クレブシエラ菌ファージにおける宿主向性遺伝子の決定要因

2023年2月8日 21:04

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)00059-1#.Y-Ib-0OlUiI.twitter

ベアトリス・ビームド
ネリス・ガルシア-ゴンサレス
マー・ゴメス＝オルテガ
フェルナンド・ゴンサレス-キャンデラス
ピラール・ドミンゴ＝カラプ
ラファエル・サンジュアン 3

脚注を表示するオープンアクセス公開日：2023年02月06日DOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112048
PlumX メトリクス

ハイライト

クレブシエラ菌の莢膜の多様性が、ほとんどのクレブシエラ菌ファージの宿主範囲を限定している

ファージにコードされたデポリメラーゼのドメインから、莢膜の向性を予測することができる

莢膜耐性予測は吸着後抵抗性機構により制限される。

カプセル依存性とデポリメラーゼを欠くファージは、より広い宿主範囲を示す
まとめ
バクテリオファージは細菌の生態や進化に重要な役割を果たすとともに、抗菌薬としての可能性も秘めている。しかし、ファージ宿主特異性の決定要因は不明であった。本研究では，46種類のファージを分離し，日和見感染の代表的な病原体であるKlebsiella pneumoniaeの臨床分離株138株に対し，ファージによる宿主特異性の検討を行った。スポットテストでは、ほとんどのファージの宿主範囲は狭く、テストした6,319のファージと宿主の組み合わせのうち検出可能な相互作用は2％未満であった。細菌カプセルの多様性が、ファージの宿主範囲を制限する主な要因である。その結果、ファージにコードされたデポリメラーゼは宿主の向性を決定する重要な因子であり、デポリメラーゼの配列タイプはファージファミリー間で特定のカプセルタイプに感染する能力と関連していることが明らかになった。しかし、より広い宿主範囲を持つすべてのファージは、標準的なデポリメラーゼをコードしておらず、別の侵入様式があることが示唆された。これらの知見は、細菌とそのウイルスの複雑な相互作用に関する知識を広げるとともに、細菌とファージのゲノム配列を用いたファージ感染の最初のステップを予測することの実現可能性を指摘するものである。
図解要旨

