健康なヒト9,770人の集団調査に基づく、共通の血液マイクロバイオームに関する証拠はない

2023年3月31日 12:52

オープンアクセス
発行：2023年3月30日
健康なヒト9,770人の集団調査に基づく、共通の血液マイクロバイオームに関する証拠はない

セドリック・C・S・タン
カリー K. K. Ko、
SG10K_健康コンソーシアム、
...
ニランジャン・ナガラジャン（Niranjan Nagarajan
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Nature Microbiology (2023)この記事を引用する
40 Altmetric（アルトメトリック
メトリックス詳細
アブストラクト
ヒトの血液は従来、無菌と考えられていたが、最近の研究では、健康な個人における血液中のマイクロバイオームの存在が示唆されている。ここでは、複数のコホートからのシーケンスデータを用いて、9,770人の健常者の血液中の微生物のDNAシグネチャーを特徴付けました。汚染物質を除去した後、血液中の117種の微生物を同定し、そのうちのいくつかは微生物複製のDNAシグネチャーを有していました。これらの微生物は主に腸（n = 40）、口腔（n = 32）、泌尿生殖器（n = 18）に関連する常在菌であり、病院の血液培養で検出された病原体とは異なっていた。84％の個体からは1種も検出されず、残りの個体からは中央値で1種のみ検出された。同じ種を共有する個体は5％未満であり、異なる種間の共起パターンは観察されず、宿主の表現型と微生物との関連は見いだされなかった。全体として、これらの結果は、ヒト血液に内在する一貫したコアマイクロバイオームという仮説を支持するものではありません。むしろ、我々の発見は、他の身体部位から血液中に常在する微生物が一過性かつ散発的に転移していることを支持するものである。
主な内容
近年、健康な人の血液中に存在するマイクロバイオームの存在や、その健康・疾病との関連性について大きな関心が寄せられています。ヒトの血液は伝統的に無菌環境と考えられていますが、血液中の病原体が時折侵入し増殖することで、調節不能な宿主反応が引き起こされ、敗血症、敗血症性ショック、死亡などの重篤な臨床的後遺症が生じることがあります1. また、献血者における無症状の一過性菌血症（血液中の細菌の存在）は、輸血関連敗血症の主要な原因であることが知られている2。最近の研究では、健康なヒトの血液中に循環する複数の微生物種の存在が示唆されています3,4,5,6,7（文献8でレビュー）。しかし、これらの研究のほとんどは、比較的小規模なコホートで行われたか、真の生物学的測定値を異なる汚染源から区別するための厳格なチェックが欠如していました8。そのため、健康なヒトの血液に存在する微生物群集の概念については、依然として議論の余地があります。私たちは、健康な人を対象とした集団研究から得られた血液DNAシーケンスデータを分析しました。この集団研究は、異なる研究室がさまざまなシーケンスキットを用いて処理した複数のコホートで構成されています。バッチ情報を含む大規模なデータセット（n = 9,770）を活用し、潜在的な汚染物質に関する体系的な分析を行うことで、血液中のマイクロバイオームが一般集団に本当に存在するかどうかを調査しました。
有意義な議論をするためには、仮定の「血液マイクロバイオーム」がどのようなものであるかを定式化することが有効である。マイクロバイオーム」とは、生態学的ニッチで互いに、また環境と相互作用する微生物の共同体を指すべきである9。したがって、血液マイクロバイオームでは、腸11や口12など他の部位のマイクロバイオームで見られるような、種の共起または相互排除10によって示されるコミュニティ構造を微生物が示すはずである。さらに、ヒトの皮膚に存在する表皮ブドウ球菌15など、個人間で頻繁に観察され共有されている種13,14として定義されるコア微生物種の存在も期待されるかもしれない。異なる個体から採取したサンプルのかなりの割合で見られる（つまり、有病率が高い）分類群は、「コア」とみなすことができる。コアとなる分類群を定義するための有病率の閾値は任意であり、これまでのマイクロバイオーム研究では30～100％の値を用いており、多くは100％を選択している14。ともあれ、血液中の中核微生物を特定することは、マイクロバイオームの変化をヒトの健康に関連付けるための基礎となるであろう。
健康な人の血液中のマイクロバイオームに関する既存の証拠は、培養に基づくアプローチ3,4と培養によらないアプローチ5,6,7の両方から得られています。前者には血液培養実験が含まれ、後者には以下の分子的手法が含まれます：16SリボソームRNA（rRNA）定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）、16S rRNAアンプリコン配列決定、RNAまたはDNAのショットガンシーケンス。研究デザインにもよりますが、サンプルサイズが小さい、分類学的解像度が低い、無細胞の微生物DNAと生きた微生物細胞を区別するのが難しい、環境汚染の偏在性など、いくつかの方法論および技術的制約があるため、これらの結果は慎重に解釈する必要があります8,16,17,18,19. 特に、血液マイクロバイオームの特徴を明らかにするためには、サンプル採取や処理中に混入した微生物DNAを考慮する必要があります。また、無菌操作の不備や皮膚穿刺部位の消毒不足により、汚染された微生物細胞が混入することもあります20。シーケンスベースのアプローチは、実験用試薬キット（つまり「キットーム」）19に内在する微生物DNAの汚染に特に敏感で、血液中の微生物バイオマスが少なく、宿主のバックグラウンドが高いためにノイズとシグナルの比率が高くなることで悪化する17．このような課題を踏まえて、血液中の微生物種の広さと有病率について包括的なプロフィールを提供した研究は、これまでほとんどありません。さらに、「血液マイクロバイオーム」のいくつかの側面は不明なままです：検出された微生物は血液に内在するものなのか、他の身体部位から転移してきたものなのか？検出された微生物は血液に内在するものなのか、それとも他の部位から移動してきたものなのか、ヒトの血液中を循環する微生物のコアセットは存在するのか。その構造と機能が宿主の健康に影響を与える可能性のある微生物群集は存在するのか？
これらの疑問を解決するために、我々は、6つの異なるコホートから得られた9,770人の健常者のDNAライブラリに基づいて、これまでで最大規模の血液配列データの解析を実施しました（補足表1）。各コホートの処理に使用した試薬キットの違いを利用して、血液中の微生物DNAシグネチャーを試薬の汚染や配列解析のアーティファクトから区別しました。これらの健常者の血液からは117種の微生物が検出されましたが、そのほとんどは他の身体部位のマイクロバイオームと関連する常在菌です。さらに、カバレッジベースのピーク・ツー・トラフ比解析21,22を用いて、血液中の複製細菌のDNAシグネチャーを同定し、これまで行われていなかった培養に依存しない調査を提供しました。しかしながら、微生物の共起関係、中核種、宿主の表現型との関連性を示す証拠は見つかりませんでした。これらの知見は、「血液マイクロバイオーム」というパラダイムを覆すものであり、代わりに、他の身体部位（例えば、腸や口）から健康な個人の血流に散発的に移行する微生物が、これまで想定されていたよりも一般的ではあるものの、そのモデルを支持するものである。全体として、私たちの観察は、血流感染症の調査において臨床メタゲノミクスを使用するために必要なベースラインを確立するのに役立つものです。
研究成果
マルチコホート解析による血液微生物DNAシグネチャーの推論
健康な人から採取した血液サンプルは、一般的に微生物量が少なく、宿主DNAのバックグラウンドが高いため17、生物学的に関連するシグナルと人工的なシグナルを区別することが困難である。私たちはまず、サンプルの厳格な品質管理を行うことで、バイオインフォマティクス配列解析中に生じるアーティファクトに対処しました（図1a）。この品質管理には、リード品質のトリミングとフィルタリング、分類学的起源があいまいな低複雑度配列の除去、ヒトリードの除外（方法）、微生物リードが少ないサンプル（<100リードペア）の除去が含まれています。これに続いて、ほとんどの（n = 8,892）サンプルについて、血液中の微生物DNAシグネチャーの種レベルでの特徴づけを行いました。分類学的な誤判定を最小限に抑えるため、存在する可能性が高い種と誤分類の可能性がある種を、存在量カットオフを用いて識別しました（Methods）。Kraken2」（文献23）を用いて検出された微生物種の信頼性を、リードを参照ゲノムにアライメントすることで検証したところ、高いカバレッジ幅により、計算上のアーティファクトから真陽性が区別された24,25。さらに、Kraken2が割り当てたリードペアの数とアライメントされたリードペアの数の間には、log10スケールで優れた直線関係があることが確認され（傾き=1.15、両側F検定、F = 154, d.f. = 1, P < 0.001; Extended Data Fig 1）、血液中の分類群を確実に識別できることが示されました。これらの結果は、血液シーケンスライブラリで検出された微生物種が、シーケンス解析のアーティファクトではない可能性が高いという確信を与えてくれます。
