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広範な植物病原性菌に対して生物活性を示すPantoea agglomerans根粒菌におけるハービコリンAの生産とクオラムセンシングによるその制御


広範な植物病原性菌に対して生物活性を示すPantoea agglomerans根粒菌におけるハービコリンAの生産とクオラムセンシングによるその制御
ミゲル・A・マティラ、テリー・J・エバンス、ヘスス・マルティン、ズレマ・ウダンド、クリスティーナ・ロマス=マルティネス、ミリアム・リコ=ジメネス、フェルナンド・レイエス、ジョージ・P・C・サルモン
初出:2022年12月18日
https://doi.org/10.1111/1751-7915.14193
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概要
世界的な人口増加により、農業生産物の収量を増加させることが必要となっている。しかし、気候変動の影響や植物病原菌による病気は、現代農業の課題となっている。そのため、化学肥料や農薬を過剰に使用することのないよう、代替策を検討する必要がある。植物微生物相は、植物の栄養と健康に不可欠な役割を担っており、農業の将来の課題に対応するための大きな可能性を持っています。このような背景から、我々は根圏細菌 Pantoea agglomerans 9Rz4 株が幅広い植物病原真菌に対して活性を示すことを明らかにした。化学分析の結果、9Rz4株は抗真菌剤herbicolin Aを生産し、その生合成遺伝子群を同定し、その特性を明らかにした。また、9Rz4株の唯一のアシルホモセリンラクトンに基づくクオラムセンシングシステムが、herbicolin A遺伝子群の発現を調節していることを明らかにした。ヘルビコリンAの生産におけるプラスミドキャリッジの役割は観察されなかった。植物アッセイにより、ヘルビコリンAの生合成はP. agglomerans 9Rz4の根のコロニー形成能に影響を与えないことが明らかとなった。現在、農業における化学農薬の使用削減が法制化されているが、本研究で得られた結果は、根圏微生物を利用した新たな生物農薬の開発への礎となる可能性がある。

はじめに
植物マイクロバイオームは、植物宿主に関連する微生物のコミュニティと定義され(Cordovezら、2019)、植物の成長と植物病原体に対する保護に不可欠な役割を果たす(Trivediら、2020)。したがって、植物は植物宿主とそれに付随する微生物相からなるホロビオントと考えられている(Bakker et al.) この相互作用は非常に動的であり、シグナル伝達分子の複雑なネットワークが関与している(Berlanga-Clavero et al.) 実際、植物は、異なる生物的・非生物的ストレスに対抗するために、特定の微生物や微生物の機能を選択し、例えば、栄養獲得や病害抵抗性を向上させることが示されている(Bakker et al.、2020;Trivedi et al.、2020)。助けを求める叫び」仮説は、植物がストレスに対処するために、植物病原菌からの保護を含め、有益な微生物を積極的に勧誘するという考え方を支持している(Rizaludin et al.、2021)。例えば、テンサイ植物が真菌の植物病原体Rhizoctonia solaniに感染すると、特定の内生微生物をリクルートすることが示された(Carriónら、2019年)。

保護的な植物マイクロバイオームは、二次代謝産物の生合成のための遺伝子クラスターの存在と関連付けられてきた。植物のエンドスフェアの比較メタゲノム解析により、病害抑制土壌で生育した植物のエンドファイトでは、病害伝導性土壌で生育した植物と比較して二次代謝産物生合成クラスターが豊富であることが明らかになっている(Carrión et al.、2019年)。さらに、ポプラの根のマイクロバイオームにおいて、二次代謝産物生産の遺伝的可能性が分析され、多様な天然物遺伝子クラスターの同定につながりました(Blair et al.、2018年)。さらに、ゲノムマイニングアプローチは、細菌性フィロスフィア単離株における強力な二次生合成の可能性も強調した(Helfrichら、2018)。このような研究は、新しい生物活性化合物の同定と単離のための植物マイクロバイオームの巨大な可能性を明らかにしています。

