見過ごされてきたCandida glabrata petitesはエキノカンジン耐性であり、宿主の炎症反応を誘導し、in vivoでの体力は低い。

2023年10月12日 09:17

mBioロゴ
ジャーナルホーム
著者紹介
論文紹介
ジャーナルについて
購読申し込み
ジャーナル
ログイン
戻る
抗菌薬と化学療法
応用・環境微生物学
臨床・ワクチン免疫学
臨床微生物学レビュー
エコサル・プラス
真核細胞
感染と免疫
細菌学ジャーナル
臨床微生物学ジャーナル
微生物学・生物学教育ジャーナル
ウイルス学ジャーナル
mバイオ
微生物学・分子生物学レビュー
微生物学リソース
微生物学スペクトラム
mSphere
mシステム
オープンアクセス
菌学
研究論文
2023年9月29日
見過ごされてきたCandida glabrata petitesはエキノカンジン耐性であり、宿主の炎症反応を誘導し、in vivoでの体力は低い。

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.01180-23?utm_source=twitter&utm_medium=social&utm_content=ASM&utm_id=falcon&utm_campaign=mBio

著者 Amir Arastehfar https://orcid.org/0000-0002-4361-4841, Farnaz Daneshnia, Hrant Hovhannisyan, Diego Fuentes, Nathaly Cabrera, Christopher Quinteros, Macit Ilkit, SHOW ALL (16 AUTHORS), David S. Perlin https://orcid.org/0000-0002-1268-5524 david.perlin@hmh-cdi.orgAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.01180-23
PDF/EPUB

mBio
オンライン・ファースト
概要
はじめに
結果
考察
材料と方法
謝辞
脚注
補足資料
参考文献
情報＆貢献者
指標と引用
参考文献
図表とメディア
シェア
要旨
一部の細菌種では小型のコロニー形成が比較的一般的であり、予後不良や難治性感染と関連している。同様に、主要な細胞内真菌病原体であるカンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）は、"小柄（petite）"と呼ばれる小型で増殖の遅い呼吸不全性コロニーを産生する。小柄なC.glabrataの臨床株が報告されているにもかかわらず、宿主における小柄なコロニーの挙動に関する我々の理解は曖昧なままである。さらに、宿主内でのプチフィットネスとその臨床的関連性についても論争がある。今回われわれは、全ゲノムシークエンシング（WGS）、デュアルRNAseq、ex vivoおよびin vivoでの広範な研究を行い、この知識のギャップを埋めた。WGSにより、核およびミトコンドリアにコードされる遺伝子に複数の小柄特異的変異が同定された。dual-RNAseqのデータと一致して、小胞体C. glabrata細胞は宿主マクロファージ内で複製せず、マクロファージや腸内コロニー形成および全身感染マウスモデルにおいて、小胞体でない親細胞に駆逐された。細胞内の小胞体は薬剤耐性の特徴を示し、エキノカンジン系薬剤の殺菌活性には比較的鈍感であった。プチット感染マクロファージは、炎症性でタイプI IFNに偏った転写プログラムを示した。国際的に分離されたC. glabrata血中分離株（n＝1000）を調査した結果、小人の有病率は国によって異なることが示されたが、全体的には低い有病率（0％〜3.5％）であった。以上より、本研究は、主要な真菌病原体において臨床的に見過ごされている表現型の遺伝的基盤、薬剤感受性、臨床的有病率、および宿主-病原体反応に新たな光を当てるものである。
重要性
Candida glabrataは主要な真菌病原体であり、ミトコンドリアを失い、"petite "と呼ばれる小さく成長の遅いコロニーを形成することができる。この成長速度の鈍化は論争を生み、プチ性の臨床的重要性に疑問を投げかけてきた。ここでは、複数のオミックス技術とin vivoマウスモデルを用いて、小柄な表現型の臨床的重要性を批判的に評価した。われわれのWGSは、小柄な表現型を支える可能性のある複数の遺伝子を同定した。興味深いことに、マクロファージに取り込まれた小柄なC. glabrata細胞は休眠状態であるため、最前線の抗真菌薬では死滅しない。興味深いことに、小柄な細胞に感染したマクロファージは、異なるトランスクリプトーム応答を示す。私たちの生体外観察と一致するように、ミトコンドリアを獲得した親株は、全身および腸内コロニー形成においてプチ株を凌駕した。C.glabrata分離株のレトロスペクティブな検討により、プチット有病率は国によって大きく異なるまれな存在であることが確認された。本研究は、小柄なC. glabrata分離株の臨床的関連性に関して、既存の論争を克服し、新たな知見を提供するものである。
はじめに
ストレスの多い条件下で微生物が迅速に適応し生き残るために用いる戦略のひとつは、中心的な炭素代謝を微調整して表現型の可塑性を獲得することである（1 - 7）。その顕著な例が、抗生物質曝露後に分離される小型コロニー変異（SCV）菌の発生であり、特に黄色ブドウ球菌において顕著である。SCVは、抗生物質による治療の失敗、治療困難な感染症の再発、疾患の重症化に関与している（1、4、8）。驚くべきことに、SCVは宿主細胞によって効果的に貪食され、トランスクリプトーム研究によって、SCVが強力な免疫応答を引き起こしたり、宿主細胞にダメージを与えたりしないことが示されている（5、9）。従って、病原性の低さと増殖の遅さは、SCVが感染した宿主細胞をうまく利用し、免疫系の細胞毒性作用を回避し、致死的な抗生物質への直接暴露から身を守るための戦略であると考えられている。しかし、抗生物質による治療が中止されると、このようなSCVは急速に完全な病原性の野生型（WT）表現型に戻り、再発を引き起こし、慢性感染の種となる(5, 9)。
ほとんどの真核生物で必須のオルガネラであるにもかかわらず、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeのような一部の真核生物種は、特定の条件下でミトコンドリアや酸化的呼吸機能を失うことがあり、その結果生じた細胞はプチ変異体として知られ、生存可能で、SCVに似た小さく成長の遅いコロニーを形成する(10, 11)。プチ・ミュータントの出現は、C. albicansよりもS. cerevisiaeに近縁なヒト真菌の代表的病原体であるCandida glabrataに感染した患者から得られた臨床検体でも認められている(2, 12)(13)。小柄な臨床C. glabrata分離株はまれであると考えられていたが、最近の研究で、検査された臨床C. glabrata分離株の約11％（16/146株）が小柄の特徴を示すことが判明した。興味深いことに、小柄なC. glabrataは、ABCトランスポーター（CDR1、CDR2、SNQ2）とその転写制御因子（PDR1）の過剰発現により、殺菌性アゾール系薬剤に対する耐性を示す。しかし、小胞子菌が殺菌性薬剤（エキノカンディン系薬剤やポリエン系薬剤）によってどのような影響を受けるかは明らかにされていない。
C. glabrataはマクロファージに取り込まれることができるが、マクロファージを介した殺傷には非常に抵抗性があり、宿主細胞内で生存・増殖することができる(16)。興味深いことに、SCVと同様に、小柄な細胞は小柄でない株に比べてより効果的に貪食される(7)。しかし、小柄な株は非小柄な株と異なって、感染した宿主の食細胞に影響を与えるのか、あるいはその逆なのかはわかっていない。さらに、小柄な菌株が宿主に及ぼす影響については議論が続いており、小柄な菌株に感染したマウスの死亡率や真菌量が大幅に増加したという研究報告もあるが（14）、そうではないという研究報告もある（15、17）。このような相違は、プチ株分離株の由来やその基礎となる遺伝的基盤に一因があるのかもしれない。S. cerevisiaeでは、小柄さはミトコンドリアの生合成や機能に影響を及ぼすさまざまな遺伝子変異によって引き起こされる可能性があるが、C. glabrataの小柄さにも当てはまるかどうかは不明である。ある研究では、ミトコンドリアDNAポリメラーゼMIP1をコードするC. glabrata遺伝子に注目し、小柄な株とそうでない株の両方で同じMIP1一塩基多型（SNP）を発見した(7)。
ここでは、臨床株と実験室で作製した小柄株を用いて、これらの疑問に系統的に取り組んだ。全ゲノム配列決定（WGS）により、ミトコンドリアmRNAの安定性に関与するタンパク質に影響を及ぼす変異を含む、小柄な表現型の根底にある複数の遺伝的メカニズムが明らかになった。C.glabrata感染マクロファージのデュアルRNA-seq解析から、細胞内の小柄細胞は非増殖のサインを示し、小柄に感染したマクロファージは非小柄株に感染したマクロファージと比較して、感染後期にI型インターフェロン（TII）と炎症性サイトカインの顕著な転写応答を示すことが示された。また、異なる生物学的起源（臨床由来または実験室由来）の小柄株は、マクロファージ相互作用アッセイや腸内コロニー形成および全身感染マウスモデルにおいて、小柄でない親株に容易に競合されることも見出した。しかし、エキノカンジン投与中は、小柄な株は非小柄な株よりも体力的に優位であった。最後に、国際的なC. glabrata血液分離株の大規模コレクション（1,000株）における小柄株の有病率を評価したところ、小柄株は極めてまれであったが（9/1,000株、0.9％）、その有病率は地域によって異なっていた（全血液分離株の0％〜3.3％）。さらに、回収された小柄な分離株のほとんど（89％）は、SCVを思わせる大小のコロニーが混在していた。以上より、本論文は、C. glabrataにおける小柄性の遺伝的基盤、その臨床的流行、および感染と薬剤耐性に関する潜在的な意味について新たな光を当てるものである。
結果
小柄分離株の収集、特性解析、および代謝欠損の評価
我々は、臨床および実験室由来の小柄なC. glabrata分離株からなる菌株コレクションを調査した（表S1）。BYP40は入院5日後にアゾール非投与患者の血液から回収された非小柄分離株であり、BYP41はフルコナゾール治療後に同じ患者から回収された小柄分離株である(12)。興味深いことに、BYP41に感染した患者はフルコナゾールに反応せず、この分離株による血流感染は最終的にアムホテリシンBで消失した(12)。また、小柄なC. glabrataの分離株（DPL248）も確認されたが、臨床データや親株は不明であった。最後に、C. glabrata型株CBS138をフルコナゾール存在下で進化させることにより、実験室由来の小柄な株4株、すなわちC5、D5、F2、G5を得た（図S1AおよびB、ならびに材料と方法を参照）。簡単に説明すると、CBS138を64μg/mLのフルコナゾールを含むRPMIに接種し、PDR1変異を欠くフルコナゾール耐性（FLZR）コロニー（MIC≧64μg/mL）を選択し、小柄な形質についてさらに解析した。最終的に独立に得られた4つの小柄な分離株は、YP-グリセロール（YPG）寒天培地では生育できず、FLZRであり（図1A）、PDR1、CDR1、CDR2、SNQ2を過剰発現し（図1B）、非小柄な分離株と比較してATPレベル（図1C）とミトコンドリア膜電位（図1D）が有意に低かった。
図1

