細菌遺伝物質陽性症候性頸動脈アテローム性動脈硬化プラーク患者の腸内細菌叢の特徴

2024年1月12日 23:39

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オリジナル研究論文
フロント Cell. Infect. 微生物学、2024年1月12日
Sec.腸内マイクロバイオーム
第13巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1296554
この論文は次の研究テーマの一部です
免疫関連疾患における腸内細菌とその代謝産物の役割-第2巻

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細菌遺伝物質陽性症候性頸動脈アテローム性動脈硬化プラーク患者の腸内細菌叢の特徴

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1296554/full?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Hang Lv1† Zhiyuan Zhang2† Bo Fu3† Zhongchen Li2 Tengkun Yin2 Chao Liu2 Bin Xu1 Dawei Wang4 Baojie Li5 Jiheng Hao2* Liyong Zhang2* Jiyue Wang2*
1中国山東省濰坊市、山東第二医科大学臨床医学部
2中国山東省聊城市聊城人民医院脳神経外科。
3中国山東省聊城市聊城人民医院精密医療科
4中国山東省聊城市聊城人民病院整形外科
5上海交通大学バイオエックス研究所（中国、上海市
背景腸内細菌叢（GM）は症候性頸動脈アテローム性動脈硬化症（SCAS）と密接に関連していると考えられているが、SCASにおけるGMの重要な役割を立証するためにはより多くの証拠が必要である。本研究では、頸動脈プラーク中の細菌DNAの検出に基づき、プラーク細菌遺伝物質陽性のSCAS患者におけるGMの特徴を調べ、その後の研究の参考とすることを目的とする。

方法健常人27名（NHF群）とSCAS患者23名（PFBS群）を登録した。16S rDNA V3-V4領域遺伝子配列決定法を用いて、両群の糞便サンプルおよび全患者の頸動脈分岐部から内頸動脈起始部までのプラークサンプルの微生物叢を解析した。

結果その結果、SCAS患者と健常人の腸内細菌叢（GM）に有意差があることが示された。プラークサンプル中の細菌DNA検出率は約26％であった。陰性プラークを有する患者（PRSOPWNP群）と比較して、陽性プラークを有する患者（PRSOPWPP群）はGMに有意な変化を示し、特に腸内の11の細菌属（KlebsiellaやStreptococcusなど）のアップレギュレーションが認められ、これらはプラークにも存在した。微生物遺伝子の機能予測に関しては、プラーク陽性患者のGMでは、フルオロ安息香酸分解などのパスウェイが有意にアップレギュレートされていた。

結論要約すると、本研究は、プラーク陽性患者の腸内細菌叢における有意な変化を初めて同定したものであり、SCASの病態をさらに解明するための重要な微生物学的証拠を提供するものである。

1 はじめに
脳卒中は現在、世界で2番目に多い死因であり、成人における身体障害の主な原因である（Feiginら、2022年）。頸動脈狭窄、不安定プラークの破裂・剥離、局所血栓症を引き起こす頸動脈アテローム性動脈硬化症（CAS）プラーク形成は虚血性脳卒中（IS）の主要因であり、臨床的予後に大きな影響を与える。症候性頸動脈アテローム性動脈硬化症（SCAS）の患者は、一般的に軽度の虚血性脳卒中、一過性脳虚血発作、一時的な失明などの軽度の脳虚血症状を呈し、無症候性頸動脈アテローム性動脈硬化症の患者と比較して心血管および脳血管イベントの再発リスクが高く、しばしば厳重なモニタリングと積極的な治療が必要となる（Thaparら、2013；WabnitzおよびTuran、2017）。男性の性別、喫煙、飲酒、グルコースと脂質の代謝異常、炎症状態などの因子は、CASの発症とプラークの安定性に影響する重大な危険因子である（Willerson, 2002; Song et al.）したがって、SCASの予防と治療は、解決が必要な緊急の健康問題となっている。

ヒトの腸内細菌叢（GM）は、その99％以上を細菌が占める広大な「生態系」を構成しており、ヒトの健康と疾病に密接に関連している。最近の研究では、腸内細菌叢と頸動脈アテローム性動脈硬化症（CAS）との間に密接な関係があることが明らかにされている。一方では、SCAS患者においてGMの著しい変化が観察されており、身体の炎症制御経路に影響を与えることによってSCASの発症を促進する可能性がある（Karlsson et al.）一方、CASプラークでは、口腔や腸に由来する様々な細菌のDNAや生きた細菌が検出されており、プラーク内の局所炎症を悪化させる可能性がある（Kozarovら、2005；Korenら、2011）。