ポリケチド(PK)および非リボソームペプチド(NRP)は、二次代謝産物の最大かつ最も多様なファミリーのうちの2つである。これらの代謝物は、それぞれポリケチド合成酵素(PKS)と非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)によって、マロニルCoAとアミノ酸拡張ユニットの連続的なラウンド縮合によって合成される(Little & Hertweck, 2022)。PKとNRPは、抗菌、抗真菌、抗ウイルス、除草、免疫抑制、抗癌などの幅広い生物活性を有しています(Little & Hertweck, 2022; Sussmuth & Mainz, 2017)。この生物活性の多様性は、様々なテーラーリング酵素(ハロゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、オキシダーゼ、グリコシラーゼなど)によってPKやNRPの骨格に行われる化学修飾に多く存在する(Little & Hertweck, 2022; Sundaram & Hertweck, 2016; Sussmuth & Mainz, 2017)。

ゲノムマイニングのアプローチでは、細菌の二次生合成能の約3%しか実験的に評価されておらず(Gavriilidou et al., 2022)、植物と共生するものを含む腸内細菌は、生合成能が最も高い分類群に含まれる(Gavriilidou et al., 2022; Mohite et al., 2022)。PKSおよびNRPS遺伝子クラスターは、植物関連細菌において最も豊富な二次代謝産物遺伝子クラスターの中に見出された(Blair et al., 2018; Carrión et al., 2019; Helfrich et al., 2018)。植物関連腸内細菌が産生する生理活性PKおよびNRPの例としては、抗真菌および抗真菌ポリケチド、オサイジンA(Matillaら、2012)、非リボソームペプチド-ポリケチドのハイブリッド抗菌剤、アンドリミド(Matillaら、, 2016)、セラタミド(Nguyen et al., 2021)、ソラニマイシン(Matilla et al., 2022)、ハイブリッド型非リボソームペプチド-ポリケチド毒素、ゼアミン(Hellberg et al., 2015)である。

農業に関連する様々な植物の根圏生物に関する以前の研究は、植物病原真菌Verticillium dahliaeの成長を阻害する能力を有する多様な腸内細菌種を同定することにつながった(Bergら、2002年)。5800を超える根圏分離株の中で、ナタネ根圏細菌Pantoea agglomerans 9Rz4は、真菌の成長に最も効果的に拮抗する細菌分離株の一つであり、Rhizoctonia solaniおよびSclerotinia sclerotiorumに対しても高い生物活性を持っていた (Berg et al.、2002).また、この細菌は、植物病原性真菌Verticillium dahliaeに対して、高い生物活性を持っていた。本研究では、遺伝学的、ゲノム学的、分析化学的アプローチを組み合わせることにより、9Rz4株の真菌拮抗メカニズムを明らかにすることができた。抗真菌性生合成遺伝子群を同定し、この抗真菌性抗生物質の生産調節におけるクオラムセンシングとプラスミドキャリッジの役割も探求した。

結果および考察
Pantoea agglomerans 9Rz4 の非生合成変異体の単離
未知の抗真菌性抗生物質の生合成に関与する遺伝子を同定するために、トランスポゾンTn-KRCPN1(Monsonら、2015)を用いたランダム変異誘発アプローチを、P. agglomerans 9Rz4変異体ライブラリーを生成する戦略として採用した。9Rz4株は遺伝学的に扱いやすいことが証明され、デュアルプレートバイオアッセイで約2500のランダムトランスポゾン変異体の表現型特性を明らかにした結果、V. dahliaeに対する拮抗活性が欠損した7つの独立したトランスポゾン変異体(非生物活性(NB)株NB1、NB7、NB9、NB13、NB14、NB15およびNB18)を分離した(Fig. 1A)。抗真菌活性の喪失が単一挿入によるものであることを確認するため、鞭毛依存性一般化導入ファージφOT8 (Evans et al., 2010) を用いて、トランスポゾン挿入物を野生型株9Rz4に戻すように導入した。本研究で使用した細菌、菌類、ファージおよびプラスミドを表S1に示す。得られた形質転換体はすべて親変異体と同じ表現型を示したことから、個々の挿入によりV. dahliaeに対する生物活性が失われていることが確認された。トランスポゾンの挿入位置を特定するために、以前に記載した方法(Monson et al.、2015)および表S1に詳述したオリゴヌクレオチドを用いてランダムプライミングPCRを行った。挿入部はNRPSをコードするいくつかの遺伝子にマッピングされ、BLAST解析によりNCBIデータベースで利用可能な配列との相同性が低いことが判明した-未特定の抗真菌生合成遺伝子群を示唆している。