図1 小柄なC. glabrata分離株の特徴。本研究に含まれるすべての小柄分離株はフルコナゾール耐性であり（A）、PDR1塩基配列決定によって確認されたようにPDR1機能獲得型変異を有していなかった。小柄な分離株は、リアルタイムPCR法で測定したPDR1とその制御下にある排出ポンプ（CDR1、CDR2、SNQ2）の基底レベルが高い（3生物学的複製、<0.01、<0.001、両側t検定）（B）。小人では、ATPレベル（5生物学的複製、<0.001、両側t検定）（C）およびミトコンドリア膜電位（3生物学的複製、<0.01および**=0.01、両側t検定）（D）が、呼吸熟達者よりも低かった。ATP、アデノシン三リン酸。
ミトコンドリアはアミノ酸、ヘム、ヌクレオチドの生産を含む複数の生合成過程に関与し、影響を与えているため(18, 19)、小柄な変異体は特定の代謝物が欠乏している可能性がある。実際、S. cerevisiaeの小柄変異体は、ロイシン、アルギニン、グルタミン酸、グルタミンに欠損を示すが、アスパラギン酸のようなTCAサイクルの還元的部分に由来するアミノ酸には欠損を示さない(10)。一般に、G5を除いて、小柄分離株の増殖はアルギニン、ロイシン、アデニン、チミジンを補充すると有意に改善した（図S1CおよびD）。これはS. cerevisiae小柄分離株と同様である（10）。しかしながら、S. cerevisiaeとは異なり、C. glabrata petitesの遅い増殖はグルタミン酸の補充では改善されなかったが、グルタミンとヘミンはpetitesと非petites分離株の増殖速度を同様に改善した。これらの観察から、小柄なC. glabrata株の大部分は、ミトコンドリアが機能していない細胞で予想される代謝不全を示すことが確認された。
最後に、YPD（一晩培養）中でプチ株を30回まで継代培養し、YPGプレート上で複数のコロニーをストリーキングして、プチでない復帰株を探すことにより、プチ表現型の安定性を評価した。G5株は2回目の継代で容易に非ペタイト表現型に復帰したのに対し、残りのCBS138由来および臨床ペタイト分離株は安定しており、30回継代しても復帰株は観察されなかった。このように、ほとんどのプチ株は安定であったが、プチ株の中で最も増殖速度が速く、ATPレベルも高かったG5は可逆的であった。
全ゲノム配列決定により、プチ株に関連する変異が明らかになった。
ミトコンドリアDNAポリメラーゼMip1の機能喪失変異は、C. glabrataにおいて小柄な表現型をもたらすことが示されている(7)。我々は小柄な株と小柄でない株の親のMIP1遺伝子の塩基配列を決定し（表S1）、小柄な株は親株にない変異を保有しておらず、MIP1多型は塩基配列を決定した分離株の塩基配列型を予測した（図2A；表S1参照）ことから、ゲノムの他の場所の変異が小柄な表現型を引き起こしたことがわかった。これらの変異を同定するために、イルミナ次世代シーケンサーを用いた。DPL248およびCBS138由来の小柄は核染色体の2～6倍のミトコンドリアゲノムカバレッジを有していたのに対し、BYP41はミトコンドリアDNA相対含量が最小であった（図S2A）。BYP40とBYP41の間で異なる変異体（表S2）、およびCBS138由来の4つの小柄な株（表S2）のすべてではないが、いくつかの株で存在する変異体（表S2）を高確率で同定し、これらの4つの株で共有される変異体は、非小柄な親株に存在する可能性が高かった。DPL248には近縁の非ペタイト親株がないため、最近獲得された変異を同定することができなかった。クレード間の系統学的距離による多型を除外するため、DPL248のゲノム配列からMLSTタイプをST7と決定し、以前に配列決定された2株、CST35とEB0911Stoを最も近い近縁株として同定した(20)。そこで、DPL248とCBS138の間で、これら2株のいずれにも存在するバリアントを除外した結果、DPL248のバリアントは限定されたリストになった（表S2）。3つの表に存在する遺伝子のジーンオントロジー（GO）濃縮解析により、ミトコンドリア機能と細胞壁の構成要素に関連するパスウェイが同定された（表S3）。細胞壁をコードする遺伝子は非常に多様であることが知られており、おそらく小柄な表現型とは無関係であろう（20, 21）。
図2

図2 多様な臨床分離株のMIP1配列決定から、分離株で生じた多型は小柄な表現型よりもむしろ配列型をよく反映していることが明らかになった（A）。プチおよびそれぞれの親株とTHP1マクロファージとの相互作用。それぞれの単離株で感染させたマクロファージと細胞内複製を感染後3、6、24、48時間で測定し、データはマクロファージを処理するために用いた最初の接種量に対して正規化した。小柄な分離株は、呼吸に堪能な分離株とは異なり、細胞内複製を示さなかった（4～8生物学的複製、<0.001、両側t検定）（B）。一方、小柄な分離株は貪食率が有意に高かった（4生物学的複製、<0.01、両側t検定）（C）。マクロファージにフルオレセインイソチオシアネート（FITC）染色したBYP40とNYP41を感染させ、各時点でマクロファージ溶解後にAF647でカウンター染色し、蛍光活性化セルソーティング（FACS）により単一陽性と二重陽性を測定した。細胞内のBYP40とBYP41のFITC染色とAF647カウンター染色から、プチプチは全ての細胞が二重染色されたことから、増殖が極めて制限されていることが明らかになったが、BYP40は一重染色された細胞の割合が高いことから明らかなように、細胞内での著しい増殖を示した（3生物学的複製）（D）。CBS138への緑色蛍光タンパク質（GFP）と赤色蛍光タンパク質（RFP）のゲノム相互作用は細胞内増殖に影響を与えず、両形質転換体はマクロファージ内で等しく複製された（4生物学的複製）（E）。RFPを発現した小柄な分離株はTHP1マクロファージに効果的に貪食された（4生物学的複製、<0.00001、両側t検定）が（F）、親株には駆逐された（9生物学的複製、<0.01および****<0.00001、両側t検定）（G）。プチ変異体はマクロファージに取り込まれた後、ほぼ休眠状態に入る。BYP40とBYP41のATPレベルは、RPMIまたはマクロファージ中でインキュベートしたコロニー形成単位（CFU）に対して、異なるタイムポイントで正規化した。細胞内 BYP41 の ATP レベルは、初期には有意に低かったが、48 時間後には BYP40 よりも有意に高くなった（6 つの生物学的複製）(H)。親株とは異なり、プチ株は乳酸脱水素酵素（LDH）で測定すると、感染後24時間の細胞毒性が最も低かった（8生物学的複製、****<0.00001、両側t検定）（I）。FACSは蛍光活性化セルソーティング。
小柄な表現型の根底にある変異を同定するために、上記の表の2つ以上に非同義変異（必ずしも同じ位置にあるとは限らない）を持つ遺伝子を同定した。小柄な系統全体で小柄な表現型を説明する最も可能性の高い候補として、COX3、SSU、Cgai1の3遺伝子を選んだ（表S3）。さらに、ミトコンドリア機能に関連する遺伝子として、RDM9（CAGL0F07469g、mRNAの安定性、ミトコンドリアでの翻訳開始を制御）を含む、CBS138由来の小柄株に特異的に現れる3つの遺伝子を同定した、 MSY1（CAGL0H05775g、グループIイントロンスプライシング、ミトコンドリアチロシルtRNAアミノアシル化、ミトコンドリア局在化に関与）、およびCIT1（CAGL0H03993g、ミトコンドリアトリカルボン酸サイクルのクエン酸をコード）。さらに、DPL248に特有と思われる表S3に示した他の2つの変異は、CaglfMp07（Cgai3）の変異を含むミトコンドリア機能に関連していた、 CaglfMp07（Cgai3）、ミトコンドリアCOX1遺伝子の最初の3つのエクソンと3番目のイントロンの一部（グループIイントロン）によってコードされる推定エンドヌクレアーゼ、およびCaglfMt24（M(CAU)9mt）、CAUアンチコドンを持つミトコンドリアのメチオニンtRNA、ミトコンドリアゲノム上にコードされる2つのtRNA-Metのうちの1つ。
小柄な表現型の根底にあるメカニズムを理解するため、またミトコンドリアゲノムの操作が複雑であることを考慮し、機能が知られている核内コード遺伝子、すなわちCIT1、MSY1、RDM9のみに焦点を当て、CBS138バックグラウンドでそれぞれの欠失変異体を構築した。cit1Δとrdm9Δの欠失は容易に作製できたが、MSY1の欠失は何度試みても失敗した。興味深いことに、rdm9Δは、cit1Δとは異なり、YPG寒天培地では生育できず、FLZRであった（図S2B）。CDR1、CDR2、PDR1、SNQ2を有意に過剰発現し（図S2C）、ミトコンドリア膜電位とATPレベルが有意に低かった（図S3AおよびB）。さらに、小柄な分離株と同様に、rdm9ΔはYNBでの生育が悪く、ロイシン、アルギニン、グルタミン、メナジオン、チミジンの依存性を示した（図S3CおよびD）。これらの結果は、小柄な表現型に関与する可能性のある遺伝子を発見するために用いた比較ゲノミクスアプローチの威力を強調するものであり、ミトコンドリア機能におけるミトコンドリアmRNAの安定性の重要性を浮き彫りにするものである。また、小柄さを支える遺伝的基盤の複雑な性質も解明され、系統間で単一の遺伝的欠陥の直接的な関連性は認められなかった。
細胞内の小細胞は増殖せず、休眠状態で、マクロファージへのダメージは最小限である。
最小培地での増殖不全が観察され、マクロファージが顕著な炭素飢餓を引き起こすことから（22-24）、プチ株はマクロファージ内では増殖しないはずだと考えた。この仮説を検証するため、THP1マクロファージ内での小柄でないC. glabrataと小柄なC. glabrataの複製を測定した。3時間後、C. glabrata分離株を感染させたTHP1細胞をPBSで広範囲に洗浄し、付着していない酵母細胞を除去した後、新鮮なRPMIを供給し、感染後3、6、24、48時間（pi）の細胞内複製率をプレーティングとコロニー形成単位（CFU）計数により測定した。さらに、3時間後に得られた非接着細胞を貪食率を測定するためにプレーティングした。非小柄分離株は24時間後と48時間後に高レベルの複製を示したが、小柄分離株は細胞内増殖を示さなかった（図2B）。対照的に、小柄な分離株は非小柄な分離株よりも有意に高い貪食率を示し、以前の観察結果（7）と一致した（図2C）。小柄な分離株と同様に、rdm9Δも細胞内増殖を示さなかった（図S3E）。
小柄なC. glabrataは細胞内で増殖できないという観察を実証するために、THP1マクロファージに、娘細胞には移行しないフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で染色した非小柄なC. glabrataまたは小柄なC. glabrataを感染させた。各タイムポイントで細胞内C. glabrata（ICCG）細胞を放出した後、母細胞および娘細胞の両方を染色するAlexa Flour-647 Concanavalin A（AF-647）でカウンター染色した(7)。したがって、細胞内の娘酵母細胞はAF-647で単一陽性となり、一方、母細胞はFITCとAF-647の二重陽性となり、フローサイトメトリーでそれらの相対量を測定することができた(7)。我々はBYP40とBYP41を選択し、3, 6, 24, 48 hpiにおける母細胞および娘細胞の存在量をモニターした（図2D）。前回の実験と同様に、BYP40の細胞内複製が進行していることは、娘細胞の割合の有意な増加によって反映された。一方、BYP41は実験期間中、娘細胞と母細胞の割合が比較的安定しており、細胞内増殖がないことを示していた。
次に、マクロファージ内でプチプチが親株である非プチプチ株と競合するかどうかを調べた。そこで、緑色蛍光タンパク質（GFP）または赤色蛍光タンパク質（RFP）のプラスミドDNAカセットをノルセオトリシンN-アセチルトランスフェラーゼ（NAT）遺伝子の近傍に構築し、CRISPR/Cas9とノルセオトリシン選択を用いて、これらのカセットをプチ株と非プチ株のF染色体に組み込んだ。注目すべきことに、GFPおよびRFP変異体は、24時間後、CBS138と比較して同様の増殖速度を示した（図2E）。貪食率は3時間後に測定し、細胞内複製は3時間後と24時間後に評価した。単培養の実験と同様、プチット菌は有意に高い貪食率を示し（図2F）、マクロファージ内では24時間後に非プチット菌に駆逐された（図2G）。
細胞内のプチプチはマクロファージ内で複製されなかったので、マクロファージの内在化が低代謝活性の引き金になっているのではないかと考えた。ATPレベルの測定が代謝活性決定の代用として用いられた。細胞内および浮遊性のBYP40とBYP41のATPレベルを3、6、24、48時間後に測定し、得られた値を対応するCFUに対して正規化した。予想通り、全ての時点において、プランクトンBYP41のATPレベルはBYP40よりも低かった（図2H）。興味深いことに、細胞内BYP41のATPレベルは動的な傾向を示し、3時間と6時間では極端に低く、48時間では回復し、浮遊状態のそれを上回った。ミトコンドリア活性がなく、ファゴソーム内に発酵可能な炭素源がないことを考えると、このようなATPレベルの急上昇は、宿主からATPを獲得したことを示すか(25)、代謝活性が低下した解糖系ATP産生の可能性がある。
この観察と細胞内増殖の欠如を考慮すると、SCVと同様に、小腸菌は非小腸菌に比べてTHP1マクロファージに対する細胞毒性が低い可能性があるという仮説を立てた。細胞毒性は、24時間後の乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）レベルを評価することによって調べた（26）。我々の仮説と一致して、非小柄分離株に感染したTHP1マクロファージのLDHレベルは、小柄分離株よりも有意に高かった（図2I）。これらの結果から、小柄な分離株は非小柄な親株とは異なり、THP1マクロファージ内で増殖せず、この増殖の欠如は細胞毒性が著しく低いことに反映されていることが示唆される。
小柄株と非小柄株のデュアルRNA-seq
小柄なC. glabrataと小柄でないC. glabrataの違い、および小柄なC. glabrataの表現型がマクロファージとの相互作用にどのような影響を及ぼすかをさらに明らかにするために、経時的デュアルRNA-seq法を用いた（27, 28）。THP1マクロファージに小柄株またはその親株を感染させ、感染マクロファージを3時間後と24時間後に回収してRNA単離とRNA-seq解析を行った。
まず、マクロファージとの相互作用に伴う真菌細胞の転写パターンを探索した。感染したC. glabrata単離株の全体的な転写プロファイル（図3A）から、細胞タイプ間の主な違いは、小柄な表現型に起因し、感染の時点による違いはそれほど大きくないことがわかった。興味深いことに、RPMIで増殖させた場合、小柄さによる差異はあるものの、タイムポイント間の差異は大きくなった。これらの観察から、マクロファージ内のストレスの多い環境が、小柄なC. glabrataとそうでないC. glabrataの間のトランスクリプトーム分岐を悪化させることが示された。
図3

