健常者および免疫不全者におけるCOVID-19ワクチン接種後も腸内細菌叢は安定している

本文へスキップ
バイオレキシブ
ホーム投稿FAQブログアラート / RSSチャンネルについて
このキーワードで検索
検索
詳細検索
新しい結果 このプレプリントをフォローする
健常者および免疫不全者におけるCOVID-19ワクチン接種後も腸内細菌叢は安定している

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.08.23.554506v3.full

Rebecca H. Boston, Rui Guan, Lajos Kalmar, Sina Beier, Emily C. Horner, Nonantzin Beristain-Covarrubias, Juan Carlos Yam-Puc, Pehuén Pereyra Gerber, Luisa Faria, Anna Kuroshchenkova, Anna E. Lindell, Sonja Blasche, Andrea Correa-Noguera, Anne Elmer, Caroline Saunders, Areti Bermperi, Sherly Jose, Nathalie Kingston, CITIID-NIHR COVID-19 BioResource Collaboration, Sofia Grigoriadou, Emily Staples, Matthew S. Buckland, Sara Lear, Nicholas J. Matheson, Vladimir Benes, Christine Parkinson, James E. D. Thaventhiran, View ORCID ProfileKiran R. Patil
doi: https://doi.org/10.1101/2023.08.23.554506
この論文はプレプリントであり、査読認証を受けていません。
00000028
要旨全文情報/履歴メトリクスプレビューPDF
要旨
免疫系と腸内細菌叢との双方向の相互作用は、様々な宿主の生理機能に重要な役割を果たしている。がんや自己免疫などの免疫関連疾患や免疫調節療法の有効性は、マイクロバイオームの変動と関連している。COVID-19感染症は微生物異常症を引き起こすことが示されているが、ワクチン接種に伴う炎症反応が微生物叢にも影響を及ぼすかどうかについては、まだ十分な研究がなされていない。ここでは、COVID-19ワクチン接種が腸内細菌叢に及ぼす時間的影響を、健常人と免疫不全患者（後者には原発性免疫不全患者と免疫調節療法を受けているがん患者が含まれる）で調べた。その結果、腸内細菌叢は、免疫状態、ワクチン反応、微生物組成の多様性にかかわらず、ワクチン接種後も極めて安定していた。この安定性は、多様性、門、種、機能的能力を含むすべての評価レベルで明らかである。この結果は、COVID-19ワクチン接種によって引き起こされる宿主免疫の変化に対する腸内細菌叢の回復力を示しており、微生物叢が介在するプロセスへの影響は、あったとしても最小限であることを示唆している。これらの知見は、特にCOVID-19感染時に観察されたマイクロバイオームの有意な変化と対照をなす場合、ワクチンの受容を促すものである。

はじめに
パンデミック（世界的大流行）の最初の30ヵ月間に、PCRで確認されたCOVID-19感染症例は全世界で約8億件、関連死は700万件に迫ると報告されている1。この深刻さを軽減するため、抗SARS-CoV-2免疫を促進する目的でワクチンが配備され、全世界でほぼ135億回接種され、そのうち1億5000万回が英国で接種された1。しかし、COVID-19の感染継続は依然として懸念されており2、その理由のひとつはワクチン接種をためらうことである3。したがって、ワクチン接種の全体的な効果を理解するのに役立つデータは、公衆衛生管理に大きな影響を与えることになる。

SARS-CoV-2 mRNAワクチンとウイルスベクターワクチンは、スパイク蛋白に対する自然免疫と適応免疫の両方を促進することにより、強力な免疫応答を誘導する4。特に、ワクチン接種に反応して炎症性サイトカインであるIFNy、IL-15、IL-6の分泌が促進されることが報告されており5、それぞれが腸管上皮の構造や粘膜免疫に影響を与えることが知られている6-8。抗原提示細胞によるスパイクmRNAの封じ込めは、全身循環への拡散を抑えることを目的としているが、SARS-CoV-2スパイクタンパク質はワクチン接種後の血漿中にも検出された9。このことから、SARS-CoV-2ワクチン接種に対する全身の免疫反応が腸内細菌叢に影響を与える可能性があるという仮説を立てた。

COVID-19感染時の腸内細菌叢を分析した多くの研究10では、バクテロイデス属やビフィドバクテリウム属などの常在細菌や有益なラクノスピラ科細菌の顕著な減少と、レンサ球菌やクロストリジウム・ハサウェイなどの日和見病原体の増加の両方が認められている。しかし、COVID-19に対するワクチン接種プログラムが開始されて以来、ワクチン接種が腸内細菌叢に及ぼす影響について取り上げた研究はほとんどない11-14。これまでの研究では、腸内細菌叢とワクチン免疫原性との関連性が研究されており、初回ワクチン接種前の特定の細菌種のベースライン存在量が、ワクチン有効性の定義されたエンドポイント（通常、ウイルス中和やスパイク特異的抗体価など、ワクチンに関連する測定値）と相関している。

しかし、2つの未解決の疑問が残されている。すなわち、炎症反応が最も高まるワクチン接種後数日間において、腸内細菌叢がCOVID-19ワクチン接種によってどのような影響を受けるのか、また、体液性免疫が開始された後、腸内細菌叢における即時的な変化は維持されるのか、あるいは解消されるのか、という点である。この知識ギャップを解決することは、ワクチン接種における腸内細菌叢と全身性免疫の相互関係の程度と性質を理解するのに役立つと考えられる。そこで我々は、COVID-19ワクチンの投与を受けた患者の腸内細菌叢を解析し、健常人または免疫不全患者の腸内細菌叢に顕著で特徴的な変化があるかどうかを明らかにしようとした［表1］。我々が募集した免疫不全患者は、免疫チェックポイント調整療法を受けているがん患者と原発性免疫不全患者であった。これらのコホートはそれぞれ、治療介入または免疫調節遺伝子（CTLA4、NFKB1、CD40L）の単発性欠損のいずれかに起因する免疫障害を有する患者で構成されている。

