高脂肪食で誘導した高脂血症ハムスターに対する雪妃カプセルの脂質低下機序を、メタボロームと腸内細菌叢の組み合わせで明らかにした。

2023年2月21日 12:43

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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Mol. Biosci.、2023年2月20日
Sec.メタボロミクス
第10巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fmolb.2023.1147910
この記事は、研究トピックの一部です
慢性肝疾患。新標的と新メカニズム - Volume II

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高脂肪食で誘導した高脂血症ハムスターに対する雪妃カプセルの脂質低下機序を、メタボロームと腸内細菌叢の組み合わせで明らかにした。
www.frontiersin.orgLi Wang, www.frontiersin.orgZhixin Zhang, www.frontiersin.orgGan Luo, www.frontiersin.orgYing Wang, www.frontiersin.orgKe Du and www.frontiersin.orgXiaoyan Gao*
北京中医薬大学中国薬学院，中国，北京
はじめに高脂血症は、血液中の過剰な脂肪や脂質の存在する一般的な代謝性疾患であり、肝臓障害、酸化ストレスや炎症を誘発する可能性があります。雪覇カプセル（XZP）は、抗高脂血症薬として臨床的に使用されている有名な中国特許薬である。しかし、XZPの高脂血症に対する調節機構は、これまで明らかにされていない。

方法本研究では、XZPの高脂血症、抗酸化作用、抗炎症作用とその潜在的なメカニズムを、アンターゲットメタボロミクスと16S rRNAシーケンサーの組み合わせにより探索することを目的とした。

結果その結果、XZPは総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）、低密度リポタンパク質コレステロール（LDL-C）レベルを低下させ、高密度リポタンパク質コレステロール（HDL-C）レベルを増加させ、肝臓における脂質滴の過剰蓄積を緩和することが示されました。肝臓のガンマ・グルタミル・トランスフェラーゼ（GGT）およびグルタミン酸トランスアミナーゼ（GOT）を含む肝機能の生化学的指標は著しく低下した。一方、XZP は、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびグルタチオン（GSH）を含む酸化ストレス生化学的指標を増加させた。さらに、XZP は、肝臓の peroxisome proliferators-activated receptors α (PPARα), acetyl CoA carboxylase 1 (ACOX1) および cholesterol 7-alpha hydroxylase (CYP7A1) のレベルを上昇させ、血清、肝臓および糞便中の脂質代謝を改善させた。XZPは多様性指数とFirmicutesとBacteroidetesの比率を高め、17の属を制御し、肝臓の脂質代謝と表現型指標に強い相関を示した。

考察これらの知見は、XZPが高脂肪食ハムスターのαリノレン酸およびリノール酸代謝、胆汁酸代謝、アラキドン酸代謝を調節し、腸内細菌叢構成を調節することにより、血中脂質および肝脂質を減少、肝機能保護、抗炎症および抗酸化、脂質代謝障害の改善を行うことを示唆するものであった。

1 はじめに
高脂血症は、全身の代謝異常によって引き起こされる慢性疾患で、血漿脂質レベルの異常を特徴とする。胆汁酸、リノレン酸、アラキドン酸の代謝異常を含む脂質代謝異常（Baoら、2021；Xiao-Rongら、2021）、腸内細菌叢組成の変化（Jiaら、2021）、全身の慢性低級炎症（Duanら、2018）を伴う高脂質食によって引き起こされる高脂質血症があります。XZPは、Gynostemma pentaphyllum（GP）、Crataegus pinnatifida Bge（サンザシ）、Fructus Rosa Roxburghii（FRR）、Cynanchum paniculatumからなる中国の特許医薬品です。これらの植物には、血中脂質の低下、抗酸化ストレス、抗炎症、腸内細菌叢の調節に関する豊富な実験的研究がある。しかし、XZPの上記の効果やメカニズムに関する研究は比較的少ない。本研究では、アンターゲットメタボロミクスと16S rRNAシーケンシングを組み合わせて、高脂血症ハムスターに対するXZPの効果およびその潜在的なメカニズムを探索することを目的とした。

GP (Dai et al., 2022; Rao et al., 2022), Hawthorn (Peng et al., 2019; Feng et al., 2022) and FRR (Song & Shen, 2021) など、XZPからなる植物性医薬品は、TC、TG、LDL-C、およびHDL-Cを調節することが広く研究されている。研究により、GPエキスは、CCAAT/enhancer binding protein-α（C/EBPα）, peroxisome proliferator-activated receptors γ（PPARγ）, sterol regulatory element-binding protein 1c（SREBP1C）, and fatty acid synthase（FAS）のコード化mRNA発現を低下させることによりAMPK活性化、脂肪生成を抑制した（Park他, 2014; Wang B.et al., 2020）ことが示されています。また、GPエキスはホスファチジルコリン代謝を上昇させ、トリメチルアミンN-オキシドのレベルを低下させ、抗高脂血症効果を示した（Wangら、2013）。サンザシ（Shatoorら、2021）およびサンザシ葉の生理活性化合物としてのビテキシン（Pengら、2019）は、いずれもAMPKによるSREBP1の抑制とPPARαの活性化により、ラットの高脂肪食誘発肝性脂肪症を抑制した。研究により、FRRは脂肪酸の代謝、BAsとステロイドの生合成を調節することにより、代謝の恒常性を維持することが示されました（Song & Shen、2021年）。FRRのハイドロアルコール抽出物は、肝組織においてリポタンパク質リパーゼおよび肝リパーゼの活性を改善し、SREBP1CおよびアセチルCoAカルボキシラーゼ1（ACOX1）のmRNAおよびタンパク質発現を低下させ、PPARαのmRNAおよびタンパク質発現を上昇させた（Wuら、2020; Niら、2022)。そこで、本研究では、XZPの脂質低下効果および潜在的なメカニズムを評価するために、肝臓および血清中のTC、TG、LDL-C、HDL-C、肝臓組織のオイルレッドO染色、肝臓中のPPARα、ACOX1、CYP7A1について検査した。

高脂肪食による酸化ストレスは、高脂血症の発症に重要な役割を果たす（Tan & Norhaizan, 2019; Kasbi-Chadliら, 2021）。GPエキスは、サーチュイン6およびフェーズ2抗酸化酵素のレベルを増加させることにより、酸化ストレスを抑制しました（Wang B. et al., 2020）。サンザシの水性抽出物は、肝の活性酸素レベルを低下させ、肝のGSHおよびSODレベルを増加させた（Hussainら、2021）。これまでの研究で、FRRの水性アルコール抽出物は抗酸化酵素の活性を改善し（Wuら、2020）、大腸の酸化ストレスを増加させる（Wangら、2022）ことが示されている。本研究では、XZPの抗酸化ストレスを評価するために、肝臓および血清中のSOD、MDA、GSHを試験した。

過剰な脂肪消費の結果の1つは、全身的な低悪性度炎症だけでなく、局所的な組織機能障害に寄与する（Fatoorechiら、2016；Yuら、2019a；Maleszaら、2021）。GPエキスは、腸内細菌叢とTLR2/NLRP3シグナル伝達経路を調節することによってNASHを改善した（Yueら、2022年）。研究により、FRRは、高脂肪食を与えたマウスにおいて、炎症性サイトカインのレベル、腸の透過性を低下させることにより、腸のバリア機能障害を修復した（Wang et al.、2022年）。XZPの植物成分の1つであるCynanchum paniculatumは、NF-κBおよびMAPKシグナル伝達経路の調節により、様々な炎症性疾患の治療によく処方されている（Chen et al.、2020）。本研究では、XZPの抗炎症作用を評価するために、肝臓および血清中のIL-6およびCRPを検査した。