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キーワード
バクテリオファージ
クレブシエラ
宿主範囲
細菌カプセル
デポリメラーゼ
微生物進化
遺伝子水平伝播
ゲノミクス
研究テーマ（複数可）
CP：微生物学
はじめに
バクテリオファージは非常に豊富で多様な生物学的実体であり、そのため生態系の重要なアクターである。1 しかし、ほとんどの研究が少数のウイルス-宿主ペアに焦点を当てているか、系統的な全ゲノムアプローチに従っていないため、ファージ-細菌相互作用を支配するメカニズムはよく分かっていない2,3 高処理シーケンスとメタゲノム研究の進歩は、ゲノム署名によってファージと宿主を結びつけることを可能にした4,5 非常に便利ではあるものの、これらの方法ではファージ-細菌相互作用に関する個別の情報を得られない。このように、ファージと細菌の相互作用をより深く理解するためには、目的の菌株を用いたファージの単離6,7,8とゲノムスクリーニング9がこれらの研究を補完することが可能です。
ファージの宿主範囲の決定要因は複雑です。一般的に、ファージは特定の細菌種の一部の株にのみ感染します。10 しかし、一部のファージは異なる細菌種8,11、あるいは異なる属に感染します。14,15,13 利用できるツールは、科や属のレベルでは中程度の精度でファージの宿主範囲を予測できますが、分類学上の低いランクでは性能が低下しています14,15,16。細菌は、表面受容体の改変から、規則的空白短回線反復（CRISPR）、制限修飾（RM）システム、不成功感染システム、プロファージ超免疫など、絶えず拡大する免疫システムまで、ファージ感染を制限できるさまざまなメカニズムを展開し、ファージ-宿主相互作用の理解を複雑にしています17,18。
細菌カプセルは、受容体を覆い隠すことで細菌を感染から守ったり19、ファージの付着に利用されることから、ファージトロピズムの主要な決定要因となっている。21 多細胞生物の免疫システムから細胞を守るカプセルは、重要な病原性因子である22。23,24 ほとんどのファージは1つか2つのDposを持ち、その結果、1つまたはいくつかの交差反応性莢膜タイプに感染する。26,27 しかし、結合と解重合がファージ感染の成功を決定する仕組みはよく分かっていない。28,29
K. pneumoniaeは、77の血清型と180以上の莢膜遺伝子型（CLT）がこれまでに報告されており、また他のファージ防御機構のレパートリーも豊富である31ことから、ファージ感染における細菌カプセルの役割を研究する上で優れたモデルとなっています32。多剤耐性株の出現により治療法が限られていることから、K. pneumoniaeは現在進行中のファージ療法の主要な研究対象です。33,34,35 Klebsiellaファージの多くは少数のCLTに感染しますが、ファージDpo配列との関連性は依然として不明20,36、または少数のファージに限定されます37,38。さらに、Dposを持たないファージも報告されていますが、宿主範囲を決定する要因はいまだ解明されていません20,35,40。
本研究では、ファージの宿主範囲と感染経路を決定する要因として、細菌とファージの遺伝的形質の相対的重要性を調べるために、配列決定された臨床K. pneumoniae株（n = 138）および多様な環境ファージ（n = 46）の包括的コレクションを使用しました。すべてのファージ-細菌ペアをスポットテストで検査し、殺菌、子孫生成、カプセル解重合、吸着アッセイで陽性結果を確認した。
結果
分離されたKlebsiellaファージの宿主指向性
バレンシア（スペイン）の下水処理場付近の水および土壌試料を用いて、36種類のK. pneumoniae臨床株から70株のプラークを分離した。ファージの増幅、精製、塩基配列を決定し、46種類の異なるゲノムを得た（図S1；表S1）。ファージはペアワイズゲノム間類似度（IGS≥45%）により13のグループ（A1-A3, P4, M5, S6, D7, S8-S11, M12, S13）に分類された。各ウイルスには、関連するウイルスファミリーの最初の文字、系統群の番号、および各種を識別するための文字（IGS≥95%）を付けて命名した（図1）。すべてのファージはインテグラーゼを欠いていたが、いくつかのファージは転写抑制因子やparAB遺伝子などのリソジェニックマーカー遺伝子を持っていた（図1; 表S1）。透過型電子顕微鏡で観察したところ、各グループの代表的なファージの形態は異なっていた（図S2）。ファージの分類を決定するために、データベースから少なくとも30%のカバー率と70%の平均塩基同一性（ANI）を示す478のファージゲノムを検索した。IGS値から、46のファージはCaudoviralesの5科（Autographiviridae, Drexlerviridae, Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae）と様々な属（Drulisvirus, Przondovirus, Webervirus, Gamaleyavirus, Mydovirus, Yonseivirus, Jedunavirus and Rouf virus; Figure 1; Table S1）を代表していると言えるでしょう。これらのファージは、これまでに報告されているKlebsiellaファージのほとんどのファミリーおよびサブファミリーを包含していた（図S3）。1つのファージを除くすべてのファージは、利用可能な配列とのIGSが95%未満であり、未知の種であることが示唆された。また、8つのファージは未分類のファージと関連しており、3つのサブファミリーと5つの属が示唆された（表S1；図S4）。
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図1分離されたKlebsiellaファージの多様性
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分離されたファージの宿主範囲を調べるために、バレンシア地方から分離されたK. pneumoniaeのうち、59種類のCLT、14種類のO遺伝子型（OLT）、76種類の配列型（ST；表S2）の配列決定済み138株を選択しました。そのうち、16株は最初のファージ単離に使用し、コレクションに含まれない20株を追加した（Table S2）。138株は、抗生物質感受性、プロファージの存在、CRISPR-CasやRMシステムなどの抗ファージ防御の点で多様であった（図S5）。得られたコレクションは、K. pneumoniaeの主要なクローン群との比較で示されるように、種全体の多様性を表していた（図S6）。
宿主向性については、46×138＝6,348組（サンプリングバイアスを避けるため、最初のファージ分離に用いたファージと細菌の組み合わせを除いた6,319組）のファージと細菌について、3重のスポットテストを実施しました。このことから、Klebsiellaファージが感染できる宿主株は平均して2%未満であることが示唆された（図2；表S3）。宿主の幅は138株中0～19株（分離株を除く）で、2つの明確なパターンがあった。ほとんどのファージ（42/46）が1株または数株に感染したが（中央値：1、平均：1.79、1～3 CLT）、グループ8と9の4つのファージ（S8/S9ファージ）はより広い宿主範囲を示した（中央値：11.5、平均：12.25、4～16 CLT, Figure 2; Table S3).
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図2 分離したKlebsiellaファージの宿主トロピズム
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細菌の莢膜型に基づくファージ-宿主間相互作用の予測可能性
宿主指向性の決定要因を調べるために、まずS8/S9以外の42のファージに注目しました。そして、どのような宿主の特徴がファージによるスポット形成を予測するか（真陽性率[TPR]）を評価した。各特徴について、無作為に参照宿主とファージのスポット結果をサンプリングし、この情報をもとに、同じ特徴を持つ他の細菌株をファージがスポットする能力を予測した。その結果、CLTがトロピズムを最もよく予測する宿主形質であることがわかった。具体的には、ある菌株にスポットしたファージは、同じCLTの他の菌株にも92%の確率でスポットした（非S8/S9ファージではTPR = 0.92 ± 0.001; Figure 3A ）。STはCLTと相関があるものの（CramérのV = 0.9）、宿主のトロピズムの良い予測因子であった（TPR = 0.60 ± 0.01）．一方、OLTおよびファージレセプターと推定される45の追加タンパク質は、宿主のトロピズムとの関連性が低かった（TPR = 0.04-0.09）。このことから、Klebsiellaファージでは菌体カプセルが宿主の向性を決定する主要な要因であることが確認されました。
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図3細菌カプセルの種類に基づくファージ-宿主間相互作用の予測可能性
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莢膜細菌に感染するファージは、その受容体結合タンパク質（RBP）にDpoドメインを持ち、莢膜多糖を特異的に消化して細胞表面にアクセスすることができる。23,24 我々はS8/S9以外のファージ42ゲノムのうち38ゲノムに推定Dposを持つRBPを見いだした。これらは、テールタンパク質と同じオープンリーディングフレーム（ORF）に存在することから、テールスパイクタンパク質（TSP）と呼ばれるようになった。プラークは通常Dpo活性の指標であるハローに囲まれていた（表S1）ので、これらのTSPのほとんどは機能しているはずである。これを裏付けるように、カプセル多糖レベルの定量は、ハローを産生するファージを接種した14/14細菌株で非接種対照に比べ強い減少（t検定：p < 0.001）を示した（図3B）。ファージゲノムにTSPが検出されないことはよくあることである20,33。例えば、TSPが検出されない4つの非S8/S9ファージのうち3つは、ハローとカプセルに対する有意な活性を示し、Dpo活性を示唆していた(図3B)。しかし、20のファージにおいて、コードされたTSPの数は感受性CLTの数よりも多く（表S1）、一部のTSPが不活性であるか、この研究に含まれないCLTに対する作用の特異性が示唆された。