インラインで見る
表1.
本研究の参加者の特徴。
このことは、COVID-19ワクチンが、完全で機能的な免疫とそれに続く腸内細菌叢の制御障害がない場合に、腸内細菌叢を変化させるかどうかを解明するまたとない機会となった。

研究方法
研究参加者の募集と倫理
参加者は観察研究に志願し、健常対照、黒色腫または腎悪性腫瘍のいずれかを呈するがん患者、主要な免疫調節遺伝子に定義された変異を有する原発性免疫不全患者、および抗体欠損を含む定義された原発性免疫不全の臨床像と一致する患者の3つのコホートのいずれかに登録された［表1］。各コホートのほぼすべての参加者がBNT162b2ファイザーワクチンを受けたが、2回目にアストラゼネカワクチンを受けた1人の患者と3回目にModernaワクチンを受けた6人の患者は例外であった［表1］。COVID-19の血清学的検査が陽性であった患者や、COVID-19ワクチン接種に対する生理学的反応に影響を及ぼす可能性のある、疾患に関連した臨床症状や特徴をもって入院していた患者は除外された。本研究は、Good Clinical Practiceの原則に従い、NIHR National Bioresourceの承認されたプロトコールに従って実施された。サンプルはNIHR Cambridge Clinical Research Facility, Addenbrookes Hospital, Cambridge, UKで採取された。サンプルは、NIHR National BioResource - Research Tissue Bank (NBR-RTB)の倫理（研究倫理委員会(REC):17/EE/0025）に基づき、研究参加者全員の書面によるインフォームドコンセントを得て提供された。すべての参加者は、East of England Cambridge Southの全国同意（REC:13/EE/0325）に基づき同意した。

参加者のサンプリング
参加者のサンプルは、研究ラボにサンプルを提供する前に、臨床スタッフによって匿名化された。末梢血と糞便のサンプルは、COVID-19に対するワクチンを最大3回接種する過程で縦断的に採取された（サンプルのカバー率は接種回数によって異なる［補足図1］）。サンプルは2021年2月9日から2022年2月22日まで採取された。末梢血単核球（PBMC）は、密度勾配遠心分離を用いて血液サンプルから抽出し、-80℃で一時保存した後、液体窒素での長期保存に移した。血清は末梢血から遠心分離により単離し、必要な時まで-80℃で保存した。糞便サンプルは各ワクチン投与前後の3つの時点で採取した：投与前（サンプルの94％はワクチン接種前3日以内に採取、残りの3サンプルは14日前まで採取）、急性（ワクチン接種後2日目または3日目）、後期（ワクチン接種後16～28日目）。糞便はOMNIgene-GUTキット（DNA Genotek社、カナダ）で採取され、サンプルは安定化・不活性化溶液に保存された。サンプルはラボに運ばれ、到着後ホモジナイズされた後、必要な時まで-80℃で保存された。

糞便DNA抽出と塩基配列決定
QIAamp® PowerFecal® Pro DNAキット（Qiagen）を用いて糞便サンプルからDNAを抽出した。サンプルを解凍し、約250mgの糞便サンプルをビーズビートで溶解した。キットのプロトコールに従い、サンプルをDNA以外の有機物および無機物で洗浄し、エタノールで洗浄した。DNAを10mM Trisに溶出し、Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社、英国）を用いて、Qubit™蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific社、英国）を用いて定量した。10mg/uL濃度のDNAをシーケンス用に送った。サンプルは、各患者のサンプルのタイムポイントを盲検化した上で、シーケンス用に一括して送られた。ショットガンメタゲノムシークエンシングは、Illumina NextSeq 2000シーケンスプラットフォームで150bp長のペアエンドリードを用いて行い、サンプルあたり中央値で約2800万リードを得た。

ショットガンメタゲノム解析
生シーケンスデータはPRINSEQ++15（v.1.2.4）を用いてペアリードモードで前処理し、15塩基のウインドウで最小Phredスコア30にクオリティトリミングし、トリミング後に75bp以下のリードを除去した。さらに、Bowtie216（v.2.4.5）を用いてGRCh38リファレンスヒトゲノムにマッピングし、マッピングされたリードをデータセットから除去することで、宿主コンタミネーションを除去した。

FastQC（v.0.11.9）（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）を用いて、生リード、トリミングリード、フィルターリードの品質をチェックした。残りのリードペアから、mOTUs317（v.3.0.1）profilerを用いて分類学的プロファイリングを行った。機能プロファイリングのために、フィルター後の残りのリードペアをmetaSPAdes18 (v.3.15.4)を用いてk-merサイズ55でアセンブルした。得られたスキャフォールドは、少なくとも200 bpの長さでフィルターされ、定量的解析を可能にするために、フィルターされたリードの平均カバレッジで重み付けされた。残りのスキャフォールドは、DIAMOND20（v.2.0.13）を用いてEggNOGデータベース19（2022/04/08にダウンロード）にアライメントした。マイクロバイオーム解析はR（v.4.2.2）を用い、phyloseq21（v.1.42.0）、microbiome（v.1.20.0）22、vegan23（v.2.6-4）パッケージ内で相対存在量を用いて行った。DESeq224（v.1.38.3）を用いて存在量の差分解析を行った。

COVID-19ワクチンに対する免疫応答の血清学的評価
血清サンプルを解凍し、56℃で30分間熱不活化し、ウイルス活性を50％低下させる血清希釈度（NT50）を測定した。抗SARS-CoV-2特異的IgG抗体については、ルミネックスビーズセットを組換えSARS-CoV-2タンパク質ヌクレオカプシドタンパク質、スパイクおよびレセプター結合ドメイン（RBD）と共有結合させ、抗体レベルを定量化する既知の方法26,27を利用した。

統計解析
必要に応じて一対比較を用い、ボンフェローニによる多重検定補正を伴うウィルコクソン検定を全体を通して実施した。混合効果線形モデリングはRのlmer428を用いて行った。