高脂肪食は、ディスバイオーシス、腸管バリアー機能不全、腸管透過性の増加、有害細菌代謝物の循環への漏出を誘発する（Maleszaら、2021年）。GPが腸の炎症に関連する短鎖脂肪酸代謝と腸内細菌叢を調節し、Firmicutes/Bacteroidetes比を減少させることが研究で示されている（Horneら、2020；Li S.ら、2022)。GPエキスは、腸内のLactococcus属などの有益な細菌の存在量を豊かにし、Ruminococcus属などの病原性細菌の存在量を抑制した（Shenら、2020年）。FRRは高脂血症ラットのFirmicutesとBacteroidetesの比率を低下させ、PrevotellaとRuminococcusの存在量を増加させ（Jiら、2022）、胆汁酸、アミノ酸および脂質代謝に有意な影響を与えた（Wang L. ら、2020）。

本研究では、高脂肪食ハムスターを対象に、XZPの血中脂質および肝臓の低下、肝機能の保護、抗炎症、抗酸化に対する有効性を解析した。また、高脂肪食により誘導されたハムスターの血清、肝臓、糞便中の脂質代謝および腸内細菌叢組成に対するXZPの作用に着目して解析を行った。最後に、腸内細菌叢と肝臓の脂質代謝の相関、肝臓の表現型指標と腸内細菌叢の相関を解析し、腸内細菌叢が肝臓の脂質代謝に及ぼす影響について検討した。本研究の目的は、表現型指標、脂質メタボノミクス、腸内細菌叢を統合し、XZPの高脂血症制御機構を研究することである。

2 材料と方法
2.1 実験デザインおよび動物飼育
北京活河実験動物技術有限公司から購入した6週齢100±10g、雄のゴールデンハムスター85匹（SCXK (Beijing) 2016-0011, NO.110011200109811516) を使用した。動物の飼育手順および試験は、北京中医薬大学動物センターが作成したガイドラインに準拠して行った。ハムスターは3匹ごとに1つのケージに入れ、25℃±1℃、湿度50～60％、12時間/12時間の暗・明周期という快適な環境で飼育した。実験前にXZPの品質管理分析を行った（補足図S1）。

13匹のハムスターに標準飼料を与えた。同時に、72匹のハムスターに高脂肪食を与え、高脂血症モデルへと誘導した。3週間後、眼窩から血液を採取し、TCとTGを測定した。標準食群でTCとTGが高かった3匹のハムスターを除外し、10匹のハムスターを正常対照群（NC）に割り付けた。NC群より血清中のTC、TGが有意に高いハムスター50匹を無作為に10匹ずつ5群に分け、HFD（水で処理、1.0mg/kg/日）、アトルバスタチン群（Pfizer Inc, NO.DP6613、2.5 mg/kg/day）、低用量XZP（貴州泰和製薬有限公司、NO.20200801-2、XZP-L、0.225 mg/kg/day）、中間用量XZP（XZP-M、0.45 mg/kg/day）および高用量XZPグループ（XZP-H、0.9mg/kg/day）の計5つのグループに分け、それぞれの投与量を測定しました。ATVTT群およびXZP群のハムスターには毎朝8:30に4週間投与し、NC群およびHFD群のハムスターには同じ水を投与した。投与中、NC群には標準食を、HFD群および治療群には高脂肪食を与えた。高脂肪食は、江蘇西通医薬生物工学有限公司（NO.20201026）より提供された。この飼料は、標準飼料41%、果糖20%、ラード油18%、カゼイン15%、第二リン酸カルシウム2%、ミネラルミックス2%、コール酸ナトリウム0.5%、コレステロール1.5%で構成されている。本試験では、総カロリー（Kcal %）の41%を脂肪、20%をタンパク質、39%を炭水化物から摂取する高脂肪食を使用した。

2.2 試料の収集と調製
体重と摂餌量は毎週測定した。実験期間中、全てのハムスターは生存していた。7週間後、個々のハムスターを代謝ケージ(1ケージあたり1匹)に入れて24時間糞便採取を行い、糞便サンプルは分析前に-80℃で保存した。実験終了後、ペントバルビタールナトリウムを30mg/kg体重で腹腔内投与し、ハムスターを麻酔した。血液サンプルは、抗凝固剤を含まない採血管を用いて、ハムスターの肝門脈から採取した。肝臓は丁寧に摘出し、重量を測定後、液体窒素で急速凍結し、-80℃で保存し、メタボローム解析を行った。内臓指数は、臓器重量/体重（mg/g）の計算式で算出した。

2.3 血液および肝臓の生化学的分析
血液および肝臓試料中のTC（Solarbio, NO.20201201）, TG（Solarbio, NO.20201120）, HDL-C（mlbio, NO.11/2020 04/2021）, LDL-C（mlbio, NO.04/2021）濃度を測定し、脂質物質の発現を評価した。肝機能を評価するために、血液および肝臓サンプル中のGPT（Solarbio, NO.20201125）, GOT（Solarbio, NO.20201130）, GGT（mlbio, NO.04/2021）, AKP/ALP（Solarbio, NO.20201201）レベルを測定しました。ハムスターの酸化ストレスに対する抵抗力を評価するために、血液および肝臓サンプル中のSOD（Solarbio, NO.20201123）およびMDA（Solarbio, NO.20201111）濃度を測定した。ハムスターの抗炎症機能を評価するために、血液サンプル中のGSH (Solarbio, NO.20201110), IL-6 (mlbio, NO.11/2020), CRP (mlbio, NO.11/2020) レベルを測定した。

2.4 肝臓の組織学的検査
肝臓の凍結切片を固定した後、オイルレッドO染色、背景分化、ヘマトキシリン染色、シーリングを順次行った。肝臓の脂質沈着は、オイルレッド O 染色で観察した。HE染色で肝臓の組織損傷の程度を調べた。CaseViewer 2.2スキャンニングソフトウェアを使用して、200倍画像撮影のために肝臓領域を選択する。撮影中は、各写真の背景光が一定になるように、視野全体を組織で満たすようにする。撮像後、Image Pro Plus 6.0 解析ソフトを使用して、各写真のオイルレッドグリース滴のピクセル面積と対応する管壁のピクセル面積を測定し、統一単位ピクセルにおけるオイルレッドグリース滴の比率を計算する。

2.5 ウェスタンブロット
肝臓を氷上で RIPA バッファーを用いて Refrigerated High-Speed Homogenate Machine で 60 秒間破砕した後、 13,000 xg, 4°C で 30 分間遠心分離した。肝臓ホモジネートの上清のタンパク質濃度は、BSAアッセイで検出した。等量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、Immun-Blot PVDF Membraneにトランスファーした。次に、ブロッキングバッファーとしてTBST中の5％NFDMで室温で1時間ブロッキングした。メンブレンを切り、各部分に対応する抗体（PPARα, NO.ab8224, 1：1000でTBST溶液で希釈； ACOX1, proteintech, NO.15540-1-AP, 1：4000でTBST溶液で希釈；CYP7A1, BOSTER, NO. A01601、1:500のTBST溶液で希釈）を室温で1時間、4℃で一晩、順次行った。その後、TBSTでメンブレンを4回洗浄した。メンブレンをさらに、対応する二次抗体（Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP), 1:20000, abcam, NO. ab205719）とともに室温で1時間インキュベートし、ブロットを、一次抗体と続いてホースラディッシュパーオキシダーゼ結合された二次抗体とともにインキュベートした。結果はFluorChem E Imaging System (proteinsimple, United States of America)により検出された。PPARα、ACOX1、CYP7A1 のタンパク質発現量は β-actin で規格化し、定量化した。

2.6 糞便、肝臓および血清からの代謝物の UPLC-MS 分析
タンパク質を沈殿させ、代謝物を抽出するために、各実験グループの血清サンプル100μLに400μLメタノール：アセトニトリル（容積比1：1）を加えて30秒間ボルテックスし、4℃で2時間保存した後、13500xgで20分間遠心し、上清をEPチューブに移して窒素ブロー装置で乾燥させました。各群20μLずつ採取し、QC血清試料と混合し、同様の調製方法でQC試料を調製した。最後に残渣を200μLメタノール：アセトニトリル（1：1）で再構成し、13500 xgで20分間遠心分離し、3μLのアリコートを注入してUPLC-Q-TOF/MS分析を行った。