図1：血液中の微生物DNAシグネチャーのロバストな同定。
a、分類学的プロファイル（n = 9,770人）に適用した前処理ステップとフィルターの概要、および各フィルター後に保持された種の数。 b-d、除染フィルターを適用する前と後で、（b）共通シーケンス汚染物質、（c）血液培養記録で検出、（d）ヒト関連である微生物種の比率を示す円グラフ。
出典データ
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試薬やハンドリングの汚染によるアーティファクトに対処するため、一連の厳格な除染フィルターを使用しました（図1aおよび方法）。これらのフィルターは、実験室の汚染物質がしばしば互いに相関し（バッチ内一貫性）、特定の実験室のバッチに偏る（バッチ間変動；拡張データ図2）26という観察に基づいている。これらのパターンに基づく同様の解析は以前にも行われ、実験室汚染物質のin silico同定に非常に有効であることが判明している27,28,29. 本研究におけるバッチ特有の汚染物質の同定は、健康な個人の複数の大規模コホート（補足表1）と、試薬キットの種類やロット番号などの対応する豊富なバッチ情報が利用可能であったことが助けとなった。試薬や取り扱いの汚染物質を考慮した結果、8,892人の全血検体から検出された117種の微生物がリストアップされました（補足表2）。これらの微生物は、110の細菌、5つのウイルス、2つの真菌からなる56の属にまたがっています。
汚染ノイズを低減しながら生物学的シグナルを改善するフィルタリング戦略の有効性を評価するため、すべてのフィルタを適用する前（870種）と後（117種）のデータセットで検出された微生物種の種類を調べました（図1b-d）。まず、微生物種を、シーケンスデータにおける汚染属の公表リスト19,30と相互参照した。このリストから、属は汚染物質である可能性が高い、混合証拠（つまり、病原体と一般的な汚染物質の両方）、または潜在的な病原体/伝染病のいずれかとして分類された。除染後、汚染物質として分類された検出種の割合は、21%から10%に減少しました（図1b）。次に、三次病院の10年以上（2011～2021年）にわたるヒト血液培養記録と微生物種を比較しました（図1c）。血液から培養された種の割合は、除染後に12%から27%に増加したことから、私たちのフィルタリング手順は、血流に侵入することができる微生物種を濃縮していることが示唆されました。最後に、病原体の宿主範囲を記述したデータベース31（図1d）を用いて、除染前後のヒトに関連する微生物の割合を比較しました。このデータベースで見つからない種については、PubMedの系統的検索（Methods）を行い、過去に少なくとも1件、ヒトへの感染報告があるかどうかを調べた。除染後、ヒトに関連する種の割合が40%から78%に増加したことから、これらの種は生物学的に関連する可能性が高いことが示された。最後に、除染後に保持された117種の微生物が、ランダムに選んだ種と比較して、汚染の可能性が高い種、ヒトに関連する種、血液培養で検出された種の割合が同じであるという帰無仮説に対して結果を検証しました（Methods）。汚染除去フィルターでは、汚染物質の可能性が高い種の割合が有意に減少し、ヒト関連種と血液培養で検出された種の割合が増加しました（すべて片側ランダム化検定 P < 0.005; Extended Data Fig.3）。全体として、汚染物質識別のためのヒューリスティックのセットを使用することで、私たちのフィルターは、生物学的に関連する分類群を保持し、汚染物質の可能性が高い分類群を除去する感度と特異性があります。
健康な血液中の常在菌からのDNAの散発的な移動
次に、微生物が検出された健常者の割合（つまり、有病率）を求めました。最も一般的な微生物種であるCutibacterium acnesは4.7%で観察され（図2a）、117種類の微生物のうち、ほとんどの健常者において「コア」な種はないことが示唆されました。さらに、除染後のサンプルのほとんど（82%）で微生物種が検出されませんでしたが（図2b）、残りの18%ではサンプルあたり中央値で1つの微生物種のみが検出されました。確信をもって検出された微生物種の数とサンプルあたりの総微生物リード数との間には弱い負の相関があったため、微生物有病率が低いのはシーケンスの深さが足りないためではなかった（スピアマンのρ = -0.279, 両側t検定、P < 0.001）．さらに、微生物種を含まないサンプルの中には、微生物リード数が最大210万に達するものもあった（中央値＝6,187リード、Extended Data Fig.4に分布を示す）。かなりの数のリードが微生物と分類されたが、それらはすべて汚染種に割り当てられていた。この結果は、健康な人の血液中に微生物が存在することはまれであり、散発的であることを示唆しています。
図2：健康な人の血液中の微生物シグネチャー。
a, 8,892個の血液シーケンスライブラリすべてにおいて、確信を持って検出された上位30種の微生物種の有病率を示す棒グラフ。 c, Disbiomeデータベース34を使用して決定した、確信を持って検出された117種が関連する人体部位を示す棒グラフ。d, 確実に検出された117種の微生物学的分類を示す円グラフ。 e, 除染前後の血液培養記録および血液シーケンスライブラリにおける属の有病率を示す棒グラフ。
出典データ
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口腔32や腸33から血液への細菌の移行が過去に報告されていることから、今回検出された微生物が様々な身体部位に由来する可能性があるかどうかを検討した。我々は、Disbiomeデータベース34から抽出した微生物-身体部位マッピングに基づいて、117種の血液微生物リストに身体部位由来である可能性を割り当てた。その結果、117種のうち多く（n = 59; 50%）は、さまざまな身体部位に関連するヒト常在菌であることがわかりました（図2c）。これらの種の一部は、当社の厳格な除染フィルターを通過した汚染物質である可能性がありますが、この観察は、その低い有病率とともに、これらの種の多くのDNAが血液に内在するというよりも、他の臓器から一過性に移行した可能性を示唆しています。また、かなりの割合（n = 42; 36%）の種が、瀉血中に持ち込まれた可能性のある皮膚関連微生物2とは異なる偏性嫌気性菌または偏性細胞内微生物であり、これらはサンプリングのアーチファクトではないと考えられる（Fig. 2d）。全体として、血液中に検出された微生物の起源は多様であり、健康な集団における有病率が低いことから、常在菌やそのDNAが血流に散発的に移行している可能性がある。
細菌性貧血は、一般に、軽度の発熱から敗血症まで、さまざまな臨床的後遺症を伴います。我々は、11年間の病院血液培養記録から得られたデータセットと微生物の有病率を比較することにより、細菌性貧血患者において同定される一般的な微生物が健常者のものと異なるかどうかを検討した。血液培養記録から得られた微生物属の有病率は、検出された分類群に重複があるにもかかわらず、我々のデータセットとは明らかに異なっていた（図2e）。例えば、血液培養ではStaphylococcus、Escherichia、Klebsiellaが優勢であったが、我々のコホートでは稀であった。敗血症患者の血液の塩基配列を決定した先行研究35と同様の比較を行ったところ、我々のデータセットと比較して有病率に同様の差があることがわかり（Extended Data Fig.5）、我々の観察結果が塩基配列と培養ベースの検出方法の違いによるものではないことが確認されました。これらの違いの説明として考えられるのは、臨床で検出される病原体の病原性が高く、試験募集時に除外されたはずの人が症状を引き起こす可能性が高いことです。逆に、我々のデータセットに含まれる微生物のシグネチャーが全細胞から得られたものであれば、これらの種は健康な個人の免疫系によってより許容されているかもしれません（例えば、腸内常在菌として免疫調節特性を持つBifidobacterium属36やFaecalibacterium prausnitizii37など；図2a）。
血液中の微生物が複製されている証拠（コミュニティ構造なし