アテローム性動脈硬化プラークの安定性は、しばしば局所炎症、内皮機能障害、血管新生などの複数の因子と関連している（Willerson, 2002; Ylä-Herttuala et al.）プラーク内の細菌がプラークの安定性に影響を及ぼす可能性を示唆する証拠が増えている。これまでの研究で、プラーク内の細菌DNAと存在する炎症細胞数との間に正の相関関係があることが示されており（Korenら、2011）、プラーク内のマクロファージや内皮細胞のToll様受容体を活性化し（El-Zayatら、2019）、泡沫細胞形成や内皮細胞損傷などのプロセスを誘導する可能性がある（Jinら、2023）。さらに、ポルフィロモナス・ジンジバリスなどのプラーク内の生きた細菌は、口腔上皮から血流に移行し、血管内皮細胞に接着、侵入する能力を有し（Farrugiaら、2021年）、内皮機能障害を誘発し、泡沫細胞形成、血管平滑筋細胞の増殖および石灰化、ならびにプラーク内の血管新生を促進する（Zhangら、2021年）。バイオフィルムは細菌の抵抗性を高め、細菌はプラーク内にバイオフィルムの沈着物として存在することが報告されている。体内のホルモンレベルはバイオフィルムの分散を促進し、プラーク破裂のリスクを高める可能性がある（Lanterら、2014）。

本研究では、SCAS患者の糞便およびプラークサンプル中の微生物叢を調査し、特にプラーク中の細菌遺伝物質が陽性であった患者のGMに注目した。これにより、中国北部におけるSCAS患者の予防・治療法を検討するための基礎的な理論的根拠が得られた。

2 方法
2.1 研究対象者
2020年4月から2021年5月にかけて聊城人民病院脳神経外科で頸動脈内膜剥離術（CEA）を受けたSCAS患者23人（女性2人、男性21人）と、同期間に同病院健診センターで健診により確定診断された健常者27人（女性12人、男性15人）を連続登録した。全患者の診断は、主に全脳MRSのデジタルサブトラクション血管造影（DSA）によって確認され、頸動脈超音波検査によって補助された。全参加者の基本情報と臨床データは、面接と臨床検査によって収集された。参加者全員から書面によるインフォームド・コンセントを得、本研究は聊城人民病院倫理委員会（承認番号：2021120）の承認を得た。

患者の組み入れ基準は以下の通りであった： (1）18歳以上の年齢、（2）左、右、または両側の頸動脈にアテローム性動脈硬化性プラーク形成の存在（内膜中膜厚1.4mm以上、または周囲の血管壁より50％以上大きい局所的な壁肥厚と定義）、（3）エピソード性頭痛、一過性脳虚血発作、一時的な視覚障害などの軽度の虚血性脳卒中症状の存在、（4）DSA検査により頸動脈アテローム性動脈硬化性狭窄と診断され、外科的治療を必要とする患者。

除外基準は以下の通りであった： (1)炎症性腸疾患の合併、過去3ヵ月以内の消化管手術歴、(2)重度の凝固障害、(3)血糖値が300mg/dlを超えるコントロール不良の糖尿病； (4) 過去3ヵ月以内に抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクス、または胃腸薬を使用した場合 (5) 重篤な心血管疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患、血液疾患、内分泌疾患、または腫瘍性疾患がある場合 (6) 妊娠中または周産期である場合。

2.2 データ収集および検体収集
すべての参加者情報は、年齢、性別、病歴を含め、当院の主治医による対面面接により収集された。大腿動脈ルートによるDSA（Digital Subtraction Angiography）を用いて全患者の脳血管状態を検査・確認した。血球数、血糖値、脂質代謝指標などの検査を行った。全参加者から標準的に糞便サンプルを採取した後、直ちに凍結し、-80℃で保存した。全患者のCEA中に頸動脈分岐部から内頸動脈起始部にかけて切除されたプラークは、将来の使用のために直ちに凍結され、液体窒素タンクに保存された。

2.3 検体DNA抽出、DNAライブラリー構築、塩基配列決定、および操作分類学的単位解析
糞便およびプラークサンプルからの微生物DNA抽出は、TIANamp Micro DNA Kit (TIANGEN, Beijing, China)を用いて行った。16S rDNAのV3-V4領域をPCR増幅の標的区間として選択し、プライマーとして341F（CCTAYGGRBGCASCAG）と806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）を利用した（Rintala et al.、2017）。その後、TRUSEQ® DNA PCR Sample Preparation Kit（Illumina, USA）を用いてシーケンスライブラリーを調製した。調製したライブラリーの品質は、Qubit® 2.0 Fluorometer（Thermo Scientific）とAgilent Bioanalyzer 2100システムを用いて評価した。高品質のライブラリーは、Illumina HiSeq 2500プラットフォーム（CapitalBio Technology Co.）配列データは、Usearch (Version 11.0.667)を用いて、類似度閾値97%に基づいて操作的分類単位(OTU)にクラスタリングされた。類似度97%の代表的なOTU配列の分類学的解析をSilvaデータベース（リリース132）に対して行った。QIIMEソフトウェアを使用して、様々な分類学的レベルでの微生物存在量情報を作成した。