図3 調査したすべてのC. glabrataサンプルの主成分分析（PCA）プロット。プロットはDESeq2によって生成されたvst変換されたリードカウントデータに基づいている。データポイントのラベルは実験のタイムポイントに対応する。PC1軸とPC2軸のパーセンテージは、各軸によって記述される分散の総量を示す（A）。X軸に示されたある比較におけるC. glabrataのアップレギュレート遺伝子のGO用語濃縮解析（カテゴリー「生物学的プロセス」）。比較の下の数字はclusterProfilerの「カウント」（すなわちGOカテゴリーに割り当てられた遺伝子の総数）に対応する。GeneRatioは、与えられたGOカテゴリーに割り当てられた入力遺伝子数と "counts "の間の比率に対応する。有意な（P adj < 0.05）濃縮のみを示す。P値の調整はBenjamini-Hochberg手順で行った（B）。tRNAやrRNA関連プロセス、アルギニンやリジンなどいくつかのアミノ酸の生合成など、ペットに特異的なGO用語。実験室由来のプチプチと比較すると、臨床プチプチは糖鎖生合成と真菌細胞壁関連プロセスのダウンレギュレーションを示した。最後に、正常な大きさの非臨床株と比較したところ、臨床染色体では、ヌクレオソームや有糸分裂紡錘体のアセンブリー、メチオニン、酢酸代謝などの様々なプロセスの制御低下が見られた（C）。全マクロファージサンプルの主成分分析プロット。プロットはDESeq2によって生成されたvst変換されたリードカウントデータに基づいている。データポイント上のラベルは内部サンプル識別子に対応する。PC1軸とPC2軸のパーセンテージは、各軸によって記述される分散の総量を示す（D）。C.glabrata株に感染したマクロファージ（X軸に描かれている）の、未感染のマクロファージと比較したアップレギュレート遺伝子のGOターム濃縮解析（カテゴリー「生物学的プロセス」）（E）。比較の下の数字はclusterProfilerの「カウント」（すなわちGOカテゴリーに割り当てられた遺伝子の総数）に対応する。GeneRatioは、与えられたGOカテゴリーに割り当てられた入力遺伝子数と "counts "の間の比率に対応する。有意な（P adj < 0.05）濃縮のみを示す。P値の調整はBenjamini-Hochberg手順で行った。C. glabrata petite株はヒトTHP-1マクロファージ細胞において炎症性転写プログラムを誘導する。小柄なC. glabrata実験室株または臨床株と小柄でないC. glabrata実験室株または臨床株でチャレンジしたTHP-1のトランスクリプトームの比較（F）。真菌チャレンジ後24時間のTHP-1細胞からのRNA-seqデータに基づいて、Molecular Signatures Databaseの有意に濃縮された「Hallmark」パスウェイを示す遺伝子セット濃縮解析（GSEA）。パスウェイは正規化濃縮スコア（NES）と偽発見率（FDR）に基づいて表示されている。点線はFDR値0.25を示し、選択された上位濃縮パスウェイは青色（非ペタイトで濃縮）と赤色（ペタイトで濃縮）で示されている（G）。小柄なC. glabrata実験室株と非小柄なC. glabrata臨床株でチャレンジしたTHP-1細胞のチャレンジ後24時間の転写産物を比較したM1マクロファージ転写モジュール(29)の濃縮を示すGSEA濃縮プロット(H)。ここで報告されているP値は公称P値であり、NESは正規化濃縮スコアである。
次に、実験室由来株(D5 vs CBS138)と臨床分離株(BYP40 vs BYP41)の小柄性に起因する機能的差異を明らかにすることを目的とした。そのために、遺伝子発現の差分解析とそれに続くGOタームの濃縮解析を行った（図3B）。興味深いことに、小柄な分離株では、複製に関連するプロセスの発現が低下していた（図3C）。
GO解析の結果、ミトコンドリアのオートファジー、タンパク質のリン酸化、カルシウムイオンのホメオスタシス、アイオソームのアセンブリーなど、多くの生物学的プロセスが、プチ変異体でのみアップレギュレートされていることがわかった。一方、臨床小柄変異体と臨床親変異体（BYP41 対 BYP40）では、鉄硫黄クラスター形成や膜貫通輸送などの生物学的プロセスが特異的に上昇することが観察された。後者の GO タームカテゴリーも、実験室由来のもの（BYP41 vs D5）と比較して、臨床小動物で発現が上昇した。最後に、臨床プチ株と非臨床非プチ株（BYP40 vs CBS138）を比較したところ、酸化ストレス、脂肪酸β酸化、様々な異化過程に関連するGOタームの発現上昇が観察された。このような多面的な違いは、両株の遺伝的背景の違いによるものと考えられ、CBS138株の酸化ストレスや代謝シフトに対する本質的な対応能力の高さを反映している可能性がある。
次に、異なるC. glabrata株に感染したマクロファージの転写プロファイルを、感染していないマクロファージと比較して調べた。主成分分析（PCA）によると（図3D）、感染初期の時点では、CBS138株に感染したマクロファージは、他の3株に感染したマクロファージとは異なる反応を示した。対照的に、感染後24時間では、小柄な株とそうでない株に対する反応には若干の層別が見られるものの、どの株もほぼ均一な反応を示した。感染マクロファージで対照株と比較して異なる発現を示した遺伝子のさらなる機能的GOターム濃縮解析（図3E）では、PCAで示されたパターンと同様のパターンが示された-異なる感染株によって誘発された生物学的プロセスの大部分は共通であり、特に感染後期において、特定の株特異的な構成要素を伴っていた。例えば、感染したマクロファージはすべて、感染株とは無関係に、ウイルスチャレンジへの応答、生物学的刺激への応答、酸素濃度低下への応答、金属イオンへの応答などで観察される経路をアップレギュレートした。興味深いことに、CBS138株を除くすべての株は、マクロファージにおいてI型インターフェロン応答を引き起こした。このI型インターフェロンは、膣上皮細胞による主要なカンジダ病原体との闘いに中心的な役割を果たすことが示されている(30)。注目すべきことに、この経路は、小柄な分離菌に感染したマクロファージでは、24時間の時点で発現が上昇していた。また、インターロイキン-1に対する反応やいくつかのER関連過程など、特定の経路が臨床株（BYP40とBYP41）によってのみ発現上昇することも観察された。
プチ感染マクロファージは炎症性転写プログラムを誘導する
真菌のミトコンドリア機能が相互作用するマクロファージにどのような影響を与えるかをより高い解像度で解明するために、非小細胞株と小細胞株C. glabrataに感染したマクロファージのトランスクリプトームを直接比較した。興味深いことに、マクロファージは、小柄なC. glabrata株と小柄でないC. glabrata株のどちらに感染したかによって、有意に発現が異なる遺伝子を多数示した（図3FとG）。真菌のミトコンドリア状態に依存して制御が異なるマクロファージ経路をさらに特異的に同定するために、"Hallmark" Molecular Signatures Database pathways (32)を用いて、小柄な真菌と非小柄な真菌にチャレンジしたマクロファージのトランスクリプトームの遺伝子セット濃縮解析（GSEA）(31)を行った。GSEAの結果、実験室と臨床のプチ株はともに、"インターフェロンα反応"、"インターフェロンγ反応"、"NFKBを介したTNFAシグナル伝達"、"炎症反応 "などの炎症性経路を誘導することが明らかになった。注目すべきは、GO用語の濃縮解析において、24時間後の "I型インターフェロン応答 "もまた、プチ感染マクロファージでのみ発現が上昇していたことである。一方、「低酸素」および「解糖」経路は、非ペタイト株でチャレンジしたマクロファージで一貫して濃縮されていることが観察された（図3H）。
多様な刺激に能動的に反応するマクロファージは、「古典的に」活性化されたM1から「代替的に」活性化されたM2表現型までのスペクトルにまたがる転写状態を持ちうる（29, 33）。小柄なマクロファージとそうでないマクロファージのトランスクリプトームがM1/M2極性状態に似ているかどうかを評価するために、ヒトのM1/M2転写モジュール（29）に対して、真菌に侵されたトランスクリプトームのGSEAを行った。観察された炎症性シグネチャーと一致して、小柄な株でチャレンジされたマクロファージは、ヒトM1転写モジュールの有意な濃縮を示した。全体として、これらのデータは、ミトコンドリア欠損プチ株がマクロファージを炎症性転写状態へと再プログラムしたことを示唆している（図3FからH）。
細胞内小柄株は薬剤濃度に関係なくエキノカンディン系薬剤に無反応である。
細菌性病原体における非増殖や低増殖は、致死濃度の抗生物質に曝されたときの生存率の上昇と関連していることから（1, 5, 34）、我々はC. glabrataの小胞体は致死濃度の殺真菌剤に曝されても生存しやすいという仮説を立てた。まず、小胞体ストレス（tunicamycin）、膜攻撃（SDS）、細胞壁ストレス（Congo red）、酸化ストレス（H2O2）などの一般的なストレスに対して、小胞体がより耐性があるかどうかを調べた。BYP41株とD5株（小柄な親株）、BYP40株とCBS138株（小柄でない親株）の生存率は、処理後3、6、24時間（pt）のCFU数を用いて定量的に評価した。実際、小胞体ストレスおよび膜ストレスでは、小胞体株は有意に高い生存率を示したが、細胞壁ストレスおよび酸化ストレスでは、非小胞体株と同程度の耐性を示した（図4A）。ERストレスに対する高い耐性は、他の小柄なC. glabrata分離株でもすでに報告されている(6)。次に、8×MICのミカファンギン（0.125 µg/mL）とカスポファンギン（0.25 µg/mL）で処理したときの小柄株とその非小柄株の3、6、24、48時間後の生存率を評価した。仮説通り、小胞子菌は非小胞子菌よりも有意に遅い殺滅速度を示し、これは緩慢で単相殺を特徴とする微生物耐性の表現型を模倣していた（34, 35）（図4B）。C.glabrataはマクロファージ内で生存でき、細胞内小柄菌は休眠状態であることから、細胞内小柄菌および非小柄菌分離株に対するミカファンギン（0.125μg/mL）およびカスポファンギン（0.25μg/mL）の影響を検討した。予想通り、細胞内小便虫はエキノカンジン処理に反応しなかったが、細胞内非小便虫は有意に高い殺滅率を示した（図4C）。細胞内小便虫は濃度に関係なくエキノカンジンに反応せず、非小便虫分離株と比較してRPMI中ではかなり遅い殺傷率を示した（図S4A）。RPMIで増殖した浮遊性小便虫はカスポファンギンの濃度が低い場合（0.03および0.06μg/mL）、24時間後に非小便虫と同程度の殺傷率を示した（図S4B）。他のプチ株で得られた結果と一致して、細胞内のrdm9Δ細胞はミカファンギン（0.125μg/mL）に対してほぼ100倍の耐性を示した（図S4C）。この結果を実証するため、ミカファンギン（0.125 µg/mL）存在下で細胞内競合アッセイを行い、3時間後と24時間後にフローサイトメトリーでGFP細胞とRFP細胞の割合を測定した。個々の株を用いた実験と一致し、小胞子株は非小胞子株よりも競争優位にあり、有意に高い生存率を示した（Fig.）
図4

