アジアゾウが直面する脅威を明らかにする生活習慣勾配に沿った腸内細菌叢のバリエーション

2023年4月22日オンライン公開
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アジアゾウが直面する脅威を明らかにする生活習慣勾配に沿った腸内細菌叢のバリエーション

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1672022923000694?via%3Dihub

著者リンク open overlay panelChengbo Zhang 1, Zhenghan Lian 2, Bo Xu 1, Qingzhong Shen 3, Mingwei Bao 4, Zunxi Huang 1, Hongchen Jiang 5, Wenjun Li 2
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https://doi.org/10.1016/j.gpb.2023.04.003Get 権利と内容
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腸内細菌は、宿主の栄養や健康と密接に関係しています。しかし、腸内細菌と宿主のライフスタイルの関係は、十分に解明されていない。我々は、交絡する地理的変動がない場合、中国西双版納の野生象谷に生息するアジアゾウ（AE）の腸内微生物に、ライフスタイル勾配（完全飼育、半適応、半野生、純粋な野生）に沿った明確な変動パターンを定義した。16S rRNA遺伝子の塩基配列を用いた系統解析の結果、飼育の程度が高くなるにつれて微生物の多様性が低下することが浮き彫りになりました。さらに、細菌分類群WCHB1-41_cが生活様式の勾配変動に大きく影響されることが明らかになった。また，定量的リアルタイムPCRにより，純粋な野生生活を送るAE のマイクロバイオームには，酪酸産生に関連する遺伝子が少ないことが明らかになったが，これは環境上の不利な要因が増加したためと考えられた．これらの結果は，生活様式の異なるAE間で腸内細菌叢の特徴が異なることを示し，この重要な動物種の幸福度向上や保全のための戦略立案の基礎となるものである．
キーワード
アジアゾウ
腸内細菌叢（ちょうないさいきんそう
系統解析
ライフスタイル
ホストの健康
はじめに
腸内細菌叢は哺乳類の栄養と健康に密接に関係しており、生理的プロセス [1]、免疫応答 [2]、栄養代謝 [3] に寄与しています。特に草食性哺乳類は、食物から栄養とエネルギーを抽出し、ビタミンを合成し、植物防御化合物を解毒するために、固有の腸内細菌叢に依存している[4]。正常な微生物-宿主関係は、健康的で安定した食事 [5]、地理的に均質な環境 [6]、長期間継続し変動がないライフスタイル [7]によって維持されています。これらの関係に乱れが生じると、宿主の病気を引き起こす可能性があります[8]。しかし、食事や地理的要因の寄与をライフスタイルの要因から分離することは困難である[7]。したがって、ライフスタイルが腸内細菌叢にどのように、またどの程度影響を与えるかを理解することは、依然として大きな課題となっています。
動物のライフスタイルの変化が腸内細菌叢を大きく変化させることは、数多くの研究で示されている[9], [10]。野生動物が飼育下に置かれると、行動範囲の制限、単調な食事、特定の社会的ネットワークの喪失など、劇的な変化に対処しなければならない。これらの条件は、動物の腸内細菌叢の多様性と組成を阻害する[11]。野生動物と比較すると、飼育下の動物は腸内細菌の多様性が低いことが分かっています[12]。しかし、飼育下と野生の哺乳類の腸内微生物群集の違いについては、相反する結果が得られています。例えば、ある研究では、飼育下のサイの腸内微生物多様性は野生のサイのそれよりも高いことが判明しました[10]。このような論争の的となる結果は、さまざまなライフスタイルが動物の腸内細菌叢に与える影響について、より詳細な対照研究の必要性を強調しています[13]。
宿主のライフスタイルと腸内細菌叢の組成の相互作用を理解することは、野生動物の保護に役立つ。例えば、生息地の劣化は、クロホエザルの腸内細菌叢における酪酸産生と水素代謝に関連する遺伝子数の減少につながり、彼らの健康に影響を与える可能性があります[14]。飼育下の葉食性霊長類では、微生物の多様性が低下し、繊維分解に関連する代謝経路の相対的な存在量が低下しています[12]。腸内細菌叢の繊維分解プロセスは、短鎖脂肪酸の形成を介してホエザルの1日の必要エネルギーの最大31％に寄与している [15]。したがって、ライフスタイルの変化に伴う腸内細菌叢の多様性と組成の変化は、野生動物の栄養と健康に影響を及ぼす可能性があります。
アジアゾウ（Elephas maximus, AE）は，中国の国家第一級重点保護野生動物に指定されている．国際自然保護連合（IUCN）によると絶滅危惧種に指定されている。野生のアジアゾウ（WAE）は、中国の雲南省南部に分布し、その生息数は288～338頭である[16]。数十年にわたる AE の保存・保護活動の結果，野生象谷熱帯雨林景勝地（2800 m2 以上）には，完全飼育（Cc），半飼育（Sc），半野生（Sw），完全野生（Wi）という生活様式のグラデーション（詳細はサンプル説明で）を持つ動物がいる．したがって，この領域のAEは，ライフスタイルの変化に対する腸内微生物の応答に関する研究に適している．しかし，上記の各ライフスタイルを持つ動物間の腸内細菌叢の比較解析はほとんど報告されていない．
