実験的大腸炎モデルにおけるフローサイトメトリーによる高感度な腸管透過性測定


原著論文|15巻2号, p425-438, 2023
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実験的大腸炎モデルにおけるフローサイトメトリーによる高感度な腸管透過性測定

https://www.cmghjournal.org/article/S2352-345X(22)00215-6/fulltext?utm_medium=Social&utm_campaign=AGA-posts&utm_source=twitter


ケビン・ツァイ
カイシャ・マ
シャオ・ハン
Lijun Xia
John J. Priatel
ブルース・A・ヴァランス
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オープンアクセス公開日:2022年10月13日DOI:https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2022.10.004
PlumX メトリクス

背景と目的
腸管透過性の亢進は、腸管感染症や炎症性腸疾患など様々な炎症性疾患において見られます。バリア機能は疾患の重症度を示す重要なバイオマーカーとなるため、多くの場合、動物モデルでアッセイされる。一般的な方法としては、マウスにフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン(FITC-D)を投与し、その後心臓穿刺を行い、血漿中の蛍光を分光光度計で測定する。FITC-D法は比較的簡便な方法であるが、被験者を死亡させる必要があるため、感度が低く、1回しか測定ができない。本稿では、経口投与したオバルブミン(OVA)が腸管から漏れ出すのを検出する、フローサイトメトリーによる新しい腸管透過性測定法について述べる。この方法は、尾静脈から採取した微量の血液を用いるため、同一被験者の複数の時点における繰り返し検査が可能である。このアッセイをゴールドスタンダードであるFITC-D法と比較することにより、腸管透過性測定における我々のOVAアッセイの有用性が拡大することを示す。
測定方法
同じ動物に両方のプローブを経口投与し、その後、血漿中のプローブレベルを検出することによって腸管透過性を測定するそれぞれの方法論を用いて、我々のOVAアッセイをFITC-Dアッセイと直接比較しました。腸管粘液の産生や糖鎖の形成を遺伝的に欠損させたマウスで透過性を評価した。また、デキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎を起こした野生型マウスや腸内細菌病原体Citrobacter rodentiumに感染したマウスもテストされた。
結果
OVAアッセイは、試験したすべての腸管バリア機能障害動物モデルにおいて、非常に高い有効性を示しました。ムチン糖鎖形成不全マウスにおける腸管バリアー機能不全の同定に加え、本アッセイにより同一動物内での腸管透過性を経時的に繰り返し追跡することができ、現在適用されている他の方法では容易に取得できないデータを得ることができた。
結論
OVAアッセイは、バリア機能障害および実験的大腸炎モデルマウスにおける腸管透過性を測定するための高感度かつ効果的な方法である。
図解要約
図 サムネイル fx1
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キーワード
サイトメトリービーズアッセイ
腸管透過性アッセイ
ELISA
リーキーガット
炎症性腸疾患
本論文で使用した略語
CML(カルボン酸修飾ラテックス)、DSS(デキストラン硫酸ナトリウム塩)、EDAC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)、F(アブ)2(2価抗体断片)、FACST(1×PBS、2%熱不活化牛胎児血清、2 mmol/L EDTAおよび0. 05% Tween 20)、FITC-D(フルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン)、GI(胃腸)、IBD(炎症性腸疾患)、IEC(腸管上皮細胞)です。LM(ラクチュロースマンニトール)、MES(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid)、OVA(オバルブミン)、PBS(リン酸緩衝塩水)、PE(フィコエリスリン)、pi(感染後)、WT(野生型)。
概要
消化管は、単層の腸上皮細胞(IEC)に覆われており、栄養吸収や抗菌ペプチドやムチンの分泌など、いくつかの重要な機能を提供している1。IECの上にある粘液バリアは、杯細胞(IECサブセット)によって作られ、大部分が高糖化ムチン2(Muc2)からなり、腸管腔に頂膜として放出されている1。上皮と粘液層は共に、栄養吸収を可能にする半透膜の粘膜保護バリアを形成しているが、同時に内腔の微生物を上皮から隔離し、上皮内壁との接触を制限している。そのため、遺伝子変異や有害な食物または微生物因子によってこの粘膜バリアの構造または機能に何らかの障害が生じると、内腔内容物(微生物、微生物産物、食物抗原)が消化管外に漏れ出し、基礎にある免疫系の急性活性化を引き起こす可能性がある。このような漏出は、局所的な免疫細胞の活性化、粘膜バリアのさらなる損傷、そして場合によっては、炎症性腸疾患(IBD)患者に見られるような慢性炎症、さらには敗血症につながる可能性があります2,3。
腸管透過性は、一般的に粘膜バリアを通過した内容物の循環系への拡散率として定義され、腸管粘膜バリアの完全性を評価するために通常用いられるパラメータです4, 5, 6。最近の研究では、腸管透過性の増加がクローン病に先行し、しばしばこのタイプのIBDの発症に関連することが示されています7。 9, 10, 11 IBDに加え、腸管透過性の著しい上昇は、1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症などの様々な自己免疫疾患に対する感受性の高まりと関連しています12, 13, 14 したがって、これらの病態における腸管透過性の重要性は、疾患活動性や疾患再発を早期に検出するバイオマーカーとしての利用の可能性を浮き彫りにしています。
腸管透過性測定は、臨床での応用のほか、前臨床モデルでも一般的に用いられています4,5。1つは、経口摂取したプローブを血液や尿から検出するもので、患者ではラクツロース/マンニトールや51クロムが、腸管バリア機能障害モデルマウスではフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン(FITC-D)がよく用いられています4,6。一方、2番目のカテゴリーは、摘出した腸管組織(Usingチャンバー)の電気伝導度をex vivoで評価する方法である15。これらの方法は腸管透過性の測定に非常に有用であるが、コスト、複雑さ、あるいは侵襲性から、その適用範囲は限定されている16,17。さらに、FITC-D法およびUssing chamber法は、いずれも同一動物または生物試料内の複数の時点における腸管透過性を測定することができない。
本報告では、腸管炎症およびバリア機能不全のよく知られたいくつかのマウスモデルにおいて、フローサイトメトリーを用いた新しい腸管透過性測定法について述べ、検証を行う。マウスにニワトリのオバルブミン(OVA)を投与し、微量の血液を採取することで、免疫沈降法によるフローサイトメトリーにより、FITC-D法をはるかに上回る感度で血漿中のOVAを定量することができました。さらに、実験動物を殺す必要がないため、同一動物で数時間から数日間にわたって繰り返し腸管透過性を測定することが可能です。本手法は、一般的な透過性測定に必要な血液量の数分の一で済み、また、プローブであるOVAは一般的な食餌性タンパク質であり、比較的無害であることから、将来的には臨床応用の有力な候補となると考えています。
研究成果
サイトメトリービーズアッセイの構築、検証、およびワークフロー
OVAアッセイプロトコルは、抗体結合カルボン酸修飾(CML)ビーズを用いてプローブ抗原OVAを捕捉する(図1A-D)。アッセイを行うために、まず動物に100μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に懸濁した1mgのOVAを経口投与した。サンプリングの一貫性を確保するためにヘパリンコートキャピラリーチューブに予め印を付け(図1C)、図1Dに示すように、25ゲージ針で尾を突いて2.5μLの血液を採取するのに使用した。サンプル内の血球をまず10μLのTween 20含有蛍光活性化セルソーターバッファーで溶解し、細胞破片を3000×gで5分間遠心分離して除去し、上清を96ウェルU底型プレートに移した。血液サンプルにOVA-CMLビーズを加え、プレートシェーカー上で4℃にてインキュベートした。OVA-CMLビーズ複合体を遠心分離によりペレット化し、ウサギ抗OVAポリクローナル抗体とフィコエリスリン標識ロバ抗ウサギIgGポリクローナルF(ab)2フラグメント(複数の種の血清タンパク質に予め吸着させて他のIg分子との交差反応を最小にした)を併用して検出した。
図 サムネイル gr1
図1OVAアッセイの構成要素、ワークフロー、および感度。(A) フローサイトメトリーによる腸管透過性測定のためのOVAアッセイの原理。(B) OVAアッセイのワークフロー。(C)採血用に設定された容量のキャピラリーチューブの製作。(D)25ゲージ針で麻酔したマウスの尾部を穿刺し、採血を行った。尾の穿刺は、図示のように尾と平行に浅い角度で行った。血液サンプルは、パネルCで作成した標識付きキャピラリーチューブを用いて収集した。 E)標準曲線を用いたOVAおよびFITC-Dアッセイのダイナミックレンジの比較。各データポイントは、それぞれのアッセイの連続的に希釈されたプローブから得られた読み出しの3連を表す。(F)すべての濃度にわたるOVAアッセイまたはFITC-Dアッセイの3つの別々の標準曲線読み出しのパーセンテージエラー。パーセンテージエラーは、3連の読み取りから得られたSEMを3連の平均値で割ることによって計算される。(G) 全濃度にわたるパネルAの3つの別々の実験間の誤差の比較。SEM値は、パネルAの3つの分離したパーセントエラー値から生成され、棒グラフとしてプロットされた。(H)それぞれのアッセイのバックグラウンドノイズの比較(C57/BL6マウス、n = 4)。MFI, 平均蛍光強度。∗∗∗∗ P ≤ .0001.
