出した（出典データ）。分離株がMICアッセイの測定可能限界に達した（すなわち、使用した最高濃度で阻害されなかった）場合、MICはMIC結果の生データファイルに上限の2倍として記録された（出典データ）。耐性表現型の数は、シプロフロキサシン（0.5 µg/mL）、アズトレオナム（16 µg/mL）、セフタジジム（8 µg/mL）、メロペネム（8 µg/mL）、ピペラシリン/タゾバクタム（16 µg/mL）およびゲンタマイシン（8 µg/mL）を超える分離株あたりのMICの数として算出した。これらのポイントは、緑膿菌に関するEUCASTガイドライン（v11ブレークポイント表、およびゲンタマイシンの緑膿菌用MIC分布データ）71から設定した。MDR分離株は、3つ以上の耐性表現型を有する分離株と定義した。コリスチンで治療された縦断的サンプリング患者（患者6、患者16、患者18、患者32、患者35）については、同じプロトコルを用いて、以下の2倍希釈系列に沿ってコリスチンMICを測定した： 0.5～64μg/mL、コリスチン耐性表現型は MIC 2μg/mL以上と判定された(Source data)71。
塩基配列決定
すべての分離株はMiSeqまたはNextSeq illuminaプラットフォームでシーケンスされ、シーケンスカバレッジは21X～142Xであった。生のリードは、trimomatic v.0.39のILLUMINACLIP (2:30:10)とSLIDINGWINDOW (4:15)で品質管理した。品質管理されたリードは、SPAdes v.3.13.1を用いて、デフォルトのパラメータで各単離株のアセンブルを行った。これらのアセンブリーは、pilon v.1.23を用い、最小フランク塩基数10、ギャップマージン100,000、kmerサイズ47でさらにポリッシュされた。得られたコンティグはprokka v.1.14.0で緑膿菌UCBPP-PA14株に基づいてアノテーションされた。各分離株はPubMLST (Last accessed on 11.06.2021) のPseudomonas aeruginosa multi-locus sequence typing (MLST) schemeを用いてタイピングした。主要なSTから無作為に選んだ16株を、FLO-MIN106フローセルとSQK-LSK109キットを用いて、Oxford nanopore MinIONプラットフォームでシーケンスした。生のリードはguppy v. 0.0.0 + 7969d57を用いてベースコールし、リードはqcat v. 1.1.0 (https://github.com/nanoporetech/qcat)を用いてデマルチプレックスした。得られたシーケンスリードはunicycler v.0.4.872を用い、SAMtools v.1.973、pilon v.1.2374、bowtie2 v.2.3.5.175を用い、それぞれのilluminaリードとハイブリッドモードでアセンブルした。
混合株患者サンプルの希少化解析のために、データセットはpython v.3.9.16の標準ランダムライブラリを使用して、サイズ2からN-1（Nはサンプルの実際のサイズ）まで100倍のサブサンプリングを行いました。サンプリングが正規分布しているという帰無仮説は、スクリプトライブラリ76,77のnormaltest関数を用いて検定した。
バリアントコール
ペアエンドリードをBowtie 2 v2.2.4で緑膿菌PAO1リファレンスゲノム（NC_002516.2）にマッピングし、SAMtools v0.1.16とPicardTools v1.140を用い、InDels周りのリアライメントにGenome Analysis Toolkit (GATK) v3.4-46を使用してpileupファイルとrawファイルを得た。生ファイルから、quality score (Phred scale probability of the samples reads being homozygous reference)が50以上、root-mean-square (RMS) mapping qualityが25以上、ambiguous variantsを除いたcoverage depthが3以上のSNPを抽出した。MicroInDelsは、quality scoreが500以上、RMS mapping qualityが25以上、カバレージリードの少なくとも5分の1からのサポート78という基準を満たしている場合に、totalpileupファイルから抽出された。フィルタリングされたファイルはvcfに変換され、SNPとInDelはSnpEff v4.2.79でアノテーションされた。SeqMonk (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/)を用いて遺伝子不在を評価し、適切な参照配列を用いたde novoアセンブリーでOprDの構造的完全性を調査した。最後に、抗生物質耐性に関与することが知られている遺伝子セット内のすべての変異を抽出し、天然に存在する多型をフィルターにかけた45。水平的に獲得された抗菌薬耐性決定基の存在も、ウェブツールResFinder（https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）を用いて調査した。