2.4 統計解析
統計解析はRバージョン3.6.0およびSPSSバージョン27を用いて行った。Studentのt検定、Wilcoxonの順位和検定、Tukeyの検定、Kruskal-Wallis検定、カイ二乗検定、線形判別分析を含む様々な統計手法を、臨床データ、微生物存在量データ、微生物機能データの解析に利用した。連続変数は平均値±標準偏差で示した。解析の前に正規性を評価し、P値0.05以上が正規分布を示した。その後、パラメトリック検定またはノンパラメトリック検定を行い、P値＜0.05が統計的有意性を示した。カテゴリー変数は数値で表し、差の検定にはカイ二乗検定を用い、P値＜0.05が統計的有意性を示した。微生物群集の多様性分析、差分有意性分析、スピアマン相関分析にはRバージョンを使用した。

3 結果
3.1 被験者の人口統計学的および臨床的特徴
参加者の臨床データ（補足表1）について統計解析を行ったところ、患者23名（PFBS群）と健常成人27名（NHF群）の間で喫煙と飲酒に有意差が認められた。危険因子に関しては、PFBS群は健常対照群と比較して、Lp(a)、WBC、FBG、TyG、N、NLR、SUAの値が有意に高かった。逆に、HDL-C、ApoA-I、Lの値はPFBS群で低く、残りの指標には有意差はなかった（表1）。

表1
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表1 患者と健常人の臨床的特徴。

その後、プラークサンプル中の細菌DNAの検出に基づいて、23例の患者サンプルを陽性プラーク群（PP群、6例）と陰性プラーク群（17例）に分けた。さらに、プラークの結果に基づいて、患者の糞便検体をプラーク陽性患者群（6例、PRSOPWPP群）とプラーク陰性患者群（17例、PRSOPWNP群）に分類した。両群間で生活習慣（喫煙、飲酒）に有意差はなかった。しかし、検査データに関しては、陽性プラーク患者は陰性プラーク患者に比べ、ApoE、WBC、FBG、N、NLRが有意に高値を示したが、その他の指標には有意差はなかった（表2）。

表2
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表2 陽性プラーク患者と陰性プラーク患者の臨床的特徴。

3.2 群集の多様性と統計解析
3.2.1 種組成分析
SCAS患者プラーク23検体中6検体から細菌DNAが検出され、陽性率は約26％であった。PP群とPRSOPWPP群の両方に共通する15菌門、24綱、43目、78科、224属を同定した。参加者全員のサンプルグループについて、門、綱、目、科、属の5つの分類レベルで種組成分析の棒グラフを作成した（補足表2、3）。これらのグラフは、NHFグループとPFBSグループ間（図1A～E）、PPグループとPRSOPWPPグループ間（図1F～J）、PRSOPWPPグループとPRSOPWNPグループ間（図1K～O）の微生物群集組成を視覚的に表し、比較している。

図1
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図1 門、綱、目、科、属レベルでの種組成の棒グラフ。(A-E）NHF群とPFBS群のコア微生物叢の組成と存在量。(F-J）PP群とPRSOPWPP群における中核微生物叢の組成と存在量。(K-O）PRSOPWPP群およびPRSOPWNP群における中核微生物叢の組成と存在量。

3.2.2 微生物叢のα多様性とβ多様性分析
シャノン指数に対するT検定（P<0.05は有意差を示す）やシンプソン指数に対するウィルコクソン順位和検定（P<0.05は有意差を示す）などの統計的検定は、グループ間の種のα多様性の統計的差異を反映するために使用できる。その結果、NHF群とPFBS群（シャノン指数、P=0.47、図2A；シンプソン指数、P=0.92、図2B）、PP群とPRSOPWPP群（シャノン指数、P=0. 09、図2C；シンプソン指数、P= 0.06、図2D）、PRSOPWPP群とPRSOPWNP群の間（シャノン指数、P= 0.57、図2E；シンプソン指数、P= 0.47、図2F）。

図2
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図2 微生物叢のα多様性とβ多様性の比較。(A-F）シャノン指数とシンプソン指数によるα-多様性の比較（NHF群とPFBS群、PP群とPRSOPWPP群、PRSOPWPP群とPRSOPWNP群）。(G-I) 主座標分析(PCoA)による、NHF群とPFBS群、PP群とPRSOPWPP群、PRSOPWPP群とPRSOPWNP群間のβ多様性の比較。

主座標分析（PCoA；Adonis多変量分散分析、R²は標本差に対するグループ化の説明力を示し、P<0.05は有意差を示す）の結果は、種のβ多様性における類似点と相違点を反映することができる。我々の結果は、NHFとPFBSグループ間（Adonis, R²=0.08, P<0.05;図2G）、PPとPRSOPWPPグループ間（Adonis, R²=0.40, P<0.05;図2H）、PRSOPWPPとPRSOPWNPグループ間（Adonis, R²=0.11, P<0.05;図2I）の微生物群集のβ多様性における有意な統計的差異を示しています。

3.2.3 微生物群集の差異の有意性分析
我々が最も注目したのは、NHF群とPFBS群間、およびPRSOPWPP群とPRSOPWNP群間の微生物群集の差異であった。