本研究では、AEsの採食植物種の調査をもとに、細菌群集解析（16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス）を用いて、ライフスタイル勾配に沿ったAEsの腸内細菌叢の特徴を明らかにしました。近年，WAEsの生息域は中国南部の西双版納地域から徐々に北上している．この拡大は世界的に注目されているが、その理由は未だ不明である。本研究では、以下のような具体的な疑問を解決することを目指した： (1) AE の腸内細菌叢は、野生象の谷のライフスタイル勾配に沿ってどのように変化するのか？(2) AE のマイクロバイオームにおいて，ライフスタイル勾配に明らかに影響を受ける細菌分類は何か？(3) AE の腸内細菌叢における宿主の栄養と健康に関連する遺伝子の含有量は，生活習慣勾配に沿ってどのように変化するのか？これらの疑問の解明は、この重要な動物種の幸福度向上や保全のための戦略設計の基礎となるであろう。
研究成果
ライフスタイル勾配に伴うAE類の採食習慣の比較分析
採食植物調査から、完全飼育ゾウに供給される餌は、ゾウリムシを中心とした3種類のみであることがわかりました。半適応ゾウは、エレファントグラスを中心とした餌のほか、野生では約25種類の植物を食べていました。最も頻繁に採食される植物は、イネ科のカニガラ（Digitaria sanguinalis）と笹の葉であった。半野生ゾウは、野生で49種の採食植物を食べており、中でもカニナバラと笹の葉が最も多く食べられていました。WAEでは、約112種の採食用植物が消費された（表S1）。これらの結果から，4つのライフスタイルにおいて，AEが採食する植物の多様性は，飼育の度合いによって低下することが示唆された．WAEの食性は非常に多様であったが，非常に偏食であった．WAEは作物や換金作物を好んで採食し、次いでタケノコや若葉、最後に毛ガニ草やゾウリムシを採食した。上記の主な採食植物をもとに（表S2）、中性デタージェント繊維（NDF）の平均含有量は、飼育の度合いに応じて増加（野生、半野生、半適応、完全飼育でそれぞれ49.5%、59.8%、66.3%、72.8%）することが判明した（表S3）。しかし，粗タンパク質（CP）含量の平均値は，完全飼育，半適応，半野生，野生ゾウの飼料でそれぞれ9.2％，12.1％，14.93％，8.5％となった（Table S3）．特に、野生ゾウの主な採食植物では、CP含量が最も低いことがわかった。一般的に、CP含量が高く、NDF含量が低いほど、飼料の栄養価は高くなる[17], [18]。採食植物のCPとNDF含量だけから、半野生群の食物の栄養価は、4つの異なる生活様式の中で優れていると考えられる。
配列情報および性・年齢要因の除外について
AE患者の糞便サンプルから、合計2029のoperational taxonomic unit（OTU）と3,207,598の配列（平均±標準偏差（SD）: 48,600±5086.552; range: 35,650～61,086 ）が得られた。希釈曲線は、コミュニティカバレッジがほぼ飽和していることを示し（図S1）、シーケンスの深さがすべてのサンプルの細菌コミュニティ組成を正確に反映していることが示唆された。
OTUレベルでの豊かさ（Chao1）と多様性（Shannon）の指標（図S2A）およびβ多様性分析（PERMANOVA；R2 = 0.1771, P = 0.80, 図S2B）に基づいて、微生物の多様性に男女間の有意差は見られなかった。同様に、腸内細菌叢の豊富さ（Chao1）および多様性（Shannon）（図S2C）、腸内細菌組成（PERMANOVA; R2 = 0.1502, P = 0.098, 図S2D）にも幼虫と成虫で有意差は認められませんでした。そこで、オスとメス、幼体と成体のデータをプールして、その後の統計解析を行った。
アルファ多様性指標とベン分析
AE の腸内細菌群集のアルファ多様性は，飼育の程度に応じて有意に減少した（野生，半野生，半適応，完全飼育の順，P < 0.05； 図 1）．腸内細菌群集の豊かさ（Chao1 index）は、野生生活から飼育生活にかけて明らかに減少し（図1A）、完全飼育生活と半適応生活の豊かさの値は、半野生生活と野生生活とで有意差があった（P < 0.05）．また，AE の腸内細菌群集の多様性（Shannon index）は，野生生活から飼育生活にかけて明らかに減少し，完全飼育生活と他の 3 つの生活との間（P < 0.01），半適応生活と野生生活の間（P < 0.05） に有意差があった（図 1B）．腸内細菌群集の均等性（Pielou指数）は、完全飼育から野生生活まで明らかに増加した（図1C）。完全に飼育されたライフスタイルの均等性の値は、他の3つのグループのそれよりも有意に低く（P < 0.01、図1C）、完全に飼育されたライフスタイルの個体では、飼育ゾウの単食と一致する極めて優位な微生物が存在することが示された。半野生群と野生群に共通するOTUで、完全飼育群と半適応群にはないものが122個あった（図1D）； このうち、Erysipelatoclostridium関連OTU975、Treponema 2関連OTU（OTU590およびOTU1438）、Ruminococcaceae UCG-005関連OTU1382、Lachnospiraceae関連OTU471、 Mollicutes RF9関連OTU542は、セミワイルド・ワイルド群の半数以上のサンプルで別々に存在量がゼロでは無かった。これらの微生物相は、WAEsの食性に適応していた。完全飼育群、半適応群、半野生群に共通して、人間の干渉を受けた野生状態では見られないOTUが54個存在した（図1D）。中でも、Bacteroidales BS11関連OTU（OTU222、OTU271、OTU1183）、Prevotella 1関連OTU1、Lachnospiraceae関連OTU194、Leptospiraceae関連OTU253、Pyramidobacter関連OTU1281は3グループの半分以上の試料で存在量が0ではなかった。これらの微生物相は，飼育下AEの高繊維食と関連していた．