80 mg の肝臓試料を、50 mg のジルコニアビーズを含む 2 mL の粉砕管に移し替えた。粉砕管に超純水200mLを加え、低温粉砕機で最高速度で30秒間ホモジナイズし、肝臓ホモジネートを得た。ホモジナイズした試料に400μLのメタノール：アセトニトリル（容積比1：1）を加えて30秒間ボルテックスした後、超音波抽出器により低温で30分間抽出した。その後、ホモジナイズした試料を13500xgで20分間遠心分離した後、上清をEPチューブに移し、窒素吹付装置でブロードライした。各群20 mgを採取してQC肝試料に混合し、同様の調製方法でQC試料を調製した。最後に残渣を200μLメタノール：アセトニトリル（1：1）で再構成し、13500xgで20分間遠心分離し、3μLのアリコートを注入してUPLC-Q-TOF／MS分析を行った。

50 mgのジルコニアビーズを含む2 mL粉砕管に80 mgの糞便試料を添加した。粉砕管に超純水200 mLを加え、低温粉砕機（Servicebio KZ-III-F）で最高速度で30秒間ホモジナイズし、糞便ホモジネートを得た。ホモジナイズした試料に400μLのメタノール：アセトニトリル（容積比1：1）を加えて30秒間ボルテックスした後、超音波抽出器（KQ-600DE, Kunshan Ultrasonic Instruments Co. その後、ホモジナイズした試料を13500 xgで20分間遠心分離した後、上清をEPチューブに移し、窒素ブロー装置でブロードライした。各群40 mgを採取してQC糞便試料に混合し、同様の調製方法でQC試料を調製する。最後に、残渣を200μLメタノール：アセトニトリル（1：1）で再構成し、13500xgで20分間遠心分離し、3μLのアリコートを注入してUPLC-Q-TOF/MS（Thermo Q Exactive Orbitrap）分析に使用した。

サンプルは、Waters BEH C18 (1.7 μm, 100 mm)を備えたThermo Scientific QExactive plusに結合したThermo Scientific Ultimate 3000システムを用いて、上記と同じ方法で分析された。溶離液Aは0.1%ギ酸（v/v）水溶液、溶離液Bは0.1%ギ酸（v/v）アセトニトリル100%溶液。分析グラジエントは、0分、1%A、2分、35%A、7分、75%A、10分、99%A、11分、99%A、16分、1%Aで、注入量は3μL、流速は0.4mL/minでした。サンプルはオートサンプラー内で4℃に保たれ、カラムは45℃で操作されました。キャピラリー電圧は3.5KVと2.8KVに設定し、ポジティブイオン化モードとネガティブイオン化モードでMSを動作させました。キャピラリー温度とAuxガスヒーター温度は、正イオンモードと負イオンモードでともに320℃に設定されました。スキャンレンジは150-1200 m/z。

2.7 腸内細菌叢の16S rRNAプロファイリング
各群10匹のハムスターの糞便から、CTAB/SDS法を用いて細菌RNAを抽出した。RNAの濃度と純度は、1%アガロースゲル上でモニターした。RNAの濃度に応じて、滅菌水を用いて1ng/μLに希釈した。各サンプルについて、バーコードの付いた特定のプライマーを用いて、16S rRNA遺伝子を増幅した。プライマーは16S V3-V4 (341F-806R), 18S V9 (1380F-1510R), ITS1(ITS1F- ITS2R)から構成される。すべてのPCR反応は、15μLのPhusion ® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs); 0.2 μMのフォワードおよびリバースプライマー、および約10 ngの鋳型RNAを用いて30μLの反応液で実施された。サーマルサイクリングは、98℃、1分間の初期変性、98℃、10秒間の変性、50℃、30秒間のアニーリング、72℃、60秒間の伸長を30サイクル行い、最後に72℃、5分間の伸長で完了する。PCR産物に同量の1Xローディングバッファー（SYB green含有）を混合し、2％アガロースゲルで電気泳動し、検出する。400-450bpの間に明るいメインストリップがあるサンプルを選び、さらに実験を行った。PCR産物は等密度比で混合し、AxyPrep RNA Gel Extraction Kit (AXYGEN)で精製した。NEB Next® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, United States of America)を用いて、メーカーの推奨する方法でシーケンスライブラリを作成し、インデックスコードを付加した。ライブラリーの品質はQubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) とAgilent Bioanalyzer 2100 systemで評価した。最後に、ライブラリーをIllumina Miseq/HiSeq2500 platformで配列決定し、250bp/300bpペアエンドリードを生成した。

2.8 統計解析
多次元LC-MSデータの可視化、処理、解釈のために、Progenesis QI v2.0 (Non-linear Dynamics, Newcastle, U.K.) で処理した実験の生データを使用した。ピークピッキングとアライメントのためにProgenesis QIに取り込まれたLC-MSデータは、主成分分析（PCA）と直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）を行い、さらにANOVA分析で確認した。代謝物のピークは、Mass Fragment TM アプリケーションマネージャ (Waters corp., Milford, United States) と組み合わせた MS/MS 分析によって割り当てられました。バイオインフォマティクス解析には、Human Metabolome Database (HMDB) (http://www.hmdb.ca/) および KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) を含む利用可能な生化学データベースを使用した。さらに多変量統計解析は、SIMCA ソフトウェア (Version 14.1, MKS Data Analytics Solutions, Umea, Sweden) を用いて実施された。潜在構造への直交投影-判別分析（OPLS-DA）は、グループの違いを可視化し、グループの分離に関与する変数を得るために適用された。

16S rRNAのデータ解析には、ペアエンドリードのアセンブリが必要です。元のRNA断片から得られたペアエンドリードは、非常に高速かつ正確な解析ツールであるFLASHを用いてマージされ、少なくとも一部のリードが同じRNA断片の反対端から生成されたリードと重なった場合にマージされるよう設計されています。OTUクラスタリングと種のアノテーションを行った。配列解析はUPARSEソフトウェアパッケージにより、UPARSE-OTUおよびUPARSE-OTU refアルゴリズムを用いて実施した。アルファ（サンプル内）およびベータ（サンプル間）多様性の解析には、社内のPerlスクリプトを使用した。類似度が97%以上の配列は、同じOTUに割り当てられた。各OTUについて代表的な配列を選び、RDP分類器を用いて各代表配列の分類学的情報をアノテーションしている。Alpha Diversityを計算するために、OTUテーブルをラリファイし、3つの指標を計算する。Chao1は種の多さを、Observed Speciesは各サンプルで見つかったユニークなOTUの量を、そしてShannon indexはその数を推定する。これら3つの指標をもとに希少度曲線を作成した。3つ目は、系統間距離と群集分布の解析である。系統から種までの細菌多様性の相対的な存在量をグラフ化することで、クロナチャートを用いて可視化することができる。クラスター分析の前に、QIIME ソフトウェアパッケージを使用して、元の変数の次元を減らすために主成分分析 (PCA) を適用した。QIIMEは、β多様性の系統学的尺度である加重ユニフラック距離と非加重ユニフラック距離の両方を計算する。主座標分析と算術平均による非加重ペアグループ法では、非加重ユニフラック距離を使用した。

有意性の正確な値はすべての図に示されている。すべてのデータは平均値±s.d.として図の説明文に記載されている。2つの条件間の比較は、対応のないスチューデントのt検定によって分析された。グラフの作成と統計にはGraphPad PRISM version 8.0を使用した。差はp < 0.05で有意とした。