私たちは、血液中の微生物DNAシグネチャーが、循環する無細胞DNAとは対照的に、生存する微生物細胞の存在を反映しているかどうかを調べました。微生物培養を用いた以前のアプローチ3,38とは対照的に、私たちは、配列決定された血液サンプルに複製率分析21,22を適用して、生きた細菌の成長をより広範囲に示す証拠を探しました。複製を行う細菌では、複製起点（Ori）に近いほどDNAリードのカバー率が高く（つまりピーク）、末端（Ter）に近いほどカバー率が低く（つまりトラフ）、カバー率のピーク/トラフ比（PTR）＞1となるはずです（参考文献22）。この解析を行うのに十分な量のある20の細菌種のうち、11の細菌種の複製を示す証拠を発見した（表1）。複製種の中央値で平滑化した被覆プロットは、すべて複製細菌細胞22に特徴的な正弦波状の被覆パターン（図3a、黒パターン）を示し、代表的な3つの汚染物質の均一な被覆パターンと対照的であった： Achromobacter xylosoxidans、Pseudomonas mendocina、Alcaligenes faecalis（図3b）。カバレッジバイアスを用いて決定されたOriとTerの位置は、細菌ゲノムのGC-skew39に基づく直交法とほぼ一致し、複製率解析の信頼性が高いことが示唆されました。さらに、これらの複製種のうち1種を除くすべてが、病院の血液培養記録や過去の菌血症の報告40,41,42,43,44,45,46,47,48,49（表1）に存在し、ヒト血液中で複製する能力を示しています。全体として、微生物DNAの検出を越えて、ヒト血液中の微生物複製に関する培養に依存しない分子シグネチャーを同定しました。
表1 iRep21を使用して細菌種が複製されていると判断された（つまり、ピーク・ツー・トラフ比（PTR）＞1）サンプルの要約統計情報
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図3：健康な人の血液サンプルに含まれる複製菌の証拠。
a,b,代表的な3種の（a）非汚染種と（b）汚染種のカバレッジプロット。a, カバレッジプロットの正弦波形状は、複製起源に近いところ（Ori）でより深く、末端に近いところ（Ter）でより低くカバーすることを特徴とし、複製する細菌細胞のサインである。
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複製する細菌のDNAシグネチャーを考慮し、健康な血液で微生物と微生物の相互作用が検出できるかどうかを調査した。種間のペアワイズ「SparCC」相関50を計算し、正の値は共起を、負の値は相互排除をそれぞれ示しています。血中微生物117種の相関関係をネットワークグラフで可視化した（図4a）。ほとんどの関連は弱く（｜correlation｜＜0.05）、相関の大きさが0.2を超えるペアワイズ関連は19しかなく、強いコミュニティの共起/相互排除パターンを検出できませんでした（図4a）。これが厳しすぎる除染によるものかどうかを判断するため、除染前の成人5コホートについて独立したネットワークグラフを作成し、コホート間で共有されている共起・相互排除の関連性を調べた。その結果、すべてのネットワークグラフに共通する関連は確認されず（図4b）、他のマイクロバイオームで一般的に見られるような、一貫して検出可能な微生物の関連は血液中に存在しないことが示されました。
図4: 微生物共起ネットワーク。
a, 異なるSparCC相関閾値（0.05, 0.2, 0.3）で除染後に少なくとも2つの微生物種を持つすべてのサンプルについて計算されたSparCC50共起ネットワーク。それぞれの閾値よりも大きなSparCC相関の大きさを持つ関連のみが保持されている。 b, 相関閾値0.2での個々のコホートのSparCCネットワーク。すべてのコホートネットワーク間のエッジの交点を取った結果、共起の関連は保持されなかった。aおよびbにおいて、各ノードは単一の微生物種を表し、各エッジは微生物種のペア間の単一の関連性を表す。エッジの太さは、相関の大きさでスケーリングされている。各ネットワークの計算に使用したサンプル数と使用した相関閾値が注釈されている。SparCCの正の相関は緑で、負の相関は青で示されている。
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血液中の微生物と宿主の表現型との間に関連性はない
これまでの研究で、血中微生物DNAを疾患バイオマーカーとして使用し、がん30、II型糖尿病51、歯周病52との関連性が示されている。同様に、我々は、微生物の存在が宿主の表現型と関連しているかどうかを、我々のデータセットで調べた。まず、乳幼児（GUSTOコホート）では、成人コホートと比較して、微生物の検出頻度が高いかどうかを調べた。これは、乳幼児の免疫システムがまだ発達していないため、感染の相対的リスクが高いためである53。GUSTOサンプルは、ほとんどの人体部位に関連する微生物の有病率が高かった（Extended Data Fig.6a）。これは、泌尿器系に関連する微生物であるFannyhessea vaginae、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus iners、Gardnerella vaginalisに起因しています（Extended Data Fig.6b）。同様に、GUSTOではビフィドバクテリウム属などの腸内関連菌の濃縮が確認された（Extended Data Fig. 6c）。これらの結果は、成人に対して乳幼児で細菌のトランスロケーションがより頻繁に起こる可能性を示唆しているが、サンプル収集の違い（臍帯と静脈穿刺の違い）もこれらの違いを説明することができる。将来、サンプリング方法の違いをコントロールする研究が、この観察結果をさらに探求するのに有用であろう。
次に、採血当日に記録された8つの宿主の表現型と、117種の血液微生物種の存在との間に、ペアワイズで関連があるかどうかを検証した。これらの宿主表現型は、性別、家系、年齢、肥満度（BMI）、血中総コレステロール（TC）、血中トリグリセリド（TG）、収縮期および拡張期血圧（SBPとDBP）である。このデータセットでは、同じ集団から採取されたコホートであるため、真の関連性は一貫していることが予想される。多重比較で調整した結果、有意な微生物と表現型の関連は5つしか見つからなかった（両側フィッシャーの正確さまたはマン・ホイットニーのU検定、P < 0.05; 補足表3）。注目すべきは、1つの有意な関連を除くすべてが、1つのコホートにのみ存在したことである。例外はC. acnesで、SEEDコホートではマレー系住民に多く見られたが、MECコホートでは中国系住民に多く見られた（拡張データ図7）。これらのコホート特有の違いは、本研究で記録されていない他の人口統計学的変数、あるいはC. acnesの亜種の違いに起因する可能性がある。宿主の表現型と微生物の関係が非線形である可能性があるため、関連性を見逃さないようにするために、カテゴリー別の表現型を導き出しました。高齢者（年齢65歳以上）、および肥満（BMI 30以上）、高トリグリセリド（TG 2.3 mmol l-1）、総コレステロール（TC 6.3 mmol l-1）、血圧（SBP 130 DBP 80以上）などの「より健康でない」ことを示す他の尺度が含まれる。これらの由来する表現型と、いかなる微生物種の存在との間にも、有意な関連は認められなかった（両側フィッシャーの正確検定、P＞0.05；補足表4）。これらの結果を総合すると、健康な集団において、血中の微生物の存在と試験した宿主の表現型との間に一貫した関連性がないことが示唆された。
考察
我々は、計算や汚染のアーチファクトを考慮しながら、ヒト血液中の微生物シグネチャーをこれまでで最大規模で解析した結果、健康な個人間で共通の血液マイクロバイオームを証明する証拠は見つからなかった。その代わりに、血液中に多様な身体由来の単一微生物種のDNAが散見され、そのうちのいくつかは活発に複製されている可能性があることがわかりました。血流は、健康な個人の異なる身体部位間を微生物が移動することを可能にします。しかし、検出された微生物種の有病率が低いことから、この移動は頻繁ではなく、一過性である可能性が高いことが示唆された。様々な身体部位のマイクロバイオームがどの程度相互に関連しているのか、また、これらのプロセスが疾患時に変化するのかについては、未解決の問題が残っています。ある部位の微生物群集の乱れは、別の部位の微生物群集に影響を与えるのでしょうか？宿主の免疫系は、血中の微生物の存在をどのように無症状に制御しているのでしょうか？本研究は、これらの疑問に対する今後の研究のための基礎となるものである。
