腸内細菌とメタボロームの統合解析により、Bifidobacterium longum BB536サプリメントによる便通調節のための糞便バイオマーカーを同定した。RCT

2022年11月30日 23:33

腸内細菌とメタボロームの統合解析により、Bifidobacterium longum BB536サプリメントによる便通調節のための糞便バイオマーカーを同定した。RCT
著者リンク集オーバーレイパネルYuyaNakamuraab1ShinjiFukudaadghi
https://doi.org/10.1016/j.csbj.2022.10.026
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クリエイティブ・コモンズ・ライセンスに基づくオープンアクセス
要旨
背景
Bifidobacterium longum BB536の補給は、健常者や過敏性腸症候群（IBS）患者を含む様々な人々の便通を整えるために用いることができる。しかし、B. longum BB536治療に対する反応には個人差がある。その要因のひとつと考えられているのが腸内細菌叢である。最近の研究では、腸内細菌叢が食事や薬剤の宿主への影響を媒介することが報告されている。そこで、B. longum BB536の排便回数増加効果に関連する腸内細菌叢やメタボロームなどの腸内環境について検討した。

研究結果
主に便秘傾向のある成人24名を対象に、無作為化二重盲検比較クロスオーバー試験を実施した。被験者には、B. longum BB536を耐酸性シームレスカプセルに入れたもの、または同様にカプセル化したデンプン粉末をプラセボ対照として、2週間の食事介入を行った。排便回数は毎日記録し、複数の時点で糞便サンプルを採取し、質量分析で得られたメタボロームデータとハイスループットシーケンスで得られたマイクロバイオームデータを統合解析するメタボロゲノムアプローチで解析した。B. longum摂取による排便頻度には被験者間で差があった。B. longum摂取前に採取した糞便サンプルのマイクロバイオームとメタボロームの特徴から、機械学習により反応者を予測したところ、反応者はB. longumの摂取により便通が改善した。8つの細菌属の存在量は、反応者と非反応者の間で有意に異なっていた。

結論
腸内細菌とメタボロームプロファイルは、B. longum BB536補給後の便通改善の潜在的なマーカーとして利用できるかもしれない。これらの知見は、個別化されたプロバイオティクス治療の開発に示唆を与えるものである。

図解抄録

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略語
AUROCarea under the receiver operating characteristic curveSCFAsshort-chain fatty acidsCE-TOFMScapillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometryCSAD-camphor-10-sulfonic acidESVsexact sequence variantsFDRfalse discovery rateIBDinflammatory bowel diseaseIBSirritable bowel syndromeITTintention-to-treatMCMCMCVMarkov Chain Monte CarloMDSMarticonal SimulationNRNR MCMCMarkov Chain Monte CarloMDSmultidimensional scalingNRsnonrespondersPPper-protocol populationPSRFpotential scale reduction factorSRsstrong respondersWAICWidely Applicable Information CriterionWRsweak responseers
キーワード
ビフィズス菌プロバイオティクス腸内細菌叢16S rRNA遺伝子配列メタボロゲノミクス機械学習

はじめに
便秘は、あらゆる年齢層の人々に影響を与える世界的に一般的な消化器疾患である。便秘は一般人口の5.4%から26.2%に見られると報告されており [1], [2], [3]、便秘は過敏性腸症候群（IBS）、パーキンソン病、腎臓病など多くの疾患の患者で起こることが知られています [4], [5], [6]。便秘を解消するために、いくつかの食事療法が行われている。例えば、食物繊維やマグネシウムは排便回数を増加させることが報告されています[3], [7], [8], [9]。また、近年、ヨーグルトなどの発酵食品が便秘解消に有用であるとして注目されています。ビフィズス菌は、代表的なプロバイオティクス属の微生物で、便通を整えるために頻繁に利用されています[10]。複数の無作為化比較試験により、ビフィズス菌の摂取により排便回数が増加すること[11], [12], [13], [14] または腸管通過時間が短縮すること[15], [16]が示されています。しかし、ビフィズス菌の補給に対する反応は、被験者によって異なります。ビフィズス菌の補給がIBS症状を緩和すると報告した試験もあれば、IBSの治療に効果を認めなかった試験もある [17], [18]。

これらの異なる観察結果を説明する1つの要因は、腸内細菌叢の構成である可能性がある。実際、腸内細菌叢の組成の個人差は、プロバイオティクスを介した刺激に影響を与えることが知られている [19] 。ヒトマイクロバイオームのハイスループット配列決定に基づく最近の研究により、食事に対する宿主応答が腸内細菌によってどのように影響されるかが解明されている [20], [21], [22], [23], [24], [25]。例えば、人工甘味料の過剰摂取により誘発される腸内細菌異常は宿主の耐糖能代謝を障害し[20]、食事性乳化剤の過剰摂取は腸内細菌叢を介して大腸炎やメタボリックシンドロームを促進する[21]などです。さらに、別の研究でIBS-Dの女性に複数種のプロバイオティクスカプセルを投与したところ、炎症マーカーに有益な変化を示した患者は、対応する非反応者と比較して、フェカリス菌、ロイコノストック、オドリバクターのベースラインの割合が高くなりました[26]。Bifidobacterium longum AH1206をヒトに経口投与したところ、菌が定着するかどうかに個人差があり、安定的に定着するためには代謝的ニッチが必要であった[27]。

こうした反応の個人差は、腸内細菌叢のオミックスデータからある程度の精度で予測できる[22], [23]。消化器疾患の中でも特に有名な炎症性腸疾患（IBD）患者では、抗インテグリン生物学的製剤治療に対する反応が、腸内細菌の機能から予測できる[28]。腸内環境の状態から薬剤や食事の効果を予測することで、個別化処方が可能になるかもしれない。つまり、個人の腸内環境に基づいたコンパニオン診断により、個別化医療や医療費削減が可能になるかもしれない。

本研究では、日本で市販されているプロバイオティクス製品であるB. longum BB536に着目し、便秘症の成人を対象とした無作為二重盲検クロスオーバー試験を行い、B. longum BB536補給の排便回数に対する効果を検討しました（図1A, B）。また、試験中に採取した糞便サンプルの16S rRNA遺伝子ベースのマイクロバイオームおよびメタボローム解析を行い、B. longum BB536の補給が腸内環境に及ぼす影響を評価しました。さらに、反応の個人差にも着目し、B. longum BB536摂取による各個人の排便回数増加効果をベイズ統計モデルで推定しました。

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図1. ビフィズス菌摂取が便通に及ぼす影響に関するランダム化比較試験の概略図。A：無作為化二重盲検プラセボ対照クロスオーバー試験の各フェーズを示すフロー図である。B：耐酸性シームレスカプセルに封入したB. longum BB536の摂取による排便回数の増加を検討するランダム化二重盲検比較試験のデザインを示す図である。C：箱ひげ図は、1日あたりの排便回数を示す。*, p < 0.05, Wilcoxon signed-rank test. ITT: Intention-To-Treat.

結果
2.1. B. longum BB536摂取による排便回数への影響
本研究では、B. longum BB536を含む耐酸性シームレスカプセルの摂取による排便回数の増加を定量的に評価するために、無作為二重盲検比較クロスオーバー試験を実施した。24名の被験者全員が試験を完了した。試験期間中に採取した糞便サンプルのマイクロバイオームおよびメタボロームプロファイルを解析した。24名中4名はプロトコールに違反したため、マイクロバイオームおよびメタボロームプロファイルの解析は行わなかった。試験介入期間中に排便回数が増加することが確認された（図1C、表S1）。その結果、介入期間2週目に排便回数が対照群に比べ増加した（intention-to-treat（ITT）集団：p＝0.0334、per-protocol（PP）集団：p＝0.0492）。その他の便のメタデータ（量、形状、色）の結果を表S2に示す。

2.2. B. longum BB536サプリメントの介入により各個体の腸内環境は安定した。
糞便サンプルから抽出したDNAをもとに16S rRNA遺伝子領域を増幅し、ハイスループットシーケンサーを用いて塩基配列を決定し、被験者のマイクロバイオーム組成が実験期間中にどのように変化したかを明らかにした。これらのシークエンスデータに基づき、細菌属レベルでの相対的存在量、α多様性、β多様性を算出した。さらに、糞便サンプルから代謝物を抽出し、キャピラリー電気泳動とエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計（CE-TOFMS）のカップリングによって分析した。その結果、322種類の代謝物が検出された。メタボロームデータから、サンプル内のマイクロバイオーム組成の複雑さを表すα多様性とサンプル間の多様性を表すβ多様性を算出した。2つの介入群のいずれにおいても、腸内細菌叢およびメタボローム組成に全体的な傾向は認められなかった（図2A、C）。また、全サンプル間の類似性を解析するためにβ多様性を用いた多次元尺度法（MDS）解析の結果、同一被験者のマイクロバイオームおよびメタボローム組成は実験期間中に類似することが示された（図2B、D、図S1A,B）。これらの結果から、腸内細菌とメタボローム組成の個人差の影響は、介入の効果よりも大きいことが示唆された。