図4 特定のストレスおよびエキノカンジン処理下では、小柄な表現型が有利である。プチット株と親株を、ツニカマイシン（小胞体ストレス；10μg/mL）、SDS（膜ストレス；0.02％）、コンゴレッド（細胞壁の完全性；10μg/mL）、メナジオン（0.5mM）を含むRPMIに懸濁し、指定した時点で生存率を評価し、生存率データを未処理のコントロールに対して正規化した。プチ株は小胞体ストレス（4生物学的複製、<0.01および*<0.00001、両側t検定）および膜ストレス（4生物学的複製、=0.01、両側t検定）に対して高い耐性を示したが、プチ株は酸化ストレスおよび細胞壁ストレスに対して同程度の耐性を示した（すべての実験は4生物学的複製で実施、=0.01、<0.01および*<0.00001、両側t検定）（A）。ミカファンギン(0.125 µg/mL)とカスポファンギン(0.25 µg/mL)投与下でのプランクトンBYP40とBYP41の生存率を評価した結果、BYP41の方が耐性が高く、細菌学で定義される耐性表現型を彷彿とさせる単相性で緩徐な殺傷動態を示した(8生物学的複製)(B)。細胞内BYP41はミカファンギンにもカスポファンギンにも反応しなかったが、細胞内親株はプチ株と比較して1,000倍から10,000倍の殺傷力を示した（4生物学的複製）（C）。細胞内のBYP40およびCBS138は、ミカファンギン処理下でそれぞれBYP41およびD5と競合した（3生物学的複製、****<0.00001、両側t検定）（DおよびE）。BYP40とBYP41は、プランクトン状態（8生物学的複製）または細胞内状態（4生物学的複製）のいずれにおいても、AMBによって同様に死滅した（F）。
以前の研究で、小柄な前駆細胞と小柄でない前駆細胞は、アムホテリシンBの標的である膜エルゴステロールの量が同程度であること(3)、BYP41に感染したカンジダ症患者がアムホテリシンBによる治療に成功したこと(12)を考えると、小柄な前駆細胞と非小柄な前駆細胞は、アムホテリシンBによる死滅速度が同程度であるはずである。この予想と一致し、2×MICのアムホテリシンB（2μg/mL）で処理した場合、小便虫と非小便虫は細胞内およびプランクトン状態で同程度の殺滅率を示した（図4F）。エキノカンジンとアムホテリシンBはともに殺真菌性抗真菌薬であるが、エキノカンジンの殺真菌性は細胞壁を産生する活発に増殖している細胞を必要とするのに対し、アムホテリシンBは増殖している細胞と増殖していない細胞を区別なく殺傷する(36)。これらのことから、小柄な細胞はエキノカンジン系薬剤に暴露された場合、非小柄な細胞に比べて体力的に有利であるが、ポリエン系アムホテリシンBでは非小柄な細胞と同様に効果的に死滅することが示唆される。
腸内コロニー形成および全身感染マウスモデルにおいて、小柄な細胞は非小柄な細胞と競合する。
細胞内に分離されたプチット菌は増殖しないことから、in vivoではプチット菌に駆逐される可能性が示唆された。この仮説を検証するため、腸内コロニー形成モデルと全身感染モデルを用いて、小柄株と非小柄株のin vivo競合実験を行った(37)。腸内コロニー形成モデルから採取した糞便サンプル、および全身感染マウスから採取した腎臓と脾臓を、それぞれコロニー形成（pc）後または感染後の複数のタイムポイントでYPDプレート上に散布し、得られたコロニーをTyphoon Laser Scanner（Cytiva社製）で可視化した。タイフーンではRFPとGFPを区別できないため、in vivoでの競合実験では、蛍光を発しないプチ株とGFPを発現する非プチ株を用いた。
腸内コロニー形成マウスモデルは、CF-1免疫不全マウスを用い、その常在腸内細菌をピペラシリン-タゾバクタム（PTZ）で除菌し、C. glabrataのコロニー形成を経口投与で誘導した。日目、3日目、5日目および7日目に採取した糞便サンプルをPTZを含むYPDプレートにプレーティングした。GFPを発現するCBS138と蛍光を発しないCBS138の組み合わせでコロニー形成されたマウスから、GFP発現細胞は腸内でわずかなフィットネスコストをもたらすことが明らかになった（図5A）。それにもかかわらず、腸内コロニー形成モデルでは、GFPを発現する非小柄なBYP40とCBS138が、それぞれ非蛍光性の小柄な分離株BYP41とD5と競合することが示された（図5BとC）。
図5

図 5 腸管コロニー形成および全身感染モデルマウスにおけるプチ株とその親株の生体内競合。CBS138-GFPおよび非標識CBS138の糞便サンプルを1、3、5、7日目に採取し、寒天YPDプレートにプレーティングし、GFPおよび非蛍光コロニー数を計数した。我々の腸内コロニー形成モデルでは、腸内コロニー形成に関連して、ゲノムGFPの統合がわずかながらフィットネスコストとなることが示された（各群5匹ずつ、各点は1匹のマウスを表す）（A）。BYP41 (B)とD5 (C)は、腸内コロニー形成モデルにおいて、親株に駆逐された。ゲノムGFPインテグレーションは腎臓では7日目に有意なフィットネスコストをもたらしたが（D）、脾臓ではフィットネスに影響を与えなかった（各タイムポイントに4匹ずつ、各ドットは1匹のマウスを表す）（E）。腸管コロニー形成と同様に、BYP41は免疫不全マウス(FとG)と免疫不全マウス(HとI)の両方でBYP40に駆逐された。
全身感染モデルでは、シクロホスファミドで免疫抑制したCD-1雌マウスを用いた。1、4、7dpiに採取した腎臓と脾臓をホモジナイズし、YPDプレートにプレーティングした。まず、このモデルにおいて、非蛍光性CBS138とGFP発現CBS138を用いて、GFP単独のフィットネスコストを評価した。GFP発現CBS138は腎臓で7日目にフィットネスコストが生じたが（図5D）、脾臓ではGFP発現単離株も非蛍光単離株も等しく豊富であった（図5E）。腸内コロニー形成の結果と一致し、小腸菌は腎臓と脾臓の両方で非小腸菌に駆逐された（図5FとG）。最後に、免疫不全マウスにおけるプチットと非プチットの競合を評価した。免疫不全マウスでは、小柄な個体はより高い持続性を示したが、腎臓と脾臓の両方で、非小柄な個体に容易に駆逐された（図S6AおよびB）。これらの結果を総合すると、小柄なマウスは非小柄なマウスに比べて、腸内コロニー形成や全身性感染症に対する適合性が低いことが示された。
エキノカンジン治療中の全身感染マウスモデルにおいて、小柄な個体はin vivoで生存率の向上を示した。
単培養および競合アッセイにおけるエキノカンジン曝露時のプタイトの生存率の優位性から、ヒト化用量のカスポファンギン（5mg/kg）投与時の全身感染マウスモデルにおいても、プタイトが非プタイトの親細胞と競合できるかどうかを検討した。小柄な細胞は全身感染マウスモデルで容易に競合するため、感染2時間前（pri）または4時間前にカスポファンギンの投与を開始した。前回のマウス実験と同様に、GFPを発現する非ペタイトおよび非蛍光性ペタイトを含む接種体でマウスを感染させ、1、4、7日目に腎臓と脾臓を採取し、YPD寒天プレートにプレーティングした。小腸菌は再び非小腸菌に駆逐されたが（図6A～D）、その生存率は無処置の状態に比べて有意に高かった（図S6AおよびB）。このことは、カスポファンギン曝露後、エキノカンジン感受性非小細胞はエキノカンジン耐性小細胞よりも効果的に死滅することを示唆している。これらの観察から、エキノカンジン投与下では、小柄な細胞はin vivoで生存に有利であることが示唆される。
図6