我々は、血液中の微生物シグネチャーを試薬や取扱いの汚染に関連する人工的なシグナルから区別するために、一連の除染フィルタを採用した（拡張データ図2および方法）。私たちのアプローチは、S/N比を大幅に改善しましたが（図1b-d）、除染後に残った117種の微生物のうち、環境由来または非ヒト由来と判定されたものが残っていたため（図1b、d）、汚染物質の除去には十分効果があるとは言えないでしょう。今後の研究では、さまざまな微生物データベースとの比較（図1b-d）を活用して、これらの117種のうち、一般的な汚染物質ではなく、血液培養で検出され、ヒトに関連する種を中心に、検証のための優先順位をつける必要があります（補足表2）。それにもかかわらず、残留汚染アーティファクトが存在する可能性が高いにもかかわらず、共通の血液マイクロバイオームを検出することができませんでした。
複製速度解析により、血液中の複製微生物のDNAシグネチャーを観察しました。しかし、血液中の複製微生物に由来するシグナルと、血流に入る前に他の身体部位で最近複製された微生物細胞に由来するシグナルを区別することはできなかった。特に、20種中11種で複製シグネチャーを検出しましたが、除染フィルターで最も多く検出された汚染物質20種（Alcaligenes属、Caulobacter属、Bradyrhizobium属、Sphingomonas属の種を含む）では、複製シグナルを検出できませんでした。このことから、私たちのデータセットで検出可能な複製シグネチャーを持つ微生物種は、「kitome」の一部ではない可能性が高いことがさらに示されました。これらの結果から、今後のメタゲノム研究において、「kitome」の汚染物質と推定される本物の分類群を識別するために、複製解析の活用が期待されます。
私たちは、データセットの個人間での有病率が低いことを根拠に、ヒト血液中にコアとなる種を見いださなかったが、これはシーケンスによる微生物の検出感度に依存する。しかし、これまでの研究で、メタゲノミックシーケンスは、1サンプルあたり2000万～3000万リードで血液中の微生物を高感度に検出できることが示されています35,54,55。それに比べ、私たちのライブラリーは深く配列されており（中央値＝3億7300万リード）、私たちの方法が感度を欠いていないことが示唆されました。また、我々の有病率の推定値は、ある種が1つのサンプルに存在するかどうかを判断するために使用した存在量の閾値によって影響を受けます（図1a）。これには、シミュレーション実験に従って定義された絶対的なリードカウントと相対的な存在量の閾値の両方が含まれます（「方法」参照）。しかし、0.001という単一の、より緩やかな相対的存在量の閾値を用いた場合でも、52%以上の有病率を持つ種は存在しなかった（補足表5）。さらに、この閾値で最も有病率の高い20種はすべて環境微生物であり、そのほとんどがシークエンスに関連する一般的な汚染物質であるSphingomonasとBradyrhizobium種で構成されています19。したがって、除染の閾値とは無関係に、検出された種はいずれもコアメンバーとして適格ではない。
また、除染フィルタの適用有無にかかわらず、種間の強い共起（協調的）または相互排除（競合的）な関連性56は検出されませんでした。微生物群集の中では、種の代謝依存性と代謝補完性が微生物共生の主要な推進力となっています57。逆に、栄養の隔離や選択的付着などの競争行動58は、微生物の相互排除につながる可能性があります。微生物種間の強い関連性がないことから、健康な人の血液中には相互作用する微生物コミュニティが存在しないことがわかります。なお、今回のデータセットは循環静脈血に由来するため、内皮の内側など、血流の他の部位で発生している可能性のある微生物の相互作用を測定することができませんでした。内皮ライニングへの細菌の接着を調査する実験により、そのような相互作用が存在するかどうかについて、さらなる洞察が得られるかもしれません。
血液サンプルと同じ出身国の血液培養記録が入手可能であったため、健康な集団と臨床における微生物有病率の信頼できる比較が可能であった59。有病率の推定値にばらつきがあるのは、検出方法の違いによるものかもしれません。しかし、これまでの研究で、培養とシークエンスベースの検出の間に強い一致があることが示されており35,54,60,61、観察された変動の大部分は異なる検出方法の使用によるものではないことを示しています。今回の結果は、血液中の微生物の存在が必ずしも疾患につながるとは限らないことを示しています。このことは、無症状の健康な人から検出される微生物DNAは、病気を引き起こす病原体に比べて病原性が低く、宿主の許容範囲が広い常在菌に由来する傾向があるという我々の他の観察と一致する。実際、循環している常在菌は、腸内細菌に似た免疫調節表現型を示し62,63、宿主との無症状での共存を促進する可能性がある。おそらく、免疫調節特性の有無が、菌血症患者が無症状であるか敗血症であるかを決定するのであろう。一般的な血液培養病原体に対する常在菌の免疫調節活性をさらに検討することで、敗血症の際に制御不能な宿主反応を調節する治療法の設計に役立つかもしれない1。
我々は、測定された宿主の表現型（例えば、血糖値、SBP）または由来する表現型（例えば、肥満）と微生物の存在との間に一貫した関連性を見いだせなかった。このことは、健康な成人のコホートにおける一過性の微生物転移してしまうリスクは、宿主の表現型によって一貫していることを示唆しています。しかし、血液中の微生物DNAプロファイルは、敗血症35,54,55,60,61,64や血流感染とは無関係な他の様々な病気など、健康状態と病気状態の区別に使用されているため、これは病気持ちの人にはあてはまらないかもしれません30,52,65。これらの研究は、血液メタゲノム解析による診断、予後予測、治療法の開発が期待できることを強調しているが、その生物学的根拠は依然として不明である。一つの仮説は、疾患や生理的ストレスの際に粘膜や上皮のバリアの完全性が損なわれ66、血流への微生物の移動率が高くなり、血中微生物プロファイルが変化することである。この仮説を検証する今後の研究では、本研究で検出された腸内または口腔関連細菌（例えば、Bifidobacterium adolescentis、Faecalibacterium prausnitzii、Streptococcus mitis）に着目することが考えられる。これらのメカニズムについてさらに研究を進めることで、血液中の微生物プロファイルが健康状態と相関する理由についての理解が深まる可能性があり、健康な人の血液中の種の多様性を特徴づけることは、そのための重要なベースラインを形成する。
結論として、「マイクロバイオーム」の定義を、構成する種が互いに影響し合い、生態学的ニッチと相互作用する微生物群集とすると9、健康な個人の血中マイクロバイオームには一貫性がないことがわかった（Extended Data Fig.8）。血中微生物の多くが他の部位に存在する常在菌であることから、他の部位から血流に移行する常在菌の散発的かつ一過性の移動が、より穏当な説明であると考えられます。さらに、血液中の微生物の有病率が比較的低いことから、長期間のコロニー形成ではなく、移動した微生物の迅速な除去が示唆される。これらの知見に基づき、我々は「血液マイクロバイオーム」や「循環マイクロバイオーム」という用語の使用を推奨する。この用語は、一過性の転流事象による血液中の微生物DNAや微生物細胞の検出を指す場合に、誤解を招く可能性がある。
研究方法
データセット
参加コホートのすべての個人は、参加する本人または未成年の場合は保護者の署名入りインフォームドコンセントを得て募集された。すべてのコホート研究は、関連する機関の倫理審査委員会によって承認され、コホートのデモグラフィックと倫理審査承認参照番号の概要は補足表1に記載されています。当社のシーケンスデータセットは、SG10K_Healthデータセット（https://www.npm.sg/collaborate/partners/sg10k/）とも呼ばれ、6つの独立したコホートの一部として募集された9,770人のシンガポール人の健康な人の全血または臍帯血から抽出したDNAのショットガンシーケンスライブラリーからなる。脳卒中、心血管疾患、がん、糖尿病、腎不全などの主要な疾患の既往歴がない場合、健康であると判断された。口腔内の健康情報は収集されていないため、除外基準の一部には含まれていない。シーケンス用の全血は、5人の成人コホート（年齢中央値＝49歳、四分位範囲＝16）のみから静脈穿刺で採取した： Health for Life in Singapore（HELIOS、n=2,286）、SingHealth Duke-NUS Institute of Precision Medicine（PRISM、n=1,257）、Tan Tock Seng Hospital Personalised Medicine Normal Controls（TTSH、n=920）、 Singapore Epidemiology of Eye Diseases（SEED, n=1,436）67,68 および Multi-Ethnic Cohort（MEC, n=2,902）69 。さらに、出生コホート Growing Up in Singapore Towards healthy Outcomes (GUSTO, n = 969) 70 については、臍帯血のみを採取した。宿主の表現型の測定は、GUSTOコホートを除き、採血当日に実施され、測定は子供が中央値6.1歳（四分位範囲=0.1）になった後のタイムポイントに行われた。以前の研究71で、個人は、遺伝的に異なる祖先を持つ4つの民族に大別された：中国系（59％）、マレー系（19％）、インド系（21％）、その他（1％）である。すべての人は、採用時のアンケートで自己申告した疾患がない場合、採用時点で健康であると判断された。この研究の文脈では、参加者への報酬は提供されなかった。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかったが、本研究のサンプルサイズは、過去の論文で報告されたものをはるかに上回るものである（文献8でレビュー）。