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図2. メタボロゲノムデータの全体像。A: ヒートマップは上位20属の相対的な存在量を表している。0.001未満の場合は白色で表現される。B: 散布図は、マイクロバイオーム組成から算出したβ多様性（スピアマン相関係数距離）を用いたMDSの結果を示している。C：糞便サンプル中の上位20代謝物の存在量を表したヒートマップです。1000未満の場合は白色で表現しています。D: 代謝物組成から算出したβ多様性（スピアマン相関係数距離）を用いてMDSを行った結果を示す散布図である。被験者ごとに同じ色を使用した。

その後、腸内細菌および代謝物の個体差を解析した。一般に、クロスオーバー試験では、キャリーオーバー効果が生じる可能性があるとされている。本研究では、腸内細菌とメタボロームについて、A群とB群の間でスピアマンの距離を比較したが、キャリーオーバー効果は認められなかった（図S2）。次に、同時点（C2-T2、C3-T3）における対照群と試験介入群の腸内細菌と代謝物の差を比較するため、Wilcoxon signed-rank test（両側検定）を実施した。その結果、試験介入群では一部の細菌属が他の群と異なっていた（p＜0.05、補正なし）。しかし、偽発見率（FDR）補正を適用した場合、変化は検出されず（表S3）、α多様性に有意な変化は検出されなかった（表S4、図S3）。以上の結果から、B. longum BB536摂取による腸内細菌叢およびメタボロームへの影響は、腸内環境の個人差による影響に比べて小さく、B. longum BB536サプリメント介入に対して各個人の腸内環境は頑健であったことが示された。

2.3. ベイズ型ワイブル回帰分析による腸内反応者の判定
B. longumサプリメントまたはプラセボ効果による排便頻度の増加の程度は、被験者によって異なっていた。個人の腸内環境のマイクロバイオームやメタボロームの特徴が反応の大きさに影響するかどうかを検証するために、まずベイズ統計モデルを用いて各個人における治療効果の大きさを定量化した。モデルは、プラセボ効果および被験物質効果の大きさを正確に推定するように定式化された。モデルでは、時間の経過に伴う便意の発生傾向から、各個人の排便間隔を使用した。排便間隔は、1日の排便頻度から算出した。モデルのパラメータは、便通間隔をモデルにベイズ統計的に当てはめることにより推定した。被験者MO03は、この被験者の排便が全観察期間（85日間）を通して一貫して1日1回であったため、さらなる解析から除外された。

個人差を調べるためにいくつかのモデルを用意し、そのうちのいくつかは個人間で一定の治療効果を仮定し、個人間のばらつきも仮定した（表S5）。モデルの評価は、WAIC（Widely Applicable Information Criterion）[29]を用いて行った。WAICが低いほど、モデルがオーバーフィットすることなくデータを説明したことを示す。WAIC は未知データに対する予測性能の指標である．その結果、プラセボ効果やサプリメント効果を考慮したモデルが最もWAICが低くなった（表S6）。この結果は、B. longum BB536サプリメントの摂取により、排便回数が増加した被験者がいることを示しており、これらの被験者を「腸管反応者」と定義した。

WAICが最も良いモデルを用いて、各個人について各パラメータの事後平均を推定し、そのベイズ信頼区間を算出した（表S6、図3）。被験者MO04、MO05、MO10における試験用サプリメントの効果は、予測分布の95 %ベイズ信頼区間の下限が0より大きいことから明らかなように、強いものであった。したがって、MO04、MO05、および MO10 を強応答者（SR）と定義した。さらに，推定事後平均値が0より大きい9名の被験者を弱い反応者（WR）と定義した．残りの被験者を非応答者（NR）とした。

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Fig.3. 排便時間間隔のヒストグラムとワイブル分布の確率密度関数。左の縦軸は確率密度関数の値、右の縦軸は全観察期間（85日間）における推定排便間隔の頻度を示す。ベイズ事後分布に基づき、被験者のレスポンダー状態を定義した。SRはオレンジ色のラベルで、WRは黄色のラベルで、NRは黒色のラベルで表示される。SRはオレンジ色、WRは黄色、NRは黒色で示した(この図の凡例の色の解釈については、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい。)。

2.4. B. longum BB536摂取前に得られたメタボロゲノミクスデータを用いた機械学習による腸内反応性物質の予測
B. longum BB536の補給に対する反応を決定する腸内環境要因の実験観察と並行して、B. longum BB536摂取前の腸内環境特徴から反応者を予測できるかについても、機械学習的アプローチで検討した。LASSO回帰とロジスティック回帰を組み合わせた機械学習法を用い、被験者がレスポンダーになるかどうかを試験介入前のメタボロゲノムデータ（糞便マイクロバイオームとメタボロームデータ）から予測し、この戦略を評価した（Fig. 4A）。レスポンダーを予測するための説明変数として、細菌属の構成、代謝物、またはそれらの組み合わせを用い、グリッドサーチと層別クロスバリデーションにより、機械学習のパラメータ推定と性能評価を行った。層別クロスバリデーションでは，7 名の被験者が NR であることを考慮し，7 回の層別クロスバリデーションを選択し，追加学習データを使用した．その結果，すべての応答者（SRとWR）を予測することができ，代謝物と菌属データを用いた場合に最も高い性能（AUROC＝0.821）を示した（図4B，表1）．高い性能が得られたものの、学習データには19サンプルしか含まれていないため、モデルの過剰学習が発生した可能性があります。そこで、予測モデルの検証のため、本研究の第2コホート（n = 22、マイクロバイオームデータのみ）のデータを追加し、サンプルサイズを拡大しました。まず、レスポンダー判定を行ったところ、SRは確認されなかったが、11名のWRが判定された（表S6）。第1コホートのデータを用いた予測モデルでは、第2コホートのレスポンダーを検出できなかったが（AUROC = 0.500）、第1および第2コホートのデータを組み合わせて学習した予測モデルでは、高い性能でレスポンダーを予測できた（AUROC = 0.696 ）。AUROCが最も高くなるようにパラメータを設定した菌属データを用いたロジスティック回帰分析では、g__Dorea, g__Parabacteroides, g__Collinsella, g__Agathobacter, g__Fusicatenibacter, g__Bifidobacterium, g__Bacteroides, g__Blautia_A, g__Bacteroides_A, ルミノコッカス_D、プレボテラ、エリシペラトクロストリジウム、ストレプトコッカス、フェカリス菌、バクテロイデス_B、ルミノコッカス_B、アナエロスティペス、ルミノコッカス_E、メガモナス、ユーバクテリウム_Eレベルは反応者の予測に関与している（図4C）。4C). B. longumによる腸内細菌叢の排便回数への影響の正確なメカニズムはまだ解明されていませんが、我々の機械学習アプローチにより、B. longum BB536の摂取に反応して排便回数が増加する患者を予測することが出来ました。

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図4. 試験サプリメント摂取前に特定された腸内環境特徴を用いた機械学習によるレスポンダー予測。A：レスポンダー予測のための機械学習アルゴリズムのフローチャート。LASSO回帰による特徴選択とロジスティック回帰アルゴリズムによる機械学習が使用されている。B：試験サプリメント摂取前に収集した腸内オミックスデータから、レスポンダー（SR、WR）となる人（便通回数が有意に増加する人）を予測する際の受信者動作特性（ROC）曲線である。C：細菌属と試験サプリメント摂取開始前に収集したデータを用いた7重の層別検証において、最も精度が高かったパラメータのレスポンダースコアに関するロジスティック回帰モデルの回帰係数。

表1. 機械学習を用いたレスポンダー予測の概要

データマイクロバイオーム
相対
存在量
閾値** メタボローム
含有量
アバンダンス
閾値** LASSO
回帰
パラメータ
α** 平均 AUROC* 精度 Fメジャー
遺伝子と
代謝物
(n = 19) 0 100 0.001 0.821 0.760 0.832
代謝物
(n = 19) - 100 0.0001 0.643 0.550 0.563
属
(n = 19) 0 - 0.001 0.793 0.773 0.841
属
(n = 41) 0.01 - 0.001 0.696 0.649 0.673
*
AUROC; 受信者動作特性曲線の下での面積。