一部のTSPの不活性化は、酵素ドメインが切り捨てられたり、ファージ粒子に組み込まれなかったりした結果である可能性がある。その結果、13のポドウィルスが2つのTSPを持つことが判明した。そのうち6つは、1つ目のTSPが切断されていたため、Dpoドメインしか持っていなかった（図3C）。さらに、ファージA1lとA1qには構造ドメインを持たない2つのDpoが見つかり、これらは可溶性酵素である可能性が示唆された（図S7A）。興味深いことに、いくつかのポドウィルスはアドヘシン（n = 3）とアセチルキシランエステラーゼ（n = 2）をコードしており、これも宿主認識に関与している41,42。
すべてのシホウイルスは、Dpoドメインを持つ1つのTSPを示した（図3C）。例外として、KlebsiellaファージD7aはエステラーゼドメインを示したが、これはプラークハローがないことと一致する（表S1）。
最後に、2つのミオウイルスは、その大きなゲノム（100 kb以上）から予想されるように、より複雑なTSP構造を示した24。TSPに典型的な構造ドメインをいくつか検出したにもかかわらず、ファージM5aは2つのDposを示し、ファージM5bは1つだけだった（表S1；図S7A）。
まとめると、5つの非S8/S9ファージはDposが検出されず、28のファージは1つ、8つのファージは2つのドメインをコードし、ファージA1qは3つをコードしていた（図3C）。この結果、Dposの数が感受性CLTと同数のファージが27個、Dposの数が感受性CLTより少ないファージが9個、Dposの数がCLTより多いファージが6個となった。
受容体結合ドメインの配列解析に基づくファージの莢膜型トロピズムの予測
細菌の莢膜型はゲノム配列から知ることができるが22、現在のところ、ファージの莢膜トロピズムを同様に予測することは不可能である。そこで、我々はまず、文献にある64種類のKlebsiellaファージを追加してデータセットを拡張し、トロピズムが判明しているファージを追加しました。そして、Dposを持つTSPの中央とC末端の領域に注目し、これを受容体結合ドメイン（RBD）と呼ぶことにした。文献上のファージから切り取られたTSPが含まれるのを避けるため、少なくとも500aaを持つものだけを保持した。S8/S9以外の42種類のファージから46個のRBDを抽出し、さらにKlebsiellaファージから117個のRBDを抽出した。163のRBDは、少なくとも2つのRBDが40%以上の配列カバー率と50%以上のアミノ酸同一性を持つ35のクラスターにグループ化された(表S4)。その結果、RBDクラスターはファージトロピズムに対して平均58.1%±4%のTPRを持つことがわかりました（図4A , 左パネル）。驚くべきことに、これらの値はファージの系統的マーカーのTRPを上回りました。例えば、任意のファージ-CLTペアについて、同じ系統群の他のファージが同じ細菌莢膜型に感染する確率は18%に過ぎなかった（図4A、左パネル）。RBDに基づくCLTトロピズム予測の精度はまちまちで、14のRBDクラスターは莢膜トロピズムと完全な関連を示した（TPR = 100%）のに対し、9は関連を示さなかった（<10%；図4A、右図）。これは、（1）多くのファージが複数のDposを持ち、そのうちのいくつかは複数の莢膜型に対して交差反応を示す可能性があること、（2）既存のすべての莢膜型を実験的に検証することができないことを考慮した結果である。これらの制限にもかかわらず、我々は、少なくとも3分の2の配列が同じCLTにスポットするファージに属するRBD配列のクラスターとして定義される、コンセンサス莢膜トロピズムを持つ25のRBDクラスターを発見した。これらの25のクラスターは65のファージの79のRBDからなり、19の異なるCLTをカバーしていた。RBDクラスターは、同じ系統群（69.1%）だけでなく、異なる属や科（22.7%）のファージも含んでおり、大きな進化スケールでRBDの水平的遺伝子伝達が行われていることが示されました（図4B）。
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図4RBDに基づくファージ莢膜の向性予測
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プロファージ配列を用いたRBD依存的なファージトロピズムの検証
RBDクラスタリングの予測力をさらに分析するために、莢膜向性にコンセンサスを示す25のRBDクラスタから代表的な配列を抽出した（図4B）。次に、RBD配列のある細菌ゲノムのRefSeqデータベースを検索し、これらのモチーフを持つプロファージを探した。宿主細菌のCLT配列を検索し、莢膜表現型を推測することで、対応するプロファージの莢膜トロピズムを予測した43。そして、この予測をRBDクラスターのコンセンサスCLTと比較した。24のRBDクラスターのうち18クラスター（79%）について十分な予測（>30）を行い、15の異なるCLT（KL2/13、KL3、KL22/37、KL23、KL25、KL30、KL35、KL47、KL57、KL63、KL64、KL102、KL106、KL126およびKL140）を包含していることが確認された。残りのクラスタについては、確信的なCLTで十分なヒットが得られず、これらのRBDは型付き菌のプロファージでは稀であることが示された。全体として、我々は3,824のRefSeq細菌ゲノムに分布する約10,000の予測を行った。18のRBDクラスターは、CLTトロピズムに対する平均予測力が35%であったが、この値はクラスターによって0%から100%と大きなばらつきがあった。13クラスタ（72%）で統計的に有意な莢膜向性予測を確認した。また、4つのRBD-CLT関連（KL2/13、KL30、KL57、KL63；図5A）については、98%を超える予測率が得られています。興味深いことに、Klebsiella属以外でも正確な予測（>99%）を得ることができた（例：Escherichia/Shigella、CLTs KL2/13、KL30、KL35、KL47、KL57、KL63に対して；それぞれ4/4、90/91、6/6、43/43、80/81、23/23正しい予測を得ることができた）。また、広い範囲のRBD IDで正確な予測が行われました（図5B）。
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図5プロファージ配列を用いたRBDベースの莢膜トロピズム予測の検証
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プロファージに基づく予測CLTがクラスタ解析のコンセンサスCLTと有意な関連を示さなかった5つのRBDについて、この失敗を説明する要因は何か、ヒット数の分布を分析した。まず、RBD1_KL22/37では、ほとんどのヒット（56.36%）がKL22/37ではなくKL25に割り当てられていることがわかった。興味深いことに、両CLT間のカプセル組換えは以前に確認されている44。第二に、RBD8_KL102については、予測の55%がKL38からの細菌を指していることがわかった。この場合、RBD_KL102の代表配列は、KL38に感染するファージφKp34のDpoと35%のアミノ酸同一性と84%のクエリーカバレッジを示し45、両CLTへの感染能力の交差反応性や進化的関連性が示唆されました。次に、KL23に感染するファージでは、クラスタRB64とRBD65がともに存在したが、KL23由来の細菌ではRBD65と同一性を有するプロファージのみが検出され、後者が活性型Dpoであることが示唆された。RBD83_KL140でも同様の状況が観察された。最後に、RBD87クラスターについては、プロファージに基づいて予測されたCLTはKL126ではなくKL14（72%）であったが、これら2つのCLTの関連性は不明である。
生産的な感染は、ファージスポットテストよりも予測しにくい
スポットテストは宿主のトロピズムを調べるための迅速な方法を提供するが、生産的な感染は明らかにならない。38,46 この問題に対処するため、124の陽性スポットテストのそれぞれについて、液体培養での光学密度を測定してファージの毒性を判断した。その結果、124の試験法のうち94の試験法において、非接種対照と比較して宿主密度の有意な減少を検出した（76％）。30組の陰性ペアのうち、5組は子孫アッセイで生産的な溶菌感染の証拠が得られたので、これも病原性と分類した。次に、液体培養で強毒性を示したファージ-宿主ペア6,319組のうち99組（1.6%）を対象に宿主向性について再検討した（Table S3）。宿主の幅は138株中0〜17株であった。S8/S9以外のファージ42株は1株または数株に限定されていたが（中央値：1、平均値：1.33）、S8-S9ファージはより広い範囲に及んでいた（中央値：10.5、平均値：10.75）。宿主のCLTは再び強毒性感染を最もよく予測する単一因子であったが，スポットテストよりもかなり低いTPR（非S8/S9ファージで0.53 ± 0.01）であった（図6A ）。
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図6宿主のトロピズムを決定する非デポリマーゼ決定因子
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したがって、スポットテストは生産的感染テストよりもカプセル依存性をよく反映しているように思われた。このことをよりよく理解するために、ファージが他の株で強毒性感染を起こしたにもかかわらず、強毒性感染を起こさなかった25のファージ-宿主の組み合わせに注目した（図6B）。予想通り、非S8/S9ファージがスポットを生成した13/13のファージ-宿主組み合わせにおいて、非病原性であるにもかかわらず、カプセル消化が誘導され（t test: p ≤ 0.06; Figure 6B）、ファージによる解重合およびカプセル依存性向性を評価するスポットテストの信頼性を示すことができた。興味深いことに、テストした16/25の組み合わせで吸着成功を確認し、そのうち14/19に非S8/S9ファージが含まれていた(図6B)。多くの場合、吸着率は100%に近く、機能的な受容体が存在することが強く示唆された。