さらに、シンガポール最大の三次病院であるSingapore General Hospitalから匿名化された血液培養記録を入手した。これらの記録は2011年から2021年にかけてのもので、282,576人の患者から採取された好気性、嫌気性、真菌性の血液培養記録が含まれています。これらの血液培養は、日常的な臨床管理の一環として、つまり、菌血症や真菌血症の調査のために臨床的に指示された場合に、オーダーされました。血液培養は、病院の標準作業手順書に従って実施され、分析されました。すなわち、血液サンプルを無菌的に採取し、ベッドサイドでBD BACTECボトル（好気性血液培養用BD BACTEC Plus Aerobic/F culture vials plastic（442023）、嫌気性血液培養用BD BACTEC Plus Anaerobic/F culture vials plastic（442022）、真菌血液培養用Myc/F Lytic（42288））に植え付けした。接種したボトルは、常温で診断ラボに輸送し、到着後BD BACTEC FX血液培養システムで培養した。BD BACTEC FX血液培養システムで陽性と判定された血液培養ボトルを固体培地に接種し、得られたコロニーを生化学検査とマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（MALDI-TOF MS）（Bruker microflex LRF）を併用して同定しました。
サンプル調製とバッチのメタデータ
サンプルはバッチで処理され、シーケンスのためにランダム化されなかった。しかし、各サンプルのバッチ情報は保持され、バッチ特有の影響を補正するために使用されました。これには、使用した抽出キットやライブラリー調製キットの種類、使用したSBSキット、PEクラスターキット、シーケンスフローセルのロット番号などが含まれます。全血からのDNAは、6種類のDNA抽出キットのいずれかを用いて抽出した。350bpのインサートサイズで151bpのペアエンドシーケンスを行い、ヒトゲノムを最大15倍または30倍カバーした。ライブラリー調製は、3種類のライブラリー調製キットのいずれかを用いて実施した。シーケンシングは、イルミナHiSeq XプラットフォームでHiSeq PE ClusterキットおよびHiSeq SBSキットを用いて実施した。使用したすべての試薬キット、バッチ数、バッチごとに処理したサンプル数は、補足表6に記載した。
データの前処理と品質管理
シーケンスライブラリに適用されたバイオインフォマティクス処理手順を図1aに要約する。シーケンスリードのGRCh38ヒト参照ゲノムへのリードアライメントは、BWA-MEM v0.7.1773を使用して、別の研究72に記載されているように実行されました。Samtools v1.15.174とBedtools v2.30.075を使用して、ペアの両方のメンバーがヒトゲノムにマッピングされていないリードペアを検索し、その後、シーケンスリードの品質管理を行いました。品質がQ10未満のリードの末尾の低品質塩基をトリミングし（塩基品質トリミング）、平均リード品質がQ10未満のリードを廃棄しました（リード品質フィルター）。また、スライディングウィンドウを50、k-mer長を5として、平均エントロピーが0.6未満の低複雑度配列を廃棄した（低複雑度リードフィルター）。すべての基本的な品質管理ステップは、BBTools suite v37.62 (sourceforge.net/projects/bbmap/) のbbdukを使用して実行されました。
血液配列決定ライブラリの分類
非ヒトリードの分類は、Kraken2 v2.1.223を用い、「-paired」フラグで行った。古細菌、細菌、ウイルス、原生動物、真菌の文献を含むPlusPFデータベース（2021年5月17日リリース；https://genome-idx.s3.amazonaws.com/kraken/k2_pluspf_20210517.tar.gz）を使用しました。すべての非ヒトリードペアのうち、72％が種レベルで微生物に分類され、8,890種が得られました。微生物のリードペアが100個未満のサンプルは削除され、最終的に8,892個のサンプルからなるデータセットとなり、微生物のリードペア数の中央値は6,187個となりました。
分類学的割り当てのノイズを最小化するため、存在量の閾値を定義し、これらの閾値以下の存在量（つまり、相対的存在量≦0.005、割り当てられたリードペア≦10）の種は存在しないとカウントした（リードカウントをゼロとする）。偽陽性種割り当てを最小化する相対存在量閾値を系統的に決定するため、シミュレーションを行った。シーケンスリードは、InSilicoSeq v1.5.476を使用してシミュレーションし、SG10K_Healthシーケンスライブラリでエラーモデルをトレーニングし、SG10K_Healthデータセットと同じバイオインフォーマティクス手順を使用して処理して、微生物の分類プロファイルを取得した。GRCh38ヒトリファレンスと10種類の微生物ゲノム（Yersinia Enterocolitica, Leclercia adecarboxylata, Moraxella osloensis, Streptococcus pneumoniae, Pasteurella multocida, Staphylococcus epidermidis, Actinomyces viscosus, Torque teno virus, Human betaherpesvirus 6A and Candida albicans）からのリードを種々の割合で構成し，すべてのサンプルの中央値ライブラリリードカウント相当373万リードのシミュレーションを行った．リードの分類ミスにより、シミュレーションしたリードの一部が誤って別の種に割り当てられ、偽陽性が発生した。これらの偽陽性と真の陽性を区別する0.005の最終相対存在量閾値を選択した（Extended Data Fig. 9a）。これらの閾値を適用した結果、存在すると分類された微生物分類群の相対存在量分布は、存在しないと分類された微生物分類群の分布とは異なることがわかった（Extended Data図9b）。さらに、微生物陰性サンプルの存在量分布は、相対存在量0.0001を中心としており、分類子が存在するかしないかを判断するために用いられる典型的な相対存在量の閾値（0.001-0.04514）の少なくとも10倍以下であることがわかった。相対存在量は、あるサンプルの種特異的な微生物リード数を、そのサンプルに割り当てられた微生物リードの総数で割ることによって計算されました。
除染フィルター
存在/不在フィルタを適用した後、下流の解析の前に、先行研究27,28で検証された確立した汚染除去ヒューリスティック26を用いて、推定汚染物質を特定し除去しました。これらのルールは、8種類のバッチ情報（ソースコホート、DNA抽出キットタイプ、ライブラリー調製キットタイプ、シーケンスバイシンセシスキット（ボックス1、ボックス2）、ペアエンドクラスターキット（ボックス1、ボックス2）、使用したシーケンスフローセル）を用いて適用しました。使用したピペットや消耗品、保管場所や保管期間など、その他のバッチ情報は記録されていないが、ある程度のバッチ固有の汚染につながる可能性がある。しかし、これらのバッチは、利用可能な他のタイプのバッチ情報と相関があると予想されるため、理論的には、結果として生じる汚染物質は、当社のフィルターを使用して説明することができます。図1aに示すように、使用した4つの除染フィルターについて、順を追って説明します：
(1)