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図1. ライフスタイル勾配を越えたアジアゾウの腸内細菌叢のα多様性指標とベン分析。4つのライフスタイルにまたがるアジアゾウの腸内細菌叢のChao1指数（A）、Shannon指数（B）、Pielou指数（C）。D. 4つのライフスタイルにおけるアジアゾウの腸内細菌叢のベン分析。Ccは飼育下生活、Scは半適応生活、Swは半野生生活、Wiは野生生活、*はP < 0.05; **はP < 0.01; ***はP < 0.001; n.s. は有意差なし。
βの多様性
OTUレベルのBray-Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）により、腸内細菌群集はライフスタイルの違いにより明確にクラスター化し（PERMANOVA；R2 = 0.3017, P = 0.001） 、多次元空間において細菌群集が明確に分離した（図2AおよびB）。これらの結果から、腸内細菌組成は、微生物分類群間の進化的関係に関係なく、4つのライフスタイルで大きく異なることが示されました。
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図2. ライフスタイル勾配を越えたアジアゾウの腸内細菌叢のベータ多様性解析。A）ブレイカーティス距離、（C）重み付けUniFrac距離、（F）非重み付けUniFrac距離に基づく、4つのライフスタイルにわたるアジアゾウの腸内細菌叢のベータ多様性分析。B）Bray-Curtis距離、（D）重み付きUniFrac距離、（G）重みなしUniFrac距離、および（E）飼育グループに対する重み付きUniFrac距離、（H）飼育グループに対する重みなしUniFrac距離、（I）飼育グループに対するSIMPER非類似度に基づいて、4つのライフスタイルにおけるアジアゾウの腸内マイクロバイオームのPC1レベルにおけるベータ多様性の解析。PC、主座標分析次元。
進化関係と微生物量情報を考慮すると、微生物叢の組成は、重み付けUniFrac距離に基づくPCoAによってライフスタイル間で有意に区別されたが（PERMANOVA；R2 = 0.3391, P = 0.001; 図2CおよびD）、自由採食ライフスタイル（Sc, Sw, Wi）と完全捕獲ライフスタイル間の重み付けUniFrac距離は有意差がなかった（クラスカル・ウォリス、P= 0.59; 図2E）。このことから，ライフスタイル勾配は，AEの腸内細菌叢の進化的な非類似性を促進しない可能性が示唆された．
さらに，4 つのライフスタイルにおける AE 腸内細菌叢の PCoA を，微生物分類群の有無に着目して（すなわち，存在量情報を無視して），重み付けのない UniFrac 距離で行った．ライフスタイルによって，微生物組成に有意な差が認められた（R2 = 0.2774，P = 0.001）．しかし、飼育を伴うライフスタイル（Cc、Sc、Sw）は、Wiライフスタイルとは別に、すなわち互いにクラスタリングした（図2F）。ライフスタイルはPCoA次元1（PC1）に沿った分散の19.71%を説明し、PC2に沿った分散の9.41%に相当する。PC1に沿って、完全捕獲型、半捕獲型、半野生型の腸内細菌組成は類似しており、W型と有意に異なっていた（P = 0.001; 図2G）。自由採食型ライフスタイル（Sc, Sw, W）と完全飼育型ライフスタイルの間の非加重UniFrac距離は、野生型ライフスタイルの度合いが高いほど有意に増加した（Kruskal-Wallis, P = 0.00013; Figure 2H）。また、OTUレベルでの自由採食型ライフスタイル（Sc、Sw、Wの順）と完全飼育型ライフスタイルの類似率（SIMPER）［19］の非類似度は明らかに上昇した（図2I）。これらの結果は、人工給餌を伴うライフスタイルが、多くの細菌分類群の損失につながる可能性を示唆している。
分類学的解析
門レベルの分類学的解析結果を図 3A に示す。SIMPER解析の結果、4つのライフスタイル勾配における門レベルの差分寄与種は、Firmicutes、Fibrobacteres、Proteobacteriaであった。Firmicutesは半野生群で有意に濃縮され（P < 0.05）、Fibrobacteresは完全飼育群で有意に濃縮され（P < 0.05）、Proteobacteriaは半適応群で他の群より存在量が著しく低かった（P < 0.05; Figure S3）。4つのライフスタイル勾配間のファミリーレベルでの差分寄与種は、Lachnospiraceae、Spirochaetaceae、Rikenellaceae、Fibrobacteraceae、Ruminococcaceae、Prevotellaceae、Bacteroidales_BS11、Porphyromonadaceae、WCHB1-41_c. Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、WCHB1-41_cは完全飼育群で最も存在量が少なく、Spirochaetaceae、Fibrobacteraceae、Bacteroidales_BS11は完全飼育群で最も存在量が多くなった（図3B）。これらの結果から、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、WCHB1-41_cは自然食の摂食により濃縮された細菌分類群である可能性があり、完全飼育群でSpirochaetaceae、Fibrobacteraceae、Bacteroidales_BS11は飼育ゾウの食事に含まれる高い繊維質と関連している可能性が示唆されました。
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図3. ライフスタイル勾配を越えたアジアゾウの腸内細菌叢の分類学的解析。アジアゾウの腸内細菌叢の門レベル（A）と科レベル（B）の分類学的解析。
ライフスタイル勾配に沿った飼育下グループと野生グループにおける細菌バイオマーカーの存在量変動