ファージが効率的に吸着するにもかかわらずアビルーレンスを示す原因を調べるため、既知の抗ファージシステムが存在するゲノムを検索した。その結果、CRISPRスペーサーや、吸着したファージと有意な同一性を持つ常在プロファージは見つからず、これらの免疫の関与はないことが示唆された。より系統的な解析を行うために、各ファージについて、異なる株における既知の細菌防御システムの頻度を算出した。その結果，ファージと防御システムの組み合わせのうち，感受性株よりも耐性株で頻度が高い（differential probability of resistance [dPR] >0）ものを39個見出した．そのうち、14個は耐性菌にのみ存在した（dPR = 1；図6C）。全体として、BREX、RexAB、Druantia、Hachiman、dGTPaseの防御系は、ファージ間で耐性株との関連性が高いことがわかった（合計dPR≧1）。このことから，S8/S9以外のファージが莢膜を剥離して吸着したとしても，CLT解析による生産性感染予測能力がスポット感染予測能力を下回るのは，後吸着機構が寄与している可能性があることが示唆された．
広範なS8/S9ファージはCLT依存性が低く、Dpo非依存的な侵入を示す。
我々のデータセットでは、特定の株に感染した非S8/S9ファージは、同じCLTの他の株で92%の確率でスポットしていたが、ブロードレンジS8/S9ファージではこの関連性が低下した（TPR = 0.39 ± 0.01; Figure 3A）。したがって、S8/S9ファージのトロピズムはCLTによって弱く決定されることがわかった。また，S8/S9ファージはプラークのハローを生成しなかった（表S1）．このことは，S8/S9ファージが細菌のカプセルを貫通するために別のメカニズムを用いていることを示唆している．このことを確認するために、S8/S9ファージを含む36種類の宿主-ファージペアのDpo活性を実験的に解析した。他のファージが示す強い被膜多糖消化活性とは対照的に、S8ファージは低い解重合活性を示し、S9aファージは全く示さなかった（図3B）。しかし、一部の株ではカプセル分解活性を見出した。例えば、S8bファージはKL39-CU293株を解重合したが、KL39-CU616株ではDpo活性を示さなかった。興味深いことに、ファージS8cでは逆のパターンが見出された。このように、S8ファージのゲノムに見出されるいくつかのタンパク質は、糖質に対して活性を持つ可能性がある。
S8/S9の宿主認識機構を探るために、推定RBPを解析した。その結果、S8ファージは2つのRBPを、S9aファージは4つのRBPをコードしていることがわかった（表S5）。興味深いことに、S8aとS8bの第一RBPは1,500 aa以上（それぞれ2,309と3,201 aa）あり、ポリタンパク質を形成している可能性を示唆している47, 48。S8ファージの第一RBPには2-3の糖鎖結合モジュール（CBM）が、第二RBPにはエンドシアリダーゼのシャペロンドメインが認められた（図6D；Table S5）。しかし、触媒ドメインは見つからず、AlphaFold2でモデル化した場合、平行なβシートを持つDposの典型的な構造も見られなかった（図S7B）。ファージS9aの場合、2つのRBPのみが500aa以上を示し、他の2つは宿主認識活性を持たない可能性が示唆された。残りの2つのRBPについては、1つがSGNHハイドロラーゼ型エステラーゼドメインを示し、Dpo活性ではなくエンドリジン活性であることが示唆された49。
最後に，S8/S9ファージでは，CLTの生産性感染予測能力が向上した（spotting TPR: 0.39; productive infection TPR: 0.46; Figure 3A）。S8ファージと細菌の組み合わせのうち、陽性スポットを示したものの、液体中で生産的な感染が起こらなかったものは全部で6つあった（図6A）。これらのスポットは非常に濁っており、細菌細胞のサブセットでのファージ複製を示唆していると思われます50 (図6E)。そこで、S8/S9の濁ったスポットは、カプセル化細菌のサブセットまたは低カプセル化産生細菌におけるファージ複製の結果ではないかという仮説を立てました51。この可能性を調べるために、野生型カプセル化細菌、自然発症のカプセル化変異体（Cap-）、および両者の1:1混合物のファージスポットを比較しました。4/6の組み合わせで、寒天培地中のCap-変異体の濃度を上げると、S8ファージのスポットがより鮮明になることが観察された（図6E）。このことは、S8/S9ファージは宿主によっては、莢膜糖鎖結合に依存しない別の侵入様式を用いることを示唆している。
考察
ファージと細菌の相互作用は重要であるにもかかわらず、表現型と遺伝子型のデータが完全にリンクしている代表的な細菌とファージのコレクションが少ないため、その研究は制限されている3。ここでは、過去の研究よりも大きなファージ-宿主相互作用行列を用いてK. pneumoniaeとそのファージ間の相互作用を徹底的に分析した20, 33, 36。分析したファージの1つを除いて、すべて未知で異なるファミリーや分類学的に未登録のエンティティが含まれる52。特に、データベースの配列とのゲノム類似度がそれぞれ95％および70％未満であったことから、44の未知のファージ種および11のファージ属を発見した53。希釈曲線は、データベース内のファージ種および属の同定に飽和がないことを示している54。この結果と合わせて、ファージの多様性を明らかにするためにはより広範囲なサンプリングの実施が重要であることを示している7、8、11。
ファージと莢膜の密接な関係を考えると、宿主とファージのDpo配列のCLTに基づいてファージと細菌の相互作用を予測することは魅力的である。37,55 我々は、CLT特異性が重複する離れたファージ間で類似のDpoドメインを発見し、各CLTに対するDposのかなりの多様性を示唆した。また、ファージ間のテールスパイクドメインの効果的な交換は、実験室条件下26や具体的なファージで示されている27が、今回の結果は、自然界において、ウイルスファミリー間でもテールスパイクドメインの交換が頻繁に行われていることを示している。しかし、ファージの宿主範囲はファージ分類や形態型にほとんど依存しないことを示した最近の研究結果と一致している。機械学習アプローチ57,58と、尾部繊維の特異性領域を特定するための深い変異スキャン研究59を組み合わせることで、この目標を達成できる可能性があります。
Dpo RBD配列解析による莢膜トロピズムの予測能力を検証するために、プロファージのRBD配列とその宿主のCLTの外部データを使用した。温帯性ファージのDpo配列は、溶菌性ファージとの同一性が低いと考えられていましたが20、我々の解析では、両ライフスタイルの間でDpoドメインが広範囲に共有されていることが示唆されました。このことは、高い組換え率を説明することができ、他の遺伝子で観察されたように、温帯性ファージが流入する溶菌性ファージのDpoドメインの重要な供給源となる可能性を示唆している60。13のCLT（KL2、KL3、KL13、KL23、KL25、KL30、KL35、KL47、KL57、KL63、KL64、KL106およびKL140）に対して莢膜向性を予想した。これらは、K. pneumoniaeのグローバルデータセット（https://kleborate.erc.monash.edu/；2021年12月2日アクセス；n = 8,366配列）におけるCLTの豊富さの約1/3（n = 2,563配列）に相当する。プロファージのRBD配列を用いた莢膜トロピズムの予測には、いくつかの限界がある。第一に、プロファージ統合後に宿主がカプセルの交換を行う可能性があり44、ファージのRBD配列と観察された宿主のCLTとの間に誤った関連付けが生じる可能性があります。第二に、複数のRBDを含むプロファージでは、実際のRBD-CLTの関連付けが複雑になる可能性があります。第四に、カプセル結合、分解、吸着に成功しても、細胞内メカニズムがファージ感染をさらに制限する可能性があることを念頭に置く必要があります。ビブリオの近縁種で観察されたように、共通のカプセルタイプを持つ宿主コレクションを拡大使用することで、吸着後の防御機構を明らかにすることができるかもしれません61。
RBDと吸着前ファージ活性の関連性を確立することは、実験室での試験前にファージを選択するのに役立つため、ファージ療法への応用に役立つ可能性があります。しかし、その結果、カプセルを消化するものの、標的を溶解しないファージが選択される可能性があり、これは通常治療には望ましいことではありません。しかし、解重合活性は免疫系を助け、抗生物質感受性を高める可能性がある。62,63 最後に、RBD依存性の莢膜トロピズムを理解することは、他の特異性を持つ既成ファージを設計することに役立つ。Dposのモジュール構造はこれを可能にし、このアプローチはKlebsiellaファージで有効であることが示されている26。
S8/S9ファージの宿主特異性は、標準的なDpoドメインに依存しないようです。S8/S9ファージは、Dpoドメインに依存せず、糖鎖結合ドメインを複数持ち、グラム陽性菌に感染するファージで見られるように、長い尾を利用して二次受容体にアクセスすることができる64, 65。また、S8/S9ファージは、カプセルの薄い細胞表面の赤道部66や、カプセルの生産量が少ない細菌において、優先的にレセプターに出会う可能性も推測される40,67。
全体として、今回の結果は、K. pneumoniaeのような公衆衛生上重要なカプセル化宿主におけるファージ感染の最初のステップを予測することが可能であることを示唆している。さらに、自然界におけるファージと細菌の相互作用の理解と予測可能性を向上させ、ファージ応用のために、今回発表したデータと同様の相互作用を検証した包括的なデータセットが必要である。
研究の限界