まず、分子分散分析（AMOVA、P<0.05は有意差を示す）を用いて、各群の微生物群集間の有意差を検定した。その結果、NHF群とPFBS群の間（P<0.05）、およびPRSOPWPP群とPRSOPWNP群の間（P<0.05）に有意差が認められた。次に、アノシム分析（R> 0は群内差より群間差が大きいことを示し、P<0.05は有意差を示す）と多回答順置換法（MRPP）分析（A> 0は群内差より群間差が大きいことを示し、P<0.05は有意差を示す）を用いて、群間差が群内差より大きいかどうかを判定し、グループ分けの有意性を検証した。その結果、NHF群とPFBS群（Anosim、R=0.24、P<0.05；MRPP、A=0.04、P<0.05；図3A）、PRSOPWPP群とPRSOPWNP群（Anosim、R=0.28、P<0.05；MRPP、A=0.07、P<0.05；図3B）ともに、より大きな群間差を示し、有意な群分けが確認された。最後に、Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe, LDA score >3, P<0.05は有意差を示す)を用いて、グループ間で存在量に有意差がある分類群を同定した(Lin and Peddada, 2020)。属レベルでは、NHFグループとPFBSグループの間で22の異なる存在量の細菌（LDAスコア＞3）が同定され、各グループは11の異なる属に富んでいた（図3C）。PRSOPWPP群とPRSOPWNP群では、2系統、4綱、7目、12科、20属（LDAスコア＞3）が異なる豊富量として同定された。具体的には、PRSOPWPPグループは1門、1クラス、2目、8科（不明1科）、16属（不明1属）に富み、PRSOPWNPグループは1門、3クラス、5目、4科（不明1科）、4属（不明1属）に富んでいた（図3D）（補足表4）。

図3
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図3 腸内細菌叢の群間差の有意な解析。(A, B）NHF群とPFBS群、およびPRSOPWPP群とPRSOPWNP群のアノシム解析（類似性解析）。このノンパラメトリック検定は、p < 0.05で、意味のあるグループ分化を示している。(C、D）LEfSe（線形判別分析効果量）を用いた、NHF群とPFBS群、およびPRSOPWPP群とPRSOPWNP群間の有意差のある腸内細菌の同定。LDAスコア＞3およびp＜0.05は有意差を示す。LEfSeは線形判別分析の効果量を評価するために用いられる。

具体的には、NHF群とPFBS群のGMは主に4つの豊富な門（ファーミキューテス門、バクテロイデーテス門、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門）で構成されており、PFBS群ではVerrucomicrobia門とアクチノバクテリア門が有意に豊富であった。PRSOPWPP群とPRSOPWNP群の患者のGMも同様に、これら4つの系統で占められていた。注目すべきは、PRSOPWNP群で濃縮されたバクテロイデーテス（Bacteroidetes）とPRSOPWPP群で濃縮されたユーラシア綱（Euryarchaeota）が、両群間で有意差を示したことである。

属レベルでは、NHF群とPFBS群の間で存在量に有意差があったのは22属であった。11属（Collinsella、Akkermansia、Ruminococcaceae_UCG_014、Parabacteroides、Phascolarctobacterium、Alistipes、Ruminococcus_torques_group、Odoribacter、Lactobacillus、Enterococcus、Barnesiella）はPFBS群で有意に豊富であった、残りの属（Lachnospira, Ochrobactrum, Lachnoclostridium, Tyzzerella_3, Megasphaera, Lachnospiraceae_NK4A136_group, Dorea, Prevotellaceae_NK3B31_group, Sarcina, Paraprevotella, Lachnospiraceae_UCG_004）はNHF群で有意に濃縮された。

属レベルでは、Escherichia-ShigellaがPRSOPWPP群で最も多く、PRSOPWNP群（Bacteroides）とは異なっていた。さらに、Acinetobacter_sp. CAG196、Anaerococcus、Anaerofustis、Blautia、CHKCI002、Christensenella、Christensenellaceae_R_7_group、Clostridium_sensu_stricto_1、Intestinibacter、Klebsiella、Methanobrevibacter、 PRSOPWPP群では、Romboutsia、Ruminococcaceae_UCG_013、Ruminococcus_2、Streptococcus、およびMollicutes_RF39に属する未知の属が有意に濃縮されていた；一方、PRSOPWNP群ではBacteroides属、Flavonifractor属、Parasutterella属、Rhodospirillalesに属する未知の属が濃縮され、群間で有意差が認められた。

さらに、プラーク陽性患者の腸内には、Streptococcus属、Blautia属、Klebsiella属、Clostridium_sensu_stricto_1属、Romboutsia属、Ruminococcaceae_UCG-013属、Ruminococcus_2属、Intestinibacter属、Christensenellaceae_R-7_group属、Anaerococcus属、Methanobrevibacter属の11属が有意に濃縮されて存在していた。