図 6 ヒト化カスプファンギン（5 mg/kg）を感染 2 時間前（A および B）または感染 4 時間後（C および D）に投与した全身感染マウスでは、BYP41 の生存率が改善した。
血液分離株における小柄な表現型の有病率は稀であるが、地域によって異なる
これまでの研究により、小柄な表現型は、薬剤（エキノカンディン）曝露がない場合、生体内では比較的不適であることが確認された。これらの観察から、小柄な株はC. glabrataの臨床分離株ではまれであることが示唆された。そこで、オーストリア（n＝600）、トルコ（n＝260）、パキスタン（n＝220）から1,000株以上のC. glabrata血流分離株を収集し、レトロスペクティブ国際研究を実施した。すべての分離株をYPG寒天平板上でストリーキングし、増殖しなかったものを小柄とみなした。興味深いことに、小柄な分離株は、純粋な小柄なコロニー（n=1；オーストリアの0.16％）、および小柄なコロニーとそうでないコロニーの両方を含む混合物（n=8；3.3％）として同定された。なお、分離株は歴史的なグリセロールストックから得られたものであり、このような分離株が同一サンプルの単一コロニーから得られたものなのか、複数のコロニーから得られたものなのかは著者らにはわからない。純粋な小児血液分離株は膵炎に罹患したアゾール未使用患者から得られたものであり、混合分離株に感染した患者の62.5％（5/8）はアゾールによる治療を受けていなかった。この疫学的知見から、プチ株は血液検体から回収されることは稀であるが、その有病率は地域によって異なり、臨床習慣と関連している可能性が示唆された。さらに、これらのデータは、SCVと同様に、小柄なコロニー（petite）と大柄なコロニー（non-petite）が混在することも示唆している(4)。
考察
多くの酵母の特徴は、酸素の有無にかかわらず増殖し、安定した呼吸不全の「プチ」細胞を形成する能力である(10)。血流病原体であるC. glabrataはこのような小胞体を形成することができるが、その生物学的性質は部分的にしか解明されておらず、その臨床的関連性については議論がある。異なる遺伝子変異が小柄な表現型を引き起こす可能性がある一方で、我々は、マクロファージ内で増殖できない、殺菌性のエキノカンジン系薬剤に極端に耐性を示すなど、異なる変異を持つ小柄な細菌が宿主やその他のストレスに対して同様の応答を示すことを示している。マウスでは、小頭菌は腸内への定着が悪く、全身感染も引き起こしにくいことが示された。WGSのデータから、小頭症に特異的な変異が、主にミトコンドリア機能に富む遺伝子で同定された。われわれのデュアルRNAseq解析により、小柄な感染マクロファージは、非小柄なマクロファージと比較して、I型インターフェロンシグナルと炎症性サイトカインに関連する経路を顕著に誘導し、これらを24時間持続することが明らかになった。最後に、3つの異なる国から分離されたC. glabrata血液分離株の大規模なコレクションをスクリーニングした結果、小柄の有病率は血液分離株全体の0％から3.3％の間で変動し、SCVと同様に小柄も大小のコロニーが混在していることが明らかになった。
以前の知見では、C. glabrataにおける小柄な表現型とMIP1の突然変異が関連していた(7)。このような変異は我々の分離株では観察されなかったことから、別のメカニズムがこの表現型の根底にあることが示された。進化した小柄のWGSデータから、新たに生じた変異はミトコンドリア関連経路に富んでいることが確認され、ミトコンドリアの欠陥が小柄の表現型を駆動していることが示唆された。根底にある遺伝的要因は複雑であり、小柄な表現型に対する複数の遺伝子の寄与はまだ完全には明らかにされていない。我々の実験では、RDM9の変異が小柄な表現型をもたらすことが確認され、小柄な表現型とミトコンドリアmRNA安定性との関連性が強調された。小柄な表現型に関与する遺伝子をより包括的に目録化するためには、より広範な臨床株を用いた今後の研究が必要である。
以前の観察と同様に、小柄な分離株はマクロファージの貪食率が有意に高いことがわかったが、これはβ-1,3-dグルカンのレベルが低下し、その代償としてマンナンのレベルが上昇したためと考えられる(7)。しかし、以前の観察結果（7）とは異なり、小柄な分離株は非小柄な分離株よりもマクロファージ内での生存率や複製率が高くはなく、24時間後にはマクロファージ内で効率的に複製された。この観察結果は、非小柄な分離株でDNA複製や細胞周期の進行に関与する経路の過剰発現が確認されたデュアルRNAseq解析のデータと一致していた。興味深いことに、このex vivoでの観察はin vivoでの競合実験と一致しており、腸内コロニー形成および全身感染マウスモデルにおいて、小柄な分離株は非小柄な分離株と容易に競合した。in vivo感染モデルにおけるプチット分離株の無力さは、これまでの観察結果（15, 17）と一致している。宿主細胞の感染初期にはミトコンドリア活性は低下すると予想されるが（7, 38）、in vivoの観察結果は、コロニー形成を確立し全身感染を維持するためにミトコンドリア機能が不可欠であることを裏付けている。免疫細胞、特にマクロファージはヘキソースに乏しく、代替炭素源や脂肪酸が豊富である(38, 39)。これら2種類の化合物の酸化には活性の高いミトコンドリアが必要であることから、小人は細胞内増殖を維持するためにこのような分子を同化することができない。さらに、RNA-seqのデータから、マクロファージはアミノ酸飢餓を引き起こすことが示唆されており（22）、アミノ酸産生にミトコンドリア経路が重要であることを考えると（10, 18）、小動物の細胞内成長はさらに妨げられると予想される。このように、抗真菌性の淘汰圧がない場合、小腸菌は宿主のコロニー形成と全身感染を維持できない不適当な表現型であり、粘膜表面にうまくコロニー形成して全身感染を引き起こすためには、ミトコンドリアの機能が重要な役割を果たすことが強調される。一方、Ferrariらは、BYP41が全身感染および膣内コロニー形成マウスモデルにおいて、BYP40を凌駕することを観察した(14)。この論争の背景を明らかにするには、さらなる研究が必要であるが、我々は、臨床検体から小柄/非小柄の比率を決定する際の技術的なばらつきに起因しているのではないかと考えている。小柄な分離株はフルコナゾール耐性であるが、非小柄な親株は耐性でないことから、Ferrariらは小柄な株と非小柄な株の比率を判別するために、ホモジネートを30μg/mLのフルコナゾールを含むYPDプレートにプレーティングした(14)。それにもかかわらず、我々の研究では、小柄な分離株も小柄でない分離株も、48時間培養後、30μg/mLのフルコナゾールを含むYPDプレート上で増殖することができた。そこで、この障害を克服し、in vivoマウスモデルで小柄／非小柄コロニーの比率を正確に測定するために、蛍光標識株を作製した。その結果、プチ感染マウスは非プチ感染マウスに比べ、試験したすべての臓器で真菌負荷が有意に低かった(15)。また、最近の研究で血液サンプルから分離されたC. glabrataのプチコロニーも、全身感染モデルマウスの脾臓、肝臓、腎臓で効率的に除去された(40)。
細菌はSCV (1, 4, 8)や抗生物質耐性細胞、持続性細胞(34)など様々な表現型をとることがあり、殺傷力のある抗生物質や宿主に関連する他のストレスでは効果的に死滅しない。このような表現型は、代謝活性が低く、増殖が停止しているか遅いことが特徴である(1, 4, 34, 41)。抗生物質にさらされると、耐性菌はクローン集団全体に存在する特異的な遺伝子変異により、ゆっくりとした一相性の死滅曲線を示すが、難分解性菌は二相性の死滅曲線を示し、遺伝的変化を持たないことが特徴である(34)。興味深いことに、カスポファンギンとミカファンギンに暴露すると、小柄な分離株は高い耐性を示し、一相性の殺傷パターンを示した。さらに、抗生物質耐性細胞と同様に、プチ株はエキノカンジン耐性を支える可能性のある複数の遺伝子に変異を有していた。しかし親株は、先に述べたようにエキノカンジン持続性の特徴を示した(36)。エキノカンジン耐性と持続性は、MIC濃度以上の殺真菌剤に曝されても生存することを意味する。興味深いことに、小柄株は細胞内で増殖しないため、貪食後に耐性が有意に増加し、殺真菌濃度のエキノカンディン系抗真菌薬に曝露すると、細胞内の小柄株は親株を凌駕した。生体内では、プチ株はミトコンドリア欠損親株に駆逐された。しかし、薬剤曝露後、ヒト化用量のカスポファンギンを投与したマウスでは、未投与の対照マウスと比較してプチ株の生存率が高かった。プチット菌がヒトにおいてどのようにして全身感染や表在性感染を引き起こし、ミトコンドリア欠損親株を凌駕することができるのかは現在のところ不明である。プチット菌は宿主の特定の生物学的ニッチを必要とし、それが確立されるには時間が必要であり、急性全身感染マウスモデルではこれらの要因が見逃されていた可能性がある。実際、小人は特定のin vitro条件下（10）や宿主内条件下（38）でミトコンドリア能力を持つ細胞に転換することができるため、末期の表現型とは考えられていない。この観察が生理学的および臨床的にどのような意味を持つのか、さらに調べる必要がある。
小柄な分離株と非小柄な分離株は、細胞膜上のエルゴステロールが同程度であるという一般的な観察結果(3)や、BYP41に感染した患者がアムホテリシンBによる治療に成功したという観察結果(12)と一致し、我々のin vitroおよびex vivoの解析では、アムホテリシンBで処理した小柄な分離株と非小柄な分離株の殺傷効率は同程度であった。この同程度の殺滅率は、エキノカンディン系薬剤と比較してアムホテリシンBの増殖依存性がないことが観察されたことに少なくとも一因がある(36)。さらなるin vitroおよび臨床試験が必要であるが、今回の実験から、アムホテリシンBによる治療がC. glabrataに慢性的に感染している患者に特に適している可能性が示唆された。
小柄な表現型が宿主細胞との相互作用にどのような意味を持つかは、いまだ解明されていないため、小柄なC. glabrataと小柄でないC. glabrataに感染したマクロファージが示すトランスクリプトーム応答を比較した。その結果、プチ感染マクロファージは24時間後に、より顕著なTII反応を示し、炎症性サイトカインシグナル伝達に関連する遺伝子の過剰発現が顕著であった。典型的にはウイルス感染と関連しているが、この反応は細菌、寄生虫（43）、真菌感染によっても誘導される（30, 44 - 48）。細菌感染と同様、真菌感染においてもTII反応は、宿主細胞の種類や真菌の種類によって異なる、やや議論の余地のある役割を果たしているようである(30, 44 - 48)。実際、TII応答はマクロファージにおけるC. glabrata細胞の生存に有益であることが指摘されており（45, 48）、それゆえ、マクロファージによって行われるTII応答が、宿主における小嚢菌の長期生存に寛容な環境を提供していると考えるのが妥当である。興味深いことに、カンジダ菌に感染した膣上皮細胞株では、π初期に宿主細胞のミトコンドリアDNAの放出がTII反応を促進する（30）。我々の実験は異なる細胞種で行われたが、プチ感染マクロファージにおける後期TII反応は、我々の細胞障害アッセイによって支持されたように、休眠プチ細胞によってマクロファージに与えられるダメージが減少した結果であると推測される。このような反応の背後にある刺激を明らかにし、マクロファージにおけるTII反応を阻害することでプチット感染者の負担を軽減できるかどうかを明らかにするためには、今後の研究が必要である。サイトカイン産生に関連する遺伝子の過剰発現は、プチット感染マクロファージのもう一つの特徴であった。このトランスクリプトームの書き換えは、C型レクチン受容体シグナル伝達の差につながる細胞壁糖鎖の違い（7）によって引き起こされる可能性がある。あるニッチにおける炎症亢進は病態の進展と関連しているので(49)、小柄なC. glabrataへの感染が現在知られていない病態の発現と関連しているかどうかを明らかにするための今後の研究が必要である。
驚くべきことに、小柄なC. glabrataは尿検体により多く含まれ（7、12、17）、最近の研究では、多様な臨床検体から分離されたC. glabrata臨床分離株のコレクションから10.2％（15/146）の小柄な分離株が同定された（7）。同じ血液サンプルから増殖したC. glabrataコロニーの遺伝子型の多様性を調べた最近のcandidemia研究でも、小柄な分離株の有病率は10％（1/10）であったようである（40）。1,000を超えるC. glabrata血液分離株を評価したわれわれのレトロスペクティブな多施設国際共同研究では、小柄な分離株はわずか9株（0.9％）であったが、小柄な有病率は国によって異なり、全分離株の0％～3.3％であった。興味深いことに、トルコで同定された小柄な分離株はすべて大小のコロニーが混在していた。これは臨床診療の違いを反映しているのかもしれないが、遺伝子型によっては小柄なコロニーを形成する傾向が強い可能性もある。臨床的な分離手順が、混合集団の中で増殖の遅いコロニーを不注意に選択し、小柄な細胞を効果的に検出できないようにし、その結果、臨床的実体としての小柄な細胞を過小評価する可能性があることは注目に値する。このように、小柄なC. glabrata分離株の同定とその臨床的妥当性の評価には、大小両方のコロニーを包括的かつ偏りなく特徴づけることが必要であることが示唆された。この仮説に沿うように、最近の研究で、血液培養から分離されたプチコロニーは寒天培地上で検出されるまでに84時間以上の培養を要し、微生物検査室では検出されなかったことが示されている。興味深いことに、検査された指標コロニーがアゾール感受性であったため、患者はフルコナゾールで治療されたが、このプチコロニーの過小評価により、フルコナゾールによる治療が失敗し、後の血液検体から純粋なプチコロニーが出現した(40)。したがって、微生物検査室での慣行と、血液（およびおそらく他の無菌検体）から分離された小柄菌の増殖の遅さが、小柄菌の表現型を過小評価する結果となった可能性がある。このような表現型の可塑性と、大コロニーから小コロニーへの、あるいはその逆への切り替えにより、C. glabrataは宿主内に効果的にとどまり、宿主の条件に応じてさまざまな代謝状態をとる。従って、感染過程におけるコロニーの大小の割合によって、抗真菌薬の治療効果を予測できる可能性がある。
小集団分離株はフルコナゾール治療後に出現することが知られているが（3, 12）、小集団感染患者の大部分はアゾール非投与株である（7, 17）。このことは、小柄なC.glabrata分離株もマクロファージ内在化後に出現するという以前の観察と一致している(7)。したがって、広範な臨床検体を用いた前向き観察研究により、臨床における小柄菌の有病率をより正確に反映し、小柄菌の出現を促進する誘導因子を発見できる可能性がある。
材料と方法
C. glabrata株および増殖条件
我々の臨床コレクションには37株が含まれ、そのうち2株は小柄であり（BYP41およびDPL248）、残りは非小柄であった。また、CBS138株からはC5株、D5株、F2株、G5株の4株が分離された（表S1）。BYP40、BYP41、DPL248、CBS138およびそれに由来する小柄変異体を除き、残りの分離株はMIP1の配列決定にのみ使用した。プチ単離株の作製に関する詳細は、結果に記載されている。すべての分離株はYPD寒天培地とブロスで一晩培養した。YPDは10g/Lの酵母エキス、20g/Lのペプトン、20g/Lのブドウ糖を含むが、YPGではブドウ糖を20g/Lのグリセロールに置き換えた。
マクロファージ感染
ヒト急性単球白血病細胞株（THP1；ATCC；米国バージニア州マナサス）由来のヒトTHP1マクロファージを用いた。THP1マクロファージは、1％pen-strep（ギブコ）と10％熱不活性化HFBS（ギブコ）を含むRPMI1640（ギブコ、フィッシャーサイエンティフィック、米国）で培養した。感染の2日前に、100万個のTHP1単球を100 nMのフォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸（PMA、シグマ社製）で24ウェルプレートに処理し、37℃の5％CO2インキュベーターで培養した。感染当日、マクロファージはPBSで洗浄し、新鮮なRPMI1640で処理した。一晩増殖させたC. glabrata細胞をPBSで3回洗浄し、実験に応じてマクロファージに10 C. glabrata/1マクロファージ、1/1、または10/1の感染多重度（MOI）で感染させた。C.glabrataは24時間後にマクロファージ内で5～7倍まで増殖する可能性があり、細胞内増殖速度を正確に測定するため、MOIを1/10とした。一方、細胞毒性および抗真菌薬による細胞内殺傷の影響を調べる実験では、MOIをそれぞれ1/1および10/1とした。注目すべきは、抗真菌薬の影響を48時間まで評価し、細胞内生存率の決定には100の希釈倍率を考慮したことから、未処理のコントロールマクロファージを再び1/10のMOIで感染させたことである。3時間の培養後、細胞外の非付着性C. glabrata株をPBSで広範囲に洗浄し、新鮮なRPMIで再度処理した。最初の洗浄液をYPDプレートにプレートし、貪食率を測定した。マクロファージを効果的に溶解し、ICCG細胞を放出させるため、氷冷水を加え、広範囲にピペッティングすることでマクロファージを溶解し、溶解液をYPD寒天プレートに移した。
小柄の判定