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OVAアッセイの感度とダイナミックレンジをFITC-Dアッセイと比較するために、まずOVA標準曲線とFITC-D標準曲線を比較しました。FITC-D のダイナミックレンジはおよそ 10-3 から 10-8 g/mL であるのに対し、OVA のダイナミックレンジは 10-6 から 10-12 g/mL です(図 1E)。OVAアッセイの検出限界(10-12 g/mL)は、OVAアッセイがFITC-Dアッセイよりはるかに高感度である可能性を示唆している(図1E)。次に、3つの別々の実験の標準曲線から得られた3連の読み取り値内に存在する分散の量を、読み取り値から得られる誤差の割合を比較することによって分析した。その結果、OVAアッセイの誤差はすべての濃度で約5%であったのに対し、FITC-Dアッセイの誤差は低濃度で約10%と高いことがわかった(図1FおよびG、上図)。次に、これら3つの別々の実験内の誤差の分散を比較することで、各アッセイ間の分散を分析した。その結果、2%から8%の誤差があったFITC-Dアッセイと比較して、実験間の誤差が2%未満であることからわかるように、OVAはすべての濃度においてより一貫した結果を生み出すことがわかった(図FとG、下段)。次に、プローブを含まない血液サンプルの蛍光値をそれぞれの濃度値に変換して比較することで、それぞれのアッセイのバックグラウンドシグナルを比較した。その結果、OVAアッセイのバックグラウンドシグナルがごくわずかであるのに比べ、FITC-Dアッセイはプローブ非存在下ではるかに高いバックグラウンドを示した(図1H)(OVA, 7.9 × 10-12 g/mL vs FITC-D, 2.6 × 10-7 g/mL )。これらのデータを総合すると、OVAアッセイはFITC-Dアッセイと比較して、標的濃度の測定においてより一貫性があり、感度が高く、バックグラウンドノイズが低い可能性があることが示唆された。
経口投与されたOVAは、遠位消化管の内腔に分布している
次に、経口投与されたOVAの局在を調べた。6〜10週齢の健康な雌のC57BL/6マウスに、1mgのOVAを含む100μLのPBS溶液を経口投与した。血液中のOVA濃度が食後約6時間でピークに達するという我々の以前の知見18に基づき、この時点でマウスを殺し、血液と小腸および大腸の組織を採取した。操作されていない野生型(WT)C57BL/6マウスで予想されるように、18 血漿中に最小レベルのOVAが検出された(1.2 × 10-12 g/mL; n = 4)(図2A)。次に、OVAアッセイで使用したのと同じウサギ抗OVA抗体を用いて、ホルマリン固定した腸組織切片を染色した。小腸(十二指腸、空腸、回腸)内では、OVAシグナルは、あったとしてもほとんど見られなかった。これは、このタンパク質がこの時点までに遠位GI管に通過したか、あるいは検出できないほど小さな断片に消化されて吸収されたと考えられる(図2B)。一方、盲腸と結腸(近位、内側、遠位)の染色では、内腔と粘膜表面に非常に強いOVAシグナルが局在していた(Figure 2C)。これらの知見は、経口摂取されたOVAの多くが部分的に消化されるか未消化のまま小腸を通過し、盲腸や大腸の内腔に局在していることを示唆するものであった。このように、経口投与したOVAの局在は、遠位消化管内のバリア機能を評価するのに適しているようである。
図サムネイルgr2
図2血液中およびGI管の様々な領域におけるOVAタンパク質の検出。(A)C57BL/6マウス(n = 4)の血液サンプルで、1mgのOVAを摂取する前または摂取後6時間で検出されたOVA濃度。(B) 小腸におけるOVA局在の可視化。前述のマウスから組織サンプルを採取し、処理した後、OVA(赤)、ならびに腸上皮(E-カドヘリン、白)、杯細胞のムチン顆粒のフコシル化残基(Ulex Europaeus Agglutin I [UEA-1] レクチン、緑)、および核(DAPI、青)について染色を実施した。(C) 盲腸と結腸におけるOVA局在の可視化。DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole. ∗P ≤ .05
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OVAアッセイにより、デキストラン硫酸ナトリウム大腸炎時の腸管透過性を高感度に測定可能
先に述べた知見に基づき、腸管透過性測定における我々のOVAアッセイの有用性をさらに検討するために、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)大腸炎モデルを選択しました。このモデルは、黄砂が化学的刺激物として大腸上皮に作用し、その結果生じる損傷が大腸炎を誘発し、腸管透過性を増加させることを反映している19。まず、C57BL/6雌マウス群に、飲料水中の3%黄砂を処理して粘膜バリアを損傷し腸管透過性を増加させた20。黄砂曝露後3日または6日に、1 mg OVAと12 mg FITC-D を含む100 μL PBS溶液で部分集合マウスを経口投与した。その後、摂取後 3 時間または 6 時間でマウスを殺し、心臓穿刺で血液を採取した。血液中のFITC-Dの量は蛍光光度計で、OVAの量はOVAアッセイで測定した。
どちらの方法でも、コリティックマウスのバリア透過性は、無処置の健康な対照群に比べて統計的に有意な増加が検出されることがわかった。ベースラインのFITC-Dレベル(5.07 ± 0.86 × 10-7 g/mL)は、DSS3日目には1.78 ± 0.31 × 10-6に倍増し、大腸炎6日目には1.06 ± 0.10 × 10-6に再び倍増した。一方、透過性の増加はOVAアッセイでさらに検出しやすく、ベースラインの2.50 ± 0.43 × 10-11 g/mLのシグナルはDSS3日目に100倍の2.62 ± 1.24 × 10-9となり、さらに6日目には15倍の 3.90 ± 1.04 × 10-8に増加しました(図3A)。これは、DSSに長期間さらされると腸の病理学的機能およびバリア機能障害が大きくなるという以前の観察と一致している21。注目すべきは、OVAアッセイは、3日目と6日目のDSS処理群間の統計的有意差を高い信頼度で検出できたが(P = .0004)、FITC-Dアッセイはできなかった(P = .13)(図 3A)ことである。したがって、OVAアッセイは、DSS処理によって誘導された様々な程度のバリア機能障害を識別する上で、FITC-Dアッセイと少なくとも同等の感度を有していることがわかる。
図のサムネイルgr3
図3DSS誘発大腸炎モデルマウスにおいて、腸管バリア機能障害を検出するために高い感度と特異性を示すOVAアッセイ。(A) FITC-D (12 mg/mouse) と OVA (1 mg/mouse) を共投与した非処理 (n = 8) または DSS 処理 (n = 8) マウスの血漿試料からの OVA または FITC-D アッセイ読み出し値。データは少なくとも3つの独立した実験の代表的なものである。統計的有意性は、Tukeyポストホックテストを用いた1元配置分散分析により決定した。(B)非処理(上段)またはDSSで6日間処理した(下段)WTマウスの遠位結腸におけるOVA局在の可視化。マウスに1mg/100μLのOVAを経口投与し、組織を3時間後に採取して組織学的に調べ、OVAアッセイで用いたものと同じウサギ抗OVA抗体で染色した。OVA(赤)の局在は、上皮(E-カドヘリン、緑)および核(DAPI、青)の染色とともに、白い矢じりで強調されている。DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole. ∗p≦0.05、p≦0.01、p≦0.001、p≦0.0001。
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これらの結果は、OVAがDSS投与マウスの粘膜バリアを容易に通過できることを示しているため、そのトランスロケーションを免疫蛍光法で可視化することを試みました。OVAを摂取したマウス(コントロールまたはDSS投与)のホルマリン固定遠位結腸切片を前述の要領で染色した。未処置のWTマウスでは、OVAが大腸上皮の頂膜表面に並んでおり、無傷の上皮バリアを越えたことを示すものはないことを確認した(図3B、上段)。対照的に、この粘膜表面の輪郭は、OVAを経口投与したDSS処理マウスではもはや観察されなかった(図3B、下段パネル)。その代わりに、OVAは大腸上皮細胞内に、また固有層内に、そして時には粘膜下層に見ることができた。高倍率では、OVAはIEC内だけでなくIECの間にも局在しているのが見られ、OVAが傍細胞および経細胞の両方の経路で結腸上皮を通過することが示唆された(図3B、下段)。これらの知見は、この大腸炎モデルにおいて、DSSによって誘発された大腸上皮の損傷によって、経口投与されたOVAが上皮を横切って移動することを確認するものである。