感染中の変異や遺伝子の獲得／喪失を同定するために、各単離株から得られた短鎖シーケンスリードを、BWA-MEM アルゴリズムを用いて bwa v. 0.7.17 で4つのロングリード de novo アセンブリーのそれぞれにマッピングした。予備的なSNPはSAMtoolsとBCFtools v.1.9を用いて同定した。低品質SNPは2段階のSNPコーリングパイプラインを用いてフィルタリングされ、まず以下の基準で潜在的SNPが同定された： (1) Variant Phred quality scoreが30以上、(2) Contig edgeまたはindelから150塩基以上離れている、(3) 潜在的SNPの位置をカバーするシーケンシングリードが20以上。第2段階では、各予備的SNPについて、参照塩基またはバリアント塩基を支持する証拠があるかどうかをレビューした。最終的なコールを支持するためには、Phred quality score 25以上のリードが少なくとも80%必要であった。曖昧なコールは、参照塩基またはバリアント塩基のサポートが十分でないコールと定義され、合計で、曖昧なコールを持つ非血統的に有益なSNP位置は1つだけであった。インデルはGATK v. 4.1.3.0のHaplotypeCallerとbreseq v. 0.34.0のオーバーラップにより同定した。可変ゲノムは、ショートリードde novoアセンブリーのprokkaアノテーションに基づき、GenAPI v.1.098を用いて調査した。可変性ゲノムの遺伝子の有無は、BWA v.0.7.17.SNP/indelsを用いてシーケンスリードをそれぞれの遺伝子にマッピングすることで検討した。患者15から回収した分離株の遺伝的多様性を示すために、高信頼度SNPに基づいて最大パーシモン系統樹を構築した（補足図2）。系統樹はiTOL80を用いてプロットした。
増殖アッセイ
すべての分離株をグリセロールストックからLBミラー寒天培地プレート上で37℃で一晩培養した。その後、シングルコロニーをLBミラーブロスに接種し、37℃で18〜20時間、225rpmで振盪しながら一晩増殖させた。一晩の懸濁液をOD595～0.05に連続希釈し、蓋付き96ウェルプレートの内側60ウェルに入れた。増殖率を計算するために、分離株を37℃のLBミラーブロス中で増殖させ、BioTek Synergy 2マイクロプレートリーダーで適度な連続振とうに設定し、光学密度（OD595nm）を10分間隔で測定した。その後、連続10回の測定におけるOD対時間の最大勾配として増殖率を算出し、肺分離株すべてについて少なくとも3つの生物学的に独立した複製培養を測定し、各分離株の平均増殖率を算出した（出典データ）。
統計
各患者サンプルについて、上述のように各抗生物質に耐性を示す分離株の割合を算出した70,71。各抗生物質に対する耐性の変化は、縦断的にサンプリングされた患者について、最終サンプルと初回サンプルの耐性分離株の割合の差として測定し（出典データ）、患者ごとに合計6回の回答を得た（すなわち、抗生物質／患者の組み合わせごとに1回の回答）。抗生物質に耐性を示す分離株の割合は正規分布していなかったが、耐性分離株の割合の変化は正規分布していた。抗生物質耐性の促進因子を検定するために、耐性分離株の初期割合（連続変数、1DF）、抗生物質（5DF）、病原体の多様性（単一株または混合株、1DF）、および対応タイプ（直接または付随、1DF）の主効果を含むANOVAを使用した。病原体の多様性（11DF）の中に患者を入れ子にした。耐性分離株の初期比率と病原体の多様性（1DF）、初期耐性と抗生物質（1DF）の間の交互作用を含めた。有意でない項を順次削除し、有意な効果のみを含む縮小モデルを得た（補足表3）。
各ST/患者の組み合わせで観察されたde novo variantsの数（n.variants）は、カウント変数として扱うことができる。過分散のため、"MASS "Rパッケージv7.3-5581のglm.nb関数を用いた負の二項回帰を用いた。n.variants〜infection.typeisolates.per.ST.というモデル式を用いて、単一感染と混合感染（infection.type）、およびSTごとのシーケンスされた分離株数（isolates.per.ST）をコントロールした。耐性関連バリアント（補足表4a）とその他のバリアント（補足表4b）について別々のモデルを実行した。いずれのモデルでも、有意な関連は配列決定された分離株数のみであった（いずれもp＜0.05）。この解析では、抗生物質の排出に関連する遺伝子に多くの多型欠失が見つかった1株患者（分離株25-0925）の異常値を除外した。しかし、この異常値を含めても、感染型に有意な影響はないという結論は変わらなかった（補足表4c、4d）。
フィットネスコストは、同じ患者から分離されたMDR（すなわち3つ以上の耐性表現型）と非MDR（すなわち0〜2つの耐性表現型）の肺分離株の増殖率を比較することによって評価した。この解析では、MDRおよび非MDR分離株が複数（すなわち1株以上）存在するすべての患者を考慮したため、10人の患者から合計179株が分離された（出典データ）。フィットネスのばらつきの原因を理解するために、耐性表現型（すなわちMDRまたは非MDR；1DF）、病原体の多様性（単一株または混合株；1DF）、および病原体の多様性（8DF）内にネストされた患者の主効果を含むANOVAを使用した。抵抗性表現型*病原体多様性の交互作用をモデルに含めることで、単一株集団と混合株集団の間のフィットネストレードオフの変動を検証した。完全な統計モデルを補足表5に示す。統計解析にはJMP v.12を用いた。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
ソースデータはOxford Research Archive for Data (https://doi.org/10.5287/ora-mzzd1qykn)に寄託されている。単離株は、ASPIRE研究委員会の許可を得た上で、MTAを介して対応する著者から研究用に入手することができる。本研究で作成されたすべてのシーケンスデータおよびすべての分離株のアセンブリーは、以下のサイトで見ることができる： (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA974969）に掲載されている。本研究の一環としてこれらの患者について解析されたすべての臨床データは、本論文の補足情報またはソースデータファイル内に含まれている。ソースデータは本論文に添付されている。