**
各データセットについて、最高性能時のパラメータ、AUROC、精度、F-measureを示す。

2.5. ベイズ統計モデルを用いて判定した腸内反応者と非反応者の腸内環境の違い
次に、SR群とWR群について、各菌属と代謝物量のfold変化を計算し、NR群のものと比較した（それぞれFCとFCw）。B. longum BB536 サプリメントの効果が強いときに相対量が大きいまたは小さい特徴を検出するために、FC > FCw > 1 または FC < FCw < 1 の順で fold 変化値を持つ菌属と代謝物を抽出し、その傾向を Jonckheere-Terpstra trend test で検証した。FCとFCwは、第1集団と第2集団のデータから、試験食介入前の時点であるT1における値から算出した。その結果、1属で増加傾向、7属で減少傾向が検出された（p < 0.05）（図5A）。ルミノコッカス属（g__Ruminococcus_E）の相対量は、レスポンダー群ではNR群より有意に高かった。逆に、g__Agathobacter, g__Alistipes, g__Bilophila, g__Butyricimonas, g__Dorea, g__Escherichia および g__Parabacteroides はNR群よりレスポンダー群で有意に少なかった（図5B； Jonckheere-Terpstra trend test, p < 0.05 ）。

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図5. B. longum BB536摂取による排便回数の増加に関連する腸内環境の特徴。A：NRと比較した反応者の微生物叢および代謝物存在量の倍率変化を示す散布図である。Y軸は、NRのfold change（FC）と比較したSRのlog 2値を表し、X軸は、NRのfold change（FCw）と比較したWRのlog 2値を表している。暖かいプロットは微生物相に対応し、その大きさは平均相対存在度を表す。赤はJonckheere-Terpstra傾向検定でp値<0.05となった菌属を表す。コールドプロットは代謝産物に対応し、その大きさは糞便量の平均値を表す。B: 箱ひげ図は、Jonckheere-Terpstra傾向検定を用いて有意差が検出されたNR、WR、SRにおける細菌属のベースライン（T1）相対量を示す。C, D: Boxplots は、介入によって誘発されたプロピオン酸（C）および酪酸（D）レベルの変化（レスポンダー・スコア）を示す。値は、摂取1週間後に測定した値（T2およびC2）に基づいて算出した。Jonckheere-Terpstra傾向検定により、NR、WR、SRの間で有意差が検出された（p < 0.05）。(この図の凡例にある色の解釈については、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)。

次に、NR、SR、WRの間で、介入によって誘発された腸内細菌叢の変化の違いを評価した。第2集団では介入後の腸内環境データが得られなかったため、この変化解析は第1集団のデータのみを用いて行った。その結果、NR、WR、SRの間で、細菌および代謝産物に有意差のある変化が認められた（表S7）。これらの細菌のうち、ベースラインで差のあった8つの細菌と共通する細菌を探した。しかし、共通する細菌は確認されなかった。腸内細菌叢が産生する主要代謝物であるプロピオン酸および酪酸の存在量は、反応者ほど増加する傾向を示した（図5C、D；酪酸はp = 0.0361, プロピオン酸はp = 0.0118; Jonckheere-Terpstra trend test）。プロピオン酸および酪酸レベルの傾向の統計的有意性は、T2での比較においてのみ観察されたが、T3での比較においても、その傾向は部分的に存在した。以上の結果より、B. longum BB536摂取による排便回数増加効果が認められた反応者は、非反応者と比較して、8属の存在量が有意に異なることが明らかになった。さらに、反応者はB. longum BB536摂取後、プロピオン酸および酪酸の存在量がより増加することが示された。

3.考察
プロバイオティクス摂取による便通反応は個人差があり[11]、腸内細菌叢はこれらの差を説明する重要な因子であると考えられる[19]。そこで本研究では、耐酸性シームレスカプセルに含まれるB. longum BB536の摂取に対する排便回数の増加の個人差を統計モデルを用いて正確に定量化し、排便回数が顕著に増加した人を反応者と定義しました。また、機械学習による解析の結果、B. longum BB536サプリメント摂取開始前の腸内環境の特徴から反応者を予測できること、マイクロバイオームとメタボロームの両データを用いると予測性能が向上することが明らかになりました。これらの結果から、個々の反応強度の正確な定量化と機械学習による予測により、腸内環境に基づくB. longum BB536サプリメント摂取の反応に関するコンパニオン診断が可能になる可能性があります。

マイクロバイオームとメタボロームの両データを用いることで機械学習の予測性能が向上することを示す今回の知見は、個々の腸内環境に依存する反応を解析するためには、マルチオミクスデータの統合的な解析が重要であることを示しています。近年、分類学的構成のデータセットを含むメタゲノム・データセットのみから介入に対する反応を予測した研究が複数あり[24], [25], [30]; メタボロームデータを取り入れることで予測性能が向上する可能性があります。さらに、これらの結果は、腸内代謝が排便頻度の個人差に影響されている可能性を示しているのかもしれません。さらに、これまでの研究では、耐酸性シームレスカプセルに包まれたB. longum BB536株の摂取により、排便回数が増えることに加え、糞便の色が濃いものから薄いものに変化すること、糞便の形状が硬さや水っぽい状態から柔らかい状態に変化すること、糞便中のアンモニア量が減少することが報告されています [14], [31]（※1）．これらの効果を持つ個々の反応が正確に定量化されれば、メタボロゲノムのデータは、どの被験者がこれらの反応を持つか、また、どの個人が排便頻度を増加させるかを予測することができるかもしれない。さらに、いくつかの研究では、他の食事要因の摂取に対する個人の反応が腸内環境から予測される可能性が示唆されている[22], [23], [32]. これらの結果から，今後，摂取前の腸内環境データからプロバイオティクスの効果を予測し，この予測システムを用いて，個別化医療や腸内環境をターゲットとした医療ビジネスの発展が期待される．

B. longum BB536摂取による排便回数増加効果を推定するための正確なベイズ統計モデルを確立し、このモデルにより、本研究でどの被験者が反応者またはNRであるかが明らかになりました。このモデルにより、B. longum BB536の摂取による排便間隔の短縮を検出することができ、先行研究[15], [16]と整合的であった。また、パラメータのベイズ推定により正しい間隔を算出することができたため、本モデルは、閾値に基づくレスポンダー推定では困難であった、B. longum BB536摂取による排便頻度への影響の正確な定量評価を達成した[23]。

ベースライン、B. longum BB536摂取、コントロールサプリメントサンプル間で、マイクロバイオームとメタボロームにおける有意差はほとんど検出されなかった。このように腸内環境に有意差がないことは、B. longum BB536の摂取の効果を覆い隠す個人間変動と関係があると考えられる。この知見は、プロバイオティクスや食事介入によって誘発される腸内細菌叢の組成の変化を観察したいくつかの研究でも報告されている。したがって、この効果は各個人の腸内環境が頑健であるためであり、腸内環境の個人差はプロバイオティクス摂取の効果を上書きしてしまうのです。

我々の観察結果と機械学習の結果、20属の相対的な存在量が、被験者がB. longum BB536の摂取によく反応したかどうかに関連しており、興味深いことに、これら20のレスポンダー関連属のうち10属がClostridiaクラスに属していた。Clostridiaは、腸内環境において、主に酪酸を含む短鎖脂肪酸（SCFA）を産生する重要な細菌群です[33]。SCFAsは腸の恒常性維持に関与しているため、SCFAsのバランスが崩れるとIBDやIBSを引き起こす可能性がある[34], [35], [36]．Clostridia属のCluster IVとXIVaは酪酸を生産し、大腸の蠕動運動の促進に関係することが報告されている[33]。本研究で腸管反応に関与する可能性が示唆された8属のうち、Ruminococcaceaeの4属はClostridia cluster IVに属し、Lachnospiraceaeの6属はClostridia cluster XIVaに属している。ClostridiaクラスターIVおよびXIVaに属する細菌はBifidobacteriumと交雑し、Bifidobacterium由来のイヌリン型フラクタンを代謝して酪酸を生産する[37], [38], [39]．したがって、B. longum BB536の摂取に伴う便通回数の増加には、ClostridiaクラスタIVとXIVaに属する細菌のバランスが酪酸や他のSCFAを介して関係していると考えられ、これらの細菌のクロスフィード関係を研究することが、この関係の深い理解につながる可能性が示唆された。