OVAアッセイは、粘液の構造/機能が損なわれたマウスの微妙な透過性障害を検出することができます。
腸管上皮のほかに、その上にある大腸粘液層は、直接的に、また健康なIECsの促進を通して間接的に、粘膜バリア機能に寄与している。ホルマリンでは粘液層を効果的に保存できないので、粘液がOVAの局在に影響を与えるかどうかを明らかにするために、Carnoyの固定液で固定した大腸組織を染色したところ、確かにOVAの大部分は粘液層によって大腸内腔に隔離されているようであった(図4A)。これらのデータは、生理的条件下では、粘液層がバリアとして働き、OVAを大腸内腔内に制限していることを示唆している。
図サムネイルgr4
図4Muc2とそのグリコシル化は、OVAと腸管上皮の相互作用を制限し、腸管透過性を調節するのに重要である。(A) 大腸におけるOVA局在の可視化。C57BL/6マウスの糞便を含む大腸組織サンプルを採取し、メチルカルノイ固定液で固定した後、OVA(赤)、ムチン上のフコシル化残基(Ulex Europaeus Agglutin I [UEA-1] レクチン、緑)、上皮細胞(Eカドヘリン、白)および核(DAPI、青)について染色をした。(B) OVAとFITC-Dを併用投与したMuc2+/+ (WT) (n = 6), Muc2+/- (n = 7), Muc2-/-マウス (n = 6) の血漿試料から読み取られたOVAまたはFITC-Dアッセイ値。データは少なくとも3つの独立した実験の代表値である。統計的有意性は、Tukeyポストホックテストを用いた1元配置分散分析によって決定した。(C)10週齢の雌Muc2-/-マウスのコホート(n=5)に、1mg/マウスOVAを指示通りに経口投与し、2.5μL血液サンプルを指示通りに採取して、各動物内の腸管透過性の変化を追跡した。(D)ムチンのグリコシル化におけるコア1およびコア3合成酵素の機序作用。(E)8〜10週齢のIEC-C1galt1-/-マウス(n=5)および(F)C3GnT-/-マウス(n=3)(それぞれコア1-/-およびコア3-/-マウスと表記)についてのOVAアッセイを用いた、対照IEC-C1galt1fl/-(コア1fl/-)(n=5)およびC57BL/6マウス(n=5)と相対的な腸の透過性に関するデータである。(G)パネルEおよびFのIEC-C1galt1-/-マウスとC3GnT-/-マウス間のOVAアッセイ読み出しからの腸管透過性の比較OVA経口投与1時間後。マウスに1mg/マウスOVAを経口投与し、示された時点で2.5μLの血液サンプルを採取した。データは3つの別々の実験の代表値である。C1GALT1、コア1β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ;DAPI、4′,6-ジアミノ-2-フェニルインドール;Gal、ガラクトース;GalNAc、N-アセチルガラクトサミン;GlcNAc、N-アセチルグルコサミン;S、セリン;T、スレオニン;β3Gn-T6、β1,3-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ6.∗p≦0.05、*p≦0.01、*p≦0.001。
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腸管粘液が欠損すると(すなわちMuc2-/-マウス)、FITC-D法を用いて評価したところ、腸管バリア透過性が緩やかに増加することが、我々や他の研究者によって示されている22。 23, 24 粘液産生不全によるバリア透過性上昇の測定におけるOVAとFITC-D法の感度を直接比較するために、我々はヘテロ接合型Muc2+/-マウスを交配し、実験的Muc2-/-マウスと同腹のMuc2+/-およびMuc2+/-コントロールマウスを作製した。
10-12週齢の雌のMuc2+/+ (WT)、Muc2+/-、Muc2-/-マウスのコホートに、120 mg/mL FITC-Dと10 mg/mL OVAを含む100 μL PBSを投与し、心臓を穿刺した。6時間後に心臓穿刺を行い、血漿を採取し、それぞれのプローブの独立した測定を行った。どちらの方法でもWT(Muc2+/+)マウスに比べMuc2-/-マウスの血漿中プローブ濃度の増加が見られたが、我々の以前の報告23と同様に、FITC-D法はMuc2+/+とMuc2-/-マウス株間で一元配置分散分析により評価したところ、統計的有意性が認められた(Muc2+/+対Muc2-/-のログ変換濃度、 -6.37 ± 0.11 対 -6.04 ± 0.05; P = 0.02 )(図4B)。対照的に、OVA濃度を測定した同じサンプルは、すべての遺伝子型間で非常に有意な差を示した(対数変換した濃度:Muc2+/+ vs Muc2+/-, -10.58 ± 0.06 vs -9.77 ± 0.24; P = .05; Muc2+/+ vs Muc2-/-, -10. 58 ± 0.06 vs -8. 0.24; P = .05)。 58 ± 0.06 vs -8.06 ± 0.33; P = .0002; Muc2+/- vs Muc2-/-, -9.77 ± 0.24 vs -8.06 ± 0.33; P = .002) (図4B)から、Muc2対立遺伝子1つでも機能喪失すると腸のバリア機能が著しく低下することが示された。
次に、OVAアッセイを使用して、同じマウスを繰り返しサンプリングすることによって、時間経過とともに腸管透過性を測定できるかどうかを検証した。この方法は、FITC-Dアッセイでは大量の血液(100-200μL)を必要とし、試験動物を殺さなければならないため、人道的に使用することができない。Muc2-/-マウスの腸管透過性を5日間にわたって追跡するために、Muc2-/-マウスのコホートに、PBS中の10 mg/mL OVA 100 μLと、示された時点で行ったテールポークスから得た2.5 μLの血液サンプルを与えた。血液(OVA)測定値がベースラインに近づくとすぐに、同じ量のOVA(1mg/100μL)を再び動物に与え、示されたように血液サンプルを再び採取した。図4Cに示すように、1つのケージ内のMuc2-/-マウスは、異なる程度の腸管透過性を示すことが分かった。興味深いことに、5日間にわたり、個々のマウスのケージメイトに対するリーク度は、Figure 4Cの2つの四角いボックスで示される記号の順序で示されるように、同じままであった。これらのデータを総合すると、OVAアッセイは腸管透過性の微妙な変化を検出でき、同じ動物内で経時的に信頼性高く追跡できることが示唆される。
注目すべきは、Muc2タンパク質が、コア1β1,3およびコア3β1,3-N糖転移酵素の作用により、重量の80%ものO-結合型糖鎖26で構成され、高グリコシル化されていることである(図4D)。コア1あるいはコア3糖転移酵素の機能欠損マウスは、腸管粘液層が薄く、コア1酵素欠損マウスは生後4-6ヶ月までに自然大腸炎を発症する27。しかし、これらのマウスも大腸炎発症前の時点において、ベースラインの腸管透過性が上昇しているかどうかは不明である。この疑問を解決するために、我々のOVAビーズアッセイを用いて、8-10週齢のIEC-β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損マウス(VillinCre-C1galt1-/-)およびコア3β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素欠損(C3GnT-/-)のコホートに100 μL PBS中に1 mg OVAを懸濁し、先に述べたようにして血漿に移行したOVA量を計測した。
その結果、IEC-C1galt1-/-マウスはflox対照(Core 1fl/fl)と比較して腸管透過性が増加し(図4E)、C3GnT-/-マウスは中間の表現型であることがわかった(図4F)。IEC-C1galt1-/-マウスは、Muc2-/-マウスで観察されたほど腸のリーク性は深刻ではなかったが(WT [Muc2+/+]の500倍18)、C1galt1fl/flコントロールで見られたものより約100倍高いOVAの血液濃度を食後6時間目に示した(C1galt1fl/fl 4. 0 × 10-11 vs IEC-C1galt1-/- 3.4 × 10-9 g/mL)(図4E)、一方、C3GnT-/-マウスは、摂取後6時間の血漿中に、コントロールと比較して約60倍高いレベルのOVAを認めた(B6 6h 2.6 × 10-11 vs C3GnT-/- 1.6 × 10-9 g/mL)(図4F)。興味深いことに、IEC-C1galt1-/-とC3GnT-/-マウスの透過性を比較すると、1時間の時点でのみ有意差が認められた(図4G)。これは、両方の酵素が粘液バリア機能の促進において重要な役割を果たしているが、コア1酵素はマウス消化管のより近い領域でコア3よりも大きな役割を果たす可能性があることを示唆している。