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このような場合、「細菌ゲノムアセンブリー」は、「細菌ゲノムアセンブリー」と「細菌ゲノ ムアセンブリー」の間に位置することになり、「細菌ゲノムアセンブリー」は、「細菌ゲノムアセンブリー」と「細菌ゲノ ムアセンブリー」の間に位置することになる。PLoS Comput. Biol. 13, e1005595 (2017).
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謝辞
本研究は、Wellcome Trust Grant (106918/Z/15/Z)およびInnovative Medicines Initiative Joint Undertaking under COMBACTE-MAGNET (Combatting Bacterial Resistance in Europe-Molecules against Gram-negative Infections, grant agreement no.115737)およびCOMBACTE-NET (Combatting Bacterial Resistance in Europe-Networks, grant agreement no.115523)の助成を受けた。イルミナ配列データの作成と初期処理については、Oxford Genomics Center（Wellcome Trust Grant 203141/Z/16/Zによる資金提供）に感謝する。本書内の図はBioRender.comで作成した（図1、2、5）。図1Aはmapchart.net（CC BY-SA 4.0ライセンス）を用いて作成した。
著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Julio Diaz Caballero, Rachel M. Wheatley.
著者および所属
オックスフォード大学生物学部、11a Mansfield Rd, Oxford, UK
フリオ・ディアス・カバジェロ、レイチェル・ウィートリー、ナタリア・カペル、アンガス・クイン、リアム・P・ショー、ロイス・オグンラナ、R・クレイグ・マクレーン
スペイン、パルマ・デ・マリョルカ、ソン・エスパセス大学病院、イレス・バレアレス州衛生研究所（IdISBa）、微生物学部門
カルラ・ロペス＝カウサペ、アントニオ・オリバー
アントワープ大学ワクチン・感染症研究所医療微生物学研究室（ベルギー、ウィルリク
トーマス・ヴァン・デル・シャルク、バジル・ブリット・ザビエル、リーン・ティンバーモント、スルビ・マロトラ・クマール
ユトレヒト大学医療センター・ユリウス健康科学・プライマリケアセンター（オランダ・ユトレヒト
クラウディア・レカナティーニ & ヤン・クルイトマンス
米国メリーランド州ゲイサーズバーグ、アストラゼネカ、バイオ医薬品研究開発部、微生物科学部門
アレクセイ・ルジン & マーク・エッサー
貢献
J.D.C.、R.M.W.、N.K.、C.L.C.、T.V.d.S.、A.Q.、L.P.S.、L.O.、C.R.、B.B.X.およびL.T.はデータの取得と解析に貢献した。J.K.、A.R.、M.E.、S.M.K.、A.O.およびR.C.M.は、プロジェクトの構想および試験デザインに貢献した。J.D.C.、R.M.W.、L.P.S.、A.O.およびR.C.M.は原稿の執筆と修正を行った。
著者
R. Craig MacLean宛。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Communicationsは、この論文の査読に貢献したIain Lamont氏とその他の匿名の査読者に感謝する。
追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。
補足情報
補足情報
報告概要
出典データ
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権利と許可
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にはその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
この記事について
この記事の引用
Diaz Caballero, J., Wheatley, R.M., Kapel, N. et al. 混合株病原体集団は患者における抗生物質耐性の進化を加速する。Nat Commun 14, 4083 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39416-2
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2022年10月24日受領
受理2023年6月12日
2023年7月12日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-39416-2
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ネイチャー・コミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723（オンライン）
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