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図1
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9Rz4が産生する抗真菌性抗生物質Herbicolin A
9Rz4 が合成する抗真菌性化合物を同定するために、野生型細菌とその抗真菌活性を欠損した数種の変異体を、最小培地 (Matilla et al., 2012), ライソジェニーブロス (LB), ポテトデキストロースブロス (Strobel medium [Strobel et al., 1999] 等), YEブロス等の異なる培地で培養を行った。その後、無細胞上清のin vitro抗真菌活性を評価するために、二重培養バイオアッセイを実施した。野生型株では、LB、YE、およびグルコースを唯一の炭素源とする最小限の培地で培養した場合に、最も高い抗真菌活性が認められた(図S1)。試験したいずれのNB変異体の上清にも抗真菌活性は検出されなかった(Figure S1)。続いて、P. agglomerans 9Rz4野生型株の培養上清、ならびに非生化学活性変異体NB1、NB7およびNB9の培養上清を、Bruker maXis質量分析計に接続したAgilent 1200 Rapid Resolution HPLCを用いて、以前に記載した条件により液体クロマトグラフィー-高分解能質量分析(LC-HRMS)により分析した(Martín et al.,2014)。1つの差分代謝物であるherbicolin Aは、C58H101N13O20の分子式と一致する、m/z 650.8721 ([M + 2H]2+, Calcd 650.8716) および 659.3861 ([M + H + NH4]2+, Calcd 659.3848) のHRMSにイオンがあるピークの存在に基づいて野生型で確認したがNB1、NB7およびNB9上清では確認しなかった(図2A,B)。また、ハーボシリンAの生合成の際に脱グリコシル化中間体として同定された構造的に関連するハーボシリンB(Xu et al, 2022)、分子式C52H91N13O15に対応するm/z 569.8458 ([M + 2H]2+, Calcd. 569.8452) および578.3595 ([M + H + NH4]2+, Calcd 659.578.3584) (Figure 2A,C) にHRMSピークの存在から野生型でも痕跡レベルで検出したがNB突然変異体では検出されず、このことから、この突然変異体は、分子式が、HRMSピークを持つことが明らかとなっている。ハービコリンAおよびB(図2D)は、生物制御細菌P. vagans C9-1によって生産されるハービコリンI(ダプジアミドとも呼ばれる)として知られる別の抗生物質とは異なるものである。Herbicolin Iは、植物病原菌Erwinia amylovoraに対して抗菌活性を有し(Andersonら、2004)、化学式はC12H21N4O6である(Kamberら、2012)。


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図2
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ハービコリンAおよびBは、ステロール含有菌に対する抗真菌活性により、1980年代にErwinia herbicola(現在はPantoea agglomeransとして再分類)から単離された(Winkelmannら、1980)。herbicolin I (Anderson et al., 2004) とは対照的に、herbicolins AおよびBには抗菌活性が検出されなかった (Winkelmann et al., 1980)。その後の研究により、ハービコリンAはマイコプラズマ、ウレアプラズマ、アコレプラズマ細胞に対しても活性を示すことが明らかになった(Birkelund et al.、1986)。

ヘルビコリンA生合成遺伝子群の同定
ハービコリンAおよびBは40年以上前に同定されたが(Winkelmannら、1980)、これらの研究が始まった当初は、対応する遺伝子群およびその生合成経路についての報告はなかった。しかし、それらの構造は、他の細菌のリポペプチドの構造(Baltz, 2014; Girard et al., 2020)と同様に、非リボソームペプチド合成酵素型の起源からの生合成が示唆されている。細菌Erwinia herbicola CHS1065に関する以前の研究は、ヘルビコリンA合成の遺伝的可能性と配列不明の170kbプラスミドpHER1065(Tenningら、1993)の保有を相関させている。