また、B. longum BB536の摂取に対する反応には、酪酸とプロピオン酸が関与している可能性が示唆された。NRと比較して、反応者は試験介入期間中に酪酸およびプロピオン酸の存在量が増加する傾向があった（図4）。これらの細菌の糖代謝における酪酸産生の効率は、菌種や生息地によって異なる。これまでの研究で、Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale（Agathobacter rectale）、Bacteroides thetaiotaomicron、Bifidobacterium adolescentis、Anaerostipes caccae、Eubacterium halliiの糖代謝能は生息地により異なることが示されている［38］, ［40］．また、RuminococcusとBifidobacteriumは腸管内腔に、Clostridiumは腸管内腔と腸管上皮細胞表面に局在しているが、E. rectaleは粘膜層に優先的にコロニー化して大腸上皮細胞による酪酸の生産と利用を促進する [33], [41]．これらの知見を総合すると、細菌間の酪酸生産性のばらつきと大腸内の位置が、B. longum BB536摂取に対する被験者の反応に影響を与える可能性が示唆された。

本研究では、プラセボ対照二重盲検試験デザイン、プロバイオティクス介入に対する反応性を定義するためのマルチオミクス機能の利用が最も価値あるポイントであるが、3つの制限事項を考慮する必要がある。第一に、腸内細菌叢の評価に16Sメタゲノム・データを用いたことである。16Sメタゲノミクスデータは分類学的な構成しか明らかにせず、詳細な機能解析には使用できないため、本研究で提案した仮説を明らかにするためには、今後ショットガンメタゲノミクスによる研究を実施する必要がある。もう一つの限界は、ベースライン解析のない被験者が最終的に20名であったことである。本研究では、各個人の時系列データを取得することでこれを補ったが、将来的には、より大規模なコホート研究によって結果を検証する必要がある。プロバイオティクスの排便回数への影響については、そのような大規模コホートは実施されていないが、そのような研究に対する期待や要望はかなり高まってきている。第三に、本研究では便サンプルを用いたが、これは小腸・大腸の微生物叢組成全体を反映したものではない。より詳細な腸管マイクロバイオーム情報は、大腸内視鏡検査による腸管組織から得られるかもしれない。

4.結論
以上より、腸内細菌叢の構成がB. longum BB536サプリメントの排便回数増加効果に影響を与えること、また糞便メタボロゲノムデータによりB. longum BB536サプリメントの摂取前に効果を予測することが可能であることが明らかとなった。これらの知見は、慢性便秘の個別化治療への興味深い示唆を与えるものです。また、プロバイオティクスに限らず、経口投与されるすべての健康効果、副作用、副作用について、腸内環境が介入に対する反応に与える影響を考慮する必要がある。今回のように、プロバイオティクス、食事、薬剤の効果が摂取前の腸内環境に依存する場合、効果を高めるための腸内環境改変の需要も高まる可能性がある。さらに、腸内環境をターゲットにした個別化医療や医療ビジネスの展開には、この介入効果定量化・レスポンダー予測システムの利用が期待される。
方法
5.1. 試験デザインおよび募集
本研究では、ビフィズス菌BB536を含有する耐酸性シームレスカプセルの摂取による排便回数の増加を定量化するために、2015年9月から12月にかけて健常者を対象とした無作為二重盲検比較クロスオーバー試験を実施しました。また、試験期間中に採取した糞便サンプルのマイクロバイオームおよびメタボロームプロファイルを解析しました（図1A、表S8、Supplementary Protocol）。本試験に参加した被験者の人権は常に保護され、ヘルシンキ宣言および医薬品の臨床試験の基準に関する事例を参照した日本における疫学研究に関する倫理指針を遵守した。この無作為化比較試験は、千代田パラメディカルケアクリニックの臨床試験倫理審査委員会の承認を得て実施し、UMIN Clinical Trials Registry（UMIN000018924）へ報告した。

サンプルサイズは、試験サプリメントとしてプロバイオティクス菌株B. longum BB536を用いた過去の無作為化比較試験に基づいて推定された[42]。研究期間中、被験者は、研究参加前からの食習慣に大きな変更を加えることを制限された。また、被験者は、プロバイオティクスとプレバイオティクスをできるだけ摂取しないように求められた。前回の試験では、試験介入期間中の排便回数は9.6 ± 0.6［/2週間］、対照介入期間中の排便回数は8.4 ± 0.4［/2週間］であり、試験介入期間と対照介入期間の排便回数を比較すると、試験介入期間中の排便回数の方が多いことが分かりました。検出力分析を適用し、有意水準5 %の被験者数を推定した。この試験で 20 % の被験者が脱落することを想定し、統計的検出力は 80 % であった。これらの条件から、本試験に必要な被験者数は8名と推定された。

予備的な便通試験が行われた。日本人被験者50名のうち、条件を満たす24名が選ばれた。年齢、男女比、便通の有無は、予備試験結果をもとに本試験前に選定した。24名中4名のデータは、プロトコルに違反したため、腸内細菌叢およびメタボローム解析に使用されなかった。MO07は採取期間中に糞便サンプルの採取ができなかった。MO14、MO20、MO21は、薬を複数回服用した。MO01は、観察前の期間に1回プロバイオティクスを摂取したが、その後の解析に含まれた。これら20人の被験者において、平均年齢は47.7±5.8であり、男女比は8：12であった。残りのベースラインの人口統計学的および臨床的特性は、対照群と治療群の間で有意な差はなかった（表S9）。

5.2. 被験者の特徴および除外基準
この臨床研究は、倫理委員会の承認を得た後、株式会社シーピーシーに依頼した。被験者全員は、本研究の内容を十分に説明した後、本研究への参加に同意した。

被験者の参加基準は以下の通りである。1）同意時年齢40歳以上60歳未満、2）便の回数が週3回以上5回未満、または週7回以上。除外基準は以下の通りである。1）試験開始前6ヶ月以内に行われた開腹手術、2）試験開始前6ヶ月以内に1週間以上の抗生物質の摂取、3）検査用サプリメントに対するアレルギー、4）検査期間中に意図した著しい生活様式の変化、5）慢性下痢になりやすい体質、など。6) 重大な肝機能障害、胃機能障害、または心血管疾患の既往、7) 慢性または急性の感染症の疑い、8) 妊娠または授乳の既知または可能性、9) 試験開始前1ヶ月以内に他の試験に参加、10) その他、試験に関わる医師が試験に不適切と判断したもの。すべての被験者に試験開始前2週間の排便頻度をモニターし、週3～5回または週7回以上の排便頻度であることを確認した。試験を完了した被験者のうち、以下の条件のいずれかに該当する者は、以降の解析対象から除外した。1) 除外基準の一つ以上に該当すると考えられる者、2) 試験用サプリメントの接種率が80%未満である者、3) 食事記録に大きなばらつきがある、または記録から変化がないことが確認できない者、4) 生活記録内容に大きなばらつきがある、または記録から変化がないことが確認できない者、 5) 試験成績に影響を与えると考えられる医薬品、食品、便軟化剤などのサプリメントの摂取が継続または反復されている者、 6) その他試験に不適切と評価される者などであった。

5.3. 試験介入：食事に関する情報
本試験では、B. longum BB536を約5.0 * 109個（1食あたり0.53 g）含む耐酸性シームレスカプセル（森下仁丹株式会社、日本）を試験サプリメントとして使用しました。このカプセルは直径約2.4 mmの球形で、2種類の耐酸性層から構成されています。カプセル化されたB. longum BB536は，pH1.2に調整した人工胃液中で約90%が2時間生存する[12]．カプセルの最外層である耐酸性pH依存性崩壊膜は、胃を通過し、小腸で周囲のpHが中性になると崩壊する。その後、中間層である硬化脂肪層が胆汁酸の界面活性作用、リパーゼの消化作用、腸管運動による物理的刺激によって溶解し、内部の細菌が放出される。放出された菌は腸内で増殖することが報告されている[43]，[44]．コントロールサプリメントには、希釈基剤として使用し、試験用サプリメントにも配合されているジャガイモ由来のデンプンのみを配合したカプセル（森下仁丹株式会社、日本）を使用した。エネルギー，タンパク質，脂質，炭水化物，ナトリウムの含有量は，試験サプリメントと対照サプリメントで同等となるように調整した．また、試験用サプリメントと対照用サプリメントの外観が区別できないように加工した。