線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析に基づき，完全飼育群ではFibrobacteraceaeとBacteroidales_BS11がバイオマーカー細菌分類群であり，完全野生群ではVerrucomicrobiaのWCHB1-41_cがバイオマーカー細菌分類群となっていた（図4）．門レベルの細菌組成解析では、完全飼育群、半適応群、半野生群から野生群にかけてVerrucomicrobiaの相対量が増加し、完全飼育群のFibrobacteresは半適応群、半野生群、野生群のそれと比べて有意にはるかに豊富だった（P < 0.05; Figure 3A）。科レベルでは、完全飼育群のWCHB1-41_cの相対存在量は他の3群より有意に低く、完全飼育群のFibrobacteraceaeの相対存在量は他の3群より有意に高くなった。半捕獲群を除き、完全捕獲群および半野生群から野生群へのBacteroidales_BS11の相対存在量は減少する傾向にあった（図3B）。
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図4. 線形判別分析効果量（LEfSe）による細菌バイオマーカー分析
ライフスタイルの変化と関連する細菌分類群
門レベルでは、4つのライフスタイルの間で腸内細菌の存在量に明確な違いがあった（図3A）。そこで、ライフスタイルの変化に関連する細菌コミュニティを特定するために、重み相関ネットワーク解析（WGCNA）により9つの共分散グループ（CAG）を求めた（図5A）。9つのCAGと4つのライフスタイルの関係をスピアマン相関係数で調べたところ、CAG2とCAG8がライフスタイルの違いと有意に関係していることがわかった（P < 0.001；図5B）。CAG2のライフスタイルと相関の高い上位10個のOTUを分析したところ、完全に飼育されたライフスタイルから野生のライフスタイルまで存在量が増加することがわかった（図S4A）。上位10個のOTUのうち8個は主にFirmicutesのLachnospiraceae（OTU1505, OTU496, OTU554, OTU1540, OTU1338, OTU1766, OTU1799）およびChristensenellaceae（OTU604）に、残りの2つはBacteroidesのRikenellaceae（OTU103）と放線菌のCoriobacteriaceae（OTU1516）に割り当てられた（図 S4A）。しかし、CAG8のライフスタイルの変化に関連する上位10個のOTUは、野生のライフスタイルで有意に濃縮された（P < 0.001; Figure S4B）。CAG8で有意に濃縮された細菌OTUは、主にVerrucomicrobiaのWCHB1-41クラス（OTU1872、OTU1957、OTU1855、OTU1994、OTU1755、OTU1465、OTU1470）である、 と3つのOTUがバクテロイデス門のRikenellaceae RC9（OTU2011）とPrevotellaceae（OTU2036）、ファーミキューテス門のRuminococcaceae UCG-010（OTU51）に割り当てられました（図S4B）。
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図5. 共起ネットワーク解析と機能予測。A. WGCNAを用いて得られた9つの共起性グループ（CAG）。B. 9つのCAGと4つの生活習慣のスピアマン相関分析。C. PICRUSt2によるWCHB1-41_cの機能予測結果のヒートマップ。WCGNA, Weighted gene correlation network analysis; CAG, Co-abundance groups.
PICRUSt2[20]による機能予測の結果，WCHB1-41_cがライフスタイルの変化と有意に関連する主な機能は，代謝経路，二次代謝産物の生合成，アミノ酸の生合成，多様な環境における微生物代謝，リボソーム，炭素代謝でした．機能予測結果のヒートマップでは、完全飼育個体から野生個体まで、上記の機能が徐々に増加することが示された（図5C）。
生活習慣に関連した微生物叢の違いがもたらす健康への影響
生活制限のある個体で腸内細菌叢の多様性が低下すると，腸内細菌叢の安定性に影響し，宿主の健康に影響を及ぼす可能性があるようで，飼育下の AE の腸内疾患がこれまでに報告されている [21], [22], [23]．明らかな病原性細菌はまれであるが，腸内細菌叢の変化により，病原体の干渉や侵入に対する抵抗力が低下する可能性がある．異なる環境における微生物分類群や代謝機能遺伝子の変化は、腸内細菌叢の組成シフトがホエザルの健康に影響を与えることを示している[14]。酪酸は結腸上皮細胞の主なエネルギー源であり、多くの健康増進効果があると考えられている[24], [25]．ライフスタイルの違いが動物の健康に与える影響を評価するために、我々は酪酸産生腸内細菌の存在量を分析した。AE の腸内には酪酸産生菌は多く含まれなかったが，Butyrivibrio（OTU792，OTU1721）と Pseudobutyrivibrio（OTU479，OTU515，OTU614）は，完全飼育から半適応，そして半野生の生活様式へと明らかに増加した（図6A）．しかし、野生群での存在量は、半野生群での存在量よりわずかに低かった（図6A）。さらに，AE の腸内では，酪酸産生菌（OTU586，OTU779，OTU1012）の存在量が極めて少なかった（図 6A）．したがって，AE の腸内の酪酸産生菌は，主にブチリビブリオとシュードブチリビブリオで構成されていた．また，酪酸酸化細菌は，酪酸産生細菌が産生した酪酸を消費することができる。しかし，AE の腸内細菌には，酪酸酸化細菌である Butyricimonas（OTU1028，OTU1050）は検出されなかった（図 6A）．