P. agglomerans 9Rz4のherbicolin A生産に関わる生合成遺伝子群を同定し、その特性を明らかにするために、MicrobesNG®によるゲノム解読を行った。この手法では、高品質のフルゲノムを得るためにIllumina short readsとOxford Nanopore technologies sequencing (long reads) を組み合わせたエンハンスドアプローチを採用している。イルミナシーケンスでは、106×のシーケンス深度で1,088,798のペアエンドショートリードを生成し、一方、Oxford Nanoporeシーケンスライブラリは、400-500 ngの高分子量DNAを用いてSQK-RBK004キットとSQK-LSK109キット with Native Barcoding EXP-NBD104/114 (ONT, United Kingdom) を使用して調製しました。Oxford Nanoporeでバーコードしたサンプルを1つのシーケンスライブラリにプールし、GridION (ONT, United Kingdom)のFLO-MIN106 (R.9.4.1) フローセルにロードし、合計6875リード、平均長10526kb、シーケンスごとの平均品質スコアQ19を生成しました。ショートリードは、Q15のスライディングウィンドウ品質カットオフ(Bolgerら、2014)でTrimomatic 0.30を使用してアダプタートリミングされ、Unicycler v0.4.0(Wick ら、2017)を使用してハイブリッドゲノムアセンブリが実行された。強化されたアセンブリの結果、1000 bpより大きいコンティグが11個得られた。最大のコンティグは3,899,485 bpであった。9Rz4のゲノムは、1つの染色体と、536,203 kb (p9Rz4_1), 177,238 kb (p9Rz4_2), 142,672 kb (p9Rz4_3), 59,924 kb (p9Rz4_4) サイズの4つのプラスミドを含む(P. agglomerans 9Rz4のGenBankアクセッション番号: JANHBZ00000000000)。プラスミドp9Rz4_1およびp9Rz4_2は、それぞれPantoea agglomerans L15由来のプラスミドpPagL15_1 (GenBank: NZ_CP034149.1) およびpPagL15_2 (GenBank: NZ_CP034150.1) に高い相同性を有している。しかし、p9Rz4_3およびp9Rz4_4は、NCBIデータベース(NCBI Resource Coordinators, 2016)に寄託された他のプラスミドと低い配列相同性を示した。

9Rz4のゲノムを利用できるため、すべてのTn-KRCPN1トランスポゾン挿入をp9Rz4_3プラスミドに位置する38.6 kb未特定NRPS遺伝子群に容易にマッピングすることができた(図1B)。非常に類似した〜38kbの生合成遺伝子クラスター(63.5%同一)が、エンドウアブラムシAcyrthosiphon pisumから分離した細菌、Candidatus Fukatsuia symbiotica 5D (Patel et al., 2019) のプラスミドp5Dで同定された。その結果、この相同性に基づいてP. agglomerans 9Rz4のherbicolin A遺伝子群の上流端と下流端を割り出した。

9Rz4のヘルビコリンA生合成クラスターは、hbcAからhbcKと名付けられた11の遺伝子からなり、5つの多機能NRPS(HbcA、HbcB、HbcD、HbcE、HbcK)をコードしている。HbcA, HbcB, HbcE, HbcI)をコードする11の遺伝子で、9つの縮合(C)、9つのAMP結合(A)、9つのチオ化(T)、3のエピマー化(E)、1のメチル転移(MT)、1のチオエステラーゼ(TE)ドメインを含む(図1B)。フリースタンディングチオール化タンパク質(HbcC)が同定された。ヘルビコリンAクラスターは、酸化還元酵素(HbcF)、糖転移酵素(HbcJ)、ヒドロラーゼ(HbcK)もコードしている(図1B)。生合成遺伝子群には、ヘルビコリンAとBの細胞外への押し出しに関与すると考えられるトランスポーター(HbcH)がコードされていた(図1B)。また、MbtH様タンパク質(HbcG)も同定された。MbtHタンパク質は小さく、その機能はまだ不明であるが、NRPSのアデニル化ドメインと相互作用してアミノ酸の活性化を調節することが示されている(Bernhardt et al, 2020; Felnagle et al, 2010)。

この論文の起草中に、Fusarium graminearumによって形成された腹膜から分離された細菌であるPantoea agglomerans ZJU23のヘルビコリンAの生産を担う遺伝子群の配列が明らかになった(Xu et al.、2022年)。この遺伝子群は、9Rz4のherbicolin Aクラスタと高い相同性(91.5%の同一性)を持ち、171 kbのプラスミド上に存在する。しかし、両クラスターにはいくつかの相違点が見出された。(i) ZJU13は10個のオープンリーディングフレーム(acbA〜acbJと命名)からなるのに対し、9Rz4の相同クラスターは前述のように11個のORFを持つ。(ii) ZJU13ハービコリンAクラスターのNRPSコード遺伝子acbA、acbBは9Rz4ではhbcA、hbcBおよびhbcCという3遺伝子に分割されている。9Rz4とZJU23のヘルビコリンA遺伝子群の連続した生合成タンパク質間では、同じドメイン配置が観察されたが(図1B)(Xu et al. , 2022).