YPG寒天培地プレート上で生育できないプチットの可能性のある単離株は、そのような単離株が正真正銘のプチット変異体であることを確認するために、以下の実験に供した。ATPはルシフェラーゼキット（Thermo Fisher）を用いて測定した。簡単に述べると、RPMI中で指数関数的に増殖した細胞をPBSで2回洗浄し、ペレットを100単位のリチカーゼ（Sigma）を含むY1緩衝液中で37℃、30分間インキュベートした。その後、ペレットをATP抽出バッファー（Thermo Fisher）に再懸濁し、80℃で10分間インキュベートした後、ビーズビートを2分間行った。最後に、これらのサンプル20 µLをルシフェラーゼを含むマスターミックスに加え、プレートリーダーを用いて発光を測定した。ミトコンドリア膜活性は、フローサイトメトリー（BD Bioscience）を用いて、指数関数的に増殖したC. glabrata細胞からローダミン1,2,3（Sigma）を用いて測定した。CDR1、CDR2、PDR1、およびSNQ2の基礎発現レベルは、表S4、2枚目に記載したプライマーを用いて、指数関数的に成長したC. glabrataから決定し、発現値は、別の場所(6)に記載したRDN5.8プライマーを用いて正規化した。RNAは以前に記載された方法（30）を用いて抽出し、続いてDNase処理（QIAGEN）を行い、QIAGEN RNeasy Kitを用いてRNAサンプルを再精製した。なお、デュアルRNA-seq解析と、FKS1およびFKS2の発現レベルを決定するために用いたRNAサンプルは、同じRNA抽出方法を用いた。フルコナゾール耐性は、C. glabrata細胞がClinical Laboratory Standard Instituteの手順に従ってMIC≧64μg/mLを示した場合に判定され、MICは目視およびプレートリーダーを用いて決定された。
代謝物依存性の決定
代謝物が小柄および非小柄分離株の増殖速度に及ぼす影響を調べるため、C. glabrata細胞をYPDブロス中で一晩増殖させ、その後PBSで2回洗浄した。ODを0.1に調整し、200μLの細胞懸濁液を通気性フィルムカバー（シグマ社製）で密閉した96ウェルプレートに入れ、Tecanプレートリーダーを用いて16時間、速度論的増殖速度をモニターした。アルギニン（20 mg/L）、ロイシン（60 mg/L）、グルタミン（2 mM）、グルタミン酸（5 mM）、アスパラギン酸（20 mg/L）、メナジオン（5 µg/mL）、チミジン（100 µg/mL）、アデニン（20 mg/L）、およびヘミン（1 µg/mL）を添加したYNB単独株の最終増殖からYNB単独株の最終増殖を差し引き、その平均値をオンライン無料ツールを用いてヒートマップを作成した。
腸管コロニー形成マウスモデル
6週齢の雌性CF-1マウス（Charles River Laboratory）を用い、以前に確立された消化管モデルマウス（37）を用いた。C.glabrataのコロニー形成を効果的に確立し、常在腸内細菌を根絶するために、感染2日前からピペラシリン・タゾバクタムをマウスの皮下に投与し、期間終了まで毎日投与を続けた。コロニー形成は、100μLの滅菌PBSに1.5×108個の細胞を経口投与することで誘導した。コロニー形成後1、3、5、7日目に糞便サンプルを採取し、100μLをPTZを含むYPDプレートにプレーティングした。プレートは37℃で最長2日間インキュベートし、タイフーンイメージングを用いてプレートを可視化した。
全身感染マウスモデル
全身感染には6週齢のCD-1マウス（Charles River Laboratory）を用い、感染3日前からシクロホスファミドで免疫抑制し（150mg/kg）、3日ごとに1回100mg/kgを投与した(37)。感染は、5×107個の細胞を含む50μLの細胞懸濁液を用い、鼻-眼窩ルートで確立した。1日目、4日目、5日目に採取した腎臓と脾臓のサンプルをホモジナイズし、その100 µLをYPD寒天培地にストリークした。
ノックアウト作製
欠失変異体C. glabrataコロニーは、以前に記載された方法で作製した(6)。簡単に述べると、所望の遺伝子の外側のORFに相同なフランキング領域を含むヌルセオトリシンカセットを、表S4に列挙したプライマーを用いて増幅し、形質転換に用いた。コンピテントC. glabrata細胞は、Frozen-EZ Yeast Transformation Kit（Zymo Research社製）を用いて作製し、前述のエレクトロポレーションに基づく方法論に従った。形質転換酵母細胞をNAT含有YPD上に移し、コロニーを表S4に示す診断用プライマーに供した。
MIP1およびPDR1の配列決定
PDR1の塩基配列決定は既述のプライマーとPCR条件(50)に従った。MIP1の増幅と塩基配列決定に用いたプライマーを表S4に示す。
マクロファージ損傷アッセイ
C. glabrata分離株がマクロファージに与えるダメージの程度を測定するために、市販のキット（Sigma）を用いて乳酸脱水素酵素のレベルを測定した（30）。24時間後、上清を回収し、前述の方法でLDHを測定した(30)。各レプリケートのOD値をバックグラウンドコントロール（感染していないマクロファージ）のOD値から差し引き、補正した値をハイコントロール（0.25% Triton X-100で3分間処理した感染していないマクロファージ）のOD値で割った。補正した正規化値はパーセンテージで示した。
RNA抽出
5/1のMOIで感染させたマクロファージを3hpiで広範囲に洗浄し、新鮮なRPMIをウェルに加え、37℃でさらにインキュベートした。各工程でPBS洗浄を行った後、マクロファージは他の文献(30)に記載されている手動のRNA抽出プロトコールにかけた。RNAサンプルはRNase free-DNaseで処理し、さらにRNeasyキット（QIAGEN）を用いて製造者の指示に従って精製した。RNAサンプルの完全性と量は、それぞれRNAサンプルを1.5%アガロースゲルとNanoDrop（Thermo Fisher）で測定することで確認した。
RNA-seq
RNAサンプルはQubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を用いて定量し、RNAの完全性はAgilent TapeStation 4200 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)を用いてチェックした。RNA シークエンシングライブラリーは、NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina を用いて、製造元の指示に従って調製した（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）。簡単に説明すると、最初にmRNAをオリゴ(T)ビーズで濃縮した。濃縮したmRNAを94℃で15分間断片化した。cDNA断片は末端修復され、3′末端でアデニル化され、ユニバーサルアダプターがcDNA断片にライゲーションされた後、インデックスが付加され、制限サイクルのPCRによってライブラリーが濃縮された。シーケンスライブラリーはAgilent TapeStation (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)で検証し、Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)および定量的PCR (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, USA)で定量した。シーケンスライブラリーは4つのフローセルレーンにクラスタリングされた。クラスタリング後、メーカーの指示に従ってフローセルをIllumina HiSeq装置（4,000または同等）にロードした。サンプルは2×150bpのペアエンドコンフィギュレーションを用いてシーケンスした。画像解析と塩基判定はControlソフトウェアで行った。シーケンサーから生成された生配列データ（.bclファイル）をfastqファイルに変換し、イルミナのbcl2fastq 2.17ソフトウェアを用いて多重化を解除した。インデックス配列の同定には1つのミスマッチを許容した。
ゲノム配列決定
破断点でビオチン化アダプターと結合するトランスポザーゼを用いて、DNAを1～20kbのサイズに断片化した。鎖置換はトランスポザーゼが残したニックを「修復」するために行われた。3-6kbの断片を0.8％アガロースゲルで選択し、環状化した。円形化されていないDNAは消化によって取り除かれた。ビオチン化された末端を含む断片は、磁性ストレプトアビジンビーズを用いて引き下げられ、標準的なライブラリー調製に供された。2％アガロースゲルでの最終サイズセレクションを行い、400-700bpの断片を最終ライブラリーに選択した。最終ライブラリーをAgilent High-Sensitivityチップで解析して量を推定し、サイズ分布を確認した後、イルミナのcBotで増幅する前に、KAPAライブラリー定量キット（参考文献KK4835、KapaBiosystems）を用いてqPCRで定量した。ライブラリーはイルミナのHiSeq 2,500で2×150 bpのシークエンシングを行った。
ゲノム解析
PerSVade v 1.0 (54)に実装されているFreebayes (51)、HaplotypeCaller (52)、Bcftools (53)を用い、CBS138 A22-s07-m01-r86のゲノム配列をリファレンスとして用いて、すべてのシーケンスデータをSNPコール処理した(55)。ミトコンドリアを含む染色体レベルで解析した全株について、mosdepth (56)を用いてカバレッジを算出した。平均マッピング品質が30以下、QUAL値が20以下、またはリード深度が30以下のSNPはフィルターで除外した。信頼性の高いバリアントコール（2人以上のコーラーによって支持されたもの）を考慮した。表現型を持つ系統に特異的に現れる最近のバリアント（小柄特異的バリアント）を同定するために、この表現型が異なる関連系統間で差次的にコールされた高信頼性バリアントを考慮した。ある系統で同じバリアントが高い信頼度でコールされ、別の表現型を持つ系統で低い信頼度でコールされた場合、そのような違いは破棄した。DPL248は近縁の親株を欠き、CBS138参照株に対して多くの多型を有していたため、遺伝子座ごとのPubMLST検索を用いて、その対立遺伝子プロファイルに基づいて使用できる最も近い配列型を同定した(57)。最も近かったのはCST35とEB0911Sto(20)であった。それらの生リード（accession PRJNA361477）をダウンロードし、同じバリアントコールパイプラインを実行した。その後、DPL248の低信頼性フィルタリングに彼らのバリアントを使用した。さらに、integrative genomics viewer (58)を用いた目視検査により、アーティファクトと思われる変異を手動でフィルターした。BYP40とBYP41は近縁種であるが、小柄な表現型を持つのは後者のみであったため、それぞれに固有のSNPのみを考慮した。また、CBS138 に由来する 3 種類の小柄系統（C5, D5, F2, G5）のうち、2 つ以上の系統間で重複する SNP は、これらの共有変異は実験に用いた親株に存在する可能性が高く、小柄な表現型とは無関係であるため、除外した。最後に、調査した3つのクローンセットのうち2つ以上で小柄特異的変異を持つ遺伝子を選択した。選択されたSNPの最終リストは、variant effect predictor (59)を通して処理され、その領域のリードアラインメントを検査することによって手作業でキュレーションされた。
RNA-seq解析
FastQC v.0.11.8（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）およびMultiQC v.1.12（60）を用いて生のシーケンスデータの品質管理を行った。リードトリミングはTrimomatic v. 0.36 (61)を用い、以下のパラメータで行った： TruSeqアダプター：2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:3 MINLEN:50。
リードマッピングと定量には、スプライスジャンクションに敏感なリードマッパーSTAR v. 2.7.10a (62)をデフォルトパラメーターで使用した。真菌またはヒトのRNAのみからなるサンプルについては、リードを対応する参照ゲノムにマッピングした。宿主と病原体の両方のRNAを含むサンプルについては、ヒトと酵母の参照ゲノムを連結したものにリードをマッピングした。ヒトのデータについては、NCBIの新規T2T CHM13v2.0 Telomere-to-Telomereゲノムアセンブリー（63）ゲノムアノテーションを使用した（最終アクセス日：2022年5月12日）。このアセンブリにはミトコンドリアDNAが欠けていたため、Ensemblデータベースから入手したGRCh38ヒトゲノムアセンブリ（最終アクセス日：2022年5月12日（63））のヒトミトコンドリアゲノムを追加した。C. glabrata CBS138のリファレンスゲノムおよびゲノムアノテーションは、Candida Genome Database（CGD、最終アクセス日：2022年5月12日（55））から入手した。潜在的なリードのクロスマッピング率（すなわち、ヒトゲノムと真菌ゲノムの両方に等しくマップされたリード）は、crossmapper v. 1.1.1 (55)を用いて評価した。さらなるダウンストリーム解析はR v.3.6.1で行った。遺伝子発現差解析はDESeq2 v. 1.26.0 (64)を用いて行った。log-2フォールドチェンジ(L2FC)が1以上、調整P値(P adj)が0.01未満の遺伝子を差次的発現とみなした。差次的発現遺伝子の遺伝子オントロジー用語濃縮解析と濃縮度の可視化は、ClusterProfiler v. 3.14.3(65)を用いて行った。GO用語の濃縮解析には、"Biological Process "カテゴリーを使用した。C.glabrataのGOターム関連表はCGDから入手した（最終アクセス日：2022年5月12日）。一方、ヒトのデータについては、genome-wide annotation for the Human（すなわち、org.Hs.eg.db）データベースv.3.10.0を使用してGO濃縮検定を行った。
遺伝子セット濃縮解析
小柄なチャレンジドTHP-1マクロファージと非小柄なチャレンジドTHP-1マクロファージで異なる濃縮経路を定義するために、DESeq2で正規化したカウントを利用し、GSEAバージョン4.2.3を用いて遺伝子セット濃縮解析(31)を行った。遺伝子のランク付けの指標として「Signal2Noise」を用いて重み付け濃縮統計量を用いた「Hallmark」Molecular Signatures Databaseパスウェイ(32)の濃縮度を検証した。0.05未満の偽発見率（FDR）を持つ遺伝子セットを決定した。M1/M2転写モジュールの濃縮度を評価するために、Xueら(29)が記述した遺伝子セット（転写モジュール）を用いてGSEAを行った。
謝辞
本研究は、D.S.P.へのNIH 5R01AI109025の支援により行われた。
脚注
この論文は、米国微生物学会のフェローであるDavid S. Perlinが、Centre Hospitalier Universitaire VaudoisのDominique Sanglardとロチェスター大学医学部のElena Bulgacの査読を手配し、確保したものである。
補足資料
図S1 - mbio.01180-23-s0001.tif
実験室由来および臨床由来の小柄なC. glabrata分離株の発生過程。
ダウンロード
3.34 MB
図S2 - mbio.01180-23-s0002.tif
全ゲノム配列を用いた小柄分離株と非小柄分離株のミトコンドリアDNA（mtDNA）カバー率から、小柄分離株は非小柄分離株よりもmtDNAが低いことが確認された。
ダウンロード
5.61 MB
図S3 - mbio.01180-23-s0003.tif
小柄な分離株と同様に、Rdm9Δは親株CBS138よりもATPレベルが有意に低い。
ダウンロード
3.34 MB
図S4 - mbio.01180-23-s0004.tif
エキノカンディンに対する細胞内プチプチの非応答性。
ダウンロード
3.34 MB
図S5 - mbio.01180-23-s0005.tif
ミカファンギン処理下でGFPとRFPを区別するために用いたフローサイトメトリーのゲーティングと戦略。
ダウンロード
3.34 MB
図S6 - mbio.01180-23-s0006.tif
小柄な分離株BYP41に感染したマウスは、ヒト化用量のカスポファンギンで治療したマウスと比較して、特に初期の時点では腎臓の負担が低かった。
ダウンロード
3.34 MB
補足凡例 - mbio.01180-23-s0007.pdf
補足図の凡例
ダウンロード
67.53 KB
ASMは、論文にリンクされている、あるいは論文を通じてアクセスできる補足資料の著作権を所有しません。著者はASMに対し、補足資料ファイルを公開するための非独占的かつ世界的なライセンスを付与しています。再利用を希望される場合は、対応する著者に直接ご連絡ください。
参考文献
1.
Proctor RA, von Eiff C, Kahl BC, Becker K, McNamara P, Herrmann M, Peters G. 2006. 小コロニー変異体：持続的かつ再発性の感染を促進する細菌の病原形態。Nat Rev Microbiol 4:295-305.