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図6. 機能性細菌と遺伝子の含有量 A. 16S rDNA配列決定による4つのライフスタイルのアジアゾウの腸内細菌叢における酪酸産生細菌OTUのヒートマップ解析。B. qPCRを用いて検出されたBCoATの相対的含有量。C.qPCRで検出されたdsrAの相対的な含有量。BCoAT, butyryl-coenzyme CoA transferase gene, dsrA, dissimilated sulfite reductase gene A. 同じ上付き文字を含むボックス（a、b、ab）は有意差なし（P < 0.05）を示す。
リアルタイム定量PCR（qPCR）解析の結果、完全飼育、半飼育、半野生、野生の各ライフスタイルの個体における標的遺伝子ブチリル・コエンザイムCoAトランスフェラーゼ（BCoAT）の平均相対発現量はそれぞれ1.29、1.67、1.80、1.05（表S4）で、飼育度合いに応じて緩やかに減少していた（SwおよびSc群からCc群まで、図6B）。また、4つのライフスタイルグループ間で相対的なBCoATレベルに有意な差が見られた（Kruskal-Wallis, P = 0.01779; Figure 6B）。しかし、相対的なBCoATレベルは野生群で最も低く、半適応群および半野生群のレベルとは有意に異なっていた（P < 0.01; Figure 6B）。これらの結果は，優占種組成（食物消化菌を含む）解析（図3；図S3）と組み合わせることで，ライフスタイルが異なるAEが健康に及ぼす影響について重要な示唆を与える可能性がある．
完全飼育ゾウ，半飼育ゾウ，半野生ゾウ，野生ゾウの qPCR で検出された dsrA 遺伝子の平均相対発現量は，それぞれ 0.74，0.67，0.88，および 0.64 であった（表 S5）．ライフスタイルの勾配を越えたdsrA遺伝子のレベルには明らかな傾向は見られなかった。dsrAの相対レベルは4つのライフスタイルグループ間で差がなく（Kruskal-Wallis, P > 0.05; Figure 6C）、4つのグループ間で硫酸還元菌の硫化水素生成能力に有意差がないことを示している。
考察
また，生活様式や食性（CPやNDFの含有量の違いなど）が異なるAEが同居していることに着目し，地理的な交絡がない中で，長期的に持続する生活様式の違いが腸内細菌叢にどのように影響するかを明らかにした．その結果、AEsの腸内細菌群集の多様性は、飼育の度合いによって著しく減少することがわかった。腸内細菌叢は動的であり，微妙な食餌の変化に反応する [26], [27]．そのため，同一集団の個体間の微生物変動は，通常，食餌変動との関連で解釈される [5], [28]．本研究では，採食植物の種類は，野生生活から飼育生活までの AE 生活勾配に沿って大幅に減少した．高繊維質で植物性の食品を多く含む食餌は，他の食餌形態よりも多様な微生物ニッチを生成するはずである [29]．しかし、主な食品の繊維含有量（すなわち、NDF含有量）は、野生から飼育下の生活様式に至るまで増加した（表S3）。したがって，飼育の程度に伴う腸内細菌多様性の低下の主な決定要因は，食餌の繊維含有量の変動よりも，採食植物種の減少[30], [31]にあると考えられる．
3つのライフスタイル（Sc、Sw、Wi）を持つ個体に共通する特徴として、新鮮な自然植物を部分的または完全に採食し、野生状態にさらされることが挙げられる。Schmidtらは、新鮮な自然食品や野生環境は腸内細菌叢を補充することができるため、個体がどこで生まれたかにかかわらず、同じ自然環境にある隣人間でシカマウスの腸内細菌叢はより似ていると報告した[32]。したがって，野生で得られる新鮮な自然食品は，AE 腸内細菌の収束濃縮を促進することができる．さらに，飼育下では，食事（地下水を含む），人工飼育環境，その他の人為的な接触が個体間で共有されている．古くなった植物を用いた人工飼料は，嫌気的環境の確立と嫌気性微生物の濃縮の遅れにより，腸内細菌の損失を引き起こす[33]．さらに、人との接触や環境条件によるホルモンや免疫のストレス反応は、腸内細菌叢に深刻な影響を与える[34]、[35]。また、人為的な干渉がAEにおける腸内細菌叢の異常につながるという研究結果もある[36]。これらの知見は，PCoAで野生個体と他の集団との間に分離が見られた理由を説明するものであろう．したがって，自由採食の程度と飼育環境が，4 つの異なる生活様式を持つ AE の腸内細菌組成の違いを決定する重要な要因である可能性がある．
また，完全飼育個体群では，フィブロバクター科が有意に濃縮されていたが，これは，フィブロバクター科がセルロースを分解する主要な細菌分類群であることから，飼料中の繊維含有量が多いことと関連している可能性がある[37]．また，Bacteroidales_BS11 は，半適応個体群で有意に濃縮されており，飼育下および自由採食状態で急速に変化する飼料に栄養学的に適応することが可能である [38] ．また，Lachnospiraceae は半野生集団で有意に濃縮され，腸内病原体によるコロニー形成に対する抵抗力を促進することで宿主に影響を与えることができる [39]．したがって、Lachnospiraceaeの存在量の増加は、自由採食型のライフスタイルを持つ個人の免疫学的プロセスにとって有益であると考えられる。