結果
腸内細菌叢の組成はCOVID-19のワクチン接種によって変化しない
COVID-19ワクチンが腸内細菌叢に及ぼす影響を調べるため、我々の3つのコホートから59人の患者（健常対照43人、がん160人、原発性免疫不全患者36人のサンプル）から採取した合計239の糞便サンプルについて、ショットガンメタゲノムシークエンシングを実施した［補足図1］。サンプルは、ワクチン3回接種の間に、各ワクチン接種について、接種前（pre-dose）、急性（acute）（接種後2-3日）、後期（late）（接種後16-28日）の3つの時点のいずれかで採取された［図1A］。投与前サンプリングはワクチン接種前の腸内細菌叢のベースライン評価を提供し、急性サンプルは初期炎症反応の最盛期における腸内細菌叢に対するワクチン接種の影響を評価する機会を提供し、後期サンプルは急性影響の解消または維持を決定することを可能にする。

図1.
図をダウンロード
新しいタブで開く
図1.
COVID-19ワクチン接種後も腸内細菌叢の組成は変化していない。
(A）COVID-19に対するワクチンの効果を縦断的に解析するために59人の患者を募集した。サンプルは健常対照（HC）、免疫チェックポイント療法を受けたがん患者（ICP）、原発性免疫不全症（PID）の3つの患者コホートのいずれかに割り当てられた。血液サンプルは生きたウイルスの中和能力を分析し、抗スパイクIgG抗体の量を定量化した。一方、糞便サンプルはショットガンメタゲノミクスで分析し、分類学的および機能的アノテーションを行った。(B）健常対照（HC）、免疫チェックポイント療法を受けたがん患者（ICP）、原発性免疫不全症（PID）の患者から採取した、異なるワクチンのタイムポイントから採取した糞便サンプルにおけるchao1とシャノンの多様性評価。統計学的検定はWilcoxon検定を用いて行い、FDR補正を用いて多重検定を調整した。(C）操作分類単位レベルでの主成分（PC）分析。各点は、ワクチン接種後の各時点（色）で採取された各コホート（形）内のユニークなサンプルを示す。(D)各コホート（HC、ICP、PID）から採取したサンプルを、サンプルの採取されたワクチンのタイムポイント（PD＝Pre-Dose、Acute、Late）で区切り、それぞれのバーの色で示した分類群レベルでの相対存在量。(E)各コホート内の患者サンプルにおける6つの最も一般的なフィラの相対的存在量。統計学的検定はWilcoxon検定を用いて行い、FDR補正を用いて多重検定を調整した。(N = 43 HC、160 ICP、36 PID）。

各コホートから採取された全サンプルのα多様性を最初に観察したとき、各コホート間で有意差が認められたが［補足図2A］、各コホート内の異なるワクチン・タイムポイントで採取されたサンプルを評価したところ、有意差は認められなかった［図1B］。これと同様に、ペアサンプル解析（投与前と急性期など、複数のタイムポイントにわたって個々の患者サンプルを追跡する）を用いて、異なるワクチンのタイムポイントで同じ患者から採取したサンプルを評価した場合も、患者サンプルのα多様性に有意差は認められませんでした［補足図2B］［補足表1］。このことは、コホートや個人間で微生物の多様性が異なるにもかかわらず、COVID-19ワクチンが腸内細菌叢の多様性に影響を与えていないことを示している。

次に、主成分分析（PCA）を適用して、検出されたすべての操作分類学的単位（OTU）の存在量を用いて、マイクロバイオーム組成データのベータ多様性を可視化した［図1C］。主成分（PC）はデータセット中の最大の変動成分を表し、マイクロバイオーム組成のシフトを表し、サンプル間の細菌種の存在量の変化を反映している可能性がある。最初の5つの主成分は、それぞれ2.9％、2.4％、2.1％、2.0％、1.9％のデータ変動を担っており、利用可能なメタデータから複数の入力変数を用いて混合効果線形モデルを用いてさらに分析した。線形モデルでは、患者検体をグループ化変数として用いた説明分散を記述するベースラインモデルと比較して、各コホートにおける検体のワクチン接種時期がPCの説明分散を改善できるかどうかを検討した。その結果、ベースラインモデルに有意な改善は見られなかった［補足図2C］。さらに、PERMANOVA分析では、サンプルが採取されたタイムポイントの共変量が微生物組成に有意に影響することは見いだされませんでした[補足表2]。これらの分析を総合すると、サンプルに見られる分散はCOVID-19ワクチンの特徴ではなく、異なるマイクロバイオーム組成を呈する患者自身の特徴であることが裏付けられた。

次に、COVID-19ワクチンが腸内マイクロバイオームの門レベルの組成に何らかの変化を引き起こすかどうかを調べ、全サンプルにわたる門の相対的存在量をプロファイリングしたところ、［図1D］、患者サンプルにばらつきがあることが観察された。さらに、最も流行している上位6つの門を比較したところ、コホート間や個人間でこれらの門に有意な差があるにもかかわらず、ワクチンの接種時期間で有意な差は観察されなかった［図1E］［補足図2D］。ペア解析アプローチを用いた場合、がんコホートにおける7つの（231のうち）タイムポイント比較において、（多重検定補正後の）わずかな、小さな効果サイズの差しか観察されなかった［補足図2E］［補足表3］。しかしながら、これら7つのうち、log2FCがどちらかの方向（+1または-1）で1を超えたのは1つだけであり（補足図2F）、これはLentisphaeraeの相対存在量の中央値に顕著な変化があったことを示している。