クロスレフ
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
2.
Bouchara J-P, Zouhair R, LE Boudouil S, Renier G, Filmon R, Chabasse D, Hallet J-N, Defontaine A. 2000. カンジダ・グラブラータのアゾール耐性プチ変異体のin vivo選択。J Med Microbiol 49:977-984.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
3.
Brun S, Bergès T, Poupard P, Vauzelle-Moreau C, Renier G, Chabasse D, Bouchara JP. 2004. Candida glabrataの小変異体におけるアゾール耐性のメカニズム。Antimicrob Agents Chemother 48:1788-1796.

Crossref
PubMed
ISI社
Google Scholar
4.
Kahl BC, Becker K, Löffler B. 2016. 持続性感染症におけるブドウ球菌小コロニー変異体の臨床的意義と病原性。Clin Microbiol Rev 29:401-427.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
5.
Tuchscherr L, Medina E, Hussain M, Völker W, Heitmann V, Niemann S, Holzinger D, Roth J, Proctor RA, Becker K, Peters G, Löffler B. 2011. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Mol Med 3:129-141.

クロスレフ
PubMed
ISI社
Google Scholar
6.
ガルシア・ルビオR、ヒメネス・オルティゴサC、デグレゴリオL、キンテロスC、ショーE、パーリンDS。2021. 薬剤耐性細胞のトランスクリプトーム解析から明らかになった、エキノカンジン耐性におけるミトコンドリアの多因子的役割。

クロスレフ
パブコメ
Google Scholar
7.
Siscar-Lewin S, Gabaldón T, Aldejohann AM, Kurzai O, Hube B, Brunke S. 2021. ミトコンドリアの一過性機能不全は、貪食細胞による殺菌とフルコナゾールに対する真菌の交差耐性をもたらす。

クロスレフ
PubMed
Google Scholar
8.
Wolter DJ, Onchiri FM, Emerson J, Precit MR, Lee M, McNamara S, Nay L, Blackledge M, Uluer A, Orenstein DM, Mann M, Hoover W, Gibson RL, Burns JL, Hoffman LR, SCVSA study group. 2019. 嚢胞性線維症の小児における黄色ブドウ球菌小コロニー変異型呼吸器感染症（SCVSA）の有病率と臨床的関連：多施設観察研究。Lancet Respir Med 7:1027-1038.

クロスレフ
PubMed
Google Scholar
9.
Tuchscherr L, Heitmann V, Hussain M, Viemann D, Roth J, von Eiff C, Peters G, Becker K, Löffler B. 2010. 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の小コロニー変異体は、細胞内持続性に適応した表現型である。J Infect Dis 202:1031-1040.

Crossref
PubMed
ISIについて
Google Scholar
10.
Vowinckel J, Hartl J, Marx H, Kerick M, Runggatscher K, Keller MA, Mülleder M, Day J, Weber M, Rinnerthaler M, Yu JSL, Aulakh SK, Lehmann A, Mattanovich D, Timmermann B, Zhang N, Dunn CD, MacRae JI, Breitenbach M, Ralser M. 2021. ミトコンドリアゲノムを欠損した小細胞の代謝成長限界。Nat Metab 3:1521-1535.

クロスレフ
PubMed
グーグル奨学生
11.
Fekete V, Cierna M, Poláková S, Piskur J, Sulo P. 2007. Saccharomyces/kluyveromyces 複合体における小胞体生成能力の変遷。FEMS Yeast Res 7:1237-1247.
引用文献へ
クロスレフ
PubMed
ISI社
Google Scholar
12.
Posteraro B, Tumbarello M, La Sorda M, Spanu T, Trecarichi EM, De Bernardis F, Scoppettuolo G, Sanguinetti M, Fadda G. 2006年。再発性真菌症の1症例におけるCandida glabrataのアゾール耐性。J Clin Microbiol 44:3046-3047.

クロスレフ
PubMed
国際インフルエンザ学会
Google Scholar
13.
Gabaldón T, Naranjo-Ortíz MA, Marcet-Houben M, Munro C. 2016. 酵母病原体の進化ゲノミクス。FEMS Yeast Res 16:fow064.
引用文献へ
クロスレフ
PubMed
ISI研究所
グーグル
14.
Ferrari S, Sanguinetti M, De Bernardis F, Torelli R, Posteraro B, Vandeputte P, Sanglard D. 2011. カンジダ・グラブラータのアゾール耐性に関連するミトコンドリア機能の喪失は、マウスにおける病原性の増強につながる。Antimicrob Agents Chemother 55:1852-1860.

クロスレフ
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
15.
Brun S, Dalle F, Saulnier P, Renier G, Bonnin A, Chabasse D, Bouchara JP. 2005. Candida glabrataにおけるプチ変異の生物学的結果。J Antimicrob Chemother 56:307-314.

Crossref
PubMed
ISI社
Google Scholar
16.
Seider K, Brunke S, Schild L, Jablonowski N, Wilson D, Majer O, Barz D, Haas A, Kuchler K, Schaller M, Hube B. 2011. 通性細胞内病原体カンジダ・グラブラータは、マクロファージのサイトカイン産生とファゴライソソームの成熟を阻害する。J Immunol 187:3072-3086.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際免疫学会
Google Scholar
17.
Singh-Babak SD, Babak T, Diezmann S, Hill JA, Xie JL, Chen YL, Poutanen SM, Rennie RP, Heitman J, Cowen LE. 2012. カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）におけるエキノカンジン耐性の進化とメカニズムのグローバル解析。PLoS Pathog 8:e1002718.

論文
PubMed
ISI社
Google Scholar
18.
Spinelli JB, Haigis MC. 2018. 細胞代謝におけるミトコンドリアの多面的貢献。Nat Cell Biol 20:745-754.

Crossref
PubMed
国際アイソトープ学会
グーグル
19.
Martínez-Reyes I, Chandel NS. 2020. ミトコンドリアのTCAサイクル代謝産物が生理と病気を制御する。Nat Commun 11:102.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
グーグル
20.
Carreté L, Ksiezopolska E, Pegueroles C, Gómez-Molero E, Saus E, Iraola-Guzmán S, Loska D, Bader O, Fairhead C, Gabaldón T. 2018. 日和見病原体Candida glabrataにおけるゲノム変異のパターンは、交尾の存在とヒトとの二次的な関連を示唆している。Curr Biol 28:15-27.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
21.
Carreté L, Ksiezopolska E, Gómez-Molero E, Angoulvant A, Bader O, Fairhead C, Gabaldón T. 2019. Candida glabrata連続臨床分離株のゲノム比較により、感染クローン集団における遺伝的変異のパターンが明らかになった。Front Microbiol 10:112.
引用文献へ
引用
PubMed
ISI社
Google Scholar
22.
Zhang YJ, Rubin EJ. 2013. 饗宴か飢餓か：アミノ酸をめぐる宿主と病原体の戦い。Cell Microbiol 15:1079-1087.

Crossref
PubMed
ISI社
Google Scholar
23.
福田雄一、ツァイHF、マイヤーズTG、ベネットJE. 2013. 好中球による貪食過程および感染マウス脾臓におけるCandida glabrataの転写プロファイリング。Infect Immun 81:1325-1333.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
24.
Rubin-Bejerano I, Fraser I, Grisafi P, Fink GR. 2003. 好中球による貪食は、Saccharomyces cerevisiaeおよびCandida albicansにおいてアミノ酸欠乏応答を誘導する。Proc Natl Acad Sci U S A 100:11007-11012.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
25.
Schmitz-Esser S, Linka N, Collingro A, Beier CL, Neuhaus HE, Wagner M, Horn M. 2004. ATP/ADPトランスロカーゼ：クラミジアやリケッチアと関連する偏性細胞内共生アメーバに共通する特徴。J Bacteriol 186:683-691.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
26.
Alonso-Roman R, Last A, Mirhakkak MH, Sprague JL, Möller L, Großmann P, Graf K, Gratz R, Mogavero S, Vylkova S, Panagiotou G, Schäuble S, Hube B, Gresnigt MS. 2022. ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）のコロニー形成は、病原性を損なう代謝的適応を強制することにより、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）と拮抗する。Nat Commun 13:3192.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
Google Scholar
27.
Westermann AJ, Vogel J. 2018. デュアルRNA-Seqによる宿主-病原体トランスクリプトミクス。Methods Mol Biol 1737:59-75.
引用文献へ
引用文献
PubMed
Google Scholar
28.
Hovhannisyan H, Gabaldón T. 2019. 日和見ヒト真菌病原体における宿主と微生物の相互作用を解明するためのトランスクリプトーム配列決定アプローチ。Curr Top Microbiol Immunol 422:193-235.
引用文献へ
引用
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
29.
Xue J, Schmidt SV, Sander J, Draffehn A, Krebs W, Quester I, De Nardo D, Gohel TD, Emde M, Schmidleithner L, Ganesan H, Nino-Castro A, Mallmann MR, Labzin L, Theis H, Kraut M, Beyer M, Latz E, Freeman TC, Ulas T, Schultze JL. 2014. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity 40:274-288.

Crossref
PubMed
ISIについて
Google Scholar
30.
Pekmezovic M, Hovhannisyan H, Gresnigt MS, Iracane E, Oliveira-Pacheco J, Siscar-Lewin S, Seemann E, Qualmann B, Kalkreuter T, Müller S, Kamradt T, Mogavero S, Brunke S, Butler G, Gabaldón T, Hube B. 2021. カンジダ病原体は、膣上皮細胞において、保護的なミトコンドリア関連I型インターフェロンシグナルと損傷駆動型応答を誘導する。Nat Microbiol 6:643-657.

クロスレフ
PubMed
グーグル奨学生
31.
Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, Paulovich A, Pomeroy SL, Golub TR, Lander ES, Mesirov JP. 2005. 遺伝子セット濃縮解析：ゲノムワイド発現プロファイルを解釈するための知識ベースのアプローチ。遺伝子セット濃縮解析：ゲノムワイド発現プロファイルを解釈するための知識ベースのアプローチ。

遺伝子発現
医学・薬学
遺伝子発現
Google Scholar
32.
Liberzon A, Birger C, Thorvaldsdóttir H, Ghandi M, Mesirov JP, Tamayo P. 2015. 分子シグネチャーデータベース（MSigDB）ホールマーク遺伝子セットコレクション。Cell Syst 1:417-425.

クロスレフ
PubMed
ISIデータベース
Google Scholar
33.
Murray PJ. 2017. マクロファージの極性化。Annu Rev Physiol 79:541-566.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
34.
Balaban NQ, Helaine S, Lewis K, Ackermann M, Aldridge B, Andersson DI, Brynildsen MP, Bumann D, Camilli A, Collins JJ, Dehio C, Fortune S, Ghigo J-M, Hardt W-D, Harms A, Heinemann M, Hung DT, Jenal U, Levin BR, Michiels J, Storz G, Tan M-W, Tenson T, Van Melderen L, Zinkernagel A. 2019. 抗生物質の残留性に関する研究の定義とガイドライン。Nat Rev Microbiol 17:441-448.