SIMPER、LEfSe、WGCNAの解析結果を総合すると、細菌分類群WCHB1-41_cはライフスタイル勾配変動に大きく影響されることがわかった。存在量変化の観点からは、WCHB1-41_cは自由採食により徐々にAEが濃縮された。また，この細菌分類群は，飼育の程度が高くなるにつれて，AEから徐々に失われる可能性がある。Guoらは、未培養のEubacterium WCHB1-41_cが、飼料がまばらな極端な環境条件下で栄養要求を調整する上で重要な役割を果たすことを明らかにした。ヤクの腸内細菌叢には、窒素とエネルギーを効果的に利用するために、厳しい寒冷期における食事の変化に対応した変化が観察された[40]。離乳初期のヤクの子牛は、栄養不足と厳しい環境条件のために死亡率が高いという研究結果がある[41]。離乳期のヤク子牛を対象にハトムギエキスの補食試験を行ったところ、ハトムギエキスの補食量の増加に伴い、WCHB1-41_cの割合が増加傾向を示すことがわかった。ヤク子牛の成長性能試験では、最終体重および平均日増体量（ADG）が対照子牛よりも有意に高く、乾物摂取量（DMI）/ADG比はハトムギ根エキス補給子牛が対照子牛よりも有意に低いことが示された。また、ハトムギエキスを給与した子牛の血清免疫グロブリンG（IgG）およびインターロイキン2（IL-2）の濃度は、コントロール群よりも高かった。これは、ハトムギ根エキスがWCHB1-41_c細菌分類群の割合の増加を引き起こし、過酷な環境に対する身体の免疫力を向上させることを示した[41]。したがって、本研究におけるWAEにおける未培養のEubacterium WCHB1-41_cの濃縮は、WAEの生息環境が最適でない可能性があり、飼料の不足がこの問題を誘発する可能性を示している。ひいては、未培養の真正細菌WCHB1-41_cの濃縮は、WAEsが野生の厳しい条件に対処するために有益である可能性があります。
絶滅危惧種であるWAEの観察フィールド調査に基づくと、この動物のライフスタイルと健康状態との因果関係を確立することはできません。しかし、今回の結果は、野生のライフスタイルが、食事に関連した腸内細菌叢の変化を通じて、宿主の健康に悪影響を及ぼす可能性があることを示すいくつかの証拠を示しています。一般に、酪酸は腸の発達と健康を促進する[42], [43]が、硫酸還元菌は水素の利用効率が低く、その最終代謝産物であるH2Sは発がんや炎症の原因となる[44], [45]。本研究では、dsrA遺伝子の相対含有量は4つのライフスタイルで有意な差はなかったが、機能性BCoATの相対含有量は完全飼育個体から半野生個体にかけて増加傾向を示し、野生個体で最も低かった（図6B）ことから、野生ライフスタイルは健康にとって好ましくない要因が含まれていることが示された。このような野生生活に伴う不利な要因（餌や生息地などの資源利用率の低下）についてさらに研究を進めることで、WAEの北上要因の解明にもつながる。
本研究の結果は、4つのライフスタイルに関連する食事における植物の多様性がマイクロバイオーム多様性のパターンを駆動することを示しているが、食事の多様性または植物種間で異なる特定の植物代謝物が、高いアルファ多様性を持つ安定した腸内細菌叢組成を促進するかどうかを明らかにするためにさらなる研究が必要である［14］。植物trnL（UAA）および細菌16S rRNA遺伝子配列解析は、異なるライフスタイルを持つAEの食事組成と腸内細菌叢の関係をより正確に判断するために使用することができる［40］。また，グルココルチコイド値や免疫グロブリン A 値など，マイクロバイオームの影響を受ける因子を直接測定して，腸内細菌叢の構成と AE の健康との関係を検討する研究［46］，［47］や，メタゲノム配列解析により腸内病原菌［48］，寄生虫［49］，ウイルス［50］の存在量や多様性を把握する必要がある．
まとめ
本研究の結果、飼育下の AE のマイクロバイオーム多様性の低下は既知の事実であり、一方、環境上の不利な要因の増加（餌や生息地などの資源利用率の低下）は、純粋な野生 AE に影響を及ぼす問題であることがわかった。本研究は、人間活動が WAEs の健康に及ぼす影響や、移動を余儀なくされた動物集団が直面する課題をよりよく評価するための、新しい保全技術やツールを開発するための基礎となるものである。
材料と方法
サンプルの説明と糞便サンプルの採取
今回調査したAEはすべて，乾季と雨季のある熱帯気候帯に位置する中国・西双版納の野象谷（図7）に住んでいる．年間気温は18℃～30℃，年間相対湿度は約80％である．野象谷には，古くから4つのAEライフスタイルが存在する．まず、Ccの動物が景勝地に存在する（図7のサンプリングS1）。これには長期飼育されているゾウとその子供が含まれる。彼らの食事は、象牙（Pennisetum purpureum）にサトウキビとニンジンを加えたものである。2つ目は、観光客との交流がある半飼育生活で、野生では放牧や採食ができ、それ以外の時間は景勝地（図7のサンプリングS2）のスタッフからゾウ草を与えられている。3つ目は半野生生活で、捨てられた子ゾウや救助されたゾウとその子供たちである。生存率が低いため、飼育係が同行して野生で採食し、個体が迷子になったり、野生のゾウに襲われたりするのを防ぐためである。夜間は，上記2種類のAEが生活する地域から約1.4km離れた繁殖救護センター（図7のサンプリングS3）に戻ってくる。4種類目の生活様式は野生であった。
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図7. サンプリング地点の地図。ワイルドエレファントバレーとその周辺の森林にある全サンプリング地点の地理的分布。S1 は飼育下のアジアゾウのサンプル地点，S2 は半飼育下のアジアゾウのサンプル地点，S3 は半野生のアジアゾウのサンプル地点，S4 は野生のアジアゾウのサンプル地 点．
サンプリング条件の一貫性を保つため、乾季（2019年3月；表S6）にすべてのAEの糞便サンプルを同様の環境条件下で採取した。抗生物質を投与していない健康な AE 20 頭（景勝地と繁殖センターの合計 42 頭のうち）と野生個体 13 頭から新鮮な糞便を採取した。合計で 33 個体の AE が含まれた（完全飼育，半飼育，半野生，野生の生活様式について，それぞれ n = 6，6，8，13）．AE の詳細な情報は，飼育者と我々の観察から得た（表 S6）．詳細なサンプリング方法は以下の通りである[51]．完全飼育個体，半適応個体，半野生個体は，飼育者が排便まで同行し，新鮮な糞の中心部から直ちに滅菌ピンセットでサンプルを採取し，滅菌遠沈管に入れ，液体窒素で保管した．WAEの場合は，AEモニターから情報を得た後，車でS4地点（図7）に移動し，出発まで観察した．また，動物が出発してから30分以内に堆積した新鮮な糞便サンプルのみを採取し，液体窒素で輸送した後，DNA抽出まで-80℃で保存した．