このことは、COVID-19ワクチンが、我々のコホートサンプルで見つかったユニークな組成にかかわらず、腸内細菌叢の組成を顕著に変化させないことを示している。

COVID-19ワクチン接種は腸内細菌叢に種レベルの変化を引き起こさない
次に、DESeq224を用いて、ワクチンのタイムポイント間、すなわち投与前、急性期、後期で異なる豊富な微生物種を解析しようとした。すべてのコホートは、各タイムポイントで採取されたサンプルにおける存在量の変化について独立して分析され、代表的なヒートマップで最も異なる存在量の種が示された。がんコホートでは、投与前と急性期に採取されたサンプル間のこれらの上位差次的応答細菌種の存在量を評価したところ、教師なしクラスタリングではタイムポイントの明らかなグループ化は示されなかった［図2A］。全菌種の中で、投与前サンプルと比較して急性期サンプルで有意に増加したのは2菌種のみで、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）とブチリビブリオ・クロソタス（Butyrivibrio crossotus）が、それぞれがん患者97サンプルのうち15サンプル［p = 1.01e-24］と7サンプル［p = 7.63e-12］で検出された［Fig2B］。前者はコホートの4分の1（11人）のメラノーマ患者でのみ代表的であり、その中での相対存在量は平均0.7％である［Fig2C］。後者は2人の腎臓がん患者で、相対存在量の平均3％を占めている［Fig2D］。全患者検体で約2500種が発現していることを考慮すると、発現量が少なくまばらに発現している2種の変化は、ごくわずかな変化であることを意味する。同様の所見は、我々の他の2つのコホート、健常対照と原発性免疫不全患者でも見られた［それぞれ補足図3Aと3C、3Bと3D］。DESeq2を用いて3つのコホートすべてでペアサンプルの存在量差分析を行ったところ、健常対照とがんコホートでは、投与前と急性期、投与前と投与後のサンプルの間で有意に変化した生物種はなかった。一次免疫不全患者1人のみから得られたサンプルでは、投与前と比較して投与後期のサンプルでエンテロバクター属細菌の有意な減少が認められた［補足図3E］。このように、我々の知見は、種レベルでは、COVID-19ワクチンによって誘導される微生物種の存在量に、生物学的に関連する統一された変化はないことを示している。

図2.
図をダウンロード
新しいタブで開く
図2.
細菌種はCOVID-19ワクチンに起因する最小限の変化しか示さない。
(A）DESeq2を用いた、ワクチン接種前（N = 29）と接種後急性（N = 69）に採取したサンプル間の上位35種の差次的存在量の相対分析。(B）DESeq2解析から得られた有意な差分存在種のLog2 fold-change。(C）ICPコホートサンプルにおけるKlebsiella pneumoniaeの相対存在量。(D) ICPコホートサンプル中のButyrivibrio crossotusの相対存在量。(E)各ワクチンタイムポイント（N = 43 HC、160 ICP、36 PID）で採取されたICPコホート内の上位15種の相対存在量。免疫関連疾患と相関する様々な細菌種の相対存在量： 各ワクチン時点（N = 43 HC、160 ICP、36 PID）で採取された患者サンプル内のFaecalibacterium prausnitzii（F）、Akkermansia muciniphila（G）、Escherichia coli（H）。

存在量の差分析では、各サンプル内の相対的な存在量に関係なく、すべての生物種の存在量の変化を考慮するため、各患者コホート内で見つかった最も存在量の多い生物種に、ワクチンのタイムポイントに起因するような顕著な変化があるかどうかが気になった。その結果、3つのワクチン・タイムポイントのいずれで採取されたサンプルにおいても、最も豊富な15種のいずれにも有意差は認められず［Fig2E］、がんコホートでは患者サンプル内の種の相対的存在量の平均47％、健常対照群では50％、原発性免疫不全患者コホートでは53％を占めた。このことは、微生物ニッチで最も高い割合を占める種にはワクチンの効果が見られないことを示している。

COVID-19ワクチンの安全性については、最初のワクチンプログラムの時点でも、また今日に至るまでかなりの懸念があった。そこで我々は、胃がんや自己免疫、代謝性疾患や神経疾患など、様々な免疫関連疾患と関連する細菌種に、差次的な生育が見られるかどうかを観察しようとした。本研究では、これらの疾患と関連する細菌種の長期的な生育を扱うことはできないが、これらの細菌種に時間的、急性的な変化があるかどうかを明らかにすることができた。Faecalibacterium prausnitziiは、胃がん、自己免疫、クローン病の両方で減少することが報告されている29。また、胃がんの発生や発症に強く関連するヘリコバクター・ピロリの存在も認められなかった30。肥満31で増加し、様々な悪性腫瘍32における免疫チェックポイント阻害療法の奏効率と相関することが判明しているAkkermansia muciniphilaは、3つのコホートすべてでワクチン接種による変化は見られなかった［図2G］。アルツハイマー病の研究では、大腸菌が神経変性を促進することが証明されている33が、我々のサンプルでは、どのコホートでもワクチンによって誘発される有意差は見られなかった［図2H］。このことは、COVID-19ワクチンが、3つのコホートのいずれにおいても、さまざまな免疫関連疾患に関連する微生物の存在量の変化を促進しないことを裏付けており、COVID-19ワクチン接種の結果として前述の疾患のリスクが高まらないことを示している。

腸内細菌叢の多様性はCOVID-19ワクチンに対する反応の大きさとは相関しない 現在の文献の中で、ワクチン有効性と相関する腸内細菌叢の変化を報告している研究は少数である12-14。そこで、腸内細菌叢の組成がCOVID-19ワクチン反応の大きさと関連しているかどうかを明らかにしようとした。ワクチンの有効性が微生物の多様性と相関しているかどうかを評価するために、ワクチン防御の予測指標32として生ウイルス中和アッセイを用いてワクチンの有効性の評価を行った。

2回目の接種時［図3A］と3回目の接種時［図3B］の両方で患者血清の中和能力を測定する際、異なるワクチン・タイムポイントにおける腸内細菌叢のシャノン多様性が、中和に影響を与えるか、あるいは中和と相関するかを検討した。どの患者コホートにおいても、多様性とワクチン効果との間に相関は見られなかった。抗スパイクIgG抗体の量についても同様であった［補足図4］。このことから、我々の患者コホートでは腸内細菌叢の多様性と免疫応答の大きさには相関がないことが示され、ワクチンの有効性の向上が微生物の撹乱を犠牲にするものではないことが示唆された。