ファージのカプセルに対する特異性を考慮すると、分離のために異なるカプセルタイプを使用することで、他の感受性の高いCLTが得られたかもしれない。もう一つの重要な限界は、各相互作用の強さを定量化するのではなく、主観的アッセイ（スポッティングカーブおよびキリングカーブ）に基づく定性的データを提示することである。これは、受容体に基づく吸着効率の違い、あるいは細胞内防御の役割がより顕著であることを示すかもしれない。我々は、ファージに対して吸着後抵抗性を持つ細菌のサブセットを検出したが、DNAの排出が起こったかどうかは検証していない。今後の課題として、カプセルの不均質な産生が影響する可能性のある広域ファージのトロピズムについても検討する必要がある。
STAR★Methods
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
バクテリアおよびウイルス株
ファージ株、表S1参照この作業 N/A
細菌株、表S2参照この作業 N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
ADNasa TURBO™ TermoFisher Scientific Cat#AM2238
Benzonase® Nuclease Sigma Cat#70664-3
Micrococcal nuclease New England Biolabs Cat#M0247S
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Fisher Scientific Cat#10259184
Zwittergent 3-10 Sigma Cat#693021
クエン酸一水和物 SIGMA Cat#C1909
四ホウ酸ナトリウム Sigma Cat#221732
3-ヒドロキシビフェニル Sigma Cat#262250
グルクロン酸 Sigma Cat#G5269
重要な市販アッセイ
Amicon Ultra-15 遠心分離フィルターユニット Sigma Cat#UFC910024
DNA Clean & Concentrator 5 キット Zymo Cat#D4004
Invitrogen Qubit dsDNA HS アッセイキット ThermoFisher Scientific Cat#Q32851
Illumina Nextera XT DNA キット Illumina Cat#FC-131-1096
MiSeq 試薬キット v2 Illumina Cat#MS-102-2002
寄託データ
Phage killing curves この研究； Mendeley Data https://doi.org/10.17632/c696dvvynf.2
文献からのデポリマーゼ配列データベース This work; Mendeley Data https://doi.org/10.17632/c696dvvynf.2
ファージレセプターの一覧表 This work; Mendeley Data https://doi.org/10.17632/c696dvvynf.2
Klebsiellaファージのレビュートロピズム This work; Mendeley Data https://doi.org/10.17632/c696dvvynf.2
AlphaFold2によるファージRBPのPDBファイル This work; Mendeley Data https://doi.org/10.17632/c696dvvynf.2
TPR計算のためのスクリプトこの仕事; Mendeley Data https://doi.org/10.17632/c696dvvynf.2
ソフトウェアとアルゴリズム
PRINSEQ Schmieder and Edwards69 https://prinseq.sourceforge.net/
Unicycler v0.4.7 Wick et al.70 https://github.com/rrwick/Unicycler
SPAdes v.3.14 Bankevich et al.71 https://github.com/ablab/spades
apc スクリプト N/A https://github.com/tseemann/apc/blob/master/apc.pl
MIRA4 N/A https://sourceforge.net/projects/mira-assembler/
FastANI Jain ら.72 https://github.com/ParBLiSS/FastANI
VIRIDIC Moraru et al.73 http://rhea.icbm.uni-oldenburg.de/VIRIDIC/
ape パッケージ Paradis and Schliep74 http://ape-package.ird.fr/
Prokka v1.14 Seemann75 https://github.com/tseemann/prokka
Prokaryotic Virus Remote Homologous Groups (PHROGS) Terzian et al.76 http://millardlab.org/2021/11/21/phage-annotation-with-phrogs/
genoplotR Guy et al.77 https://genoplotr.r-forge.r-project.org/
Blast+ NCBI ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+
inphared Cook et al.54 https://github.com/RyanCook94/inphared
bactaxR Carroll et al.78 https://github.com/lmc297/bactaxR
ViPTreeGen Nishimura et al.79 https://github.com/yosuken/ViPTreeGen
Kleborate Wyres et al.43 https://github.com/katholt/Kleborate
Snippy Seemann https://github.com/tseemann/snippy
trimAl Capella-Gutiérrez et al.80 http://trimal.cgenomics.org/
IQ-TREE2 Minh et al.81 https://github.com/iqtree/iqtree2
PhageBoost Sirén et al.82 https://github.com/ku-cbd/PhageBoost
CRISPRCasTyper Russel et al.83 https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/Home/Download
defense-finder Tesson et al.32 https://github.com/mdmparis/defense-finder
PIRATE Bayliss et al.84 https://github.com/SionBayliss/PIRATE
HMMER 3.1 Eddy85 http://hmmer.org/download.html
HH-suite3 Steinegger et al.86 https://github.com/soedinglab/hh-suite
InterProScan5 Jones et al.87 https://github.com/ebi-pf-team/interproscan
Phyre2 Kelley et al.88 http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/∼phyre2/html/page.cgi?id=index
NGLVieweR Rose et al.89 https://github.com/nvelden/NGLVieweR
Gget AlphaFold2 Luebbert and Pachter90 https://github.com/pachterlab/gget
MAFFT v7 Katoh and Standley91 https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/
gggenomes N/A https://github.com/thackl/gggenomes
Gblocks Castresana92 https://anaconda.org/bioconda/gblocks
seqtk N/A https://github.com/lh3/seqtk
新しいタブで表を開く
リソースの有無
主担当者
リクエストはリードコンタクトのRafael Sanjuán (rafael.sanjuan@uv.es)に直接お願いします。
材料の入手方法
本研究で作製されたすべての細菌およびファージは、リード・コンタクトから制限なく入手可能である。
実験モデルおよび被験者の詳細
ファージ株
本研究で使用したすべてのファージは、Table S1に詳細を示す。
細菌株
本研究で使用したすべての細菌株の詳細をTable S2に示す。
メソッドの詳細
ファージの分離、精製、塩基配列の決定
バレンシア（スペイン）の下水処理場付近で土壌と水から環境試料（n = 9）を採取した。候補プラークの単離は、K. pneumoniaeの臨床分離株36株（うち19株は完全なゲノム配列を有する）を用いて、前述38と同様に行った（Table S2）。ファージは5 mLのLBブロス中で3時間増幅させた（150 rpm）。遠心分離（13,000×g, 5分）後、上清を0.22μmシリンジフィルターに通し、細菌を除去した。ライセートをAmiconフィルター装置(100 kDa)の上部リザーバーにロードし、精製したファージを2回の洗浄工程の後、200 μLのSMバッファーで回収した。ファージをTurbo DNAse Buffer 1Xで10倍希釈し（最終容量100μL）、2μLのDNAse Turbo、ベンゾナーゼ、マイクロコッカールヌクレアーゼを添加した。消化は37℃で1時間インキュベートし、さらに1時間の間に1μLのDNase Turboを添加した。DNaseを不活性化するために、15mM EDTAを使用し、75℃で10分間インキュベートした。ファージカプシドを消化するために、10μLのSDS10％と5μLのプロテイナーゼK（20mg/mL）を加え、55℃で45分間インキュベートした。DNA Clean and Concentrator 5-Kit (Zymo)を用いてDNAの抽出と精製を行った。イルミナNextera XT DNAキットを用いてシーケンスライブラリを調製し、Illumina MiSeqプラットフォーム（MiSeq Reagent Kit v2）でペアエンドリード（2x250 bp）を生成した。透過型電子顕微鏡のために、精製したファージからの滴を、300メッシュの銅グリッドで支持されたカーボンコートFormvarに沈着させ、30分間風乾させた。ファージは2% phosphotungstic acidで陰刻染色し、Jeol JEM-1010で可視化した。