各グループの性比は，サンプル数が少ないため非常に偏っていたが，腸内細菌多様性に及ぼす性別の影響を調べるため，半野生生活をしている成人AEを雌3頭，雄3頭選択した（表S6）．同様に，腸内細菌叢に及ぼす年齢の影響を解析するために，4 歳の幼生 3 例と成人 6 例（半野生群，年齢 20～33 歳）のサンプルを選択した（表 S6）．
AE類の採食習慣の同定
完全飼育ゾウの餌は、サンプリングS1ではゾウ舎の横に目立つようにストックされていた（図7）。しかし、半捕獲ゾウや半野生ゾウの場合は、消費する野草の種類を観察・記録するために、常に追跡する必要がある。画像データと植物標本を収集し、最も頻繁に食べられる植物種の同定と分類に役立てました。WAEは攻撃的であるため、採食調査は森林警備隊員やAEモニターの協力を得て実施しました。Jiangら[52]が報告した植物種の同定・確認方法を用いて，本研究で異なるライフスタイルの個体について，摂食・採食植物のリストを新たに作成した（表S1）．
DNA抽出、遺伝子増幅、塩基配列決定
EZNA土壌DNAキット（カタログ番号D5625-01、Omega、Irving、TX）を用いて、33の糞便サンプルから微生物ゲノムDNAを抽出した。DNAの質と量は、それぞれ1％アガロースゲル電気泳動とNanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific, Wilmington, DE）を用いて評価した。細菌16S rRNA遺伝子の超可変領域V3〜V4は、ABI GeneAmp 9700 PCRサーモサイクラー（ABI、Foster City、CA）を用いて、プライマー対338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）および806R（5'-GACTACHVGGTWTCTAAT-3'）を使用して、振幅した。PCR混合物は、4μlの5×TransStart FastPfuバッファ（カタログ番号AP221-01/11）、2μlの2.5mM dNTPs、各0.8μlの5μMフォワードおよびリバースプライマー、0.4μlのTransStart FastPfu DNA polymerase（カタログ番号 AP221-01/11 ）、10 ngのテンプレートDNAおよび20μlまでのydH2Oを含んだ。PCR増幅は、以下の条件下で3回に分けて行った： 95℃で3分間、95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で45秒間を30サイクル行い、72℃で10分間最終伸長した。精製したアンプリコンを等モル分注でプールし、Illumina MiSeqプラットフォーム（Illumina, San Diego, CA）でシーケンスしてペアエンドリードを得た［53］。
シーケンシングデータの処理
生の16S rRNA遺伝子シーケンスリードは、fastp (version 0.20.0) [54]を用いてデマルチプレックスおよび品質フィルターを行い、FLASH (version 1.2.7) [55]を用いてマージした。品質については、厳しい基準を設けた。300塩基対のリードは、50bpのスライディングウィンドウで平均品質スコア<20となった部位で切断された。50bpより短い切り捨てられたリードと、あいまいな文字を持つリードは廃棄された。配列のアセンブリには10 bp以上のオーバーラップが必要で、オーバーラップ領域の最大ミスマッチ率は0.2であった。アセンブルできないリードは廃棄した。サンプルはバーコードとプライマーで区別され、それに応じて配列方向が調整された。バーコードの完全一致が求められ、プライマーの一致では2塩基のミスマッチが許容された。
類似度97%カットオフのOTU [56], [57] は、UPARSE (version 7.1) [56]を用いてクラスタリングし、キメラ配列は識別・除去した。各代表OTU配列の分類は、16S rRNA遺伝子データベース（Silva version 138）を用いて、RDP classifier (version 2.2) [58] を用いて、信頼閾値0.7で決定した。
共起ネットワーク解析
4つのライフスタイルを持つ動物の腸内細菌から相関のあるOTUを同定するために、OTUレベルでの共起ネットワーク解析を実施した。各サンプルから最小限の配列をランダムに抽出し、OTUテーブルを得た。重み付け相関ネットワーク解析のために、少なくとも50％のサンプルで存在量が0でない967のOTUが選択された。次に、WGCNA Rパッケージ（バージョン1.72-1）[59], [60]を使用して、少なくとも12サンプルで配列リードを持つOTUを分析した。ソフト閾値は5とし、スケールフリーのトポロジーモデルの適合指標R2は約0.9であった。また、"softConnectivity "関数を用いてスケールフリートポロジーを確認し（スケールR2 = 0.84, slope = -2.29）、"adjacency "関数を用いて隣接行列を求めた（パワー = 4, type = "unsigned," other parameters default）。TOMsimilarity」関数を用いて、隣接行列をトポロジカルオーバーラップ行列(TOM)に変換した。TOMを用いてOTUをクラスタリングした後、ダイナミックツリーを用いてモジュール（サブネットワークとも表記）を作成し、OTUをモジュールにクラスタリングした（モジュールサイズの最小値は60 OTU）。スピアマン相関が0.7を超えるモジュールはマージされた。corAndPvalue "関数を用いて各モジュールとライフスタイルの相関を計算し、ライフスタイルの変化に関連する有意なモジュールを得た。