3 結果
3.1 XZPは高脂血症ハムスターの肝臓および血清中の脂質濃度を低下させた
高脂肪食を3週間摂取させたハムスターを高脂血症モデルに誘導し、誘導終了時にハムスターの尾端から採取した血清中のTCおよびTGを測定したところ、TCおよびTGは高脂血症モデルにおいて有意に減少した。高脂肪食で誘導されたTCは標準食に比べ有意に高く、高脂肪食で誘導されたTC値が低いハムスターは除外した（Supplement Figure S2）。XZPおよびATVTTの介入4週間後、生化学的指標および肝組織病理学を検査した。オイルレッドOを用いた組織化学的検査により、XZPとATVTTが肝臓の脂質蓄積を緩和できることが示された（図1A）。高脂肪食を与えたハムスターの肝臓組織には、明らかな病理学的損傷は検出されなかった（補足図S3）。XZPおよびATVTT処理は、いずれも高脂肪食で誘導したハムスターの血清および肝臓中のTC、TGおよびLDL-Cを減少させた。さらに、XZPおよびATVTT処理は、高脂肪食で誘導されたハムスターの肝臓でHDL-Cを増加させたが、血清では見られなかった（図1B；補足表S1）。Acox1は、ペルオキシソームβ酸化の第一段階を触媒し、肝臓に濃縮されている。CYP7A1 は、コレステロールの 7ahydroxycholesterol への水酸化を触媒する。PPARα 標的遺伝子は、心臓や肝臓のような酸化速度の速い組織での脂肪酸代謝に関与している。XZPは、高脂肪食で誘導されたハムスターの肝臓において、ACOX1、CYP7A1およびPPARαを増加させた（図1C-E）。

図1
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図1 (A) 肝臓のオイルレッドO染色。(スケールバー＝100μm）（B）脂質指標には、血清および肝臓のTC、TG、HDL-CおよびLDL-Cレベルを含む（C）肝臓におけるACOX1の発現はWBにより測定した。(D)CYP7A1の発現は、WBにより肝臓で測定された。(E)PPARαの発現は、WBにより肝臓で測定した。*p < 0.05, **p < 0.01：HFD群経由；#p < 0.05, ##p<0.01：NC群経由。

総じて、XZPは、HFDハムスターの肝臓において、血中および肝臓のTC、TG、LDL-Cなどの脂質レベルを低下させ、HDL-Cの発現を増加させることが分かった。高脂肪食によって引き起こされた肝臓の脂質滴の過剰な蓄積は、XZPとATVTTの介入によって大きく緩和された。また、XZP は、高脂肪食により誘導されたハムスターの肝臓において、PPARα、ACOX1、CYP7A1 の発現を増加させることにより、脂肪の分解と酸化を促進させた。

3.2 XZPは高脂血症ハムスターの軽度の肝損傷、酸化ストレスおよび炎症を緩和する
XZPおよびATVTTが高脂肪食による肝障害から保護できるかどうかを評価するために、HE染色による肝病理変化、および肝臓と血清中のGOT、GPT、ALP、GGTなどの肝機能を調べた（補足表S1）。H&E染色の結果、高脂肪食も薬物治療も肝組織に病理的な損傷を与えることはできなかった。しかし、XZPおよびATVTTは、肝臓および血清中のGGTを減少させることが示された。さらに、XZPは肝臓のGOTを有意に減少させた（図2A）。XZPとATVTTが酸化ストレスに抵抗できるかどうかを評価するために、肝臓と血清中のSOD、MDA、GSHを検査した。その結果、XZPは肝臓と血清中のSOD、および肝臓のGSHを有意に増加させた（図2B）。ATVTTの抗酸化ストレスに有意な差はなかった（図2B）。XZPおよびATVTTが、高脂肪食によって誘導されたハムスターの炎症に抵抗できるかどうかを評価するために、IL-6およびCRPを検査した（補足表S1）。その結果、XZPおよびATVTTは、血清中のCRPレベルを有意に減少させることが示された（図2C）。

図2
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図2 （A）肝機能はGOTとGGTを含む（B）抗酸化ストレス指数はSODとGSHを含む。(C) 炎症指数CRP。*p < 0.01, *p < 0.05, **p < 0.01 via HFD group; #p < 0.05, ##p < 0.01 via the NC group.を参照。

本実験の結果、肝機能指標（GGT、GOT）のXZP、ATVTTはHFDより顕著に低下し、肝機能保護効果が示された。同時に、XZP は高脂肪ハムスターの SOD と MDA を増加させ、抗酸化ストレスを発現させた。

3.3 XZP による肝臓、血清および糞便中の脂質代謝の制御
XZP が高脂血症ハムスターの脂質代謝を制御していることをより良く理解するために、血清、肝臓、糞の 3 種類のサンプルの代謝物プロフィールを測定した。脂質の種類は、主にリゾホスファチジルコリン（LysoPC）、リゾホスファチジルセリン（LPS）、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、スフィンゴミエリン（SM）、セラミド（Cer）であった。血清、肝臓、糞便の脂質代謝を解析することにより、XZPの脂質低下機構を評価した。

3.3.1 XZPは高脂血症ハムスターの血清脂質代謝を調節した
OPLS-DA により、高脂肪食投与群では NC 群と比較して血清メタボロームプロファイルの明らかなシフトが認められ、高脂肪食はハムスターの血清代謝を変化させることが示唆された。さらに、介入後のXZP-H、XZP-M、XZP-L群では、HFD群と比較して、メタボロームプロファイルの明確なシフトが認められた（図3A、B）。

図3
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図3. (A) UPLC-MS/MSで得られた分子特性に基づく血清代謝プロファイルのOPLS-DAスコアプロット [ESI+] (B) UPLC-MS/MSで得られた血清代謝プロファイルのOPLS-DAスコアプロット [ESI-]. スコアプロット中の各ドットは独立したサンプルを表す (C) 血清代謝パスウェイはMetaboAnalystによって濃縮された。Enrichment RatioはHits/Expectedで計算され、Hits=観察されたヒット、Expected=予想されたヒットです。(D）血清バイオマーカーの相互作用は、MetaboAnalystによって濃縮された。

Progenesis QIの標準化処理により、血清代謝物の含有情報形式と同定情報形式を取得しました。そして、フラグメントスコアが50以上、VIPが1以上のイオンをフラグメント情報を持つ化合物の同定基準として選択しました（Supplementary Table S2）。NC群と比較して、モデル群では9 PC、4 SM、2 PE、4 Cer、7 LysoPCを含む34のバイオマーカーが高脂肪食により有意に影響を受けた。特に、XZP-H、XZP-M、XZP-Lは、それぞれ18、30、33の高脂肪食ハムスターのバイオマーカーを有意に制御した（Supplementary Table S3）。このように、XZP-Lは他の投与群に比べ、高脂肪食で誘導されたハムスターの血清脂質代謝をより良く制御していた。これをもとに、MetaboAnalystのエンリッチメント解析とネットワーク解析により、血清代謝パスウェイとバイオマーカーの濃縮を行った。その結果、インパクト値が0.05以上のパスウェイを抽出し、図示することにした。リノール酸とα-リノレン酸は、α-リノレン酸とリノール酸の代謝に関与しており、p=0.0225であった。コール酸は胆汁酸の生合成に関与しており、p = 0.0442であった。プロスタグランジン E2 と 5, 6-DHET, 20-ヒドロキシエイコサテトラエン酸はアラキドン酸代謝に関与しており、p = 0.0414 でした。テトラヒドロコルチゾールと11b-ヒドロキシプロゲステロンはステロイド生成に関与し、p = 0.01であった（図3C）。

代謝物-代謝物相互作用ネットワークは、幅広い注釈付き代謝物セット間の潜在的な機能的関係を強調するのに役立ちます。5,6-DHET, 20-hydroxyeicosatetraenoic acid, tetrahydrocortisol, linoleic acid, prostaglandin E2, LysoPC(18:1(9Z)), PC(18.1(9Z)), PC(18.1(9Z)) の間に強い相関があることが分かった。 1(9Z)/18:1(9Z)), PE(18:0/20:1(11Z)), SM(d18:0/22:1(13Z)), glucosylceramide (d18:1/20:0) and galabiosylceramide (d18:1/16:0) MetaboAnalystによるネットワーク分析により、LysoPC(18:1(9Z)), PC(18:1), SM(18:0), GPC (d18:0), GLAS (18:0) が明らかにされた。また、XZP-H、XZP-M、XZP-Lは、それぞれHFDハムスターの9、9、10のバイオマーカーを有意に制御することがわかった（Table 1）。