有病率フィルター。微生物種は、そのバッチで25％以上の有病率で存在し、他のバッチの有病率より2倍以上高い場合、そのバッチに特有の汚染物質とみなされる。100サンプル未満のバッチは、この分析から除外された。このフィルターは、あるバッチでは非常に有病率が高いが、他のバッチでは有病率が低いか存在しない種は、汚染物質である可能性が高いという原則に基づいている26。Extended Data Fig. 10aで、ある種の例について説明しています。
(2)
相関フィルター。微生物種は、有病率フィルターによって特定されるように、同一バッチ内の任意の汚染物質と高い相関性（スピアマンのρ＞0.7）がある場合、汚染物質とみなされる。このフィルターは、汚染物質が同じバッチ内で高い相関性を持つという原則に基づいている26。スピアマンのρは、中心対数比変換77された微生物相対量を用いて計算された。中心対数比変換とスピアマンのρは、Rのcompositionsパッケージ78のclr関数とcor.test関数を用いて計算した。Extended Data図10bに、ある種の例についてこのバッチ内相関を示す。
(3)
バッチフィルター。非汚染微生物種は、少なくとも2つの試薬キットのバッチまたは試薬タイプで処理されたサンプルで検出される必要があります。つまり、使用した試薬キット（補足表6）のいずれかについて、単一のバッチでのみ検出される種は、汚染物質とみなされます。このフィルターは、異なる試薬バッチ間で繰り返し観察できる種は、本物の非汚染シグナルを反映している可能性が高いという原則に基づいている26。ライブラリ調製キットの種類は、3種類のキットのみが使用され、86％のサンプルがいずれかのキットを使用して処理されたため、この分析から除外された。
(4)
リードカウントフィルター。微生物種は、少なくとも1つのサンプルで少なくとも100リードが割り当てられていない場合、シーケンスまたは解析のアーティファクトとみなされます。このフィルターは、シーケンスライブラリ内のバックグラウンドノイズを超えることのない低い数のリードペアが常に割り当てられる種は、本物のシグナルではなくアーティファクトである可能性が高いという原則に基づきます。artefactualな種の例として、'Candidatus Nitrosocosmicus franklandus'が挙げられ、これは21のシーケンスサンプルにおいてKraken2によって最大22リードペアが割り当てられました。
汚染除去フィルターの有効性を実証するために、汚染除去後に保持された117の微生物種が、ランダムにこれらの種を選んだ場合と比較して、汚染物質の可能性が高い、ヒトに関連する、または血液培養で検出されたと分類される種の割合が同じという帰無仮説に対して結果を追加でテストしました。この解析では、除染前の微生物種リストからランダムに選んだ117種の微生物種を1000セット作成し、3つのデータベースと比較しました（図1b-d参照）。P値は、汚染物質の可能性が高い、血液中で検出された、またはヒトに関連すると分類された種の割合が、当社の除染フィルターで保持された117種で観察された割合と同じかそれよりも極端であるランダム反復を生成する割合を取ることによって計算しました。
微生物種の特性評価
我々は、公表されている宿主-病原体関連データベース31に基づいて、微生物種をヒトに関連するか否かに分類した。このデータベースでは、宿主と病原体の関連は、病原体による宿主の感染が少なくとも1回記録されていることで定義されている31。このデータベースで見つからなかった種については、検索語：（微生物種名）AND（ヒト）AND（（感染）OR（常在菌））を用いて系統的なPubMed検索を実施しました。同様に、ヒトのコロニー形成/感染に関する発表が少なくとも1件あった種は、ヒト関連とみなした。さらに、発表されたマイクロバイオーム研究のデータとメタデータを標準的な方法で収集するDisbiomeデータベースを用いて、各微生物種の潜在的な身体部位起源を分類した34。同データベースに登録されているすべてのマイクロバイオーム実験の情報を、URLを用いて抽出した： 'https://disbiome.ugent.be:8080/experiment' (accessed 26 April 2022). まず、この情報から微生物とサンプルタイプのマッピングを抽出した（例えば、C. acnes→skin swabなど）。次に、各サンプルタイプを異なる身体部位に手動で分類しました（例えば、皮膚スワブ→皮膚）。これにより、微生物と身体部位のマッピングを作成することができました。身体部位が曖昧なサンプルタイプ（例えば、膿瘍など）は除外した。微生物-身体部位マッピングの作成に使用したDisbiomeデータベース内のサンプルタイプの範囲は、補足表7に記載されています。最後に、臨床微生物学の教科書79を参考に、微生物種を増殖要件に基づき分類した。ウイルスは、義務的細胞内生物に分類した。各生物種の微生物学的分類は、補足表2に記載した。
カバレージの広さと細菌の複製速度の見積もり
Bowtie v2.4.580を使用し、デフォルトのパラメータで微生物参照ゲノムに対するシーケンスライブラリのリードアライメントを実施しました。血液中に検出された117の微生物種のうち、1つのサンプルで少なくとも1,000のKraken2割り当てリードペアを持つすべての細菌種とすべてのウイルス種（n = 5）からなる28種のリファレンスを使用した合計。各生物種について、その生物種に割り当てられたリードが最も多い5つのサンプルライブラリの微生物リードを、その生物種の参照ゲノムにアライメントしました。各サンプルと微生物ゲノムについて、位置ごとのゲノムカバレッジをRのRsamtools v2.8.0パッケージ81のpileup関数を用いて計算した。原理的に、ゲノム上の特定の領域にマッピングする散発的なリードとは異なり、微生物ゲノムの大部分を回収することは、そのサンプルが本当に存在していることをより確実にする24、25をもたらす。28種のうち27種（96%）について、少なくとも10%の微生物ゲノムを回収することができました。少ないリード数でカバーされる種のカバー幅を評価するのは難しいので、すべてのウイルス（n = 5）と、少なくとも1,000のKraken2割り当てリードペアを持つすべての細菌種（n = 23）に対してのみこの解析を実行しました。これは、典型的な3 Mbp細菌ゲノム（重複しないリードと仮定）に対して〜10％のカバーに相当します。複製率解析のために、PTR値は、以前に提案された方法22に基づくiRep v1.1.021のbPTR関数を使用して計算した。OriとTerの位置は、カバレッジの山と谷を基準に決定した（図3、それぞれ赤と青）。また、OriとTerの位置は、ゲノム全体の正弦波カバレッジパターンと逆位相になることが予想される累積GC-skew線を用いて計算した39（図3、緑色）。
微生物ネットワーク
微生物共起/相互排除関連は、RのSPIEC-EASI v1.1.2パッケージ82に実装されているSparCCアルゴリズム50を用いて計算し、微生物ネットワークはIgraph v1.2.983を用いて可視化した。出生コホートであるGUSTOは、微生物との関連性が異なる可能性があるため、除外した。
微生物の分類学的プロファイルと宿主の表現型との間の関連性の検出
個々のコホート内で微生物-宿主表現型の関連を個別に検定した。遺伝的性別と家系という2つのカテゴリー別宿主表現型については、両側フィッシャーの正確検定（Rのfisher.test関数）を用いて、異なるカテゴリー間の各微生物種の有病率の違いを検証した。連続変数（年齢、BMI、TC、TG、SBP、DBP）については、両側Mann-Whitney U検定（Rのwilcox.test関数）を用いて、種がある場合とない場合の変数の分布に違いがあるかどうかを検定した。Benjamini-Hochberg多重検定補正は、両方の検定からのP値を統合した後、RのP.adjust関数を使用してすべてのコホートについてのみ適用した。統計検定は、少なくとも合計50サンプルで種が存在する場合にのみ実行した。これとは別に、派生する表現型（つまり、高齢者であることや「健康状態が悪い」ことの指標）については、Benjamini-Hochberg多重検定補正を適用する前にFisherの正確検定を用いている。すべての場合において、宿主の表現型データが欠落しているサンプルは除外された。分析したすべてのデータは、使用した統計検定の前提条件を満たしていた。
データ解析と可視化
すべてのデータ解析は、R v4.1.0またはPython v3.9.12を用いて実施した。可視化はggplot v3.3.584で行った。Extended Data Fig.8はBioRender.comを使用し、アカデミックなサブスクリプションで作成しました。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