OVAアッセイは、感染性大腸炎時の腸管透過性亢進を検出することができる
腸管感染症もまた、腸管透過性の亢進を引き起こす可能性がある。様々な腸管感染モデルマウスの中で、我々や他の研究者は、付着・排出型細菌であるCitrobacter rodentiumが、適度な組織病理と炎症と協調して腸管透過性の増加を引き起こすことを示した28,29。このモデルへのOVAアッセイの適用性を試験するために、C57BL/6マウスに2×108CFUのC rodentiumを感染させ、感染後6日目(pi)に100μLの10 mg/mL OVAを経口摂取させた。30 投与後 6 時間にマウスの血液を採取し、OVA の存在を測定した。OVAアッセイを使用して、同じ動物内で腸管透過性の統計的に有意な約850倍の変化を検出し、ベースラインレベル(2.50 ± 0.43 × 10-11)は、π6日目に2.13 ± 0.56 × 10-8に増加した(P = .0001)(図5A)。これらの結果は、OVAアッセイが、C rodentium感染モデル内の腸管透過性の微妙な変化を検出できることを示唆している。
図5 gr5(サムネイル)
図5C rodentiumの消化管感染により、OVAが腸管上皮を通過する病変が生じる。(A) 6〜8週齢のC rodentium感染(6日π)または非感染雌WT C57BL/6 マウスのコホート(n = 12)のOVAアッセイの代表データ。マウスに1 mgのOVAを経口投与し、投与後6時間目に採血した。データは3つの別々の実験の代表値である。統計的な有意性を決定するために、2-tailed Student t testを使用した。(B)C rodentiumに6日間感染したマウスの遠位結腸組織を染色し、OVA(赤色)を確認した。OVAは、付着したC rodentiumの近傍(緑)および重感染クリプトの深部(矢頭)で検出され、E-cadherin(白)およびDAPI(青)も染色された。(C)腸管透過性を追跡する代表的なOVAアッセイデータ(C rodentium感染前と感染経過中)。6〜8週齢のメスC57BL/6マウスのコホート(n = 4)は、感染直前に腸管透過性OVAアッセイを行い、その後、C rodentiumの4日目と6日目のπに再度、腸管透過性アッセイを行った。以前のOVAアッセイからの残留循環OVAが結果に影響するかもしれないという懸念に対処するため、OVA投与直前に血液を採取して既存のベースラインを確立し、この値を6日目の測定値から差し引いた。結果は、3つの独立した実験の代表値である。血液サンプルは、示された日πにOVA(1mg/マウス)を経口投与した6時間後に採取した。(D)パネルCに記載のマウスの病原体便負担。マウスに、C rodentium感染前(0日目)、または4日目または6日目にOVAを経口投与した。便サンプルは経口投与直後に採取し、血液サンプルはOVA経口投与の6時間後に採取した。便サンプルは、100μg/mLストレプトマイシンを含むルリアブロス寒天培地プレート上に3連でプレーティングされた。パネルCおよびDの統計的有意性は、Tukeyポストホックテストを用いた1元配置分散分析により決定された。CR, Citrobacter rodentium; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; NI, Not infected. ∗p≦0.05、****p≦0.001、****p≦0.0001。
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C rodentiumのような付着・排出型の細菌性病原体は、IECの頂膜表面に付着し、その3型分泌系を介してエフェクタータンパク質をIEC細胞内に移行させることにより、IECバリアの崩壊を引き起こす31。この系における C rodentium vs OVA の局在を明らかにするために、遠位結腸組織切片を抗OVA抗体と、標的 O-抗原の一つ(O152)を発現している C rodentium を認識することが示されている Escherichia coli lipopolysaccharide (Poly 8) に対する抗血清で共染色を行った32。我々は、大腸粘膜表面に付着したC rodentiumを容易に検出し、その近傍にOVAシグナルを頻繁に検出するとともに、感染クリプトルーメンの深部にまで浸透した(図5B、矢頭で強調)。これらのデータは、C rodentium感染がバリア破壊を引き起こし、内腔因子(OVAなど)が大腸クリプトに入り、上皮バリアを越えて移動できるようになることを確認するものである
C rodentiumの感染が進行すると腸管透過性が高まることが予想されるが、FITC-D法やUsing chamber法ではマウスを殺さなければならないため、同じマウスで経時的に追跡することはできなかった。この仮説を検証するため、私たちは熱を持ったマウスにOVAを投与し、6時間後に2.5μLの血液サンプルをOVAアッセイで検査し、ベースラインを確立しました。その後、これらのマウスを2×108コロニー形成単位のC rodentiumに感染させ、先に述べたのと同じ手順を経て、4日目のπにOVAをギャベッジし、そして6日目のπに再びギャベッジした。図5Cに示すように、感染前のベースライン血中OVAレベルは極めて低かったが、4日目のπでアッセイを繰り返すと統計的に有意な大きな増加(約240倍)を示した(0日目、5.45 ± 3.78 × 10-12 vs 4日目、1.30 ± 3.78 × 10-9; P < .0133)。6日目には、OVAを新たに摂取した後、血漿OVAレベルはさらに2倍上昇した(2.98 ± 3.78 × 10-9; P < .0002)。さらに、C rodentiumの便の負担が最も大きいマウス(4日目または6日目のπ)は、OVAに対する腸管透過性が最も高いことが観察された(図5D)。このように、OVAアッセイは腸管感染症や大腸炎における腸管バリア機能障害や疾患(病原体負荷)を評価するのに有用であると思われる。
考察
FITC-DアッセイとUsing chamberアッセイは、研究者がマウスの腸管透過性を測定するために最もよく使用される方法である。FITC-D法は比較的簡単で、感度もそれなりにある。残念ながら、このアッセイに通常必要な血液量(100-200μL)は、試験動物を殺す必要があるため、非常に動的なプロセスのスナップショットしか得られない。同様に、Usingチャンバーは生体外での腸管透過性を正確に測定できるが、これも実験動物を殺す必要がある。さらに、装置のコストとその技術的な課題により、近年、ウッシングチャンバーの使用は減少しています。
OVAアッセイはフローサイトメトリーを用いたアッセイであるため、FITC-Dアッセイよりも若干複雑ではあるが、それでも単一色を用いるため(蛍光補正が不要)比較的簡便である。また、フローサイトメーターを使用するノウハウは、大学や研究所に広く普及している。また、OVAアッセイは十分に特性化された抗原を用いるため、多くのOVA抗体を選択し、解析することができるのも特徴の一つです。コスト面では、フローサイトメーターの運用コストを考慮しても、FITC-D($5.45/サンプル)に比べ、OVAアッセイは驚くほど安価($0.1/サンプル)です(表1)。OVAアッセイの最も有益な特徴は、動物を殺すことなく実施できるため、腸管透過性を長期間にわたって追跡できることである。これは実験のばらつきを減らすだけでなく、各実験で使用する動物の数を大幅に減らすことができる。本報告では、腸管バリア機能障害および/または大腸炎のいくつかのマウスモデルを用いて、OVAおよびFITC-Dアッセイのバックグラウンドノイズレベル、検出限界、感度を相対的に比較する一連のベンチマーク実験を行った。
表1FITC-DとOVAアッセイ間のコスト比較
コンポーネント(メーカー) 単価 1ユニットあたりの検査数 1検査あたりのコスト
5μm CML ビーズ(ThermoFisher) $461 3.6 × 105 $0.001
ヤギ抗 OVA 抗体(MP Biomedicals) $240 4.5 × 104 $0.005