ファージゲノムアセンブリとアノテーション
Prinseq69 (-min_len 20 -min_qual_mean 20 -ns_max_n 30 -trim_qual_right 20 -derep 14) で生リードをフィルタリングし、Unicycler v0.4.7.70 で組み立てた。あるいは、SPAdes v.3.1471 または MIRA4 (https://sourceforge.net/projects/mira-assembler/) と apc script (https://github.com/tseemann/apc/blob/master/apc.pl) でゲノム環状性をチェックした。FastANI72 (fraglen = 50) を用いて一対の平均塩基同一性 (ANI) 値を求めた。74 ファージゲノムは Prokka v1.1475 で Prokaryotic Virus Remote Homologous Groups (PHROGS) 76 のデータベースを用いてアノテーションした (http://millardlab.org/2021/11/21/phage-annotation-with-phrogs/). ファージゲノムの可視化のために、ファージはsmall/large terminase subunitで任意に並べ替え、genoplotR77を用いてblastn比較（-evalue 1e-5）を描画した。温帯性挙動は、注釈付きリソジェニーマーカー（インテグラーゼ、エクスキジオナーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、転写調節因子／抑制因子、parAB遺伝子）の検索により推論した。
ファージの分類
NCBI (PhageDB) で公開されているファージゲノムを inphared54 (10/02/2021, n = 14,037) で取得し、FastANI (fraglen = 500) で分離したファージと比較検討した。PhageDBの配列は、ANI70%以上、アラインメントカバレッジ30%以上を保持し、上記と同様に我々のファージとのIGS値を計算した。bactaxR package78のANI.dendrogram関数を用いて、IGSの閾値をそれぞれ95%および45%として、種およびグループのクラスタを定義した。ViPTreeGen79(https://github.com/yosuken/ViPTreeGen)を用いて、PhageDBの全クレブシエラファージとファージゲノムを比較した。
K. pneumoniaeの収集とゲノム解析
1,145株のK. pneumoniaeのゲノム配列を検討した。93 生リードをprinseq69でトリミングし、Unicycler v.0.4.770 を用いてアセンブルを行った。各莢膜遺伝子型（CLT）の分離株は、アセンブリの品質、CLT血清型の信頼性、Kleborateで得られたO抗原とST多様性に基づいて選択された43。コンタミネーションを除去するために、精製された分離株をwziシーケンス法94でタイピングし、サンガー配列をイルミナから以前に入手したものと比較した。その結果、NTUH-K204495を含む138の真正株が得られた（表S2）。これらをK. pneumoniae clonal complexの代表的な配列と比較した。20,96 そのために、Snippy (https://github.com/tseemann/snippy) (--ctgs option) を用いて、NTUH-K2044を参照として、すべての配列のコアゲノムアライメントを取得した。IQ-TREE281を用い、最適なモデルのもとでコアML系統を推定した97 PhageBoost82を用い、プロファージを抽出した。97 PhageBoost82 はプロファージの抽出に使用した。CRISPRCasTyper83 は CRISPR システムの存在を検出するために使用した。残りの細菌防御システムについては，Defense-finder32をデフォルトのオプションで使用した．最後に、ファージレセプターの有無を判断するために、Prokka v1.14.75 を用いてゲノムのアノテーションを行い、ファージレセプターのタンパク質を取得98 してFastaファイルを作成した。このファイルと138の細菌プロテオームをPIRATE84の入力として使用し、存在/非存在マトリックスを得た。さらに、分岐または追加の外膜タンパク質を得るために、セマンティック検索を行った（Data availabilityを参照）。
ファージホストトロピズム(スポッティング)
ファージストック（108から1011PFU/mLの範囲）を96深井戸プレートでチェス盤パターンを用いて10倍に希釈した。スポットテストは、0.3%トップアガーLB培地中の各K. pneumoniae株の細菌芝生に希釈した各ファージを2μL滴下して行った99。この結果、≥104 PFU/スポット（最大107 PFU、表S1）、3連で評価された。プレートは37℃で一晩培養し、少なくとも2つの複製が陽性の相互作用（透明スポット、濁ったスポット、または単一プラーク）を示したとき、その症例は陽性とみなされた。このアッセイの検出下限は、ファージプラーク形成効率0.0001であった。さらに、1,242のファージと細菌の相互作用を2つの濃度で評価したところ（表S1）、不一致は4例のみ（0.003%）であった。これらのファージとバクテリアの相互作用のうち，関心のある95件（すなわち，生産的感染に至らなかった陽性スポットと関連ファージ間の差分スポット）について，順次希釈したファージ（109 PFU/mLストックから10-1から10-8）2μLをバクテリアローンに二重にスポットして再試験をした。このアッセイの最低希釈度（105PFU／スポット）を用いて観察されなかったスポットは廃棄した。
ファージ宿主のトロピズム（病原性）
スポットアッセイで陽性のファージ-バクテリア相互作用はすべて、浮遊性殺傷アッセイで確認された。この選択は、いくつかのファージがプラークを生成できないこと46、および感度／時間の制約に基づいている100。簡単に言えば、細菌をグリセロールストックからストリークし、指数関数期まで増殖させた。調整した指数関数培養とファージストックを使って、96ウェルプレートに200μLのLBを接種し、それぞれ107 CFU/mL と108 PFU/mL とした。101 プレートをTecanマイクロプレートリーダーInfinite 200で37℃、60rpmで振とうし、20分ごとにOD600を記録し、少なくとも16時間培養した。ファージ処理した細菌が成長障害を示したとき、すなわち、定常期を除く時間経過のどの時点でもファージ処理した細菌の成長曲線が対照を下回ったときに、正の殺菌効果を割り当てた。これは、2つの独立した複製における両曲線の結合プロットを直接観察することによって決定された。疑わしい場合、相互作用は陰性と分類された。最後に、ファージの病原性の低さや細菌の抵抗力の高さによる殺傷アッセイの偽陰性を除外するために、3時間の共培養後にファージ-子孫を測定した（遊離ファージの定量化参照）。ファージが遊離細胞対照の10倍を超えた場合、子孫生産が陽性であると判断した。また、上記のように複数のファージ希釈液をスポットした際に、ファージプラークを観察することで、子孫生成の陽性例を確認した。
遊離ファージの定量
3個のコロニーを摘出し、LBブロスで107CFU/mLになるまで培養した。次に、細菌に∼105 PFU/mLを感染させ、37℃で軌道振盪（250 rpm）しながら3時間インキュベートした。その後、プレートを遠心分離（4000×g、10分）し、上清の連続希釈液（10°-10-3）を用いて、スポッティングアッセイにより各ファージの増幅株におけるファージ子孫の滴定を行った。これらの結果から、子孫の生産量を以下の式で算出した：100×1-AAo
ここで、AおよびAoは、それぞれ菌の有無にかかわらず、ファージのPFU/mLである。3時間後にファージが完全に吸着していない組み合わせでは、新たに生成した粒子との干渉を避けるために、インキュベーション時間を30分に短縮した。非可逆的吸着を測定するために同じ手順を用いたが、ファージとバクテリアを共培養した後、混合物を激しくボルテックスして遠心分離した（13000 x g, 5 min）。宿主不在のコントロールと比較して、平均自由粒子価が80%以上低下した場合、陽性吸着と判断した。
真陽性率（TPR）の計算
細菌およびファージの遺伝的形質が陽性感染に及ぼす影響を予測するために、統計的感度（すなわちTPR）を計算した。細菌については、スポッティングアッセイから得られた感染マトリックスを入力として使用した。簡単に言えば、各宿主形質（例えば細菌のCLT）および宿主形質の状態（例えばKL2）について、基準株を選択し、その感染パターンを決定した。この感染プロファイルを、同じ形質（例えばKL2）を持つ他の菌の感染パターンと比較した。基準菌の選択は、バイアスを避けるために100回繰り返した。得られた感染陽性と陰性の分割表を用いて、以下のようにTPRを算出した。TPR=P(S|SR)P(S|SR)+P(R|SR)