5.4. 試験介入：無作為化および盲検化
試験における無作為化は、ブロック層別無作為化法によって行われた。まず、選択基準を通過した24名の被験者を、年齢、男女比、試験期間前の排便状況などを考慮した層別化により、2群（A群、B群）に割り付けた。その後、各群に試験用サプリメントまたは対照用サプリメントを表す記号「A」または「B」をランダムに割り当て、試験用サプリメント記号と被験者識別コードを記載した試験用サプリメント割り当て表を作成した。試験用サプリメントが1つのグループに割り当てられた後、直ちにその表を封印し、試験終了まで安全に管理し、ほとんどの治験責任医師がグループの割り当てを知らないようにした。各被験者は、1日に1食分の試験用または対照用のサプリメントを、好きなだけ水と一緒に経口摂取した。1種類の介入剤を2週間摂取し、4週間のウォッシュアウト期間の後、もう1種類の介入剤を2週間摂取した。カプセルは摂取まで被験者が室温で保存した。

5.5. 試験結果および試料採取
本研究では、排便回数と腸内環境の特徴（腸内マイクロバイオームとメタボローム）を主要なアウトカムとした。排便頻度データおよびその他の活動に関するデータは、1日1回記入する質問票から取得した（表S10）。アンケートには、生活状況、食事、排便状況などが含まれた。乳酸菌やビフィズス菌を大量に含む飲料や食品、2）食物繊維やオリゴ糖を多く含む飲料や食品、3）栄養補助食品、4）機能性ヨーグルト、5）納豆の摂取を禁止し、摂取した場合は質問票に記載することとした。腸内環境の特徴は、介入1週間前、介入1週間後、2週間後に採取した便検体から得た。便は，便器に敷いた採取シート（ながせる；日本オザックス）と便採取チューブ（便容器54×28mm；SARSTEDT AG & Co, Germany）を用いて，各被験者が自宅で採取した。採取後、便サンプルはすぐに家庭用冷凍庫で保存し、後日回収して冷蔵輸送で実験室に運んだ。

5.6. DNA抽出と16S rRNA遺伝子解析
便サンプルからのDNA抽出には、以前の報告書[45]に記載されているプロトコルを使用した。抽出した DNA サンプルから、細菌 16S rRNA 遺伝子の V1-V2 領域に対するユニバーサルプライマー 27Fmod および 338R を用いて 16S rRNA 遺伝子領域を増幅した [46] (図 S4)。アンプリコンDNAの塩基配列決定には、MiSeqプラットフォーム（Illumina、米国）を用い、ペアエンドモードで600サイクルを行った。得られた16S rRNA遺伝子配列データは、DDBJのDRA（DRA accession number: DRA006874）にて公開されている。

16S rRNA遺伝子の解析は、各サンプルのフォワードリードとリバースリード（平均リード数：44,441 ± 5,959）を、vsearch version 1.9.3 （オプション）を用いてマージした。--fastq_maxee 9.0 --fastq_truncqual 7 --fastq_maxdiffs 300 --fastq_maxmergelen 330 --fastq_minmergelen 280） [47] を用いて、各サンプルのフォワードリードとリバースリードをマージした。その後、fastp を用いてデフォルトのパラメータで品質フィルタリングを行い、高品質リードを得た[48]。高品質リードのFASTQファイルは、SeqKitを使用してFASTA形式に変換した[49]。高品質リードの最終セットは、Deblurパイプライン[50]を用いて正確な配列変異（ESV）を同定するために使用されました。パイプラインでは、PhiXを含むアーティファクト配列が除去され、de novoキメラ配列が解析・除去された。すべてのESVは、BLAST version 2.8.1 [52]を用いてGenome Taxonomy Database version 86 [51]にアラインメントされ、属レベルでは94 %の同一性が使用された[53]。ESVと系統情報の対応表、および各段階でのリード数を表S11、S12に示す。

5.7. メタボローム抽出と解析
メタボローム解析は、いくつかの修正を加えながら、以前に記載した方法で行った[45]、[54]。糞便から代謝物を抽出するために、試料をVD-800R凍結乾燥機（TAITEC）で24時間以上凍結乾燥した後、Shake Master NEOホモジナイザー（Biomedical Science）で激しく振盪（1500rpm、10分）して3.0mmジルコニアビーズで糞便を破砕した。破砕した糞10 mgに内部標準物質（メチオニンスルホンおよびd-カンファー-10-スルホン酸各20 μM）を含むメタノール500 μLを添加した。サンプルは、Shake Master neoを用いて激しく振盪（1,500 rpm、5分間）することにより、0.1 mmジルコニア/シリカビーズでさらに破砕した。次に、200μlの超純水と500μlのクロロホルムを加えてから、4,600×g、20℃で15分間遠心分離を行った。その後、水層150μlを遠心分離フィルターチューブ（UltrafreeMC-PLHCC 250/pk for Metabolome Analysis, Human Metabolome Technologies）に移し、タンパク質および脂質分子を除去した。濾液は遠心濃縮し、CE-TOFMS分析直前に50 μlの超純水に溶解した。抽出した代謝物の測定は、CE-TOFMS によりポジティブモードおよびネガティブモードで行った。CE-TOFMS 実験はすべて Agilent CE キャピラリー電気泳動システム (Agilent Technologies) を使用して実施した。標準化合物の測定値からアノテーションテーブルを作成し、類似値と正規化移動時間に従ってデータセットと整列させた。次に、ピーク面積を内部標準物質のピーク面積に正規化しました。内部標準物質は、カチオン性代謝物にはメチオニンスルホン、アニオン性代謝物には d-Camphor-10-Sulfonic Acid を使用しました。各代謝物の濃度は、相対ピーク面積と標準化合物の濃度から算出しました。得られたメタボロームデータを表S13および表14に示す。

5.8. バイオインフォマティクスおよび統計解析
すべての統計解析は、Python（バージョン3.7.3）およびR（バージョン3.6.1）を用いて行った。アルファ多様性にはシャノン多様性指数を、ベータ多様性にはスピアマン相関距離を使用した。MDSはβ多様性を用いて算出した。糞便のメタデータ（排便回数、形状、色）、マイクロバイオームデータ、メタボロームデータの2群間比較には、両側Wilcoxon符号順位検定を用いた（scipy version 1.3.1）。多重検定補正にはBenjamini-Hochberg偽発見率補正法（FDR）を用いた（statsmodels version 0.10.1）。腸内細菌叢の解析には、属レベルおよびESVレベルの分類学的組成データを用いた。このうち、ESVレベルのデータはα多様性の算出にのみ使用した。属レベルのデータは他の統計解析に使用した。腸内メタボローム解析には、内部標準物質と比較した相対面積と代謝物含有量のデータを用いた。代謝物含有量は、腸管レスポンダーの予測および特徴量解析に使用した。腸管レスポンダーの特徴量の統計解析では、NR、WR、SR 群に両側 Jonckheere-Terpstra 傾向検定を適用し、p 値が 0.05 未満のものを抽出した（clinfun version 1.0.15）。

5.9. ベイズ型ワイブル回帰モデルに基づく腸管レスポンダーの定義
各被験者が試験期間中に記録した質問票のデータを用いて、治療に強く反応した被験者、すなわち排便回数の増加を示した被験者を、統計モデルを用いて推定した。排便頻度の増加効果は、排便間隔の短縮と定義したが、他の排便頻度または排便確率の指標も評価した。

排便は時間の経過とともに起こりやすくなることに着目し、各個人の排便間隔をワイブル分布でモデル化した。ワイブル分布は，生存時間に対する薬物の影響を調べるために広く用いられている分布で，形状パラメータとスケールパラメータを持つ[55]．摂取量自体の影響は、摂取量がスケールパラメータに影響すると仮定し、比例ハザードモデルに基づいて推定した。対応する数式を以下に示す。

このモデルでは、時間tにおける各変数の影響は、基礎状態におけるハザード関数の積として発生すると仮定している。ハザード関数とは，ある事象が時刻tから時間経過Δt後に発生する確率を表す関数であり，本研究では，被験物質の摂取の影響など，便通時間に伴う変数の影響が，基底状態におけるハザード関数の積として生じ，便通の発生確率が変動すると仮定している．この仮定は、摂取量以外の要因が観測期間を通じてハザード関数に影響を与えないという仮定と等価である。この仮定は、本研究のコホートのように食事摂取が厳しく制限された状態では、腸内の状態が安定しているという経験則によって裏付けられている。さらに、モデルにおけるワイブル分布のパラメータと摂取量の影響は未知である。そのような値は、観測データから推定した。本研究で取得した排便記録は、各排便の時刻を含まず、1日当たりの排便回数を報告している。したがって、連続した排便の間隔は、24時間を回数で割ることによって推定された。1人の被験者（MO03）は、85日間の観察期間中、一貫して1日に1回の排便があり、したがって排便間隔は常に24時間であった。分散がゼロの変数はモデル推定に不適切であるため、この被験者は以降の分析から除外された。さらに、複数のモデルを構築し、WAIC（Widely Applicable Information Criterion）*を用いて比較した。WAICは、モデル中の未知データに対する予測誤差（汎化誤差）を近似する。WAICは、パラメータの事後分布が正規分布で近似できないモデルにも使用されている[56]。