表1
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表1. 濃縮された血清バイオマーカーの強度のグループ間比較傾向に関する情報。

3.3.2 XZPによる高脂血症ハムスターの肝脂質代謝の制御
OPLS-DAの結果、高脂肪食群はNC群と比較して肝臓メタボロームプロファイルに明らかなシフトが認められ、高脂肪食がハムスターの肝臓代謝を変化させることが示唆された。さらに、介入後のXZP-H、XZP-M、XZP-L群では、HFD群と比較してメタボロームプロファイルの明確なシフトが観察された（図3A, B）。

Progenesis QIの標準化処理により、肝臓代謝物の含有情報形式と同定情報形式を取得した。そして、フラグメント情報を持つ化合物の同定基準として、フラグメントスコアが50以上、VIPが1以上のイオンを選択した（Supplementary Table S4）。NC群と比較して、HFD群の52のバイオマーカーは、7 PC、15 PE、1 Cer、12 LysoPC、2 PIを含む高脂肪食によって有意に影響を受けた。特に、XZP-H、XZP-M、XZP-Lは、それぞれ46、47、48のHFDハムスターのバイオマーカーを有意に制御した（Supplementary Table S5）。したがって、XZP-Lは他の投与群よりも高脂肪食で誘導されたハムスターの肝臓脂質代謝を良好に調節していた。これをもとに、MetaboAnalystのエンリッチメント解析とネットワーク解析により、血清代謝パスウェイとバイオマーカーのエンリッチメントを行った。その結果、インパクト値が0.05以上のパスウェイを抽出し、図示することにした。タウロコール酸、グリココール酸、デオキシコール酸、リトコール酸抱合体、25-ヒドロキシコレステロールはp=0.000528で胆汁酸生合成に関与していることがわかった。α-リノレン酸、8,11,14-エイコサトリエン酸はα-リノレン酸およびリノール酸の代謝に関与し、p = 0.0418であった。その他の肝臓代謝経路には、リン脂質生合成、スフィンゴ脂質代謝、ステロイド生成、エストロン代謝、短鎖飽和脂肪酸のミトコンドリアβ酸化、脂肪酸代謝、ステロイド生合成が含まれる（図4C）。

図4
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図4 (A) UPLC-MS/MS [ESI+]で得られた分子的特徴に基づく肝臓代謝プロファイルのOPLS-DAスコアプロット (B) UPLC-MS/MS [ESI-]で得られた肝臓代謝プロファイルのOPLS-DAスコアプロット。スコアプロット中の各ドットは独立したサンプルを表す (C) 血清代謝経路はMetaboAnalystによって濃縮された。Enrichment RatioはHits/Expectedで計算され、ここでhits = observed hits; expected = expected hits。(D）肝臓バイオマーカーの相互作用は、MetaboAnalystによって濃縮されました。

その結果、8,11,14-エイコサトリエン酸、デオキシコール酸、LysoPC（20：4（8Z,11Z,14Z,17Z））、PI（18：0/18：2（9Z、12Z））、5β-シプリノール硫酸、グリココール酸、PS（18：0/18: 1(9Z))、ビリルビン・グルクロニド、タウロコール酸、α-イノレン酸、リトコール酸グリシン抱合体、24-メチレンコレステロール、PC（16：0/22: 5(7Z,10Z,13Z,16Z, 19Z))、25-hydroxycholesterol, PE(16:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z, 19Z)), LysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z, 16Z)), LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z, 14Z)) は MetaboAnalyst によるネットワーク解析で判明しました。また、XZP-H、XZP-M、XZP-Lは、それぞれHFDハムスターの15、15、17のバイオマーカーを有意に制御することがわかった（Table 2）。

表2
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表2. 濃縮肝臓バイオマーカーの相対存在度のグループ間比較傾向に関する情報。

3.3.3 XZPによる高脂血症ハムスターの糞便中脂質代謝の制御
OPLS-DAの結果、HFD群ではNC群と比較して糞便中のメタボロームプロファイルに明らかなシフトが認められ、高脂肪食がハムスターの糞便代謝を変化させることが示唆された。さらに、介入後のXZP-H、XZP-M、XZP-L群では、HFD群と比較して、メタボロームプロファイルの明確なシフトが観察された（図5A、B）。XZPはHFDハムスターの糞便代謝を調節したが、NCと相対的にクラスタリングすることはできなかった。

図5
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図5 (A) UPLC-MS/MSで得られた分子特性に基づく糞便代謝プロファイルのOPLS-DAスコアプロット [ESI+] (B) UPLC-MS/MSで得られた糞便代謝プロファイルのOPLS-DAスコアプロット [ESI-]. スコアプロット中の各ドットは独立したサンプルを表す (C) 血清代謝経路はメタボアナリストによって濃縮された。Enrichment Ratioは、Hits/Expectedで計算され、Hits = 観察されたヒット、Expected = 予想されたヒットである。(D）糞便のバイオマーカーの相互作用は、MetaboAnalystによって濃縮された。

Progenesis QIの標準化処理により、肝臓代謝物の含有情報形式と同定情報形式を取得しました。そして、フラグメント情報を持つ化合物の同定基準として、フラグメントスコアが50以上、VIPが1以上のイオンを選択しました（Supplementary Table S6）。NC群と比較して、モデル群ではPC 7種、PE 3種、Cer 4種、SM 2種、LysoPC 4種を含む37種のバイオマーカーがHFDにより有意に影響を受けた。特に、XZP-H、XZP-MおよびXZP-Lは、それぞれ24、31および34のHFDハムスターのバイオマーカーを有意に制御した（Supplementary Table S7）。したがって、XZP-Lは他の投与群よりも高脂肪食で誘導されたハムスターの肝臓脂質代謝をより良く制御していた。これをもとに、MetaboAnalystによる濃縮解析とネットワーク解析により、糞便代謝パスウェイとバイオマーカーの濃縮を行った。その結果、インパクト値が0.05以上のパスウェイを抽出し、図示した。コレステロール、24-ヒドロキシコレステロール、3a,7a,12a-トリヒドロキシ-5b-コレスタン-26-aL、3β-ヒドロキシ-5-コレスタン酸、7α-ヒドロキシ-3オキソ-4-コレスタン酸はp<0.0001で胆汁酸生合成に関与していることがわかった。α-リノレン酸とドコサヘキサエン酸はステロイド生成に関与し（p < 0.0001）、α-リノレン酸とリノール酸の代謝に関与している（p < 0.0001）。11,12-DiHETrEはアラキドン酸代謝に関与し、p = 0.002であった。デヒドロエピアンドロステロンは、アンドロゲンおよびエストロゲン代謝に関与しており、p = 0.007であった。スフィンガニンとセラミド（d18:1/18:0）はスフィンゴ脂質の代謝に関与しており、p=0.012であった（図5C）。

我々は、コレステロール、3a,7a,12a-トリヒドロキシ-5b-コレスタン-26-aL、17α、20α-ジヒドロキシプレグン-4-エン-3-オン、7-デヒドロデスモステロール、4, 4-ジメチル-5a-コレスタ-8，24-ジエン-3-b-オール、22b-ヒドロキシコレステロール、ドコサヘキサエン酸、24R，25-ジヒドロキシビタミンD3、24-ヒドロキシコレステロール、11，12-ジHETrE、7α-ヒドロキシ3-オキソ-4-コレステノエート、SM（d18: MetaboAnalystのネットワーク解析により、スフィンガニン、デヒドロエピアンドロステロン、α-リノレン酸、3β-hydroxy-5-cholestenoate、PC（14：0/22：2（13Z、16Z））、メソビルビノゲン、ビリルビンが検出された。また、XZP-H、XZP-M、XZP-Lは、それぞれHFDハムスターの17、19、20のバイオマーカーを有意に制御することを見出した（表3）。

表3
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表3. 濃縮糞便バイオマーカーの相対存在量のグループ間比較傾向に関する情報。