図3.
図をダウンロード
新しいタブで開く
図3.
ワクチンの有効性は腸内細菌叢の多様性とは相関しない。
生ウイルス中和能（NT）は糞便サンプルのシャノン多様性に対して評価され、各ポイントは3つのワクチン時点のいずれかで採取された異なるサンプルを表す。色は、健常対照（HC）、免疫チェックポイント療法を受けたがん患者（ICP）、原発性免疫不全症患者（PID）のコホートを表す。2回目の投与時（N = 9 HC、57 ICP、15 PID）（A）または3回目の投与時（N = 33 HC、54 ICP、5 PID）（B）に採取した患者血清のNT能力によるワクチン反応との相関。

腸内細菌叢の機能的能力はCOVID-19ワクチンの影響を受けなかった。
腸内マイクロバイオームを構成する微生物種の組成と相対的存在量を調べた後、次に微生物種の機能的能力がCOVID-19ワクチンによって変化するかどうかを調べようとした。EggNOGデータベースを用いて、配列決定されたメタゲノムに機能的アノテーションを付与した。最高レベルの機能アノテーションでは、細胞プロセスとシグナル伝達、情報保存と処理、代謝の3つの機能グループが描かれている。これらについては、コホート内のワクチンのタイムポイント間で有意な差は見られなかった[Fig4A]。先に示した分類学的データと同様に、コホートサンプルを個別に評価すると、有意な変化が見られた[補足図5A]。

図4.
図をダウンロード
新しいタブで開く
図4.
マイクロバイオームサンプルの機能的能力はCOVID-19ワクチンによって変化しない。
(A）EGGNOGデータベースを用いた、各患者コホートにおける異なるワクチンタイムポイントでの患者サンプル内の最高機能アノテーションレベルの相対的存在量。(B)各コホート（HC、ICP、PID）から採取したサンプルの機能組成を、サンプルを採取したワクチンのタイムポイントで区切り、それぞれのバーの色で表したもの。(C)各患者コホート内の患者サンプルにおける最も豊富な3つの機能的注釈の相対的存在量。統計学的検定はWilcoxon検定を用いて行い、FDRを用いて多重検定を調整した（N = 43 HC、160 ICP、36 PID）。

次に、各患者コホート内の別々のワクチンのタイムポイントにおいて、次の機能アノテーションレベルで定義された22の機能グループの存在量を観察した［図4B］。最も高い3つの機能アノテーションレベルのそれぞれで最も豊富な機能アノテーションの代表的なグラフは、我々の患者コホート内でワクチン接種後も変化せず［図4C］、残りの19個についても同様であった（補足図5B）。

最も低い機能アノテーションレベルでは、私たちはコホート内の別々のワクチンタイムポイントにおけるcluster of orthologous genes（COGs）の存在量を調査した。驚くべきことに、3つのコホートのいずれにおいても、COVID-19ワクチンの結果、患者サンプルに存在する2142個のCOGのうち、有意に変化したものはなかった（多重検定で補正した場合）。このことは、腸内細菌叢の機能的アノテーションがCOVID-19ワクチンの投与によって変化しないことを示している。

考察
われわれの知る限り、本研究は、COVID-19ワクチンに対する腸内細菌叢の構成を、複数回の投与にわたって、また投与前、急性期、ワクチン接種後期の複数の時点で採取したサンプルで評価した初めての研究である。本試験はまた、がん患者および重度の免疫調節異常を伴う先天性免疫異常患者において、COVID-19ワクチンが腸内細菌叢に及ぼす影響を評価した初めての試験でもある。コホート間のサンプリングは全体的にばらつきがあったため、3回のワクチン投与を組み合わせ、各コホート内のワクチンのタイムポイントまたはサンプルを評価することを選択した。これにより、これらの状況におけるCOVID-19ワクチンの影響をよりよく観察することができた。

腸内細菌叢内の微生物の相対的な存在量は、SARS-CoV-2ウイルスに対するワクチンを含め、ワクチン免疫原性と関連して最近評価されている。最初に報告されたCOVID-19ワクチン接種患者の腸内細菌叢の研究では、不活化ウイルスであるCoronaVacワクチンとスパイクタンパク質をコードするmRNAワクチンであるBNT162b2ワクチンのワクチン免疫原性が、それぞれ腸内ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）およびロゼブリア・フェシス（Roseburia faecis）のベースライン存在量と相関しており12、またマイクロバイオーム組成の変化にも注目している。われわれの研究デザインは、ワクチン投与量に対する変化を個別に調べるものであり、これらの細菌種や組成の変化は観察されなかった。以前の研究では、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いてRNAseqデータと微生物の存在量を相関させることにより、COVID-19ワクチンに対する腸内細菌叢反応の変動性を調査した14。その結果、高抗体反応者と低抗体反応者、および高T細胞反応者と低T細胞反応者の間で、発現量の異なる分類群がいくつか同定された。免疫不全コホートに関しては、抗TNF免疫調節薬の投与を受けている腸内細菌叢異常症34の特徴としてよく知られている炎症性腸疾患13の患者を評価した先行研究がある。彼らの研究では、幾何平均以上のワクチン反応者における多様性の変化は示されなかったが、ビロフィラの多さは反応性の改善と相関していた。これらの研究に共通しているのは、マイクロバイオームの組成とワクチン免疫原性との関連性であるが、これらの研究はワクチン接種後の単一時点を解析したものであり、様々な生活習慣や、食事、投薬、サンプリング時間帯など、マイクロバイオームの組成に大きな影響を与えることが知られている他の因子が交絡する可能性がある35-38。個々のワクチン投与量に関連したマルチタイムポイント研究により、マイクロバイオームの変化（またはその欠如）をより確実に評価することができた。我々の研究に登録された患者はすべて健康であったわけではなく、我々のコホートサンプルは他の研究に比べてはるかに広範で多様性が高く、すべてのサンプルは英国で採取された。