ウサギ抗OVA抗体(Bethyl Laboratory) $122 2000 $0.06
PE 抗ウサギ抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories) $255 10,000 $0.03
合計 $0.1
FITC-D (Sigma) $452 83 $5.4
合計 $5.4
注 コンジュゲーション反応1回あたりのビーズ生成量:1.80 × 107、1回あたりのビーズ使用数:20,000、コンジュゲーション反応1回あたりのテスト数:900。
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まず、標準曲線を比較し、それぞれのアッセイのダイナミックレンジを決定することで、検出限界を検討しました。OVAアッセイのダイナミックレンジは6桁(つまり10-6から10-12 g/mL)であるのに対し、FITC-Dアッセイは10-4から10-9 g/mLをカバーしています。わずか1桁の違いですが、OVAアッセイは10-12 g/mLまで感度があり、これはFITC-Dアッセイの1000倍も低いレベルです。この感度の高さは、OVAが45キロダルトンの大きなタンパク質であり33、多くの異なるエピトープを持つため、2種類のポリクローナル抗OVA抗体でOVAを効果的に捕捉し結合できるためであると推測している。ウサギポリクローナル抗体のエピトープは、ロバ抗ウサギポリクローナル抗体によってさらに増幅され、低濃度でも強固なシグナルを生成します。次に、未処理のC57BL/6マウスの血漿からそれぞれのアッセイを使用して読み取り値を得ることで、それぞれのアッセイのバックグラウンドノイズを比較検討した。その結果、OVA法では検出下限値の約8倍であるのに対し、FITC-D法では約35倍であり、OVA法のバックグラウンドノイズは検出下限値の約8倍であることがわかりました。このことはOVAアッセイの感度が高いことを示唆するが、同時にFITC-Dアッセイのバックグラウンドノイズがなぜ高いのかという疑問が生じる。このバックグラウンド信号は、FITC-D分子の励起に使われるのと同じ波長の光で励起される生体分子を含むことが知られている血漿の成分から生じているのではないかと考えている34。
我々は、黄砂を含む飲料水を3日または6日間与えたC57BL/6マウスにOVAとFITC-Dを共投与し、黄砂大腸炎モデルのベンチマーク実験を開始した。健康なマウスでは、血漿中にほとんどOVAが検出されないことから、ごく少量のOVAが無傷の上皮バリアを通過することが示唆されました。このことは、対照マウスの腸管切片の免疫染色によって裏付けられた。そこでは、OVAが盲腸および大腸の内腔および上皮表面の裏打ちに見られたが、上皮を通過して検出されるものはなかった。DSS投与マウスでは、いずれのアッセイもDSS後3日目の透過性上昇を検出することができたが、感度は劇的に異なっていた。大腸の病変が明らかであるにもかかわらず、FITC-Dアッセイでは、DSS投与3日後の腸管透過性の増加はわずか2倍であり、3日目から6日目にかけてさらに2倍増加した。一方、OVAアッセイでは、DSS投与3日後にベースラインから100倍、3日目から6日目にかけてさらに15倍(DSS投与前に比べ1500倍)の増加が見られた。これらの結果は、OVAアッセイがFITC-Dアッセイと比較して優れた解像力を有することを示唆している。
粘液バリアの欠陥は、ほとんどのマウス IBD モデルと同様に IBD27 の特徴であるが、その腸管透過性への影響は十分に解明されていない35。そこで、粘液バリアの構造的/機能的障害の程度が異なるマウス系統を用いて、追加のベンチマーク実験を行った。Muc2+/-マウスは軽度の大腸炎、Muc2+/-マウスは中等度の大腸炎、Muc2-/-マウスは重度の大腸炎を発症する)25。Muc2+/-マウスの黄砂感受性の高さが、ベースラインのバリア機能障害に関連しているかどうかは不明であった。この仮説を検証するために、Muc2+/+、Muc2+/-、Muc2-/-マウスにOVAとFITC-Dを共投与し、腸管透過性がMuc2対立遺伝子機能数に相関していることを見出した。特に、OVAアッセイでは統計的に有意な差が認められたが、FITC-Dアッセイでは有意な差は認められなかった。この結果は、Muc2-/-マウスの腸管透過性が上昇するという我々の以前の知見と一致していた22が、OVAアッセイではMuc2+/+マウスの600倍の透過性の上昇を確認した。さらに、Muc2+/-マウスの血漿中のOVA濃度は、WT Muc2+/+マウスに比べ14倍も高いことが確認されました。
疾患条件下での腸管透過性は動的であるため、個体のサンプルを繰り返し採取することができれば、非常に有益な情報となる。そこで、同じ動物から少量の血液を採取できる利点を生かし、Muc2-/-マウスの腸管透過性を1週間にわたり、経口投与と採取を繰り返しながら検討した。その結果、Muc2-/-マウスの腸管透過性は1週間にわたりほぼ一定であり、本アッセイの信頼性が確認された。Muc2+/+とMuc2+/-マウスの間で腸管透過性に有意差があることから、我々は、粘液の構造や機能における他の欠陥も腸管透過性の上昇につながるのではないかと推測し、OVAアッセイを用いてこれを検証しようとした。先に述べたように、コア1とコア3の糖転移酵素は、Muc2ムチンのO-結合型糖鎖を適切にグリコシル化するのに重要であり、その欠損は化学的誘導や自然大腸炎に対して宿主をより感受性にする36, 37, 38, 39。我々はIEC-C1galt1-/-マウスもC3GnT-/-マウスもWTコントロールと比べてOVA法で有意な透過性の増大を示すことを明らかにした。これらの結果は、腸管粘液とその適切な糖鎖修飾が腸管透過性の調節に重要であることを示している。さらに、我々の研究は、バリア機能のより微妙な変化を検出するためのOVAアッセイの有用性をも浮き彫りにしている。
最後に、C rodentium感染モデルは、FITC-Dアッセイでバリア破壊が示されている確立されたモデルであるため、OVAアッセイがバリア機能の追跡に有用であるかどうかを検討した。OVAアッセイを用いると、C rodentium感染により、6日目のπで腸管透過性がベースラインより850倍上昇することが示された。さらに、感染の時間経過とともに腸管透過性を評価することができ、同じマウス内で、バリア機能障害が4π日目にはベースラインよりも劇的に増加し、6π日目にはさらに増加することが示された。このように、OVAアッセイを用いることで、疾病の経過に伴う腸管透過性の変化や、回復に至る可能性を研究することができるのです。
OVAアッセイを繰り返す(すなわち、OVAを繰り返し経口投与する)際に考えられる注意点は、自己の抗OVA抗体の産生をもたらす免疫反応を誘発する可能性があり、これはアッセイで使用する捕捉抗体および検出抗体を阻害する可能性があることである。宿主ブロック抗体は、あらゆる抗原の反復投与に伴う合併症である可能性があるため、長期的な研究においてバリア機能を評価するために様々なプローブを使用する必要があるかもしれない。これと同様に、我々は以前、ウシβ-ラクトグロブリンもMuc2-/-マウスの腸管透過性を追跡するためのプローブとして使用できることを示した18。宿主の抗プローブ抗体が結果を混乱させる可能性を考えると、1週間以上の実験に同じプローブを使用し、プローブ特異的適応免疫応答を調べる場合には注意が必要であることを示唆している。長期間の実験には、OVAやβ-ラクトグロブリンと同様の化学的・物理的特性を持ちながら、比較的免疫原性が低い合成分子の使用を検討することが提案される。このようなプローブを用いれば、自己抗体の干渉を受けずに、より長い期間、透過性を繰り返し測定することが可能になるであろう。
本研究はマウスモデルを対象としていますが、IBD患者においても腸管透過性は有意に上昇します。しかし、腸管透過性の増加は、IBDの罹患率3、疾患活動性4、5、6、7、および他の自己免疫疾患や自己炎症疾患の罹患率と強く関連しています8、9、10。Lactulose Mannitol (LM) テストは、バリア機能障害を有する患者における腸管透過性の測定において臨床上のゴールドスタンダードとなっています11。その後、尿サンプルを採取し、糖の存在について分析する。LM検査を受ける患者は検査施設に拘束されるため、患者や臨床医にとって魅力的な検査法とは言い難い。OVA検査は、ごく少量の血液で検査が可能であることから、LM検査に代わる検査法となる可能性がある。さらに、指を刺す方法は安全で簡単であり、比較的苦痛が少ない。また、食品グレードの低温殺菌オバルブミンは安価で入手しやすい。また、卵や焼き菓子などの卵を含む食品を摂取した後に、オバルブミンが検出されるかどうかも評価する予定です。また、尿中の OVA を定量することにより、腸管透過性の亢進をモニターできることを示しました18 。さらに、若い患者の多くが針恐怖症であることから、この代替サンプリング法は臨床で広く採用する価値があると思われます。さらに、このサンプリング方法は、若い患者の多くが注射針恐怖症であることから、臨床で広く採用される可能性があります。我々は、OVAアッセイの安全性プロファイルと臨床的有用性を調査することによって、この可能性を探り、臨床使用への道を開くつもりである。