本研究の著者はSG10K_Healthデータセットの権利を所有しておらず、このデータセットは、優れたデータガバナンス、責任あるデータ利用、およびSG10K_Health研究コホートのIRBおよび倫理承認に従った意図した研究目的にのみ使用されることを保証するために、アクセス制御されている。SG10K_Healthの個人レベルデータ（WGSおよびVCFファイル）へのアクセスを希望するユーザーは、提案する研究の概要を記載したデータアクセス要求を提出し、毎月招集されるNPMデータアクセス委員会（DAC）による承認を得る必要があります。書式とデータアクセスポリシーは、研究機関のメールアドレスを登録すると、SG10K_Healthポータル（https://npm.a-star.edu.sg/help/NPM）からダウンロードすることが可能です。より詳細な情報については、ASTARのNational Precision Medicine Programme Coordinating Office (contact_npco@gis.a-star.edu.sg)に問い合わせることができます。申請の平均的な所要時間は、申請書を受け取ってから、NPM DACから申請が受理されたか、却下されたか、修正が必要かの結果を受け取るまで4-6週間です。承認された申請者は、(1)データが提案された研究目的にのみ使用されること、(2)参加者を再識別する試みがなされないこと、(3)データの第三者への共有がないこと、(4)原稿に標準謝辞が含まれていることを保証する、譲れないデータアクセス契約書に署名することが求められます。
解析に使用したすべてのソースデータはZenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7665281)にホストされており、すべての実シークエンスライブラリーとシミュレーションシークエンスライブラリーのKraken2分類プロファイル、および匿名化した血液培養記録を含みます。使用したすべてのゲノムリファレンスのアクセッション番号は、補足表8に記載されています。PlusPFデータベース（2021年5月17日リリース）は、オンラインでアクセスできます（https://genome-idx.s3.amazonaws.com/kraken/k2_pluspf_20210517.tar.gz）。Disbiomeデータベース34は、オンライン（https://disbiome.ugent.be:8080/experiment）でアクセスできる。宿主-病原体データベース31は、FigShare（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.8262779）を通じてアクセスできる。ソースデータは本論文で提供しています。
コードの入手方法
ここで報告された分析を行うために使用されたすべてのカスタムコードは、GitHub (https://github.com/cednotsed/blood_microbial_signatures.git) でホストされています。
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謝辞
本研究で使用したデータの収集とキュレーションを行ったSG10K_Health Consortium（メンバーおよび所属は補足表9に記載）に感謝します。本解析のための計算作業は、National Supercomputing Centre, Singapore (https://www.nscc.sg)のリソースで部分的に実施されました。本研究は、Industry Alignment Fund (Pre-Positioning) (IAF-PP: H17/01/a0/007)からの助成金を受けたシンガポール国立精密医療プログラムの一部として生成されたデータを利用した。これらのデータ／サンプルは、シンガポールの以下のコホートで収集された：（1）南洋理工大学リー・コン・チアン医学部、シンガポールにおけるHealth for Life in Singapore（HELIOS）研究（リー・コン・チアン医学部の戦略的イニシアティブ、シンガポール保健省（MOH）のシンガポール・トランスレーショナル・リサーチ研究者賞（NMRC/STAR/0028/2017）およびIAF-GPのもとでのグラントにより支援されています： H18/01/a0/016）； (2) 国立大学病院（NUH）、KK女性・子ども病院（KKH）、シンガポール国立大学（NUS）、シンガポール臨床科学研究所（SICS）が共同主催するGrowing up in Singapore Towards Healthy Outcomes (GUSTO) 研究、科学技術研究庁（ASTAR）（シンガポール国立研究財団のTranslational and Clinical Research（TCR）フラッグシッププログラムによる支援、シンガポール保健省のNational Medical Research Council（NMRC）、シンガポール - NMRC/TCR/004-NUS/2008 および NMRC/TCR/012-NUHS/2014 により管理される。追加資金はSICSおよびIAF-PP H17/01/a0/005から提供された）；（3）シンガポール眼科研究所（SERI）のシンガポール眼病疫学（SEED）コホート（NMRC/CIRG/1417/2015、NMRC/CIRG/1488/2018およびNMRC/OFFLCG/004/2018によって支援されている）； (4) Multi-Ethnic Cohort（MEC）コホート（NMRC grant 0838/2004の支援、BMRC grant 03/1/27/18/216; 05/1/21/19/425； 11/1/21/19/678、シンガポール保健省、シンガポール国立大学、シンガポール国立大学保健システム）、（5）SingHealth Duke-NUS Institute of Precision Medicine（PRISM）コホート（NMRC/CG/M006/2017_NHCSの支援を受けています； NMRC/STAR/0011/2012、NMRC/STAR/0026/2015、リー財団、タノト財団）；（6）TTSH Personalised Medicine Normal Controls（TTSH）コホート（NMRC/CG12AUG17およびCGAug16M012の支援）である。ここに示された見解は著者のものであり、必ずしもNational Precision Medicineの研究者または機関パートナーのものではありません。National Precision Medicineプロジェクトを可能にしたすべての研究者、スタッフ、研究参加者に感謝する。
著者情報
著者ノート
これらの著者はこの研究を共同で監修した： Minghao Chia、Niranjan Nagarajan。
著者と所属
シンガポール科学技術研究庁（A*STAR）ゲノム研究所（GIS）、シンガポール、シンガポール共和国
Cedric C. S. Tan, Karrie K. K. Ko, Hui Chen, Jianjun Liu, Minghao Chia & Niranjan Nagarajan
UCL遺伝学研究所、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン、ロンドン、英国
セドリック・C・S・タン
シンガポール総合病院微生物科、シンガポール、シンガポール共和国
カリーケーケーコー
シンガポール総合病院分子病理科、シンガポール、シンガポール共和国
カリーケーケーコー
シンガポール国立大学ヨンローリン医学部（シンガポール、シンガポール共和国
カリー・ケー・コー＆ニランジャン・ナガラジャン
南洋理工大学リー・コン・チアン医学部人口・グローバル・ヘルス学科（シンガポール、シンガポール共和国
マリー・ロー
インペリアル・カレッジ・ロンドン疫学・生物統計学科（英国、ロンドン、サウスケンジントン
マリー・ロー
国立皮膚センター（シンガポール、シンガポール共和国
マリー・ロー
コンソシア
SG10K_健康コンソーシアム
貢献度
C.C.S.T.とN.N.は、本研究を構想し設計した。C.C.S.T.は、共著者全員の知的インプットを得て、すべてのデータ解析を実施した。K.K.K.は、病院の血液培養記録の取得とキュレーションを行った。C.C.S.T.、N.N.およびM.C.は、すべての共著者の貢献と編集を受けながら原稿を執筆した。コンソーシアムは、参加者の募集、配列決定、データのキュレーションを監督する責任を負った。N.N.とM.C.はこの研究を共同監修した。
対応する著者
Cedric C. S. TanまたはNiranjan Nagarajanに対応する。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