本研究では、血清、肝臓および糞便の代謝は、αリノール酸およびリノール酸代謝、胆汁酸生合成、ステロイド生成およびステロイド生合成の4つのパスウェイを共有していた（図6A）。血清、肝臓、糞便中の全バイオマーカーをMetPA解析した結果、高から低まで有意な5つの代謝パスウェイは、一次胆汁酸生合成、スフィンゴ脂質代謝、アラキドン酸代謝、ステロイド生合成、リノール酸代謝だった（図6B；補足表 S8）。バイオマーカー間の相関から、コレステロールは一次胆汁酸生合成とステロイド生合成の間のキーマーカーであり、血清、肝臓、糞便中に確認されたホスファチジルコリンはアラキドン酸代謝とリノール酸代謝の間のキーマーカーであることが示された。また、肝臓と糞便中に確認されたセラミドは、スフィンゴ脂質代謝の重要なマーカーであった（図6C）。

図6
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図6 （A）血清、肝臓、糞便サンプル間で共有または独自の脂質代謝経路を示すベン図（B）血清、肝臓、糞便バイオマーカーのMetPAによるパスウェイ解析。(C) XZPが制御する高脂血症代謝経路に関与するバイオマーカー間の相関関係。

3.4 XZPによる高脂血症ハムスターの腸内細菌叢組成の制御
XZPによる腸内細菌叢の全体的な構造変化は、全グループの糞便から分離した微生物サンプルの16S rRNA遺伝子配列の解析により決定された。OPLS-DAは、実験群ごとに腸内細菌属の明確なクラスタリングを示した。XZP-L、XZP-M、XZP-Hの微生物はHFD群から著しく離れており、これはXZPが高脂肪食によって誘導されたハムスターの腸内細菌叢を制御していることを示している（図7A）。観察された種によって算出された腸内細菌叢のα多様性高脂肪食は、ハムスターの腸内細菌叢のα-diversityを有意に減少させることを見出した。XZPは、高脂肪食によって誘導された腸内細菌叢のα-ダイバーシティを有意に増加させた（図7B）。ハムスターでは、ファーミキューテスおよびバクテロイデテスが主要な構成要素である。その結果、高脂肪食はFirmicutesの相対存在量を有意に増加させ、Bacteroidesの相対存在量を減少させた。XZPの各群は、高脂肪食により誘導されたハムスターのFirmicutesの相対存在量を有意に減少させた。しかし、XZP-MおよびXZP-Lは、高脂肪食で誘導されたハムスターのBacteroidesの相対量を有意に増加させた（図7C）。高脂肪食によりハムスターのFirmicutesとBacteroidetesの比（F/B）は有意に増加し、XZPの各群により有意に減少した（図7D）。FirmicutesのRuminococcaceaeとLachnospiraceaeの遺伝子の相対量は、いずれもHFDの顔で有意に増加した。XZP-M、XZP-Lは、Lachnospiraceaeの相対量を有意に減少させた（図7E）。BacteroidetesのBacteroidaceaeの相対量はHFDで有意に減少し、Prevotellaceaeの相対量はHFDで有意に増加した。XZPの各群はBacteroidaceaeとPrevotellaceaeを有意に制御した（図7F）。

図7
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図7 （A）16S rRNA配列決定で得られた属プロファイルに基づくOPLS-DAスコアプロット（B）観察された種によって計算された腸内細菌叢のα-多様性。(C）ファーミキューテス類とバクテロイデテス類の相対的存在量（D）ファーミキューテス類とバクテロイデテス類の相対的存在量の比。(E) FirmicutesにおけるRuminococcaceaeとLachnospiraceaeの相対的存在量 (F) BacteroidetesにおけるBacteroidaceaeとPrevotellaceaeの相対的存在量。*p < 0.05, **p < 0.01：HFD群；#p < 0.05, ##p<0.01：NC群。

その結果、FirmicutesとBacteroidetesが各群の主要な構成要素であることがわかった。また、FirmicutesとBacteroidetesの比率は高脂血症と密接な関係があることがわかった。そこで、FirmicutesとBacteroidetesの属性の分析に注目した。その結果、Firmicutes属のRuminococcaceae UCG-014, Ruminiclostridium 9, Lactobacillus属はHFDではNCより有意に減少し、Ruminococcaceae UCG-010, Ruminiclostridium 5, UBA 1819, Lactobacillus属はHFDでは減少しなかった。ハリーフリンティア、ラクリスピラ科NK4A136グループ、ローズブリア、GCA-900066575 [Eubacterium] ruminantiumグループ、ラクリスピラ科UCG-006、タイゼレラ属は、HFDでNCより有意に増加し、FirmicutesはHFDで有意に増加した。Bacteroidetes属のBacteroidesとPrevotellaceae UCG-001はNCよりHFDで有意に減少し、Alloprevotella属はNCよりHFDで有意に増加した。その結果、Akkermansia muciniphilaは肥満に関連した代謝異常の予防や治療のための新規候補物質であることが示唆された。我々は、帽子の高脂肪食がAkkermansiaを著しく減少させることを観察し、これは経口投与により緩和されることが確認された。最後に、XZP-H、XZP-MおよびXZP-Lは、高脂肪食によって誘導されたハムスターの腸内細菌叢の12、15および17属をそれぞれ有意に制御することを見いだした（図8）。

図8
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図8. 腸内細菌叢は、16s rRNA配列決定により決定した。糞便微生物叢の属組成の棒グラフ。HFD群経由の*p < 0.05, **p < 0.01；NC群経由の#p < 0.05, ##p < 0.01.

PICRUStソフトウェアを用いて、16Sシークエンスデータから得られた菌種構成情報を比較することにより、サンプルの機能的遺伝子構成を推測し、グループ間の機能的差異を解析した。XZP-LはXZP-HやXZP-MよりもHFDからの識別に優れていたため、XZP-Lを例として腸内細菌叢のシグナル経路を充実させる。KEGG機能予測では、高脂肪食により、グリセロリン脂質代謝、脂肪酸生合成、不飽和脂肪酸生合成、スフィンゴ脂質代謝、ステロイドホルモン生合成、グリセロ脂質代謝などの腸内細菌が関わる脂質代謝関連経路、酸化的リン酸化、ペントース・グルクロン酸相互変換、ペントースリン酸経路などの炭水化物代謝が有意に増加していた (図 9). 脂質代謝と糖質代謝の両方がハムスターのエネルギー代謝に関与していることから、XZPは高脂肪食で誘導されたハムスターの微生物叢を制御することでエネルギー消費を増加させることが示唆された。XZPは腸内細菌叢を制御し、ペルオキシソーム、PPARシグナル伝達経路、脂肪酸の合成と分解に関連するパントテン酸およびCoAの生合成に関与していることが示唆された。さらに、XZPは腸内細菌叢を制御し、ブタン酸代謝やプロパン酸代謝などの短鎖脂肪酸代謝に関与することを見いだした。短鎖脂肪酸代謝は、大腸の正常な機能や大腸上皮細胞の形態・機能の維持に重要な役割を担っている。注目すべきは、XZPが腸内細菌叢を制御してグルタチオン代謝に関与していることであり、XZPが腸内細菌叢を制御することで高脂肪食ハムスターの抗酸化ストレスを高めることが示唆された（図10）。以上より、高脂肪食ハムスターの腸内細菌叢解析において、XZPは多様性指数およびFirmicutesとBacteroidetesの門の比率を高め、脂肪酸の分解と酸化を促進し、脂質の蓄積を減少させることが示された。

図9
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図 9. NC、HFD、XZP-L群における糞便微生物叢のバイオインフォマティクスパスウェイを解析した。HFD群経由では**p < 0.01、NC群経由では#p < 0.05、#p < 0.01であった。