qPCR解析
腸内細菌の酪酸産生能を確認し、生活習慣がAEsの健康に与える影響を明らかにするために、BCoATを選択し、蛍光qPCR解析を行いました。さらに，腸内硫酸還元菌の有害な硫化水素産生能を調べるため，SYBR Green PCRマスターミックス（カタログ番号 MT0017, Danfeng Biotech, Chengdu, China）を用いて，Navaら［61］に記載の方法に従って蛍光リアルタイムqPCRによる定量検出のために，異化亜硫酸還元酵素遺伝子（dsrA）を選定した．プライマーBCoATscrF（5′-GCIGAICATTTCACITGGAAYWSITGCAYATG-3′）およびBCoATscrR（5′-CCTGCCTTTGCAATRTCIACRAANGC-3′）は、サンプル中の酪農生産菌BCoATを定量するために使用した［62］．プライマーDSR-F（5'-ACCACTGGAAGCACGCCGG-3'）およびDSR-R（5'-GTGGMRCCGTGCAKRTTGG-3'）は、硫酸還元細菌における分岐型亜硫酸還元酵素（dsrA）遺伝子の相対含有量を測定するために使用された[63]。反応混合物は、1×SYBR Green Supermix 5μL、各プライマー（200nM）0.5μL、鋳型DNA 1μLとし、ddH2Oを加えて10μLになるようにした。サーマルサイクリング条件は以下の通りである： 初期変性は95℃で3分、95℃で10秒、65℃で30秒を39サイクル、融解曲線解析（60～95℃、+1℃/サイクル、保持時間4秒）。データは、2-ΔΔCt法 [64], [65] に基づくPfaffl法を用いて解析し、ハウスキーピング遺伝子として16S rRNA遺伝子に対して正規化しました。
統計解析
OTU表は、1000反復の各サンプルについて、等しい配列番号（n=24,600）に希釈された（表S7）。希薄化曲線はRのveganパッケージ（バージョン2.5-7）を用いて作成した[66]。アルファ多様性指標はMOTHUR（バージョン1.30.1）を用いて計算した[67]。β多様性とBray-Curtis類似度行列の算出には、veganパッケージを使用した[66]。微生物間の進化関係を考慮し，β多様性は，重み付けされていないUniFrac距離と重み付けされたUniFrac距離を計算し，PCoAで可視化することで推定し，結果はRのGUniFrac (version 1.6) およびape (version 5.5) パッケージを用いてプロットした [68], [69]. Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA; Adonis, permutations = 999) を用いて、2群間のβ多様性の差異を評価した。また、ライフスタイル勾配に沿った微生物群集の非類似性に対する様々な細菌分類群の寄与を明らかにした。SIMPER解析は、vegan Rパッケージを用いて実施した。線形判別分析効果量（LEfSe）を用いて、完全飼育グループと純粋野生グループの間で統計的に有意なバイオマーカーを見出した。LDAの閾値は4とし、分類学的レベルは門から科のレベルまでとした。ヒートマップは、RのpHeatmapパッケージ（バージョン1.0.12）を用いてデータを可視化するために作成した[70]。
CRediTのオーサーシップ貢献声明
チェンボ・ジャン（Chengbo Zhang 概念化、方法論、形式分析、原稿執筆、ソフトウェア、データ管理、調査。リャン・ジェンハン（Zhenghan Lian 方法論、ソフトウェア、視覚化。ボー・シュー（Bo Xu）： 概念化、リソース。沈清中： リソース、調査 Mingwei Bao： 資源、調査。黄俊熙：構想、原案執筆、校閲・編集、監修。姜紅晨：執筆-レビューと編集。李文俊：執筆-校閲・編集、監修。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（助成番号31660304、31960131、32260015）、中国国家重点研究開発計画（助成番号2017YFB0308401）、雲嶺奨学生基金および雲嶺技術指導基金による支援を受けた。言葉の助けを借りたNanyu Han博士に感謝する。
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データの有無
本研究の結果を裏付けるデータは、原稿とその補足情報ファイルに記載されています。本研究で得られた生の配列データは、中国科学院北京研究所ゲノムデータセンターのゲノム配列アーカイブ[71]に寄託され（GSA：CRA007093）、https:// ngdc.cncb.ac.cn で一般に公開されています。
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
ORCID
0000-0001-6877-430X (張成甫)
0000-0002-0562-5849 (Zhenghan Lian)
0000-0001-5389-8131 (Bo Xu)
0000-0002-7036-2272 (沈清中)
0000-0003-4190-9432 (Mingwei Bao)
0000-0002-7998-3673 (Zunxi Huang)
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© 2023 The Author. 制作とホスティングはElsevier B.V.が中国科学院北京ゲノム研究所と中国遺伝学会の委託を受けて行っています。
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