興味深いことに、9Rz4のヘルビコリンA遺伝子クラスターを境にして、トランスポーザーの残骸が確認され、この生合成クラスターが水平遺伝子移動によって獲得されたことが示唆された。この仮説を支持するいくつかの追加的な観察結果:(i)9Rz4のヘルビコリンAクラスターのG+C含有率(59.5%)は、それが局在するプラスミド、p9Rz4_3のG+C含有率(48.9%)よりかなり高い、(ii)ヘルビコリンA生合成クラスターは系統的に離れた細菌、すなわちPantoea属とカンジダ属Fukatsuiaに属する株で存在している(Patel et al, 2019).

以前の研究では、77 kbのオーシジンA遺伝子クラスターを完全に高い頻度でトランスダクションにより動員することができた(Matilla & Salmond, 2014)。高効率の一般化したトランスダクションファージφOT8は、上述のように9Rz4を含むSerratiaおよびPantoea種に感染し(Evans et al., 2010)、このファージおよび関連ファージが、ハーバコリンA遺伝子群の属内および属間拡散の経路となり得るという見解と一致している。

Herbicolin Aは幅広い種類の植物病原真菌に対して活性を示し、その生産はP. agglomerans 9Rz4による根のコロニー形成に影響を与えない。
我々は、野生型 9Rz4 とハービコリン A の生合成に欠損を持つ変異体の 26 種類の植物病原真菌および菌類に対する生物活性を、二重 板培養バイオアッセイを用いて分析した。その結果、Helminthosporium sativum、Pyrenophora graminae、Cladosporium sp.を含む試験した植物病原菌の68%に対してherbicolin Aが活性を示した。Mycosphaerella graminícola, Phialophora fastigiata, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Colletotrichum coccodes, Fusarium culmorum, Verticillium chlamydosporum, Botrytis allii, Botrytis cinerea, Botrytis fabae, Monilinia fructigena, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis and Rhizoctonia tuliparum (Figure 3) - これらは世界の植物病理学における上位10位に入る病原体も含まれています (Dean et al.参照)。2012). Pythium ultimum, Rhizoctonia oryzae, Armillaria mellea, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Penicillium crustosum, Chaetomium globosumに対する生物活性は検出されなかった(not shown)。また、herbicolin Aは子嚢菌酵母Schizosaccharomyces pombeに対しても活性があることが確認された(図3)。以前の研究では、ヘルビコリンAはヒトの真菌病原体であるCandida albicansに対しても活性があることが示されている(Winkelmannら、1980)。ハービコリンAは最近、エルゴステロールを含む脂質ラフトを標的として、真菌細胞の細胞膜を破壊することが示された(Xuら、2022年)。エルゴステロールは真菌膜で最も一般的なステロールであり(Rodrigues、2018)、これはヘルビコリンAの広い作用スペクトルと一致する(図3)。このデータを裏付けるように、真菌類はステロールオーソトロフィーであり(Wang et al., 2021)、これが、ハービコリンAがP. ultimumに対して活性がないことを観察した理由であると思われます。


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図3
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ヘルビコリンAの抗真菌活性をさらに調べるため、野生型9Rz4とヘルビコリンA産生不全のNB1変異体(図2)の上清を、指数関数的に増殖するS. pombe培養物に添加した。野生型上清を添加してから 30 分後に、S. pombe の生細胞数が NB1 上清を添加したときと比較して 10 倍に減少した(図 4A)。また、野生型上清を添加してから2.5時間後には、生細胞は検出されなかった(図4A)。これらの死細胞を顕微鏡で観察したところ、不規則な細胞境界やストレス顆粒の形成など、さまざまな形態変化が認められた(図4B)。