図10
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図10 （A）微生物叢の属と肝臓の濃縮代謝物の関係を表したヒートマップ（B）微生物叢の属と肝臓の脂質、肝機能、抗酸化ストレス、抗炎症指標などの表現型との関係を表したヒートマップである。相関関係は、Spearman相関検定主体によって決定されている。凡例は相関係数の値を示し、赤は正の相関、青は負の相関を表す。**p＜0.01、*p＜0.05である。(C) 脂質と腸内細菌叢の間で共有または独自の脂質シグナル伝達経路を示すベン図。

3.5 XZPによる高脂血症ハムスターの腸-肝臓軸の制御
糞便中の微生物と糞便中の代謝物との強い関連性を確認するために、相関分析により、有意に多い属と代謝物との関連性を調べた。一般に、Lachnospiraceae NK4A136 group, Ruminiclostridium 9, GCA-900066575, Alloprevotella, Lachnospiraceae UCG-006, Tyzzerellaとtaurocholic acid, 5b-cyprinol sulfate, lithocholic acid glycine conjugate, PC(16: 0/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)), PE(16:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)); 一方、上記の微生物相とLysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z, 16Z), 25-hydroxycholesterol, deoxycholic acid, LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)) の間に強い正の関連が見られた。）また、Lactobacillusは、Ruminococcaceae UCG-014と25-hydroxycholesterol, deoxycholic acid, LysoPC(20.)との間に強い負の関連が観察された。 4(5Z,8Z,11Z, 14Z))、一方、上記微生物相とタウロコール酸、5b-シプリノール硫酸、リトコール酸グリシン結合物、PC(16：0/22：5（7Z,10Z,13Z,16Z、19Z）)、PE（16：0/22：6（4Z,7Z,10Z,13Z,16Z、19Z））間に強い陽性関連が認められた（図10A).

次に、微生物叢の属と肝臓の表現型指標との関係を検証した。一般に、Bacteroides、Lachnospiraceae NK4A136グループ、Ruminiclostridium 9、GCA-900066575、Plevotellaceae UCG-001、Roseburia [Eubacterium] ruminantiumグループ、Lachnospiraceae UCG-006, UBA 1819, Tyzzerella, Harryflintiaと肝TC、TG、GOT、GGT、ALP、MDAおよびGSHなどの肝表現型には強い正の関連性が確認された (Figure 10B).

本研究では、脂質代謝と腸内細菌叢は、スフィンゴ脂質代謝、不飽和脂肪酸の生合成、グリセロリン脂質代謝、ステロイドホルモン生合成、ペントースおよびグルクロン酸相互変換の5つのシグナル経路を共有していた（図10C）。腸内細菌は、脂質代謝と関連性の高い酸化的リン酸化、グルタチオン代謝、パントテン酸およびCoA生合成、PPARシグナル伝達経路、ペルオキシソームに関与していた。相関分析の結果、XZP は腸内細菌叢に影響を与えることで、肝臓の脂質および抗酸化ストレス物質の発現を調節していることが示されたが、その関係は説明しがたい。

4 考察
本研究では、高脂肪食を 3 週間摂取させることにより高脂血症モデルを構築した。その結果、XZPはハムスターの血清および肝臓のTC、TGおよびLDL-Cを減少させ、肝臓のHDL-Cを増加させることが明らかとなった。XZPは肝臓の脂質の蓄積を緩和した。XZPは血清および肝臓中のGGTおよびGOTを減少させたが、高脂肪食を与えたハムスターの肝臓組織には明らかな病理学的損傷は検出されなかった。この結果は、高脂肪食による誘導期間が7週間と短く、肝細胞の障害を伴わない脂質の肝臓への蓄積のみであったためと考えられる。特に、XZP は高脂肪食で誘導されたハムスターの血清および肝臓の SOD、血清の GSH を増加させた。XZP は肝臓の CYP7A1 の発現を増加させ、胆汁酸の生合成速度を促進した (Zhang et al., 2022)。そこで、XZPの脂質低下作用は、その抗酸化ストレスと密接に関係しているのではないかと推測し、脂質代謝と腸内細菌叢からその関係を見出そうとした。

その結果、XZPは血清、肝臓、糞便中のα-リノレン酸とリノール酸の代謝を調節し、血清中のα-リノレン酸とリノール酸、肝臓中のα-リノレン酸と8，11，14-エイコサトリエン酸、糞便中のα-リノレン酸とドコサヘキサエノールはいずれもα-リノレン酸やリノール酸代謝に関与していることを見出した。したがって、α-リノレン酸がα-リノレン酸とリノール酸の代謝の中心であることがわかった。我々の実験結果は、XZP-Lが高脂肪食を与えたハムスターの血清、肝臓、糞中のαリノレン酸レベルを有意に増加させたことを示している。研究者らは、α-リノレン酸が体組成、肝臓重量、グルコースホメオスタシス、肝コレステロール値、代謝性内毒素血症と全身性炎症、白色脂肪組織ホメオスタシス、肝臓ホメオスタシス、腸内ホメオスタシスに及ぼす影響を系統的に検討した。および高脂肪食マウスの腸内細菌叢を調べたところ、a-リノレン酸投与により高脂肪食マウスの宿主代謝表現型および腸内細菌叢が有意に改善し、腸内細菌叢の改善と代謝表現型との間に相関があることが判明しました（Goncalves et al. , 2018; Gao et al., 2020）。α-リノレン酸は、HFDマウスの肝臓組織において、ミトコンドリア生合成の促進、ミトコンドリア脂肪酸酸化能の向上、ミトコンドリア動態の改善、ミトコンドリア膜電位の回復、ROS産生の減少を有意に示した（Han et al.、2021年）。α-リノレン酸は、HFDと比較して、ACOX1関連タンパク質の発現をさらに増加させ、PPARα誘導タンパク質を抑制した（Liput et al, 2021; O'Reilly et al., 2020）。

胆汁酸代謝は、肝臓、血清、糞便の代謝に富む脂質代謝経路である。高脂肪食は高脂血症を引き起こし、胆汁酸代謝と腸内細菌叢の障害を悪化させた（Duanら、2021）。血清代謝では、コール酸は胆汁酸代謝の調節に関与していた。肝臓代謝では、タウロコール酸、グリココール酸、デオキシコール酸、リトコール酸グリシン抱合体、3a、7a-ジヒドロキシ-5b-コレスタン-26-aL、7α、24-ジヒドロキシ-4-コレスタン-3-ONの6つのバイオマーカーが胆汁酸代謝の調節に関与していました。糞便代謝では、コレステロール、24-ヒドロキシコレステロール、3a,7a,12a-トリヒドロキシ-5b-コレスタン-26-aL、3β-ヒドロキシ-5-コレステネートおよび7α-ヒドロキシ-3-オキソ-4-コレステネートの5つのバイオマーカーが胆汁酸代謝の調節に関与することが示された。したがって、XZPは高脂肪食ハムスターの糞便および肝臓の胆汁酸代謝を調節することがわかったが、血清では明らかでなかった。高脂肪食はParabacteroides属、Bacteroides属、Flavobacterium属を含む腸内細菌叢組成にはるかに大きな影響を与え、腸管透過性を高め、胆汁酸恒常性を破壊した（Carbajo-Pescador et al, 2019; Rohr et al, 2020）。

アラキドン酸代謝は、血清と糞便代謝に濃縮され、肝臓代謝には見られなかった。糞便中の11,12-DiHETrE、血清中のProstaglandin E2、5,6-DHET、20-hydroxyeicosatetraenoic acidはアラキドン酸代謝の調節に関与していた。したがって、アラキドン酸の代謝経路が糞便代謝において最も重要であることがわかった。脂肪酸の一種であるアラキドン酸は、余分な脂肪の沈着に関係する炎症性バイオマーカーに属します。研究によると、HFDは炎症性酵素の発現を増加させ、脂質過酸化産物の含有量を上昇させ、酸化系の障害を引き起こすことがわかった（Sztolsztenerら、2020年）。腹腔内グルコース注入により、視床下部のリン脂質、特にアラキドン酸含有リン脂質の分布と量に変化が生じ、その後代謝されてプロスタグランジンが生成され、HFD中に同じ経路を継続的に活性化させてプロスタグランジンを生成すると、グルコース代謝が悪化するという研究結果です（Zhuang et al.、2017； Lee et al., 2021）。アラキドン酸は、TLR4-NF-κB経路を介した炎症の増幅とともにNAFLDを悪化させる一方で、抗炎症および酪酸産生微生物叢の救済、GPR41およびGPR109Aのアップレギュレーション、女性の視床下部炎症の制御を介して肥満関連障害を緩和させた（Zhuang et al.、2017）。ファルネソイドX受容体（FXR）は、高脂肪食とNF-kBシグナルによって誘導されたマウスの肝臓におけるアラキドン酸代謝を活性化した（Gai et al.、2018）。