3.3 腸内細菌叢と臨床的特徴の関連性
Spearman相関分析を用いて、有意に異なるGMと臨床的特徴との間の本質的な関連を探った。その結果、PFBS群の腸内で有意に濃縮された11の細菌属のうち、6つがFBG値と正の相関を示し、6つがApoA-I値と負の相関を示し、3つがTyG値と正の相関を示し、3つがLp（a）値と正の相関を示し、2つがNLR値と正の相関を示し、2つがL値と負の相関を示し、1つがN値と正の相関を示し、1つがTG値と正の相関を示し、1つがVLDL-C値と正の相関を示した。(図4A）。

図4
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図4 腸内細菌叢と臨床的特徴の相関。(A)NHF群とPFBS群、(B)PRSOPWPP群とPRSOPWNP群間における有意差のある細菌属と臨床的特徴との相関。

さらに、PRSOPWPP群で有意に濃縮された15種の既知の細菌属は、臨床的特徴と密接な関係があることがわかった。具体的には、8つの細菌がApoE値と、7つがNLR値と、5つがN値と、4つがWBC値と、2つがFBG値と正の相関があった。さらに、4つの細菌がVLDL-C値と、1つがL値と負の相関を示した（図4B）。(図4B）。

3.4 微生物叢の機能的プロフィール
微生物遺伝子の機能プロファイルを予測するために、Greengenesデータベースに基づくPICRUST 2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）ソフトウェアを使用した。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）とCOG（Clusters of Orthologous Groups）の機能カテゴリーについて予測解析を行い、微生物群集における代謝経路やタンパク質機能に関連する機能性遺伝子発現の違いや変化を観察した（補足表5）。

その結果、NHF群とPFBS群の腸内細菌叢間で、予測される代謝経路の発現に有意差は認められなかった（図5A）。しかし、予測された9つのタンパク質機能の発現には有意差があった（図5B、C）。NHF群と比較して、PFBS群では6つの予測タンパク質機能が有意に発現上昇し、特に嫌気性ホモシステイン生合成に関与する酵素COG1900の発現上昇が顕著であった。

図5
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図5 腸内細菌叢の機能発現の予測分析。(A）NHF群とPFBS群間のKEGG代謝パスウェイの差分解析のボルケーノプロット。(B, C) NHF群とPFBS群間のCOGタンパク質機能の差分解析のボルケーノプロット、および有意に異なるタンパク質機能のクラスタリングヒートマップ。(D, E) PRSOPWPP群とPRSOPWNP群間のKEGG代謝パスウェイの差分解析のボルケーノプロット、および有意に異なる代謝パスウェイのクラスタリングヒートマップ。(F) PRSOPWPP群とPRSOPWNP群間のCOGタンパク質機能の差分解析のボルケーノプロット。

PRSOPWPP群とPRSOPWNP群の腸内細菌叢では、8つの予測代謝経路の発現に有意差が認められたが（図5D、E）、予測タンパク質機能の発現には有意差は認められなかった（図5F）。PRSOPWNP群と比較して、PRSOPWPP群は4つの予測代謝経路において有意な発現上昇を示した：フルオロ安息香酸分解、ダイオキシン分解、アトラジン分解、β-ラクタム抵抗性である。

3.5 腸内細菌叢の機能的発現、臨床的特徴、および発現量の異なる細菌属の相関関係
スピアマン相関分析を用いて、微生物の機能発現、臨床的指標、および発現量の異なる細菌属の間の潜在的関連性を探索した。

その結果、PFBS群では、有意に豊富なEnterococcus属、Lactobacillus属、Collinsella属、Ruminococcus_torques_groupが、それぞれCOG4841、COG3548、COG5584、COG5416の発現と正の相関を示した。Phascolarctobacterium、Ruminococcaceae_UCG-014、Barnesiella、AlistipesおよびOdoribacterは、COG2122およびCOG1900の発現と正の相関があった（図6A）。さらに、PFBS群で発現が増加した予測タンパク質機能はすべて、ApoA-Iレベルと負の相関を示し、4つの予測タンパク質機能（COG4841、COG3548、COG5584、COG5416）は、TG、TyG、FBGレベルと正の相関を示した（図6B）。

図6
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図6 腸内細菌叢の機能的発現、臨床的特徴、および異なる細菌属間の相関解析。(A）有意に異なる細菌属とNHF群とPFBS群間のタンパク質機能の差との相関。(B）NHF群とPFBS群間のタンパク質機能の差と臨床的特徴との相関。(C）PRSOPWPP群とPRSOPWNP群間の有意差のある細菌属と差のある代謝経路との相関。(D）PRSOPWPP群とPRSOPWNP群間の代謝経路の差と臨床的特徴の相関。

また、PRSOPWPP群内では、ダイオキシン分解経路が有意に濃縮された細菌種と最も多くの正の相関を示し（n=11、p<0.05）、次いでアトラジン分解（n=10、p<0.05）、βラクタム耐性（n=7、p<0.05）であった（図6C）。さらに、有意にアップレギュレートされた予測代謝経路は、脂質指標、炎症マーカー、FBG、TyGレベルと正の相関があった（図6D）。