クロスレフ
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
35.
Hill PWS, Moldoveanu AL, Sargen M, Ronneau S, Glegola-Madejska I, Beetham C, Fisher RA, Helaine S. 2021. サルモネラ菌の抗生物質持続感染における脆弱な万能性。Cell Host Microbe 29:1757-1773.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
36.
Arastehfar A, Daneshnia F, Cabrera N, Penalva-Lopez S, Sarathy J, Zimmerman M, Shor E, Perlin DS. 2023. マクロファージ内在化は多剤耐性真菌のリザーバーを形成し、薬剤耐性の出現を促進する。Nat Commun 14:1183.

Crossref
PubMed
グーグル奨学生
37.
Healey KR, Nagasaki Y, Zimmerman M, Kordalewska M, Park S, Zhao Y, Perlin DS. 2017. Candida glabrataのコロニー形成と全身播種のマウスモデルにおいて、消化管はエキノカンジン薬剤耐性の主要な発生源である。Antimicrob Agents Chemother 61:e01412-17.

クロスレフ
PubMed
ISI社
Google Scholar
38.
Rai MN, Balusu S, Gorityala N, Dandu L, Kaur R. 2012. カンジダ・グラブラータとマクロファージの相互作用の機能ゲノム解析：病原性におけるクロマチンリモデリングの役割。PLoS Pathog 8:e1002863.

論文
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
39.
Lorenz MC, Bender JA, Fink GR. 2004. マクロファージによるカンジダ・アルビカンスの内在化に伴う転写応答。Eukaryot Cell 3:1076-1087.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI社
Google Scholar
40.
バドレーンH、チェンS、デュポンCL、ハオB、ドリスコルE、モーダーK、リューG、ニューブロウA、フレレスG、コールD、エスピノサJL、クランシーCJ、グエンMH。血液培養陽性菌から得られたCandida glabrataの集団における遺伝子型の多様性と未認識の抗真菌薬耐性。Res Sq:rs.3.rs-2706400.

クロスレフ
PubMed
Google Scholar
41.
Moldoveanu AL, Rycroft JA, Helaine S. 2021. 宿主に対する細菌の持続性の影響。Curr Opin Microbiol 59:65-71.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
42.
Rosenberg A, Ene IV, Bibi M, Zakin S, Segal ES, Ziv N, Dahan AM, Colombo AL, Bennett RJ, Berman J. 2018. 抗真菌薬耐性は耐性とは異なる亜集団効果であり、持続性カンジダ血症と関連している。Nat Commun 9:2470.
引用文献へ
相互参照
PubMed
グーグル奨学生
43.
Boxx GM, Cheng G. 2016. 細菌感染におけるI型インターフェロンの役割。Cell Host Microbe 19:760-769.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
44.
Majer O, Bourgeois C, Zwolanek F, Lassnig C, Kerjaschki D, Mack M, Müller M, Kuchler K. 2012. I型インターフェロンは、カンジダ感染時に炎症性単球と好中球を制御することにより、致命的な免疫病理を促進する。PLoS Pathog 8:e1002811.

クロスレフ
PubMed
国際免疫学連合
グーグル
45.
Riedelberger M, Penninger P, Tscherner M, Seifert M, Jenull S, Brunnhofer C, Scheidl B, Tsymala I, Bourgeois C, Petryshyn A, Glaser W, Limbeck A, Strobl B, Weiss G, Kuchler K. 2020. I型インターフェロン応答は、宿主の鉄ホメオスタシスを調節し、カンジダ・グラブラータ感染を促進する。Cell Host Microbe 27:454-466.

クロスレフ
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
46.
Pekmezovic M, Dietschmann A, Gresnigt MS. 2022. 宿主と真菌の相互作用におけるi型インターフェロン：抗真菌免疫のウイルス化？PLoS Pathog 18:e1010740.

クロスレフ
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
47.
Smeekens SP, Ng A, Kumar V, Johnson MD, Plantinga TS, van Diemen C, Arts P, Verwiel ETP, Gresnigt MS, Fransen K, van Sommeren S, Oosting M, Cheng S-C, Joosten LAB, Hoischen A, Kullberg B-J, Scott WK, Perfect JR, van der Meer JWM, Wijmenga C, Netea MG, Xavier RJ. 2013. 機能ゲノミクスにより、カンジダ・アルビカンスに対する宿主防御の中心となるI型インターフェロン経路が同定された。Nat Commun 4:1342.

クロスレフ
PubMed
Google Scholar
48.
Riedelberger M, Penninger P, Tscherner M, Hadriga B, Brunnhofer C, Jenull S, Stoiber A, Bourgeois C, Petryshyn A, Glaser W, Limbeck A, Lynes MA, Schabbauer G, Weiss G, Kuchler K. 2020. I型インターフェロンは、マクロファージによるカンジダ・グラブラータの亜鉛中毒を改善し、真菌の免疫回避を促進する。

Crossref
PubMed
Google Scholar
49.
Meli VS, Veerasubramanian PK, Atcha H, Reitz Z, Downing TL, Liu WF. 2019. 健康と疾患におけるマクロファージの生物物理学的制御。J Leukoc Biol 106:283-299.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
50.
Arastehfar A, Daneshnia F, Salehi M, Yaşar M, Hoşbul T, Ilkit M, Pan W, Hagen F, Arslan N, Türk-Dağı H, Hilmioğlu-Polat S, Perlin DS, Lass-Flörl C. 2020. トルコにおけるカンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）血中分離株の低レベル抗真菌薬耐性：フルコナゾール最小発育阻止濃度とFKS変異は治療失敗を予測できる。Mycoses 63:911-920.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
51.
Garrison E, Gabor M. 2012. ハプロタイプに基づくショートリードシーケンスからのバリアント検出。
引用文献へ
Google Scholar
52.
Poplin R, Ruano-Rubio V, DePristo MA, Fennell TJ, Carneiro MO, Van der Auwera GA, Kling DE, Gauthier LD, Levy-Moonshine A, Roazen D, Shakir K, Thibault J, Chandran S, Whelan C, Lek M, Gabriel S, Daly MJ, Neale B, MacArthur DG, Banks E. 2018. 正確な遺伝子バリアント発見を数万サンプルまで拡大。
引用文献へ
クロスリファレンス
グーグル・スカラー
53.
Li H. 2011. シーケンシングデータからのSNPコーリング、変異発見、関連マッピング、集団遺伝学的パラメータ推定のための統計的フレームワーク。Bioinformatics 27:2987-2993.
引用文献へ
論文
論文
ISI研究所
Google Scholar
54.
Schikora-Tamarit MÀ, Gabaldón T. 2022. PerSVade：あらゆる生物種におけるパーソナライズされた構造バリアント検出。Genome Biol 23:175.
引用文献へ
論文
パブコメ
ISI社
Google Scholar
55.
Skrzypek MS, Binkley J, Binkley G, Miyasato SR, Simison M, Sherlock G. 2017. カンジダゲノムデータベース（CGD）：アセンブリ22の組み込み、系統的識別子、ハイスループットシーケンスデータの可視化。Nucleic Acids Res 45:D592-D596.

Crossref
PubMed
ISI社
Google Scholar
56.
Pedersen BS, Quinlan AR. 2018. Mosdepth: ゲノムとエクソームの迅速なカバレッジ計算。Bioinformatics 34:867-868.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI社
グーグル
57.
Gabaldón T, Gómez-Molero E, Bader O. 2020. カンジダ・グラブラータの分子タイピング。Mycopathologia 185:755-764.
引用文献へ
相互参照
PubMed
ISI研究所
グーグル
58.
Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Winckler W, Guttman M, Lander ES, Getz G, Mesirov JP. 2011. Integrative Genomics viewer. Nat Biotechnol 29:24-26.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISIのホームページ
Google Scholar
59.
McLaren W, Gil L, Hunt SE, Riat HS, Ritchie GRS, Thormann A, Flicek P, Cunningham F. 2016. ensemblバリアント効果予測ツール。Genome Biol 17:122.
引用文献へ
論文
パブコメ
ISI（国際標準化機構
Google Scholar
60.
Ewels P, Magnusson M, Lundin S, Käller M. 2016. MultiQC: 複数のツールやサンプルの解析結果を1つのレポートにまとめる。Bioinformatics 32:3047-3048.
引用文献へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
グーグル
61.
Bolger AM, Lohse M, Usadel B. 2014. Bioinformatics 30:2114-2120.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI社
Google Scholar
62.
Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, Chaisson M, Gingeras TR. 2013. STAR：超高速ユニバーサルRNA-seqアライナー。バイオインフォマティクス 29:15-21.
引用文献へ
論文
パブコメ
ISI社
グーグル
63.
Nurk S, Koren S, Rhie A, Rautiainen M, Bzikadze AV, Mikheenko A, Vollger MR, Altemose N, Uralsky L, Gershman A, Aganezov S, Hoyt SJ, Diekhans M, Logsdon GA, Alonge M, Antonarakis SE, Borchers M, Bouffard GG, Brooks SY, Caldas GV, Chen N-C, Cheng H, Chin C-S, Chow W, de Lima LG、 Dishuck PC, Durbin R, Dvorkina T, Fiddes IT, Formenti G, Fulton RS, Fungtammasan A, Garrison E, Grady PGS, Graves-Lindsay TA, Hall IM, Hansen NF, Hartley GA, Haukness M, Howe K, Hunkapiller MW, Jain C, Jain M, Jarvis ED, Kerpedjiev P, Kirsche M, Kolmogorov M, Korlach J, Kremitzki M、 Li H, Maduro VV, Marschall T, McCartney AM, McDaniel J, Miller DE, Mullikin JC, Myers EW, Olson ND, Paten B, Peluso P, Pevzner PA, Porubsky D, Potapova T, Rogaev EI, Rosenfeld JA, Salzberg SL, Schneider VA, Sedlazeck FJ, Shafin K, Shew CJ, Shumate A, Sims Y, Smit AFA, Soto DC、 Sović I, Storer JM, Streets A, Sullivan BA, Thibaud-Nissen F, Torrance J, Wagner J, Walenz BP, Wenger A, Wood JMD, Xiao C, Yan SM, Young AC, Zarate S, Surti U, McCoy RC, Dennis MY, Alexandrov IA, Gerton JL, O'Neill RJ, Timp W, Zook JM, Schatz MC, Eichler EE, Miga KH, Phillippy AM. 2022. ヒトゲノムの全塩基配列。Science 376:44-53.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
グーグル
64.
Love MI, Huber W, Anders S. 2014. DESeq2によるRNA-seqデータのフォールド変化と分散のモデレート推定。Genome Biol 15:550.
引用文献へ
引用文献
PubMed
ISI社
グーグル
65.
Yu G, Wang L-G, Han Y, He Q-Y. 2012. ClusterProfiler: 遺伝子クラスター間の生物学的テーマを比較するためのRパッケージ。omics 16:284-287.
引用文献へ
遺伝子発現
パブコメ
ISIの概要
グーグル
全文を見るPDFをダウンロード
推奨する
一過性のミトコンドリア機能障害は真菌の貪食細胞死とフルコナゾールに対する交差耐性をもたらす
MBio, 2021
一過性のミトコンドリア機能不全が貪食細胞死とフルコナゾールに対する真菌の交差耐性をもたらす
MBio, 2021
薬剤耐性細胞のトランスクリプトーム解析から明らかになったエキノカンジン耐性におけるミトコンドリアの多因子的役割
MBio, 2021
気管支肺胞洗浄液の自然免疫および適応免疫単一細胞プロファイリングによる軽症COVID-19と重症COVID-19の鑑別
Els Wautersら、Cell Research誌、2021年
DNAインターカレーションを介して作用する微生物抗腫瘍剤のターゲットゲノムマイニング
Zhijie Zhaoら、Synthetic and Systems Biotechnology誌、2023年
バングラデシュにおける肺炎桿菌の臨床分離株における抗生物質耐性パターンの評価
パラマ・アミヌルら、バイオセーフティと健康、2021年
提供
米国微生物学会ロゴ
ASMジャーナルロゴ
ジャーナル
抗菌薬と化学療法
応用・環境微生物学
臨床およびワクチン免疫学
臨床微生物学レビュー
エコサル・プラス
真核細胞
感染と免疫
細菌学ジャーナル
臨床微生物学ジャーナル
微生物学・生物学教育ジャーナル
ウイルス学ジャーナル
mバイオ
微生物学・分子生物学レビュー
微生物学リソース
微生物学スペクトラム
mSphere
mシステム
リソース
Microbiologyについて
著者センター
アクセス許可
ASMジャーナルコレクション
出版倫理
移行情報
広告
ASMメンバーシップ
プライバシーポリシー
会員規約
所有権に関する通知
非商用TDMライセンス
いつでもつながる
アラート
RSSフィード
お問い合わせ
ASMコミュニティ
ニュース
プレスリリース
ポリシーステートメント
著作権 © 2023 米国微生物学会

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？