材料と方法
マウス
IEC特異的C1galt1欠損(IEC-C1galt1-/-)マウスは、C1galt1-floxマウスとVillinCreマウスを以前に記載したように交配して作成した40。コア3転移酵素欠損(C3GnT-/-)、C57BL/6、Muc2-/-41マウスはBritish Columbia Children's Hospital Research Instituteで特定の病原体とヘリコバクターフリー条件で飼育されたものであった。実験には、特に指定がない限り、雄マウスと雌マウスを使用した。DSS および C rodentium 感染実験において年齢と性別が一致するように、雌の C57BL/6 マウスもジャクソン研究所から購入した。すべての実験は、British Columbia大学のAnimal Care CommitteeおよびCanadian Council on Animal Careによって承認されたプロトコルおよびガイドラインに従って実施された。
OVAアッセイのためのオバルブミン特異的CMLビーズの調製
抗 OVA ポリクローナル抗体は、以前に記載されたようにカルボジイミド法を用いて CML (#C37255; ThermoFisher) ビーズに結合させた。42,43 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer と 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC) は結合反応の前に、最大の活性を確保できるように直ぐに準備された。MESバッファーを調製するために、まずMESを蒸留したH2Oに溶解した。EDTAを加えて、最終濃度が50 mmol/L MESおよび1 mmol/L EDTAのバッファーを作成し、pHを6.0に調整した。EDAC粉末を15mLコニカルチューブで秤量し(0.01-0.015g)、EDAC-MES溶液の最終濃度が50 mg/mLとなるよう十分なMES緩衝液に溶解した。
CMLビーズを調製するために、まず5個のビーズを最大速度で1分間ボルテックスすることにより再懸濁した。ビーズを数滴、1.5mLロビンドエッペンドルフチューブ(#0030108442; Eppendorf)に移した。ビーズを15,000×g、3分間、室温で遠心分離することによりペレット化した。上清を、ピペットを用いた注意深い吸引によって除去した。CMLビーズを500μLのPBSで2-3回洗浄し、最後に100μLのMESバッファーにピペットで再懸濁させた。CMLビーズの10μLアリコートを、血球計数機で計数するためにPBSを用いて5000~10000倍に希釈した。ビーズ濃度を決定した後、1.8×107個のCMLビーズを1.5mLロビンドエッペンドルフチューブに移し、MESバッファーを用いて50μL容量まで増加させた。20μL EDAC-MES溶液を加えてCMLビーズを活性化し、ピペッティングで混合した後、800RPMに設定したシェーカー上に室温で15分間置き、ビーズが沈降しないようにした。また、シェーカーを使用できない場合は、1-2分ごとにピペッティングを行い、ビーズを浮遊させることも可能である。15分間の活性化後、CMLビーズを15,000×g、室温で3分間の遠心分離によりペレット化し、500μLのPBS洗浄を2~3回行った。CMLビーズを遠心分離してペレット化し、PBSを注意深く吸引して除去し、ビーズを抗体結合の準備完了としました。
ビーズに抗体を結合させるため、活性化CMLビーズを100μLヤギ抗OVAポリクローナル抗体(#0855303;MP Biomedicals)に再懸濁し、800RPMに設定したシェーカー上で室温で4時間インキュベートした。インキュベーション後、CMLビーズを15,000×gでペレット化し、500μLのPBSで2-3回洗浄し、100μLのQuenching, Blocking, and Storage buffer (1% bovine serum albumin, 0.02% NaN3 in PBS) に再懸濁させてビーズ表面に残った化学基を不活性化させた。CMLビーズを計量し、4℃で最長6ヶ月間保存しました。信頼できる結果が得られるよう、ビーズ活性は1ヶ月ごとに確認する必要があります。この研究に記載された抗体濃度(ウサギとヤギの抗OVAとロバの抗ラビットのフィコエリスリン[PE])は、連続希釈した抗体とオバルブミンを用いて経験的に最適化されたことに留意する必要があります。他の抗オバルブミン抗体や検出抗体を使用される場合は、最適化実験を行うことを強くお勧めします。
FITC-Dを用いた腸管透過性の測定
FITC-D (#68059; Sigma-Aldrich) を滅菌PBSまたは10 mg/mL OVAを含むPBS(共投与実験用)に溶解し、120 mg/mL の作業濃度とした。各マウスに100μLのFITC-D溶液を経口ガベージで与えた(マウス1匹あたり12mg)。動物はアッセイの間絶食させ、6時間後に頸椎脱臼により殺し、心臓穿刺を用いて血液サンプルを採取した。血漿を遠心分離を用いて分離し、FITC-Dの血漿濃度を蛍光光度計(ThermoFisher Scientific)を用いて測定した。
OVAアッセイを用いた腸管透過性の測定
緩衝液(1×PBS、2%熱不活性化牛胎児血清、2mmol/L EDTA、0.05% Tween 20)(FACST)はアッセイ前に新鮮に調製したものを使用した。マウス血液中のOVAの存在を検出するために、2.5〜5μLの血液アリコートを、ヘパリン化マイクロヘマトクリット毛細管(Fisher)を用いて、図1に示される尾突きの技法を用いて収集した。血液サンプルは、抗原直線化のために0.5% TWEEN 20および50 mmol/L EDTAを含む10 μLのPBSと混合した。血液サンプルは、他の時点のサンプルが収集されている間、-20℃で保存することができた。サンプルは-20℃で最大2週間まで保存可能であった。サンプル採取終了後、血液サンプルを室温で5分間解凍し、FACSTバッファーを100μLまで添加し、2000×g、4℃で3分間遠心分離して細胞破片をペレット化した。上清を注意深く吸引し、96ウェルU底プレート(BD Falcon)に移し、10μL FACSTバッファに懸濁した20,000個のCMLビーズを各ウェルに加え、マルチチャネルピペットを用いてピペッティングして混合した。
サンプルは、800rpm、4℃に設定したプレートシェーカーで一晩インキュベートした。翌朝、CMLビーズを750×g、4℃で5分間ペレット化し、上清を除去した。FACST緩衝液で希釈したウサギ抗オバルブミンポリクローナル抗体(100μL、#GTX21221;GeneTex)を各ウェルに加え(最終濃度10μg/mL)、マルチチャネルピペットを用いて混合した。プレートを800rpmに設定したプレートシェーカー上で室温で1.5〜2時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを750×g、4℃で5分間遠心分離してペレット化し、上清を除去した。このビーズを、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジなど様々な種のIgGに対して交差反応性の少ない100μL PE conjugated-F(ab')₂ fragment donkey anti-rabbit IgG polyclonal antibody (#711-116-152; Jackson Immunoresearch Laboratories) で染色した。その後、二次抗体をFACSTバッファーで最終濃度0.5μg/mLに希釈し、マルチチャンネルピペットを用いてピペッティングにより混合した。プレートを光から保護するためにアルミホイルで包み、800rpmに設定したプレートシェーカー上で室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後のビーズを750×g、4℃で5分間遠心分離してペレット化し、上清を除去して200μLのFACSTバッファで1回洗浄し、200μLのFACSTバッファに再懸濁してデータ取得に使用した。データは、染色が完了次第、BD FortessaまたはBD LSR IIフローサイトメーターとBD FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences)を併用して取得し、FlowJoソフトウェア(FlowJo, LLC)を使用して解析した。