Tpr=P(S|SR)P(S|SR)+P(R|SR)、ここでS|基準菌の感度を与えられたファージに対する感度とR|基準菌の感度を与えられたファージに対する抵抗性である。各形質のヌルTPR分布を決定するために、基準菌株をデータセット全体からランダムに選択した（例えば、任意のCLT）。宿主形質が二値データ（受容体の有無など）を表す場合は、存在レベルからTPRを推定した。この作業を3回繰り返し、標準誤差を推定した。ファージ形質のTPRについては、個々のファージ-細菌ペアではなく、CLT感染マトリックスを考慮した。ファージがCLTに感染できるのは、対応するCLTの少なくとも1株がspotting assayで感染しているか、文献で参照されている場合であるとみなした。したがって、各ファージの形質（ファミリー、グループ、特定のRBDの存在）ごとに、参照ファージを選択し、上記のようにTPRを算出した。
ファージデポリメラーゼ活性
一晩の細菌培養物2mLのアリコートを、10μLのファージ（MOI≧1）または10μLのSMバッファーで処理した。37℃で適度に振盪（150rpm）しながらONインキュベートした後、培養物を遠心分離（18,000 x g、5分）し、PBSで2回洗浄した。次に、カプセルは、以前に記載された102 に修正を加えたように抽出された。0.5 mLのPBSで洗浄した細胞を100 μLのカプセル抽出バッファー（500 mMクエン酸 pH 2.0, 1% Zwittergent 3-10) と混合し、ボルテックスした。この混合物を56℃で20分間加熱し、遠心分離（18,000 x g、5分間）により細胞残屑を除去した。カプセルを沈殿させるため，上清を最終濃度80%(v/v)のエタノールと混合し，4℃で30分間インキュベートした。沈殿物を遠心分離 (18,000 x g, 20 min, 4°C) で集め、風乾し、200 μLの水に再懸濁した。カプセル懸濁液を 1,200 μL のホウ砂溶液 (12.5 mM 四ホウ酸二ナトリウム H2SO4) と混合し、氷上に 10 分間保持した後、95℃で 10 分間インキュベートし、直ちに氷上でさらに 10 分間冷却し、ウロン酸法による定量を行った104。0.5% NaOH中の3-hydroxybiphenyl 20μLを添加した後、520nmにおける吸光度を測定した。グルクロン酸を用いた標準曲線を用いて、各定量バッチのウロン酸濃度を算出した。カプセル減少率（%）は、ファージ処理菌と未処理菌のウロン酸含有量を比較することで算出した。この手順は、試験した各ファージと細菌の組み合わせについて、少なくとも2回繰り返した。ファージ解重合活性は、以下の式で算出した：100×1-CCo
ここで、CおよびCoはそれぞれ、ファージありまたはなしの細菌のグルクロン酸の量（μg／200μL）である。このアッセイのポジティブコントロールとして、顕微鏡でカプセルの減少を確認したいくつかのファージと細菌の組み合わせを使用した38。ハローの存在は、CLTの少なくとも1つの代表的な細菌で一晩インキュベートした後にファージプラークを目視することによって確認された。
デポリマーゼ配列の検索
デポリマーゼの解析データセットを拡大するために、文献からトロピズムが知られているKlebsiellaファージを含めた（Data availability参照）。NCBIでタンパク質が入手できないものについては、上記のようにファージゲノムを組み立て、アノテーションを行った。すべてのファージタンパク質(>100 aa)を、blastp (e-value threshold of 10-5)を用いて、よく特徴付けられた23,24または実験的に検証されたデポリメラーゼ配列（データ提供元を参照）と比較した。候補となるタンパク質は、N-末端アンカーと中央/C-末端酵素ドメインの両方を持つことを、構造アラインメントを用いて検証した。N末端ドメインについては、文献から得たHMMs N末端プロファイルのデータベースに対してhmmsearch (e-value: 0.01 and coverage 0.01) が使用された。デポリメラーゼ」「ペクチン」「ペクチン酸」「シアリダーゼ」「レバナーゼ」「キシロシダーゼ」「ラムノシダーゼ」「デキストラナーゼ」「アルギン酸」「ヒアルロニダーゼ」「ヒドロラーゼ」「リアーゼ」および「スパイクおよびβ-ヘリックス｜ヒドロラーゼ」の用語を含むプロファイルと構造整列するタンパク質はさらなる分析のために保持されていた23、24。さらに、すべてのファージCDSに対してhhblitsが実行された。Blastp検索で得られたものとは別に、追加のDposは見つかりませんでした。酵素活性があると思われるタンパク質は、gget90 AlphaFold2105 (See Data availability)を用いて特徴的なβ-helicalドメインを持つことが確認された。タンパク質の構造はNGLVieweRで可視化した89。
ファージRBPの構造
RBPがどのようにファージ粒子に組み込まれるかを決定するために、以前に確立された命名法を使用した。24 RBPにN末端ドメインが確認された場合、これを「一次RBP」として割り当てた。保存されたペプチドが見つかった場合、RBPは「二次RBP」と命名された。どちらも「アンカー結合型」RBPに相当する。構造ドメインがない、あるいは同定できない場合、そのRBPは「不明」と分類された。これは推定可溶性タンパク質を表しているのかもしれない。構造ドメインは存在するが、Dpoが存在しない場合、そのRBPは「truncated」に分類された。存在する酵素ドメインが典型的なDpoと異なる場合、これも特定された。この分類には、これまでに検出された構造的ドメインと酵素的ドメインが用いられた。さらに、アンカードメインと保存ペプチドを、関連ファージのRBPの多重配列アラインメント（RBP-MSA）に基づいて同定した。RBPs-MSAは以下のように構築した。各RBPは、PhageDBの全ファージタンパク質、および我々のファージのタンパク質とblastp (-evalue 1e-5 -max_hsps 1 -length 100)で比較された。遺伝子内ヒットと判断されたものは、MAFFT (--adjustdirection) による配列アライメントに使用された91。遺伝子内ヒットは、対応するファージがFastANIでゲノムの40%において少なくとも70%のANIを獲得した場合に判断された。RBPのS8/S9ゲノムコンテキストは、blastpによる比較とInterproScan5によるアノテーションの後、ggenomes (https://github.com/thackl/gggenomes) で可視化された87。
受容体結合ドメイン(RBD)の定義付け
宿主のトロピズムを駆動する領域に焦点を当てるため、デポリマーゼのアンカードメインを削除した。このため、各RBPs-MSAの保存領域を削除した。この領域はGblocks (-b3 = 4)92 で検出し、subseq seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) で抽出した。複数のブロックが選択された場合、最初のブロックをアンカードメインとみなした。保存されたブロックが割り当てられなかったり、20a未満の場合は、タンパク質全体が保持された。8つのケースでは、アンカードメインはアラインメントを目視で確認した後に区切られた。テールスパイクの残りの長さを受容体結合ドメイン(RBD)と称した。RBDのクラスタを決定するために、all vs all blastp比較を行い（-evalue 1e-5 -max_hsps 1 -qcov >40）、上記のようにbactaxRパッケージ78を使用した（identity threshold = 50）。
プロファージ配列データを用いた予測されるトロピズムのクロスバリデーション
莢膜屈性シグナルを持つRBDクラスター、すなわち、少なくとも2/3の配列がCLT屈性を共有するファージに含まれるクラスターを抽出した。クラスタの代表的な配列を用いて、blastp (-evalue 1e-5 -max_hsps 1 -qcovs 0.4) でバクテリアの完全なRefSeqタンパク質データベースと検索し、推定プロファージ領域を取得した。ヒットしたタンパク質のアクセッションは、efetchでバクテリアアセンブリのアクセッションと対応する分類を検索するために使用された。細菌アセンブリはNCBI ftpサイトからダウンロードし、Kleborate43に供して各アセンブリのCLTを決定した。信頼度「なし」または「低」の細菌アセンブリは、解析から除外した。次に、クラスター分析から各RBDに割り当てられたCLTを、プロファージが存在する細菌のCLTと比較した。統計的有意性を検定するために、K. pneumoniae RefSeqデータベース（アクセス：2021/04/27）における各CLTの頻度に等しい確率で、ランダムなCLTを各菌体集合に割り当てた。その後、フィッシャーの正確検定を用い、ランダム化されたデータと実際のデータにおける予測の正しさの比率を比較した。
無菌感染のメカニズム
吸着したファージを細菌常在プロファージ（e-value 1e-5、min identity 80%、alignment length ≥ 99 nt）とblastnで比較し、スーパーインフェクション除外の可能性を判定した。CRISPRCasTyper83を使用して、blastn-short（カバレッジと同一性の閾値90％、e値1e-5）でファージと比較したCRISPRアレイを特定した20。それぞれの防御システム（DF、n = 42）の存在は、その特定の菌株のファージの病原性（V）またはアビルレンス（A）の結果と比べて、比較された。このことから、各ファージ防御システムの耐性確率の差（dPR）は、dPR=P（DF|A）-P（DF|V）として算出された。
1に近い値は、耐性株にDFが過剰に存在すること（ファージのアビルレンス）を示す。逆に，負の値は，DFが感受性株に過剰に存在すること（ファージの病原性）を示し，観察された耐性表現型に寄与していない可能性がある．自然発症のカプセル型細菌は、以前に記載された方法で単離され、106 アカプセル表現型の安定性を確認するためにストリーク精製し、LBブロスで増殖させた。ファージの連続希釈液（10～104PFU）を、500μLの一晩のWT菌、WT：カプセル化菌、またはカプセル化菌のみのバクテリアローンに、前述と同様にスポットした。
定量化および統計解析
統計解析は、Rバージョン3.6を使用して行った。使用した統計検定の詳細は、方法および/または図の説明文に記載されている。
データおよびコードの入手方法