我々の患者コホートでは、コホート間でかなりの差があるにもかかわらず、COVID-19ワクチン接種後の腸内細菌叢の多様性に有意な影響は認められなかった。原発性免疫不全症患者の腸内細菌叢を調査した研究39と同様に、私たちのコホートでも対照サンプルと比較して多様性の減少が観察された。これらの患者では、腸管透過性が亢進し、細菌の移行率が高いことが示されている40。おそらく、全身性免疫の双方向透過性が腸内細菌叢に影響を及ぼしていることを示しているのだろう。われわれの研究では、遺伝的に決定された免疫調節異常の持続状態にある患者では、ワクチン接種後のマイクロバイオームの変動に影響はないことがわかった。

メラノーマ患者において、放線菌門とファーミキューテス門の細菌種の存在は、免疫チェックポイント阻害療法に対する良好な反応と関連している41-43。また、免疫チェックポイント阻害療法に良好な反応を示す腎がん患者では、Akkermansia muciniphiliaのシグネチャーが見られた44,45。癌の進行は腸内細菌叢の組成やそれに由来する代謝産物と関連していると報告されているが、これらの関連性は癌の種類によって異なる46。われわれのがんコホートサンプル内では、おそらくわれわれの患者が幅広い病態と治療を受けたためであろう、幅広い組成のばらつきがみられた。われわれの研究では、腸内細菌叢に影響を与えることが知られている食事や薬物などの因子は考慮していない47。とはいえ、このことは、我々の分析が特定の変化ではなく安定性を示唆しており、また、事後調査による検出力計算では、一対のサンプル（投与前-急性期、投与前-後期、急性期-後期）を採取した場合、偽陰性に対する検出力が十分であることを示しているため、重要なことではない（効果量については、Cohenのd = 0.55、推定検出力 = 0.8）。がん患者のワクチン接種に対する反応は、がんの種類によって大きく異なる。例えば、固形がんにおける抗体関連の免疫反応は、血液がんよりも良好である48。従って、免疫学的に多様な個人のコホートにおいて、ワクチン反応が多様であるにもかかわらず、COVID-19ワクチン接種による腸内細菌叢への影響が観察されなかったことは注目すべきことであり、これは投与前の組成に関係なく安定していることを示している。

いかなる分類学的レベルや機能的能力においても変化は観察されなかったが、微生物叢の機能を変化させる可能性のある突然変異レベルでの遺伝的変化を否定することはできない。微生物-宿主相互作用49を媒介することが知られている細菌由来の短鎖脂肪酸、トリプトファン、胆汁酸代謝産物を調べるメタボロミクスなどの独立した機能検証を利用すれば、この点を評価できるだろう。

PIDコホートからのサンプリングは、一般集団におけるPID患者の希少性を反映し、限られていた。にもかかわらず、内在性B細胞および外在性B細胞の両方の病因における単発性欠損を特徴とする患者を集めることができたので、希少なPID集団の中の多面性を表すことができた。さらに、すべてのワクチン投与期間において、すべての患者をサンプルすることはできなかった。それにもかかわらず、われわれの知見は、患者コホートを個々に評価し、可能であればペアサンプルデータの解析が全体的な知見と一致することから、依然として妥当性がある。

世界的なワクチン接種の努力によりSARS-CoV-2ウイルスの蔓延は抑えられたが、それでも過去1ヵ月以内に260万人の新規患者が発生したと報告されており1、ワクチン接種による疾病予防が公衆衛生にとって依然として重要であることを強調している。アルコール摂取、肉類の摂取、一般的に使用される薬剤など、一般的な生活因子が微生物叢に与える測定可能な影響を考慮すると49、我々の研究では、ワクチン接種が微生物叢を介する過程に与える影響は、あったとしてもごくわずかであることがわかった。COVID-19感染でマイクロバイオームが大きく変化することが報告されていることを考慮すると、この対照はさらに鮮明である10。今回の知見は、腸内細菌叢がワクチン接種後も安定していることを示しており、ワクチン摂取の促進に向けてさらなる安心感を与えるものである。

データの利用可能性
シーケンスデータはEuropean Genome-phenome Archiveにアップロードされ、コードはGitHub: https://github.com/RHBoston/COVID-19_Vaccination_GM。

著者情報
コンソーシアム CITIID-NIHR COVID-19 BioResource Collaboration
Juan Carlos Yam-Puc、Zhaleh Hosseini、Emily C. Horner、Nonantzin Beristain-Covarrubias、Robert Hughes、Maria Rust、Rebecca H. Boston、Lucy H. Booth、Edward Simmons-Rosello、Magda Ali、Anne Elmer、Caroline Saunders、Areti Bermperi、Sherly Jose、Nathalie Kingston、Thomas E. Mulroney、Sarah Spencer、Nicholas J. Matheson & James E. D. Thaventhiran。

貢献
R.H.B.は試料採取を行い、データ解析と結果の解釈を行った。

R.G.、S.B.、L.K.はデータ解析と結果の解釈を行った。E.C.H.、N.B-C.、J.C.Y-C.、P.P.G.、L.F.、A.K.、A.E.L.、S.B.は、試料採取と実験的アッセイを行い、技術的サポートを行った。A.C.-N.、A.E.、C.S.、A.B.、S.J.、N.K.、S.G.、E.S.は、本試験の参加者のリクルートとサンプル収集を行った。M.S.B.、C.P.、S.L.、N.J.M.、J.E.D.T.は、参加者の募集、試料採取、実験の監督を行った。V.B.は技術的サポートを提供した。R.H.B.、R.G.、J.E.D.T.、K.R.P.は図の作成と原稿の執筆を行った。R.H.B.、J.E.D.T.、K.R.P.は本研究を計画・監督した。J.E.D.T.とK.R.P.は同等に貢献した。