パラメータの推定は、PythonとStanを用いたNUTSアルゴリズムに基づくハミルトンモンテカルロ法を用いて行った[57]。Markov Chain Monte Carlo (MCMC)を用いたWeibull分布の一般化線形モデルは、以前の研究[58]で説明されたように適用された。MCMCの反復回数は20,000回、連鎖数は8、各反復の最初の1,000ステップはバーンインとして廃棄された。以前の研究では、MCMCの収束は、すべての推定値について潜在的規模縮小係数（PSRFまたはRhat）＜1.1によって確認された[59]。同様に、本研究では、Rhatは複数のMCMCチェーンの分散に基づいて計算され、収束の判定に用いられた。他のパラメータは初期値を用いた。実装されたソフトウェアは https://github.com/metagen/EEBIIC から入手可能である。

5.10. その他の排便レスポンダー推定モデル
排便動態を排便頻度と排便確率としてモデル化した。排便頻度については、各個体の1日あたりの排便回数がポアソン分布に従うと仮定した。ポアソン分布はカウントデータをモデル化する際に用いられる分布で、比パラメータは1つである。摂取の影響は，摂取によって比率パラメータが変化すると仮定して推定した．この方法には，各被験者から得たアンケートによる排便頻度を使用した．

排便確率については，各個人の1日あたりの排便回数がベルヌーイ分布でモデル化できると仮定した．ベルヌーイ分布は，コインの表裏のような選択肢の発生確率を表すのに使われ，確率パラメータは1つである．この確率パラメータが摂取量に応じてロジスティック関数で変化すると仮定し、摂取の影響を推定した。この方法では、排便回数データを毎日排便の有無データに変換し、排便があった場合は1を記録し、それ以外は0とした。

5.11. 機械学習による回答者予測、統計解析による回答者の特徴分析
第1コホートのMO03を除く全ての被験者の試験介入前（T1）の細菌属の相対存在量と糞便代謝物含有量を特徴量とした。MO03は、全観察期間（85日間）を通して排便が常に1日1回であり、ベイズ統計モデルによる応答者の判定に適さないため、本解析から除外した。マイクロバイオームデータのみで解析した場合は41サンプル、メタボロームデータと組み合わせた場合は19サンプルを使用した。全特徴量のうち、相対量または糞便量がある閾値を超えるものを選択した。閾値については、グリッドサーチを行い、予測AUROCが最大となるものを探した。その後、1）微生物の相対量と代謝物含有量では取り得る値の範囲が異なるため、取り得る値の範囲が大きい特徴量が予測に大きな影響を与える可能性がある、2）マイクロバイオームとメタボロームの特徴の重要度を直接比較できない、という潜在的問題を考慮し、平均値を 0 にセンタリングして各特徴量を標準化（z スコア）し、その標準偏差で除算して、各特徴量を求めた。19名の被験者を、反応者（SRとWR）とNRの2群に分類した。反応者とNRを区別できるメタボロゲノミクスマーカーを特定するため、LASSO回帰とロジスティック回帰のアルゴリズムを用いて、メタボロゲノミクスデータに基づく分類モデルを構築した。モデルの検証は7重の層別クロスバリデーションテストで行った（データセット分割を10回再サンプリングした）。トレーニングデータセットからの特徴選択にはLASSO回帰モデルを用い、統計モデルで推定した各個人のテスト用サプリメントによる排便回数の増加の平均値に当てはめた。係数が非ゼロの特徴量のみを抽出した。LASSO回帰のハイパーパラメータについては、グリッドサーチを行い、予測されるAUROCが最大となるパラメータセットを検索した。テストデータは、特徴量から選択された学習データから学習したロジスティック回帰モデルによって予測された。ロジスティック回帰のハイパーパラメータには、sklearn.linear_model.LogisticRegression（バージョン 0.19.1）のデフォルトパラメータを使用しました。

ハイパーパラメータと精度は表 1 に記載した．レスポンダー特性の解析では、機械学習と同様に、摂取直前に採取した41サンプルの値を用い、試験食摂取後の変化率（レスポンダー・スコアと定義）も解析に用いた。レスポンダースコアは、ベースライン値を考慮した上で、試験食摂取後に得られた値とプラセボ摂取後に得られた値を比較した。レスポンダースコアは以下の式で定義される。

統計解析では、NR 群、WR 群、SR 群について両側 Jonckheere-Terpstra 傾向検定を適用し、p 値が 0.05 未満のものを抽出した。

5.12. 第 2 コホートの臨床試験
本試験の結果を確認するため、第2集団の解析を行った。第 2 コホートでは、健常者を対象とした 3 者間無作為二重盲検比較クロスオーバー試験が実施された。組み入れ基準および除外基準は基本的に本試験と同様であったが、組み入れ基準における排便回数は、セカンドコホートでは週3～5回であった。5.9.排便回数に基づくレスポンダー推定」に記載したレスポンダー推定を行った。Bayesian Weibull回帰モデルに基づく腸管レスポンダーの定義」に記載したレスポンダーの推定を、プラセボ／B. longum BB536カプセルを使用した2期間について実施した。さらに、B. longum BB 536カプセル使用直前の時点で採取した糞便サンプルからマイクロバイオームを解析した。

著者による貢献
S.F.とT.Y.が企画・デザインした。M.K.、T.Y.、S.F.は臨床試験のデザインを担当した。M.K.は介入に使用した試験用サプリメントを準備した。S.M.、C.I.、Y.I.は糞便からDNAを抽出した。C.I.とY.I.はマイクロバイオーム解析を行った。S.M.、C.I.、Y.I.はCE-TOFMSによるメタボローム解析を実施した。Yuya N.が統計解析を行った。Yuya N.とShinya S.がメタボロゲノムデータに関する全ての解析を行った。Yuya N.と Yuichiro N.は、機械学習を用いてメタボロゲノムデータからレスポンダーを予測しました。Y.M.はビフィズス菌の 16S rRNA 遺伝子領域の PCR 増幅を行った。Yuichiro N., N.W., K.H., J.U. は研究デザインに貢献した。Yuya N.、Shinya S.、Yuichiro N.は原稿の初稿を執筆した。S.F.とT.Y.はプロジェクトの監督と論文の執筆を行った。すべての著者が最終版の査読と承認を行った。

資金提供
特になし。

データの入手方法
本論文で報告されたシーケンスデータセットは、DDBJ Sequence Read Archive (DRA006874)で入手可能です。

CRediTの著者による貢献ステートメント
中村裕也: 執筆 - 原案、形式的解析、方法論。鈴木真也: 執筆 - 原案, 方法論. 村上慎之介：調査。西本雄一郎。執筆 - 原案、方法論。東晃一：調査渡會直樹：調査梅津純平：調査梅津純平：調査石井千春：調査調査伊藤裕太郎：調査調査森由佳：調査河野真美子リソース山田卓司：コンセプト立案、監修、執筆（校閲・編集）。福田真二。構想、監修、執筆 - 査読と編集。

利害関係者の宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる既知の競合する金銭的利益や個人的関係がないことを宣言するものである。

謝辞
鈴木修二氏には、機械学習による応答者予測に関する知見とご意見をいただきました。また、臨床試験を実施された森下仁丹株式会社、株式会社シーピーシーに感謝いたします。また、本研究の議論に参加いただいた東京工業大学山田研究室、株式会社メタジェンのスタッフの皆様に感謝いたします。

付録A. 補足データ
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補足データ1.