高脂肪食の長期摂食は、腸内細菌叢を変化させ、腸管バリア機能障害を誘発し、その結果、血糖恒常性の乱れに寄与する慢性炎症を促進する可能性があることが研究で示されている（Heら、2020年；Ahrensら、2021年；Chengら、2021年）。XZPの構成薬の一つであるGPは、腸内のFirmicutes/Bacteroidetes比を低下させ（Li S. et al., 2022）、Lactococcus属の存在量を高め、Ruminococcus属の存在量を抑制する（Shen et al., 2020）。本研究では、XZP-L が高脂肪食によって誘導される腸内細菌叢を効果的に制御し、高脂肪食群と区別することを明らかにした。Akkermansia muciniphilaは、HFD誘発動物において、非エステル化脂肪酸およびエネルギー代謝を低減し（Anhêら、2019；Liaoら、2022）、グルコース恒常性を改善し（Yoonら、2021）、血清TGを減らし、腸の恒常性を維持した（Kimら、2020）。さらに、Akkermansia muciniphilaとその誘導体は、HFD/CCL4誘発マウスモデルの肝損傷において抗炎症性を示した（Raftarら、2022年）。我々の研究では、XZP-L は高脂肪食によって誘導されたハムスターの糞便中の Akkermansia の相対存在量を増加させることがわかった。炎症指数が高い被験者ではプレボテラがより多く存在した（Aranaz et al., 2021）。Prevotellaceae UCG-004 は酪酸の生産を増加させ、アスコルビン酸代謝とアルダル酸代謝を有意にアップレギュレートし、それによって胡羊の抗酸化特性を改善した (Li C. et al., 2022)。我々の研究では、XZP は高脂肪食によって誘導されたハムスターの糞中の Prevotellaceae UCG-001 属の相対存在量を増加させた。

臨床研究では、Ruminococcaceaeの相対存在量と多様化の豊かさがTCおよびTGと高い相関があることが示されました（Weaverら、2018年）。我々は、肝臓の脂質代謝と強い相関を示す8つの属を発見しました。ほとんどの炎症性腸疾患患者のRuminococcaceaeは豊富である（Wang et al, 2021）。本研究では、Ruminiclostridium 5、Ruminiclostridium 9、Ruminococcaceae UCG-010はHFDでNCより有意に増加し、Ruminococcaceae UCG-014は有意に減少し、XZPはRuminococcaceaeの腸内細菌叢構成を制御していた。また、肝臓の表現型指標と強い相関を示す14属を見出した。腸内細菌叢は、食事性多価不飽和脂肪酸を代謝することにより、肥満に対する宿主抵抗性を付与する（Yuら、2019b；Miyamotoら、2019）。しかし、細菌叢と脂質代謝の因果関係を判断することはできない。

結論として、我々の研究は、XZPが高脂肪食ハムスターの血中脂質と肝臓脂質を減らし、肝機能、抗炎症、抗酸化を保護することを確認しました。XZPは、HFDハムスターの血清および肝臓の脂質代謝（αリノレン酸およびリノール酸代謝、胆汁酸生合成、アラキドン酸代謝など）を有意に調節した。XZPは、高脂肪誘導ハムスターの顔面におけるFirmicutesとBacteroidesの比率を低下させ、腸内細菌叢を再構築した。肝臓の脂質代謝と強い相関を示す属が8種、肝臓の表現型指標と強い相関を示す属が14種存在した。XZPによって制御された腸内細菌叢は、グルタミン酸代謝、ペルオキシソーム、PPARシグナル伝達経路、パントテン酸およびCoA生合成などの脂質代謝および酸化ストレスシグナル伝達経路に関与していた（図11）。

図11
www.frontiersin.org
図11. XZPは、高脂血症ハムスターの肝臓および血清中の脂質レベルを低下させた。XZPは、高脂血症ハムスターの軽度肝損傷、酸化ストレスおよび炎症を緩和した。XZPによる肝臓、血清および糞の脂質代謝制御は、腸内細菌叢に関連している可能性がある。

データ利用について
本研究で発表されたデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができる。リポジトリ名とアクセッション番号は、論文/補足資料に記載されている。

倫理に関する記述
この動物実験は、北京中医薬大学中医薬学院の審査を受け、承認された。

著者の貢献
LWは研究の計画、実験の実施、論文の執筆を行った。ZZは病理学的な議論に協力し、原稿を編集した。GLとYWは原稿の確認と編集を行った。KDはデータ解析に参加した。XGはプロジェクト全体を監督し、原稿に目を通した。最終原稿は著者全員が読み、承認し、出版した。

資金提供
本研究は、北京中医薬大学基金会（助成番号：BUCM-2020-JS-KF-040）の助成を受けて実施したものである。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2023.1147910/full#supplementary-material でオンライン公開されています。

略語
ACOX1, acetyl CoA carboxylase 1; AKP, alkaline phosphatase; Cer, ceramide; CRP, C-reactive protein; CYP7A1, cholesterol 7-α hydroxylase; FRR, Fructus Rosa Roxburghii; GGT, gamma glutamyl transferase; GOT, glutamic oxaloacetic transaminase.FRT, GYR, GYR, GT, GT。GP, Gynostemma pentaphyllum; GPT, glutamic pyruvic transaminase; GSH, glutathione; Hawthorn, Crataegus pinnatifida Bge; HDL-C, high density liptein cholesterol; HFD, high-fat diet; LDL-C, low density Lipoprotein.の略。LPS、リゾホスファチジルセリン；LysoPC、リゾホスファチジルコリン；MDA、マロンジアルデヒド；MetPA、メタボロームパスウェイ解析；OPLS-DA、直交部分最小二乗判別分析；PC、ホスファチジルコリン。PE, phosphatidylethanolamine; PPARα, peroxisome proliferators-activated receptors a; SM, sphingomyelin; SOD, superoxide dismutase; TC, total cholesterol; TG, triglyceride; VIP, variable importance; XZP, Xuezhiping capsule.All Rights Reserved.参照。

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このため、このような場合にも、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」。Gynostemma pentaphyllum多糖類は、腸内細菌叢とTLR2/NLRP3経路に関連するマウスの非アルコール性脂肪肝炎を改善する。Front. Endocrinol. (ローザンヌ）。13, 885039.

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キーワード：メタボローム、マイクロバイオーム、高脂血症、肝臓、脂質代謝、雪国まいたけ

引用元 Wang L, Zhang Z, Luo G, Wang Y, Du K and Gao X (2023) Metabolome combined with gut microbiome reveal the lipid-lowering mechanism of Xuezhiping capsule on hyperlipidemic hamster induced by high fat diet. Front. Mol. Biosci. 10:1147910.論文番号: 10.3389/fmolb.2023.1147910

Received: 2023年1月19日; Accepted: 2023年2月8日発行。
公開：2023年2月20日

編集者

エニス・コスタラリ、メイヨークリニック、米国
査読者：Wen-Sen He, Jiangsu University, 米国

Wen-Sen He, Jiangsu University, China（中国
Weijian Bei, Guangdong Metabolic Disease Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine, China（広東省中西医学統合代謝疾患研究センター、中国
Copyright © 2023 Wang, Zhang, Luo, Wang, Du and Gao. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*Correspondence: Xiaoyan Gao, gaoxiaoyan@bucm.edu.cn

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