査読
ピアレビュー情報
Nature Microbiologyは、本作品の査読に貢献した匿名査読者に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 Bowtie2マッピングされたリード数とKraken2アサインされたリード数のlog10スケールでの強い直線関係。
すべてのデータポイント（n = 122）を散布図に示した。ここで示した線形回帰直線と関連するパラメータ推定値は、外れ値のデータポイント（赤色）を除去した後に計算したものである。これらの外れ値は、すべてのデータ点を含む最初の線形回帰から計算された学生時代の残差>2であった。線形回帰モデルの勾配パラメータがゼロと異なるかどうかを判断するために、両側F検定が使用されました。
ソースデータ
Extended Data 図2 汚染シグナルのバッチ間変動とバッチ内一貫性。
シーケンスに使用したHiSeq SBSキットのロット番号と血液サンプルの処理に使用したDNA抽出キットの違いで層別した汚染種の有病率のヒートマップ。汚染種は属ごとに分類され、一般的な汚染物質として知られている注目すべき属は図に注釈されています。微生物の有病率は、使用したバッチやキットの種類によって大きく異なり（バッチ間変動）、複数の種は1つのバッチ内で強く相関しているように見えます（バッチ内一貫性）。
出典データ
Extended Data 図3 除染フィルターにより、保持された微生物分類群の信号対雑音比が大幅に改善された。
汚染物質である可能性はない」「血液から検出された」「ヒトに関連する」と分類された種の割合のヌル分布。これらのヌル分布を作成するために、1000回の反復ごとに、除染前の種リストから117の微生物種をランダムに選択し、図1b-dの作成に用いたのと同じ手順で分類しました。除染フィルター適用後に観察された比率は、黒い破線で示されている。P値は、種の割合が観察された割合より大きいか等しい反復の割合として計算された（片側検定、多重検定補正は行わず）。
出典データ
Extended Data 図4 非汚染分類群が検出されなかったサンプルの総微生物リード数の分布。
微生物総リード数は、アバンダンスフィルター適用後、除染前に微生物と分類されたリード数と同等である（方法、図1aを参照）。
ソースデータ
Extended Data 図5 敗血症患者における微生物の有病率は、健常者と異なる。
除染前と除染後の敗血症患者および血液シーケンスライブラリで検出された属の有病率を示す棒グラフ。Blauwkampらは、敗血症患者から採取した血漿のショットガンシーケンスを使用して、関与する病因を決定し、複数の代替培養ベースおよびPCRベースの検出方法によってこのアプローチの分析感度を評価しました。
ソースデータ
Extended Data 図6 健康な子供の血液に含まれる微生物の高い有病率。
(a) 子どもコホートGUSTOにおける微生物の有病率は、他の成人コホートと比較して不釣り合いなほど高い。シルエットアイコンは、Adobe Stockから標準ライセンスで調達した。性差で層別化した小児および成人コホートにおける（b）泌尿生殖器関連微生物および（c）腸内関連微生物の有病率。身体部位の分類は、Disbiomeデータベースを用いて決定した。
出典データ
Extended Data 図7 C.acnesと遺伝的祖先の間の矛盾した関連性。
C.acnesの有病率を算出するために、サンプルを感染源コホートと遺伝的祖先によって層別化した。C.acnesの存在と遺伝的祖先との間に有意な（p < 0.05）関連が認められたコホート（すなわち、MECとSEED）のみが示されている。有病率を算出する際に分母として使用したサンプル数は、注釈付きです。
出典データ
Extended Data 図8 血液中の微生物の想定モデル。
私たちの発見は、一貫した循環型血液マイクロバイオーム（つまり、血液マイクロバイオームモデル）は存在しないことを示唆しています。より可能性の高いモデルは、他の身体部位に存在する微生物が一過性かつ散発的に血液に移行することである。BioRender.comで作成され、学術的な契約に基づいている。
出典データ
Extended Data 図9 擬似陽性種割り当てを減らすための存在量カットオフを決定するシミュレーション実験。
(a)Kraken2種割り当ての真陽性と真陰性の相対存在量のヒストグラム。InSillicoSeqを用いて、ヒト（GRCh38）および10種類の微生物参照ゲノムから、様々な微生物リード分率で約3億7300万リードを生成した。偽陽性（FP）を真から区別する存在量カットオフが選択され（相対存在量=0.005）、真陽性および偽陽性のKraken2種割り当てをそれぞれすべて保持および除外した。(b)存在閾値（相対存在量≦0.005、割り当てられたリードペア≦10）で区分される、存在または不在と考えられる分類群の相対存在量分布。
出典データ
Extended Data 図10 使用した除染フィルタの説明図。
(a) 有病率フィルターでは、Sphingobium sp. YG1の少なくとも1つのバッチ（つまり、使用したフローセルのロット）における有病率が25%以上（赤い点線で示した閾値）で、他の少なくとも1つのバッチにおける有病率よりも2倍以上高いため、汚染物質としてフラグを立てました。(b) フローセルバッチ20367079の相関フィルターによって同定された72種の汚染物質間のペアワイズ・スピアマンのRho（つまり相関関係）のヒートマップです。これらの種の高い相関性は、それらが確かにバッチ20367079に特有の汚染物質である可能性が高いことを示している。
出典データ
補足情報
報告書の概要
補足表1～9
補足表1. 6つの独立したコホートからのデータセットに含まれる9,970人の健常者の人口統計学的特徴。関連する施設の倫理審査委員会からの承認参照番号を記載した。表2. 厳格な除染後に8,892人の血液サンプルから検出された117の微生物種の最終リスト。表3. Benjamini-Hochberg手順を用いた多重比較の調整後の、5つの有意な微生物-表現型関連（調整済みP < 0.05）のまとめ。Mann-Whitney U統計は、両側Mann-Whitney U検定またはFisher's exact検定が使用された場合、それぞれ提供または空白とする。表4. 微生物の存在（すなわち、任意の微生物種の存在）と派生する宿主表現型との間のすべての関連性のまとめ。これらの関連性の統計的有意性を評価するために、両側フィッシャーの正確検定を実施した。検定は、各コホートについて別々に行った。多重検定を補正するためにBenjamini-Hochberg手順を適用した。表5. 相対的存在量が0.001より大きい場合に種が存在するとみなす緩和存在量フィルターを適用した後に検出されたすべての微生物種の有病率、ただし除染を実施する前。有病率は、特定の微生物種が検出されたサンプル（n = 8,892）の割合として計算されました。表6. 各サンプルに使用した試薬キットの種類またはロット番号のメタデータ（n = 9,770）。表7. Disbiomeデータベースから取得したサンプルタイプの範囲とそれに関連する微生物種。各サンプルタイプには、解析に使用した微生物と身体部位のマッピングを導き出すために、由来する身体部位が割り当てられました。身体部位の起源が曖昧なサンプルタイプ（例えば、膿瘍の膿）は除外した。表8. 本研究で使用した微生物参照ゲノムとそれに対応するNCBIアクセッション番号のリスト。参照ゲノムが使用された解析の種類は注釈付きで記載されています。表9. SG10K_Healthコンソーシアムのメンバーリストとその所属先。
出典データ
ソースデータ図1～4、エクステンドデータ図1～10
統計の元となるデータです。
権利と許諾
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Tan, C.C.S., Ko, K.K.K., Chen, H. et al. No evidence for a common blood microbiome based on a population study of 9,770 healthy humans. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01350-w
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2022年8月13日受領
2023年3月2日受理
2023年3月30日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41564-023-01350-w
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