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参考文献
[1]
H. Chu, L. Zhong, H. Li, X. Zhang, J. Zhang, X. Hou
中国における一般人口、小児人口、高齢者人口に対する便秘の疫学的特徴
消化器病研究実践（2014）, 10.1155/2014/532734
Google Scholar
[2]
N.C.スアレス、A.C.フォード
地域社会における慢性特発性便秘の有病率、およびリスクファクター。系統的レビューとメタアナリシス
Am J Gastroenterol (2011), 10.1038/ajg.2011.164
Google Scholar
[3]
K. 村上晃一、佐々木聡、大久保秀夫、高橋康夫、細井靖雄、板橋正夫
日本人若年女性における食物繊維、水分、マグネシウム摂取と機能性便秘の関連性
Eur J Clin Nutr (2007), 10.1038/sj.ejcn.1602573
Google Scholar
[4]
M. Forootan、N. Bagheri、M. Darvishi
慢性便秘症メド（米国）（2018）, 10.1097/MD.00000000010631
[5]
P. Stirpe、M. Hoffman、D. Badiali、C. Colosimo
便秘：パーキンソン病の新たなリスクファクター？
Eur J Neurol (2016), 10.1111/ene.13082
Google Scholar
[6]
K. Sumida, M.Z. Molnar, P.K. Potukuchi, F. Thomas, J.L. Lu, K. Matsushita, et al.
便秘とCKD発症の関係
J Am Soc Nephrol (2017), 10.1681/ASN.2016060656
Google Scholar
[7]
M. ポルタラティン、N.ウィンステッド
便秘の内科的管理
臨床結腸直腸外科（2012）、10.1055/s-0032-1301754
Google Scholar
[8]
G. ボーテ、A. コー、A. オウインガー
マグネシウムと硫酸塩を豊富に含む天然ミネラルウォーターの腸機能に対する有効性と安全性：二重盲検無作為化プラセボ対照試験
Eur J Nutr（2017年）、10.1007/s00394-015-1094-8
Google Scholar
[9]
M.M.H.アブドラ、C.L.ガイルス、C.P.F.マリナンゲリ、J.G.カールバーグ、P.J.H.ジョーンズ
カナダの成人における食物繊維の摂取量と機能性便秘の発生率の減少。コストオブイリネス分析
フード・ニュートル・レズ（2015）, 10.3402/fnr.v59.28646
Google Scholar
[10]
M. Simreń, G. Barbara, H.J. Flint, B.M.R. Spiegel, R.C. Spiller, S. Vanner, et al.
機能性腸疾患における腸内細菌叢。ローマ財団の報告書
Gut (2013), 10.1136/gutjnl-2012-302167
Google Scholar
[11]
S. グリエルメッティ、D.モラ、M.グシュベンダー、K.ポップ
無作為化臨床試験ビフィズス菌MIMBb75は過敏性腸症候群を有意に緩和し、QOLを改善する-プラセボ対照二重盲検比較試験
Aliment Pharmacol Ther (2011), 10.1111/j.1365-2036.2011.04633.x
Google Scholar
[12]
M. 河野真澄，田中吾妻，鎌口倫明，田川大介
Bifidobacterium longumを含む腸溶性シームレスカプセルの機能性食品への応用
フォリア・ファーマコル日本版 (2016), 10.1254/fpj.148.310
Google Scholar
[13]
Wong CB, Odamaki T, Xiao J zhong. Bifidobacterium longum subsp. longum BB536のヒトの健康に対する有益な効果。主要な作用としての腸内細菌叢の調節。J Funct Foods 2019. 10.1016/j.jff.2019.02.002.
Google Scholar
[14]
河野美和子、吉野俊之、松浦靖子、浅田正樹、柚子健一郎：ビフィズス菌と乳酸菌を含む腸管カプセルの健康ボランティアにおける糞便性状への影響. J Intest Microbiol 2004. 10.11209/jim.18.87.
Google Scholar
[15]
A. Ibarra, M. Latreille-Barbier, Y. Donazzolo, X. Pelletier, A.C. Ouwehand
機能性便秘を有する成人における28日間のBifidobacterium animalis subsp: 二重盲検、無作為化、プラセボ対照、用量設定試験
腸内細菌（2018）、10.1080/19490976.2017.1412908
Google Scholar
[16]
E. Dimidi, A. Zdanaviciene, S. Christodoulides, S. Taheri, P. Louis, P.I. Duncan, et al.
無作為化臨床試験。ビフィドバクテリウム・ラクティスNCC2818プロバイオティクス対プラセボ、および慢性便秘における腸管通過時間、症状、腸内細菌学への影響
アリメント・ファーマコル・サー（2019）, 10.1111/apt.15073
Google Scholar
[17]
S. グリエルメッティ、D.モラ、M.グシュベンダー、K.ポップ
無作為化臨床試験。ビフィズス菌MIMBb75は過敏性腸症候群を有意に緩和し、QOLを改善する-二重盲検プラセボ対照試験
Aliment Pharmacol Ther, 33 (2011), pp.1123-1132, 10.1111/j.1365-2036.2011.04633.x
ScopusGoogle Scholarで記録を見る
[18]
Charbonneau D, Gibb RD, Quigley EMM. Bifidobacterium infantis 35624の糞便排泄量とカプセル化プロバイオティクスの8週間経口補給後の糞便微生物叢の変化。Gut Microbes n.d.;4:201-11. 10.4161/gmic.24196.
Google Scholar
[19]
G. Reid, E. Gaudier, F. Guarner, G.B. Huffnagle, J.M. Macklaim, A.M. Munoz, et al.
プロバイオティクスの介入に対する反応者と非反応者。どのように我々は確率を向上させることができますか？
腸内細菌 (2010), 10.4161/gmic.1.3.12013
Google Scholar
[20]
J. Suez, T. Korem, D. Zeevi, G. Zilberman-Schapira, C.A. Thaiss, O. Maza, et al.
人工甘味料は腸内細菌叢を変化させることでグルコース不耐性を誘発する
ネイチャー（2014）, 10.1038/nature13793
Google Scholar
[21]
B. Chassaing, O. Koren, J.K. Goodrich, A.C. Poole, S. Srinivasan, R.E. Ley, et al.
食事性乳化剤がマウスの腸内細菌叢に影響を与え、大腸炎とメタボリックシンドロームを促進する
ネイチャー（2015）, 10.1038/nature14232
Google Scholar
[22]
D. Zeevi, T. Korem, N. Zmora, D. Israeli, D. Rothschild, A. Weinberger, et al.
血糖値反応予測による個別化栄養学
セル (2015), 10.1016/j.cell.2015.11.001
Google Scholar
[23]
T. Korem, D. Zeevi, N. Zmora, O. Weissbrod, N. Bar, M. Lotan-Pompan, et al.
パンは臨床パラメータに影響を与え、腸内細菌に関連した個人的な血糖値反応を誘導する
セルメタブ（2017）、10.1016/j.cmet.2017.05.002
Google Scholar
[24]
M.K. Doherty, T. Ding, C. Koumpouras, S.E. Telesco, C. Monast, A. Das, et al.
クローン病患者における糞便微生物叢シグネチャーはウステキヌマブ療法への反応と関連している
MBio (2018), 10.1128/mBio.02120-17
Googleスカラー
[25]
T. Bazin, K.B. Hooks, T. Barnetche, M.E. Truchetet, R. Enaud, C. Richez, et al.
微生物叢の構成は脊椎関節炎患者における抗TNFα反応を予測する可能性がある：探索的研究
サイ・レップ（2018）、10.1038/s41598-018-23571-4
Google Scholar
[26]
K. Hod, R. Dekel, N. Aviv Cohen, A. Sperber, Y. Ron, M. Boaz, et al.
下痢を主症状とする過敏性腸症候群患者の臨床試験における、微生物叢組成に対する多種類のプロバイオティクスの効果
Neurogastroenterol Motil, 30 (2018), p. e13456
CrossRefView レコードをScopusGoogle Scholarで見る
[27]
M.X. Maldonado-Gómez、I. Martínez、F. Bottacini、A. O'Callaghan、M. Ventura、D. van Sinderen、et al.
ヒト腸管におけるビフィドバクテリウム・ロンガムAH1206の安定した生着は、常在微生物群の個別的な特徴に依存する
Cell Host Microbe, 20 (2016), pp.515-526, 10.1016/j.chom.2016.09.001
記事ダウンロードPDFView Record in ScopusGoogle Scholar
[28]
A.N. Ananthakrishnan、C. Luo、V. Yajnik、H. Khalili、J.J. Garber、B.W. Stevens、et al.
腸内細菌群の機能は、炎症性腸疾患における抗インテグリン生物学的製剤治療への反応を予測する
セルホストマイクロビー（2017）, 10.1016/j.chom.2017.04.010
Google Scholar
[29]