組織処理と免疫染色
ホルマリン固定切片は,10%ホルマリン緩衝液(#HT501128-4L; Sigma-Aldrich)にて4℃で一晩固定後,70%エタノールに移してパラフィン包埋・切片化した.粘液染色は,採取した組織をメタカルン(60%メタノール,30%クロロホルム,10%氷酢酸)中で4℃,1時間固定し,100%メタノールに移して包埋・切片化した。
免疫染色のために,切片を約60℃で15分間加熱して脱パラフィンし,キシレンで洗浄した後,エタノールから水への減少勾配で再水和し,緩衝液(10 mmol/L sodium citrate, 0. 05% Tween 20, pH 6.0)で30分間蒸し、ブロッキングバッファー(PBS中のロバ血清、1%ウシ血清アルブミン、0.1% Triton X-100 [Sigma Alderich], 0.05% Tween 20 [Sigma Alderich] および 0.05% アジ化ナトリウム含有)で1時間ブロッキングをした。IECバリアを通過するOVAの視覚化のために、ウサギ抗OVAポリクローナル抗体(#GTX21221、1:1000;GeneTex)またはヤギ抗OVAポリクローナル抗体(#0855303、1:100;MP Biomedicals)およびマウスモノクローナル抗マウスEカドヘリン抗体(#610182、1:400;BD Transduction Laboratories)が使用された。APCコンジュゲート-F(ab')₂フラグメント ロバ抗ウサギIgGポリクローナル抗体(#711-116-152;Jackson Immunoresearch Laboratories)、ロバ AlexaFluor 568コンジュゲート抗ヤギIgG(H+L)高架橋二次抗体(#A-11057.Thermal Fisher)、およびAlexaFluor 488標識抗マウスIgG(H+L)高クロス吸着二次抗体(#R37114; Thermal Fisher)を、1.2000の濃度で添加した。 2000でそれぞれ使用した。Muc2の可視化には、抗原を回収しブロックしたスライドをFITC標識Ulex Europaeus Agglutinin I (#FL-1061-5; Vector Laboratories) で染色し、1:2000の濃度で使用した)。C rodentiumの可視化には、以前に大腸菌O152を認識することが示されている抗血清、C rodentium32に発現する同じO-抗原を1:1000の濃度で使用した(#81449;SSI Diagnostica)。
飲料水投与におけるDSSソルト
DSS塩(#160110;MP Biomedicals)を飲料水に溶解し、3%(w/v)DSS溶液を生成した。マウスには、指定された期間、DSS飲料水のみを与えた。大腸炎の臨床的徴候がないか、体重と便の硬度を毎日モニターした。
C rodentiumの感染
C rodentium biotype 4280 strain DBS100 (ATCC 51459; American Type Culture Collection, Manassas, VA) の冷凍ストックをLuria broth agar plateにストリークし、コロニーを用いて37℃のLuria brothに一晩培養を接種した。感染当日、6〜8週齢の雌性C57BL/6マウスに、約2.5×108コロニー形成単位のC rodentiumを含む100μLの一晩培養液を経口投与した。感染後6日間マウスを観察し、6日目のπで感染マウスにOVAアッセイを実施した。
C rodentium感染による病原体負荷の評価
OVAを経口投与した直後に便サンプルを採取し、ボルテキサーを用いて1mLの滅菌PBSで可溶化した。サンプルを滅菌PBSで連続希釈し、100μg/mLストレプトマイシンを含むルリアブロス寒天培地プレートに3連でプレーティングした。寒天培地プレートは37℃で一晩培養し、コロニーを計数して病原体量を評価した。
カーブフィッティングおよび統計解析
統計的有意性の決定、標準曲線のフィッティング、および相関分析は、GraphPad Prism 6 ソフトウェアを使用して行った。データはまず、パラメトリックまたはノンパラメトリックのどちらの検定が必要かを決定するために、正規性の検定が行われた。統計的有意性は、対応のない両側Student t検定または1元配置分散分析検定で決定した。ポストホックテストとしてTukey法またはBonferroni法が用いられた。P値0.05以下を有意とし、図中ではアスタリスクが有意であることを示す。どの統計検定およびポストホックテストを使用したかの詳細は、図の説明文に記載した。
CRediT 著者による貢献
Bruce Vallance (構想: イコール、資金獲得。研究方法 同等、資金獲得:リード、方法論:リード、プロジェクト運営:リード リード、リソース。リード、スーパービジョン。リード、執筆-レビューと編集。リード)
Kevin Tsai (概念化: リード、データキュレーション。リード、形式的分析。リード、調査 リード、方法論。執筆 - 原案: 執筆 - 原案: 主任、執筆 - 査読および編集: 同等)
馬嘉霞 (方法論: 同様)
Xiao Han (方法論: 助言; 執筆 - 査読と編集: 助言)
Joannie Allaire (方法論: 助言; 執筆 - 査読と編集: 同上)
Genelle R. Healey (方法論:支援、執筆-レビューと編集:均等)
シャウナ・M・クロウリー (方法論:支援)
ホンビン・ユー(執筆 - 査読および編集:均等)
Kevan Jacobson (執筆 - 査読と編集: 助成)
Lijun Xia (リソース: 助成; 執筆 - 査読と編集: 助成)
John J. Priatel (構想: 主任; 調査: 主任) John J. Priatel (構想: 主任; 調査: 主任; 方法: 主任) イコール、メソドロジー。同等、リソース。サポート、スーパービジョン。執筆 - 査読と編集: イコール)
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記事情報
出版履歴
オンラインで公開されました。2022年10月13日
受理されました。2022年10月7日
受理:2022年10月7日 2022年6月22日
脚注
利益相反 著者らは利益相反を開示しない。

資金提供 この研究は、自然科学・工学研究評議会からの発見助成金2018-05120、カナダ保健研究所からの運営助成金PJT-159528および178090、およびカナダクローン病・大腸炎(B.A.V.)から支援を受けている。

身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2022.10.004

著作権について
© 2022 The Authors. AGA Instituteに代わってElsevier Inc.により発行されました。
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図表の概要
図のサムネイル gr1
図1OVAアッセイの構成要素、ワークフロー、および感度。(A) フローサイトメトリーによる腸管透過性測定のためのOVAアッセイの原理。(B) OVAアッセイのワークフロー。(C)採血用に設定された容量のキャピラリーチューブの製作。(D)25ゲージ針で麻酔したマウスの尾部を穿刺し、採血を行った。尾の穿刺は、図示のように尾と平行に浅い角度で行った。血液サンプルは、パネルCで作成した標識付きキャピラリーチューブを用いて収集した。 E)標準曲線を用いたOVAおよびFITC-Dアッセイのダイナミックレンジの比較。各データポイントは、それぞれのアッセイの連続的に希釈されたプローブから得られた読み出しの3連を表す。(F)すべての濃度にわたるOVAアッセイまたはFITC-Dアッセイの3つの別々の標準曲線読み出しのパーセンテージエラー。パーセンテージエラーは、3連の読み取りから得られたSEMを3連の平均値で割ることによって計算される。(G) 全濃度にわたるパネルAの3つの別々の実験間の誤差の比較。SEM値は、パネルAの3つの分離したパーセントエラー値から生成され、棒グラフとしてプロットされた。(H)それぞれのアッセイのバックグラウンドノイズの比較(C57/BL6マウス、n = 4)。MFI, 平均蛍光強度。∗∗∗∗ P ≤ .0001.