4 考察
本研究の主要目的は、動脈プラーク陽性の患者における腸内細菌叢の特徴と頸動脈プラークとの潜在的関連性を検討することであった。NHF群と比較して、PFBS群では喫煙と飲酒の習慣が多いことが観察された。臨床データから、これらの患者では糖代謝障害や脂質代謝障害、炎症状態などの代謝異常が指摘されており、これらは頸動脈アテローム性動脈硬化症の発症に寄与し、プラークの安定性に影響を及ぼす可能性がある（Tangら、2018；Sterpetti、2020；Lubrano and Balzan、2021）。さらに、プラーク中の細菌DNAの検出に基づいて、陽性プラークを有する患者と陰性プラークを有する患者の臨床データを比較した。その結果、プラーク陽性患者では、ApoE、FBG、WBC、N、NLRが有意に高値であった。これらの指標は、陽性プラークを有する患者において、より重篤な代謝異常と炎症状態を示唆しており、CASの進行とプラークの不安定性を悪化させる可能性がある。

GMとCASの間に関連性がある可能性を考慮し、全参加者のGMを分析した。その結果、SCAS患者のGMには腸内細菌叢の異常が認められ、コリンセラのような特定の細菌が有意に濃縮されていた。また、SCAS患者のプラーク中の微生物叢を解析したところ、プラーク中のいくつかの細菌はプラーク陽性患者のGMと共通しており、プラーク細菌の少なくとも一部は腸に由来する可能性があることがさらに確認され、これまでの知見と一致した（Koren et al.）先に述べたように、プラーク中の細菌はプラークの安定性に関係している可能性がある。細菌がプラークに移行する可能性と移行量（すなわち細菌のDNA含量）は、しばしば宿主の生理的状態、プラーク部位の特徴、細菌固有の性質に関係している（Pizarro-Cerdá and Cossart, 2006）。我々は、陽性プラークを有する患者のGMは陰性プラークを有する患者と異なる可能性があり、おそらく前者ではより重篤な生理的異常が関連し、プラークへの腸内細菌の移行に関連する可能性があると仮定した。

われわれは、陽性プラーク患者と陰性プラーク患者との間で、GMのβ多様性に有意な差があることを見いだした。さらに解析の結果、陽性プラークを有する患者の腸内には16属（未知1属）が有意に濃縮されており、陰性プラークを有する患者と比較してGMに顕著な違いがあることが明らかになった。相関解析の結果、プラーク陽性患者の腸内に濃縮された細菌のほとんどが、臨床指標の上昇と有意な正の相関を示したことから、GMの変化が異常な生理学的状態を悪化させる要因のひとつである可能性が示唆された。

我々は、腸内細菌叢（GM）の機能性の潜在的な変化と、身体の生理的状態との潜在的な関連性を探るために、全参加者において腸内細菌叢の機能性発現の予測解析を行った。我々は、嫌気性ホモシステインの生合成に関与する酵素（COG1900）の予測発現が、SCAS患者の腸内細菌叢において有意に上昇していることを発見した。これまでの研究で、ホモシステイン値の上昇は、頸動脈プラークの形態や面積の増加と独立して関連し（Alsulaimaniら、2013）、プラークの進行や脆弱性と密接に関連し（Yangら、2014；Benら、2020）、脳卒中リスクの不顕性マーカーであることが示されている（Zhangら、2020；Rabeloら、2022）。このことは、GMがCOG1900の発現をアップレギュレートすることにより、間接的にSCASの発症を促進する可能性を示唆している。さらに、プラーク陽性の患者の腸内細菌叢において、予測される特定の代謝経路で有意な発現上昇が見られた。特に、フルオロ安息香酸分解経路は、プラーク陽性患者で最も発現が上昇した。この代謝経路は変形性関節症やクローン病などの炎症性疾患でも発現が上昇しており（Gevers et al. アリール炭化水素受容体（Ahr）はヒトの炎症反応と関連しており（Rothhammer and Quintana, 2019）、Ahrの活性化に関与するダイオキシン（Furue et al、 2021）、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン（TCDD、ダイオキシン化合物の一つ）による活性化により、胸腺萎縮、アポトーシス、Treg誘導、骨髄由来抑制細胞の誘導などのメカニズムを通じて炎症を抑制することができる（Cannonら、2021）。したがって、ダイオキシン分解経路のアップレギュレーションは、Ahrの活性化を低下させ、体内での抗炎症作用を弱める可能性がある。β-ラクタム抵抗性の有意なアップレギュレーションは、陽性プラークを有する患者の腸内では薬剤耐性菌が優勢であり、免疫系の異常な炎症反応を誘発し、身体の感染抵抗能力に影響を及ぼす可能性があることを示唆している（von Klitzing et al.）まとめると、これら3つの代謝経路のアップレギュレーションが、陽性プラークを有する患者のより重篤な炎症状態と関連している可能性がある。クロストリジウム（Clostridium）は、潜在的なアトラジン分解菌（Fang et al.、2015）であり、Clostridium_sensu_stricto_1と同じ科に属する。我々の結果では、Clostridium_sensu_stricto_1は陽性プラークを有する患者で濃縮され、アトラジン分解経路の発現と最大の正の相関を示した。したがって、アトラジン分解菌の可能性があると推測される。相関解析の結果、プラーク陽性患者の腸内に濃縮された16の細菌属は、アップレギュレートされた代謝経路のほとんどと有意な正の相関を示し、これらの細菌属がこれらの代謝経路の発現に関与している可能性が示唆された。