配列決定された70のKlebsiellaファージのFASTQファイルは、Bioproject PRJEB46367としてEuropean Nucleotide Archive (ENA)に寄託されています。

本研究で得られた46のファージのゲノム配列は、Table S1に示したAccession numberに従ってNCBI GenBankに寄託されている。

使用した細菌株の配列は、Table S2のAccession numberでENAに寄託されている。

ファージキリングカーブの生データ、デポリマーゼのデータベース、ファージレセプターとクレブシエラファージの文献からのリスト、モデル化したRBPのタンパク質データバンクファイル、TPR計算に用いたスクリプトは、この論文のMendeley Dataで公開しています。https://doi.org/10.17632/c696dvvynf.2

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、リクエストに応じて主担当者から提供されます。
謝辞
菌の提供およびゲノム配列へのアクセスについて、Comunitat Valenciana, Ana Djukovic, Beatriz Herrera, Carles Úbeda, InfectERA Consortium の Networked Laboratory for Surveillance of Antimicrobial Resistance (NLSAR) に謝意を表する。NTUH-K2044株の提供を受けたJin Town Wang教授に感謝する。David SaizとLourdes Torderaには菌株収集と解重合アッセイを、Concha Hueso, Nuria Jiménez, Loles Catalán, Alejandro Sanz Carbonellには技術支援を、Centro de Investigación Príncipe Felipe microscopy serviceにはTEMの提供に感謝する．Dimi Boeckaerts、Olaya Rendueles、Marta Lourençoには有益な議論をしていただいたことに感謝する。本研究は、R.S.へのERCグラント724519 - Vis-a-Visおよび101019724 - EVADER、F.G.-C.へのプロジェクトPID2020-118602RB-I00（スペインMICINN）およびBFU2017-89594R（スペインMICINN）、F.G.-C.へのプロジェクトPROMETEO2016-122（バレンシア州）により資金提供されています。 C.とR.S.に、ESCMID Research Grant 20200063、プロジェクトPID2020-112835RA-I00、MCIN/AEI/10.13039/501100011033の助成を受け、プロジェクト SEJIGENT/2021/014 Conselleria d'Innovació, Universitats, Ciència i Societat Digital (Generalitat Valenciana) から P.D.-C. へ助成された。P.D.-C.はRamón y Cajal contract RYC2019-028015-I funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033, ESF Invest in your futureから資金援助を受けています。B.B.はスペインのMCIU FPU16/02139から博士号取得のための資金援助を受けた。
著者による貢献
B.B.はプロジェクトの構想、研究の設計、実験・計算解析の実施、データ解析、原稿執筆に貢献した。N.G.-G.は、計算機解析、リソース、可視化に貢献した。M.G.-O.はリソースに貢献した。F.G.-C.はデザイン研究、リソース、原稿修正、監督に貢献した。P.D.-C.はファージの単離を行い、プロジェクトの構想、研究計画、原稿の修正、監督に貢献した。R.S.は、プロジェクトの構想、研究計画、データ解析、原稿執筆・修正、監修に貢献した。
利害関係者の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言しない。
インクルージョンと多様性
私たちは、包括的で多様な、そして公平な研究の実施を支持します。
補足情報
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資料S1 図S1〜S7、表S5
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表S1. 分離された46種類のバクテリオファージの一般的特徴
ファージID、13グループへの系統分類、ゲノムサイズと円形度、配列深度、GC %、CDS、推定溶原性遺伝子、分類学上のファミリー、サブファミリー、最も近いファージとのIGS値による属を記載。さらに、スポットアッセイ用のファージ濃度、プラークハローの形成、感受性CLT、RBPシステム、デポリメラーゼドメイン数（Dpos）も示している。REP：転写抑制因子／制御因子、PAR：parAB遺伝子、REC：リコンビナーゼ。TSP：Tail Spike protein。CBM：carbohydrate-binding module（糖鎖結合モジュール）。星印のついた分類ランクは、本研究で示された関係に基づいて再分類される可能性がある。星印のついたCLTは、細菌が非冠水性であることを示す。星印のついたDposは、可溶性Dposと推定されるものを示す。

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表S2. Klebsiella臨床株138株の一般的特徴
菌株、配列の詳細、病原性と抗生物質耐性のスコア、wziアレル、CLTとOLTの推論、プロファージの数、CRISPR遺伝子座、防御システムと二次受容体の有無を記載している。カプセルの有無は、光学顕微鏡を用いたコロニーの目視検査により決定した。

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表S3. ファージ-バクテリアのポジティブな組み合わせ
ファージ単離に用いた菌株を示す。Spotting：スポットアッセイで陽性。Virulent: 殺菌プランクトンまたは子孫アッセイで陽性。

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表S4. 本研究と文献から推定されるデポリメラーゼ活性を持つファージRBDのクラスタリング
RBDはファージ名、ドメインが検出されたファージタンパク質、アンカードメイン除去後に考慮した位置で同定しています。

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記事情報
出版履歴
オンライン公開 2023年2月6日
受理されました。2023年1月13日
改訂版受理 2022年11月25日
受理：2022年11月25日 2022年6月2日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112048

著作権について
© 2023 The Authors.
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図
図のサムネイルfx1
図表の概要
図1.サムネイルgr1
図1分離されたKlebsiella属菌のファージの多様性
図1.サムネイルgr2
図2 単離されたKlebsiellaファージの宿主トロピズム
図2.サムネイルgr3
図3細菌の莢膜型に基づくファージ-宿主間相互作用の予測可能性
図3.gr4
図4RBDに基づくファージ莢膜の向性予測
図3RBDを用いたファージ宿主間相互作用の予測
図5プロファージ配列を用いたRBDによる莢膜対向性予測の検証
図5RBDに基づくファージ莢膜向性予測の検証
図6宿主のトロピズムを決定する非デポリマーゼ決定因子
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