競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

資金提供宣言
本研究は、英国医学研究評議会（プロジェクト番号MC_UU_00025/11およびMC_UU_00025/12）から資金提供を受けた。

謝辞
患者のリクルートとサンプル採取に協力してくれたアデンブルークス病院の臨床スタッフ、サンプル処理に協力してくれたTaventhiranおよびPatil研究室のメンバーに感謝する。

参考文献
1.↵WHOコロナウイルス（COVID-19）ダッシュボード https://covid19.who.int.Google Scholar
2.↵Lind, M. L. et al. 収監者集団におけるCOVID-19ワクチン接種とSARS-CoV-2感染後の漏出防御の証拠。Nat. Commun. 14, 5055 (2023).Google Scholar
3.ȕJennings, W. et al. COVID-19パンデミック時の信頼とワクチン接種のためらい： クロスナショナル分析。ワクチンX 14, 100299 (2023).Google Scholar
SARS-CoV-2ワクチンに対する免疫反応。Biomedicines 10, 1464 (2022).Google Scholar
5.ȕBergamaschi, C. et al. BNT162b2 mRNAワクチン接種者におけるSARS-CoV-2に対する有効な免疫応答と関連する全身性IL-15、IFN-γ、IP-10/CXCL10シグネチャー。Cell Rep. 36, 109504 (2021).CrossRefGoogle Scholar
6.↵Nava, P. et al. インターフェロンγは、β-カテニンシグナル伝達経路の収束を通じて腸上皮の恒常性を制御する。Immunity 32, 392-402 (2010).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
7.Pagliari, D. et al. 消化管疾患におけるIL-15の役割：自然免疫応答と適応免疫応答の架け橋。Cytokine Growth Factor Rev. 24, 455-466 (2013).CrossRefPubMedGoogle Scholar
8.↵Wu, S. et al.インターロイキン-6の欠失は、マウスにおける腸内細菌叢異常と粘膜免疫を誘発する。Cytokine 153, 155841 (2022).Google Scholar
9.↵Röltgen, K. et al. ヒトSARS-CoV-2感染およびワクチン接種における免疫刷り込み、変異体認識の幅、胚中心反応。Cell 185, 1025-1040.e14 (2022).Google Scholar
10.↵Rocchi, G. et al. 腸内細菌叢とCOVID-19： 疾患の重症度に対する潜在的影響。Pathogens 11, (2022).Google Scholar
11.↵Leung, J. S. M. 腸内細菌叢とCOVID-19およびそのワクチンの相互作用。World J. Gastroenterol. 28, 5801-5806 (2022).Google Scholar
12.↵Ng, S. C. et al. 腸内細菌叢組成はSARS-CoV-2ワクチンの免疫原性および有害事象と関連している。Gut 71, 1106-1116 (2022).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
13.ȕAlexander, J. L. et al.腸内細菌叢とメタボロームは、免疫抑制炎症性腸疾患患者におけるCOVID-19ワクチン誘発抗体応答の低下と関連している。EBioMedicine 88, 104430 (2023).Google Scholar
14.↵Hirota, M. et al. COVID-19 mRNAワクチン誘発免疫の個人差に関連するヒト免疫および腸内微生物パラメータ。Commun. Biol. 6, 368 (2023).Google Scholar
15.↵Cantu, V. A., Sadural, J. & Edwards, R. PRINSEQ++, a multi-threaded tool for fast and efficient quality control and preprocessing of sequencing datasets. PeerJ (2019) doi:10.7287/peerj.preprints.27553.CrossRefGoogle Scholar
16.↵Langmead, B. & Salzberg, S. L. Bowtie 2による高速ギャップドリードアライメント。Nat. このような研究手法は、研究者、研究者間の情報交換の場として有用である。
17.↵Ruscheweyh, H.-J. et al. 培養に依存しないゲノムは、様々な環境における微生物群の分類学的プロファイリング能力を大幅に拡張する。Microbiome 10, 212 (2022).CrossRefGoogle Scholar
18.↵Nurk, S., Meleshko, D., Korobeynikov, A. & Pevzner, P. A. metaSPAdes: a new versatile metagenomic assembler. Genome Res. 27, 824-834 (2017).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
19.ȕCantalapiedra, C. P., Hernández-Plaza, A., Letunic, I., Bork, P. & Huerta-Cepas, J. eggNOG-mapper v2： メタゲノム規模での機能アノテーション、オルソロジーアサインメント、ドメイン予測。Mol. Biol. Evol. 38, 5825-5829 (2021).CrossRefGoogle Scholar
20.ȕBuchfink, B., Xie, C. & Huson, D. H. DIAMONDを用いた高速で高感度なタンパク質アライメント。Nat. Methods 12, 59-60 (2015).CrossRefPubMedGoogle Scholar
21.↵McMurdie, P. J. & Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS One 8, e61217 (2013).CrossRefPubMedGoogle Scholar
22.↵Microbiome@GitHub. http://microbiome.github.io.Google Scholar
23.↵vegan： 群集生態学者のためのRパッケージ：一般的な順序付け法、生態学的ヌルモデル、多様性分析。(Github).Google Scholar
24.↵Love, M. I., Huber, W. & Anders, S. DESeq2によるRNA-seqデータのフォールド変化と分散のモデレート推定。Genome Biol. 15, 550 (2014).CrossRefPubMedGoogle Scholar
25.↵Gerber, P. P. et al. 本物のSARS-CoV-2感染のためのプロテアーゼ活性化可能な発光バイオセンサーとレポーター細胞株。PLoS Pathog. 18, e1010265 (2022).CrossRefGoogle Scholar
26.ȕXiong, X. et al. 耐熱性閉鎖型SARS-CoV-2スパイクタンパク質三量体。Nat. Struct. Mol. Biol. 27, 934-941 (2020).Google Scholar
27.↵Collier, D. A. et al. SARS-CoV-2ワクチンBNT162b2に対する年齢に関連した免疫応答の不均一性。Nature 596, 417-422 (2021).PubMedGoogle Scholar