われわれの研究では、プラーク陽性患者の腸内に有意に濃縮された11の細菌属がプラーク自体にも存在することが判明し、これらの細菌が腸からプラークに移行する可能性があることが示唆された。粘膜層、腸管上皮細胞、免疫細胞からなる腸管バリアの完全性は、ヒトの生存、健康、防御にとって極めて重要である（Farhadi et al, 2003; Vancamelbeke and Vermeire, 2017）。プラーク陽性の患者はほとんどが高齢者であり、加齢は腸管バリア機能不全の重要な潜在的要因である（Manら、2014；Untersmayrら、2022）。これらの患者のアルコール摂取歴、著しい高血糖、全身性炎症と相まって、これらの因子は腸から血流への細菌の移行を促進すると考えられる（Leclercqら、2014；Liら、2016；Thaissら、2018）。血液中のマクロファージや好中球は、血流に入った細菌を貪食することができ（Sharmaら、2022年）、細菌を保有する免疫細胞は、走化性因子の影響下で頸動脈アテローム性動脈硬化症の領域に移動・集積し（Gencerら、2021年）、プラーク中の細菌DNA量を間接的に増加させる可能性がある。Klebsiella pneumoniaeなどKlebsiella属の一部の細菌は、Rho GTPaseとホスファチジルイノシトール3キナーゼ/Aktに依存する細胞侵入機構を介して、腸管上皮を横切って移動することができる（Wyres et al.）連鎖球菌やクレブシエラは、ピリやアドヘシンなどの接着分子を通じて接着し、コロニー形成することができる（Nobbsら、2009；Chenら、2023）。ブラウティアの中には、ファージやトランスポゾンをコードする遺伝子を持ち、付着やコロニー形成を促進する種もある（Shen et al.、2020；Liu et al.、2021）。Clostridium_sensu_stricto_1の過剰増殖は壊死性腸炎と関連しており（Yang et al.、2019）、腸管上皮を横断するトランスロケーションを促進する可能性がある（Ciftci et al.、2012）。Clostridium_sensu_stricto_1の種は様々な感染症に関連しており（Gublerら、1989；Tappeら、2009；Daganouら、2016）、Romboutsiaがヒトの骨髄壊死を引き起こしたという症例報告もあり（Seviarら、2022）、これらの属がある種の接着能力やコロニー形成能力を持っている可能性を示唆している（Boyle and Finlay、2003）。ムチンは腸のバリアー機構において重要な役割を果たしており（Breugelmansら、2022）、Ruminococcus_2はその分解に関連している（Hatayamaら、2023）ことから、この属は腸のバリアーの完全性を破壊することで移動する可能性がある。皮膚や消化管に一般的に存在するAnaerococcusは、特定の条件下で感染症を引き起こし、菌血症を引き起こす可能性があり（Murphy and Frick, 2013; Badri et al. さらに、ストレプトコッカス（Domenechら、2012年）、クレブシエラ（Alcántar-Curielら、2013年）、メタノブレビバクター（Bangら、2014年）がバイオフィルムを形成する能力を有することを示す証拠があり、強力な生存能力が示唆されている。これらがバイオフィルム沈着物としてプラーク中に存在すれば、プラークの不安定性を増大させる可能性がある。陽性プラークを有する患者の異常な生理学的状態は、CAS部位の内皮機能不全のような病理学的変化を悪化させ、遊離細菌の付着とコロニー形成を促進するかもしれない（Lemichezら、2010）。

興味深いことに、NHF群とPFBS群では、Streptococcus属、Klebsiella属、Blautia属、Clostridium_sensu_stricto_1属に有意差は認められなかったが、陽性プラークを有する患者と陰性プラークを有する患者では有意差が認められ、これらの属がプラーク中に存在していた。したがって、これらの属はCASを引き起こす可能性はないが、プラークの安定性に影響を与える可能性があると推測される。

この研究にはいくつかの限界がある。第一に、連続登録というわれわれの患者募集戦略では、性別分布のバランスを十分にとることができなかった。しかし、先行研究によれば、GMの変動は主に大動脈アテローム性動脈硬化症による脳卒中またはTIAによるものであり（Yinら、2015年）、本研究集団と類似している。したがって、GMの結果に対する性別の影響は小さいかもしれない。第2に、本研究はサンプル数の少ない単施設研究である。われわれの知見を検証するためには、より大きなサンプルサイズを有する将来の多施設研究が必要である。最後に、我々は抗糖尿病薬がGMに及ぼす潜在的な影響を十分に考慮しなかったが、このような潜在的な影響を緩和するために、サブグループ解析を通じて将来の大規模研究で対処されるであろう。