図サムネイルgr2
図2血液中および消化管内各部位におけるOVAタンパク質の検出。(A)C57BL/6マウス(n = 4)の血液サンプルで、1 mg OVA投与前または投与6時間後に検出されたOVA濃度。(B) 小腸におけるOVA局在の可視化。前述のマウスから組織標本を採取し、処理した後、OVA(赤)、ならびに腸上皮(E-カドヘリン、白)、杯細胞のムチン顆粒のフコシル化残基(Ulex Europaeus Agglutin I [UEA-1] レクチン、緑)、および核(DAPI、青)について染色を実施した。(C) 盲腸と結腸におけるOVA局在の可視化。DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole. ∗P ≤ .05
図のサムネイル gr3
図3DSS誘発大腸炎モデルマウスにおいて、OVAアッセイは腸管バリア機能障害を高い感度と特異性で検出することができる。(A) FITC-D (12 mg/mouse) と OVA (1 mg/mouse) を共投与した非処理 (n = 8) または DSS 処置 (n = 8) マウスの血漿サンプルからの OVA または FITC-D アッセイ読み出し値。データは少なくとも3つの独立した実験の代表的なものである。統計的有意性は、Tukeyポストホックテストを用いた1元配置分散分析により決定した。(B)非処理(上段)またはDSSで6日間処理した(下段)WTマウスの遠位結腸におけるOVA局在の可視化。マウスに1mg/100μLのOVAを経口投与し、組織を3時間後に採取して組織学的に調べ、OVAアッセイで用いたものと同じウサギ抗OVA抗体で染色した。OVA(赤)の局在は、上皮(E-カドヘリン、緑)および核(DAPI、青)の染色とともに、白い矢じりで強調されている。DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole. ∗p≦0.05、p≦0.01、p≦0.001、p≦0.0001。
図 サムネイル gr4
図4Muc2とそのグリコシレーションは、OVAと腸管上皮の相互作用を制限し、腸管透過性を調節するのに重要である。(A) 大腸におけるOVA局在の可視化。C57BL/6マウスの糞便を含む大腸組織サンプルを採取し、メチルカルノイ固定液で固定した後、OVA(赤)、ムチン上のフコシル化残基(Ulex Europaeus Agglutin I [UEA-1] レクチン、緑)、上皮細胞(Eカドヘリン、白)および核(DAPI、青)について染色をした。(B) OVAとFITC-Dを併用投与したMuc2+/+ (WT) (n = 6), Muc2+/- (n = 7), Muc2-/-マウス (n = 6) の血漿試料から読み取られたOVAまたはFITC-Dアッセイ値。データは少なくとも3つの独立した実験の代表値である。統計的有意性は、Tukeyポストホックテストを用いた1元配置分散分析によって決定した。(C)10週齢の雌Muc2-/-マウスのコホート(n=5)に、1mg/マウスOVAを指示通りに経口投与し、2.5μL血液サンプルを指示通りに採取して、各動物内の腸管透過性の変化を追跡した。(D)ムチンのグリコシル化におけるコア1およびコア3合成酵素の機序作用。(E)8〜10週齢のIEC-C1galt1-/-マウス(n=5)および(F)C3GnT-/-マウス(n=3)(それぞれコア1-/-およびコア3-/-マウスと表記)についてのOVAアッセイを用いた、対照IEC-C1galt1fl/-(コア1fl/-)(n=5)およびC57BL/6マウス(n=5)と相対的な腸の透過性に関するデータである。(G)パネルEおよびFのIEC-C1galt1-/-マウスとC3GnT-/-マウス間のOVAアッセイ読み出しからの腸管透過性の比較OVA経口投与1時間後。マウスに1mg/マウスOVAを経口投与し、示された時点で2.5μLの血液サンプルを採取した。データは3つの別々の実験の代表値である。C1GALT1、コア1β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ;DAPI、4′,6-ジアミノ-2-フェニルインドール;Gal、ガラクトース;GalNAc、N-アセチルガラクトサミン;GlcNAc、N-アセチルグルコサミン;S、セリン;T、スレオニン;β3Gn-T6、β1,3-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ6.∗p ≤ .05, ∗p ≤ .01, ∗∗p ≤ .001.
図 サムネイル gr5
図5C rodentiumの消化管感染により、OVAが腸管上皮を越えて透過する病変が生じる。(A) 6〜8週齢のC rodentium感染(6日π)または非感染雌WT C57BL/6マウスのコホート(n = 12)のOVAアッセイの代表的なデータ。マウスに1 mgのOVAを経口投与し、投与後6時間目に採血した。データは3つの別々の実験の代表値である。統計的な有意性を決定するために、2-tailed Student t testを使用した。(B)C rodentiumに6日間感染したマウスの遠位結腸組織を染色し、OVA(赤色)を確認した。OVAは、付着したC rodentiumの近傍(緑)および重感染クリプトの深部(矢頭)で検出され、E-cadherin(白)およびDAPI(青)も染色された。(C)腸管透過性を追跡する代表的なOVAアッセイデータ(C rodentium感染前と感染経過中)。6〜8週齢のメスC57BL/6マウスのコホート(n = 4)は、感染直前に腸管透過性OVAアッセイを行い、その後、C rodentiumの4日目と6日目のπに再度、腸管透過性アッセイを行った。以前のOVAアッセイからの残留循環OVAが結果に影響するかもしれないという懸念に対処するため、OVA投与直前に血液を採取して既存のベースラインを確立し、この値を6日目の測定値から差し引いた。結果は、3つの独立した実験の代表値である。血液サンプルは、示された日πにOVA(1mg/マウス)を経口投与した6時間後に採取した。(D)パネルCに記載のマウスの病原体便負担。マウスに、C rodentium感染前(0日目)、または4日目または6日目にOVAを経口投与した。便サンプルは経口投与直後に採取し、血液サンプルはOVA経口投与の6時間後に採取した。便サンプルは、100μg/mLストレプトマイシンを含むルリアブロス寒天培地プレート上に3連でプレーティングされた。パネルCおよびDの統計的有意性は、Tukeyポストホックテストを用いた1元配置分散分析により決定された。CR, Citrobacter rodentium; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; NI, Not infected. ∗p≦0.05、*****p≦0.001、*****p≦0.0001。

表1FITC-DとOVAアッセイのコスト比較
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