28.ȕBates, D., Mächler, M., Bolker, B. & Walker, S. Fitting linear mixed-effects models Usinglme4. J. Stat. Softw. 67, (2015).Google Scholar
29.↵Islam, M. Z. et al. 自己免疫疾患とがんを区別する再現性と相反する腸内マイクロバイオームシグネチャー：システマティックレビューとメタアナリシス。Microbiome 10, 218 (2022).Google Scholar
30.↵Polk, D. B. & Peek, R. M., Jr. ヘリコバクター・ピロリ：胃癌とその先。Nat. Cancer 10, 403-414 (2010).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
31.↵Aoun, A., Darwish, F. & Hamod, N. 成人の肥満に対する腸内マイクロバイオームの影響と、減量のためのプロバイオティクス、プレバイオティクス、シンバイオティクスの役割。Prev. Nutr. Food Sci. 25, 113-123 (2020).PubMedGoogle Scholar
32.↵Shi, Z. et al. がん免疫療法における腸内細菌叢の新たな役割。Front. Immunol. 14, 1139821 (2023).Google Scholar
33.ȕBairamian, D. et al. 神経炎症とシナプス機能障害における微生物叢：アルツハイマー病に焦点を当てて。Mol. Neurodegener. 17, 19 (2022).Google Scholar
34.ȕQiu, P. et al. 炎症性腸疾患における腸内細菌叢。Front. Cell. Infect. Microbiol. 12, 733992 (2022).Google Scholar
35.ȕJohnson, A. J. et al. Daily sampling reveals personalized diet-microbiome associations in humans. Cell Host Microbe 25, 789-802.e5 (2019).CrossRefPubMedGoogle Scholar
36.Hasan, N. & Yang, H. Factors affecting the composition of the gut microbiota, and its modulation. PeerJ 7, e7502 (2019).CrossRefGoogle Scholar
37.Vujkovic-Cvijin, I. et al. Host variables confound gut microbiota studies of human disease. Nature 587, 448-454 (2020).PubMedGoogle Scholar
38.↵クリルシコフ（Kurilshikov, A.）ら、ヒト腸内細菌叢組成に影響を及ぼす宿主因子を特定する大規模関連解析。Nat. Genet. 53, 156-165 (2021).CrossRefGoogle Scholar
39.↵Castagnoli, R. et al. 先天性免疫異常における腸内細菌-宿主相互作用。Int. J. Mol. Sci. 22, 1416 (2021).Google Scholar
40.↵Ho, H.-E., Radigan, L., Bongers, G., El-Shamy, A. & Cunningham-Rundles, C. Circulating bioactive bacteria DNA is associated with immune activation and complications in common variable immunodeficiency. JCI Insight 6, (2021).Google Scholar
41.↵Routy, B. et al. 腸内細菌叢は、上皮性腫瘍に対するPD-1に基づく免疫療法の有効性に影響を及ぼす。Science 359, 91-97 (2018).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
42.Matson,V.ら、常在細菌叢は転移性黒色腫患者における抗PD-1有効性と関連している。Science 359, 104-108 (2018).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
43.ȕFrankel, A. E. et al. Metagenomic shotgun sequencing and unbiased metabolomic profiling identify specific human gut Microbiota and metabolites associated with immune checkpoint therapy efficacy in melanoma patients. Neoplasia 19, 848-855 (2017).CrossRefPubMedGoogle Scholar
44.ȕDerosa, L. et al. 腸内細菌組成は、腎細胞がん患者におけるがん免疫療法に対する一次抵抗性を駆動する。Eur. Urol. 78, 195-206 (2020).CrossRefPubMedGoogle Scholar
45.↵Salgia, N. J. et al.抗PD-1免疫チェックポイント阻害薬を投与された転移性腎細胞癌患者の便中マイクロバイオームプロファイリング。Eur. Urol. 78, 498-502 (2020).PubMedGoogle Scholar
46.↵Yang, Q. et al. 腫瘍の進行とがん治療における腸内細菌叢由来の代謝産物に関する総説。Google Scholar。
47.↵Maier, L. et al. ヒト腸内細菌に対する非抗生薬の広範な影響。Nature 555, 623-628 (2018).CrossRefPubMedGoogle Scholar
48.↵Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M. & Spitzer, M. H. Systemic immunity in cancer. Nat. Cancer 21, 345-359 (2021).CrossRefPubMedGoogle Scholar
49.↵Lindell, A. E., Zimmermann-Kogadeeva, M. & Patil, K. R. 薬物、天然化合物、汚染物質と腸内細菌叢とのマルチモーダル相互作用。Nat. Rev. Microbiol. (2022) doi:10.1038/s41579-022-00681-5.CrossRefGoogle Scholar
トップへ戻る
前へ 次へ
2023年12月04日掲載
PDFダウンロード
印刷/保存オプション
補足資料

リビジョンサマリー

Eメール
共有
引用ツール

COVID-19 SARS-CoV-2プレプリント（medRxivおよびbioRxivより
主題領域
微生物学
対象分野
すべての記事
動物の行動と認知
生化学
生物工学
生物情報学
生物物理学
癌生物学
細胞生物学
臨床試験
発生生物学
生態学
疫学
進化生物学
遺伝学
ゲノミクス
免疫学
微生物学
分子生物学
神経科学
古生物学
病理学
薬理学と毒性学
生理学
植物生物学
科学コミュニケーションと教育
合成生物学
システム生物学
動物学

• bioRxiv の臨床研究パイロットプロジェクトが終了し、健康科学専用サーバー medRxiv (submit.medrxiv.org)が開設されたことに伴い、Clinical Trials と Epidemiology のサブジェクトカテゴリーは新規投稿を締め切りました。臨床試験の結果を報告する新規論文は、medRxivへの投稿が必須となりました。ほとんどの疫学論文もmedRxivに投稿されるべきですが、もし論文に健康に関する情報が含まれていない場合、著者は他のbioRxivの主題カテゴリー（例えば、遺伝学や微生物学）に投稿することもできます。

コンテキストと評価 x

0 0 0 0 0 0 28