要約すると、陽性プラークを有する患者は、より重篤な代謝障害と炎症状態を示すとともに、腸内細菌、特に腸管関門を通過し、付着、コロニー形成、バイオフィルム形成が可能な細菌が著しく濃縮されている。これらの能力は、プラーク領域への移行や局所感染に好都合な条件を提供し、プラーク中の細菌DNA含量を増加させる。このことがプラークの不安定性を促進し、結果として虚血性脳卒中のリスクを高めると考えられる。

5 結論
われわれの研究は、症候性頸動脈アテローム性動脈硬化症（SCAS）患者が、代謝障害と炎症状態を示すとともに、腸内細菌叢（GM）にも有意な変化を示すことを示しており、これまでの研究結果と一致している。プラーク中の細菌DNAを分析することにより、我々は初めて陰性プラーク患者と陽性プラーク患者の臨床的特徴とGMの違いを比較した。その結果、陽性プラークを有する患者では、より重篤な生理的異常が認められ、頸動脈プラーク領域の内皮の完全性がさらに損なわれ（細菌の付着とコロニー形成が促進され）、プラークの安定性が損なわれている可能性があることがわかった。陽性プラークを有する患者と陰性プラークを有する患者との間のGMにおいて有意差が観察され、特に陽性プラークを有する患者の腸内では11の細菌属が有意に濃縮され、プラークにも存在していた。これらの細菌の一部はプラークに移行する能力を持ち、局所感染、炎症、細菌DNA含量の増加を通じてプラークの不安定性を悪化させる可能性がある。結論として、これらの知見はSCASにおけるプラークの安定性に関する理解を深め、プラーク不安定性のリスクが高い患者を同定するのに役立つであろう。今後の研究では、プラークの形成と進展における様々な微生物の役割の違いや特異的な分子機序、さらにGMの調節がSCASのプラークの安定性にどのように介入しうるかをさらに追求すべきである。

データの利用可能性
本研究で発表されたデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができる。リポジトリ名とアクセッション番号は以下の通り： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1012713.

倫理声明
ヒトを対象とした研究は、聊城人民病院倫理委員会の承認を得た。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。参加者は、本研究への参加について書面によるインフォームド・コンセントを提供した。

著者貢献
HL： HL：概念化、形式分析、方法論、プロジェクト管理、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）。ZZ：概念化、データキュレーション、調査、監督、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）。BF: 概念化、形式分析、調査、視覚化、執筆-初稿、執筆-校閲・編集。ZL: リソース、監督、執筆-校閲・編集。TY: 調査、監督、執筆-校閲・編集。CL: 調査、執筆-校閲・編集。BX: 調査、執筆-校閲・編集。DW: ライティング-校閲・編集、リソース。BL：執筆-校閲・編集、リソース。JH：資金獲得、プロジェクト管理、執筆-校閲・編集。LZ：資金獲得、プロジェクト管理、執筆-校閲・編集。JW：資金獲得、方法論、プロジェクト管理、執筆-校閲・編集。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および／または発表のために金銭的支援を受けたことを表明する。本研究は、聊城人民病院青年研究基金プロジェクト（助成金番号LCPH201907）、山東省老年医学会2021年科学技術プロジェクト（助成金番号LKJGG2021Z010）、聊城市科学技術局（助成金番号2022YDSF18）の助成を受けた。

謝辞
本研究に協力してくれた聊城人民病院検査部および血管神経外科の医師に感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が、利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

著者は投稿時にFrontiers誌の編集委員であったことを申告した。このことは、査読プロセスおよび最終的な決定には影響しなかった。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはそのメーカーが主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1296554/full#supplementary-material。

補足表1-5｜参加者と実験結果の詳細。

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キーワード：頸動脈アテローム性動脈硬化症、腸内細菌叢、プラーク、炎症、微生物機能

引用 Lv H, Zhang Z, Fu B, Li Z, Yin T, Liu C, Xu B, Wang D, Li B, Hao J, Zhang L and Wang J (2024) 症候性頸動脈アテローム性動脈硬化プラークを有する患者の腸内細菌叢の特徴は、細菌遺伝物質陽性である。Front. Cell. Infect. Microbiol. 13:1296554.

受理：2023年9月18日 2023年9月18日；受理：2023年12月26日；
発行：2024年1月12日

編集者

蕭傳興（アモイ大学、中国
査読者

芝孝彦, 東京医科歯科大学, 日本
Rongmu Xia, アモイ大学, 中国
Copyright © 2024 Lv, Zhang, Fu, Li, Yin, Liu, Xu, Wang, Li, Hao, Zhang and Wang. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 Jiyue Wang, 13326356176@163.com; Jiheng Hao, haojiheng@163.com; Liyong Zhang, 13346256936@163.com.

これらの著者は本研究に等しく貢献している。

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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