S. 渡辺
特異学習理論におけるベイズクロス検証と広く適用可能な情報量規準の漸近的等価性
J Mach Learn Res (2010)
Google Scholar
[30]
K. Korpela, H.J. Flint, A.M. Johnstone, J. Lappi, K. Poutanen, E. Dewulf, et al.
腸内細菌叢のシグネチャーは、肥満の個人における食事介入に対する宿主と微生物叢の応答を予測する
PLoS ONE (2014), 10.1371/journal.pone.0090702
Google Scholar
[31]
T. 緒方昌彦、金角昌彦、八重島哲也、寺口聡、福渡義人、石橋直樹、他．
Bifidobacterium longum BB536ヨーグルトの投与が健常成人の腸内環境に及ぼす影響
Microb Ecol Health Dis (1999), 10.1080/089106099435916
Google Scholar
[32]
S.M.P. Bennet, L. Böhn, S. Störsrud, T. Liljebo, L. Collin, P. Lindfors, et al.
IBS患者の糞便細菌プロファイルの多変量モデリングは、FODMAPの少ない食事への反応性を予測する
ガット（2018）, 10.1136/gutjnl-2016-313128
Googleスカラー
[33]
A. リビエール、M.セラック、D.ランタン、F.ルロワ、L.ドヴュイスト
ビフィズス菌と酪酸産生大腸菌。ヒトの腸内におけるその重要性と刺激のための戦略
フロント・マイクロバイオル (2016), p.7, 10.3389/fmicb.2016.00979
ScopusGoogle Scholarで記録を見る
[34]
L.R.ロペトゥーゾ、F.スカルダフェリ、V.ペティート、A.ガスバッリーニ
コミネンサルクロストリジウム。腸内恒常性維持の主役たち
Gut Pathog (2013), 10.1186/1757-4749-5-23
Google Scholar
[35]
J. J. Jalanka-Tuovinen、J. Salojärvi、A. Salonen、O. Immonen、K. Garsed、F. M. Kelly, et al.
胃腸炎後および感染後過敏性腸症候群における糞便微生物叢の組成と宿主-微生物クロストーク
ガット（2014）, 10.1136/gutjnl-2013-305994
Google Scholar
[36]
S. 岡井史郎、臼井文雄、太田正樹、森博之、黒川和彦、松本聡、他．
腸内細菌叢のモジュレーターとしての腸管IgA
腸内細菌, 8 (2017), pp.1-7, 10.1080/19490976.2017.1310357
ScopusGoogle Scholarで記録を見る
[37]
A. リビエール、M.ギャニオン、S.ウェックス、D.ロイ、L.ドヴュイスト
Bifidobacterium longum subsp. longum NCC2705とEubacterium rectale ATCC 33656の相互摂食作用がアラビノキシランオリゴ糖のビフィズス菌作用とブチロゲン作用を説明する。
Appl Environ Microbiol (2015), 10.1128/AEM.02089-15
Google Scholar
[38]
F. モーエンス、M.ベルセ、L.デヴュイスト
イヌリン型フルクタン存在下での乳酸菌、ビフィズス菌、大腸菌の選択菌株間の乳酸および酢酸ベースの相互摂食相互作用
Int J Food Microbiol, 241 (2017), pp.225-236, 10.1016/j.ijfoodmicro.2016.10.019
記事ダウンロードPDFView Record in ScopusGoogle Scholar
[39]
G. Falony, A. Vlachou, K. Verbrugghe, L. De Vuyst
Bifidobacterium longum BB536と酢酸変換型酪酸産生結腸菌のオリゴフルクトース上での増殖過程における交差摂食性
Appl Environ Microbiol (2006), 10.1128/AEM.01296-06
Google Scholar
[40]
X. Ze, S.H. Duncan, P. Louis, H.J. Flint
Ruminococcus bromiiはヒト大腸におけるレジスタントスターチの分解に重要な役割を果たす種である
ISME J (2012), 10.1038/ismej.2012.4
Google Scholar
[41]
S.M. Jandhyala, R. Talukdar, C. Subramanyam, H. Vuyyuru, M. Sasikala, D.N. Reddy.
正常な腸内細菌叢の役割
World J Gastroenterol (2015), 10.3748/wjg.v21.i29.8787
Google Scholar
[42]
J. Xiao, S. Kondo, T. Odamaki, K. Miyaji, T. Yaeshima, K. Iwatsuki, et al.
Bifidobacterium longum BB 536を含むヨーグルトの健康成人における排便回数および便性状に及ぼす影響：二重盲検クロスオーバー試験
日本乳酸菌学会誌 (2007), 10.4109/jslab.18.31
Google Scholar
[43]
シームレスカプセル，2009．
Google Scholar
[44]
鎌口理恵子, 水谷正樹. 大腸特異的に分解可能なカプセル, 2013.
Google Scholar
[45]
村上聡、後藤祐子、伊藤圭、早坂聡、栗原聡、曽我崇、他重炭酸を多く含むミネラルウォーターの摂取は血糖コントロールを改善する。Evid Based Complement Altern Med 2015;2015. 10.1155/2015/824395.
Google Scholar
[46]
S.W. Kim, W. Suda, S. Kim, K. Oshima, S. Fukuda, H. Ohno, et al.
ハイスループットパイロシークエンスによるプロバイオティクス介入に対する健康成人の腸内細菌叢の頑健性の解明
DNA Res (2013), 10.1093/dnares/dst006
Google Scholar
[47]
T. Rognes、T. Flouri、B. Nichols、C. Quince、F. Mahé
VSEARCH。メタゲノム解析のための汎用的なオープンソースツール
PeerJ (2016), 10.7717/peerj.2584
Google Scholar
[48]
S. チェン、Y. Zhou、Y. チェン、J. グー
Fastp: 超高速オールインワンFASTQプリプロセッサー
バイオインフォマティクス (2018), 10.1093/bioinformatics/bty560
Google Scholar
[49]
W. シェン、S. レ、Y. リ、F. フー
SeqKit: FASTA/Qファイル操作のためのクロスプラットフォームかつ超高速なツールキット
PLoS ONE (2016), 10.1371/journal.pone.0163962
Google Scholar
[50]
A. Amir、D. McDonald、J.A. Navas-Molina、E. Kopylova、J.T. Morton、X.Z. Zech、et al.
Deblurは一塩基コミュニティ配列パターンを迅速に解決する
MSystems (2017), 10.1128/msystems.00191-16
Google Scholar
[51]
D.H. Parks, M. Chuvochina, D.W. Waite, C. Rinke, A. Skarshewski, P.A. Chaumeil, et al.
ゲノム系統樹に基づく標準化された細菌分類学は、生命の木を大幅に改訂する
ナットバイオテクノル (2018), 10.1038/nbt.4229
Google Scholar
[52]
S.F.アルトシュール、W.ギッシュ、W.ミラー、E.W.マイヤーズ、D.J.リップマン
基本的なローカルアライメント検索ツール
J Mol Biol (1990), 10.1016/S0022-2836(05)80360-2
Google Scholar
[53]
H. 森, 丸山, 矢野, 山田, 黒川.
VITCOMIC2: 16S rRNA遺伝子アンプリコンとメタゲノムショットガンシーケンスに基づく微生物群集の系統組成を可視化するツール
BMC Syst Biol (2018), 10.1186/s12918-018-0545-2
グーグルスカラー
[54]
E. 三島、福田悟、嶋宏、平山敦、秋山祐子、竹内祐子、他．
ルビプロストンによる腸内環境の変化がアデニン誘発性CKDの改善と関連すること
J Am Soc Nephrol, 26 (2015), pp.1787-1794, 10.1681/ASN.2014060530
ScopusGoogle Scholarで記録を見る
[55]
G.S. Mudholkar、D.K. Srivastava、G.D. Kollia
ワイブル分布の一般化と生存データの解析への応用
J Am Stat Assoc (1996), 10.1080/01621459.1996.10476725
Google Scholar
[56]
A. Gelman, J. Hwang, A. Vehtari
ベイズモデルの予測情報量基準の理解
スタット・コンピュット (2014), 10.1007/s11222-013-9416-2
Google Scholar
[57]
Carpenter B, Gelman A, Hoffman MD, Lee D, Goodrich B, Betancourt M, et al. Stan: A probabilistic programming language（スタン：確率的プログラミング言語）. J Stat Softw 2017. 10.18637/jss.v076.i01.
Google Scholar
[58]
P. デラポルタス、A.F.M.スミス
一般化線形および比例ハザードモデルに対するギブスサンプリングによるベイズ推論
Appl Stat (1993), 10.2307/2986324
Google Scholar
[59]
S.P.ブルックス、A.ゲルマン
反復シミュレーションの収束を監視するための一般的な方法
J Comput Graph Stat (1998), 10.2307/1390675
Google Scholar

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