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図4
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これまでのデータから、ヘルビコリンAは植物の葉や果実において毒性作用を示さないことが示され、ヘルビコリンA生産菌が真菌性病原体から植物を保護することが示された(Xuら、2022年)。複数のP. agglomerans株が広範囲の植物病原体から植物を保護することが示され、いくつかのP. agglomerans分離株は生物農薬として市販されている(Dutkiewiczら、2016;Lahlaliら、2020;Xuら、2022)。9Rz4が植物の成長に及ぼす悪影響を排除するため、トウモロコシの根の結球アッセイを行い、接種10日後に接種したトウモロコシと非接種トウモロコシのフィットネスを比較した。その結果、地上部の大きさや根の重量に処理間で統計的に有意な差は認められず(図 S2A、B)、9Rz4 を根圏生物防除剤として安全に使用するための最初の土台を築くことができた。その後、植物根のコロニー形成におけるヘルビコリンA産生の意味を評価するため、野生型9Rz4とヘルビコリンA欠損株NB1を用いた追加の根のコロニー形成アッセイを実施した。このことは、抗真菌性代謝物の生合成が9Rz4の根圏での適応性に影響を与えないことを示している(図S2C)。

プラスミドキャリッジは抗真菌剤生産に影響を与えない
9Rz4 のゲノム解析により、本菌株の黄色色素はカロテノイドの生産に関連することがわかった。カロテノイドの生産を担う生合成クラスターが p9Rz4_1 プラスミドに存在するためである。カロテノイドの生産は、Pantoea属の他の株でも報告されており、その多くは対応する生合成クラスターをプラスミド上に持っている(Choi et al.、2021;Smits et al.、2010)。二次代謝産物の生合成はエネルギーを必要とし(Krell & Matilla, 2022; Liu et al., 2013)、プラスミドの保有は細菌宿主にエネルギーコストをもたらす可能性がある(Trautwein et al., 2016; Vial & Hommais, 2020)。実際、いくつかの研究では、プラスミド負荷が二次代謝産物の生合成に影響を及ぼすことが報告されている(Thomas et al.、1991)。ヘルビコリンAの生産におけるプラスミドキャリッジの役割を調べるために、以前に記載したプラスミドキュレーションプロトコルを用いて、9Rz4の非着色変異体である9Rz4-W株を作製した(図S3)。この色素欠乏は、PCR スクリーニングにより、9Rz4 のカロテノイド生合成遺伝子群を含む p9Rz4_1 プラスミドが欠損していることに起因することがわかった。この株 9Rz4-W は V. dahliae に対して野生株と同様の抗真菌性を示し(図 S3)、p9Rz4_1 にはハー ビコリン A 産生を調節するような制御因子は存在しないことが示唆された。

クオラムセンシングによるherbicolin A 産生の調節
ハービコリンA遺伝子群の発現を調べるために、hbcB遺伝子に位置する染色体転写融合体を使用した(NB1株)。β-ガラクトシダーゼアッセイにより、この遺伝子群の転写は生育初期指数関数期で始まり、生育初期定常期に最大発現することが明らかになった(図5A)。また、成長曲線全体を通してのヘルビコリンA産生の解析から、生合成クラスターの発現は、無細胞上清中の抗真菌性抗生物質の存在と完全に相関していることがわかった(図5B)。


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図5
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ヘルビコリンA遺伝子群の発現パターンから、抗真菌性抗生物質の生産調節にクオラムセンシング(QS)が関与している可能性が示唆された。P. agglomerans 9Rz4のゲノム配列の解析から、単一のQS遺伝子座PagIRの存在が明らかになった。そのアシルホモセリンラクトン(AHL)合成酵素PagIは、以前からメジャーおよびマイナーQSシグナルとしてそれぞれN-ブタノイルL-ホモセリンラクトン(C4-HSL)およびN-ヘキサノイルL-ホモセリンラクトン(C6-HSL)の生産と関連していた (Chalupowicz et al., 2008)。QSが腸内細菌の複数の抗生物質の生産を制御することが示されていることから、我々は9Rz4におけるヘルビコリンAの生合成の調節におけるQSの役割の可能性を検討した(Matilla et al.、2015)、プロジジオシン(Williamson et al.、2006)、カルバペネム(Coulthurst et al. この目的のため、Serratia SP19 バイオセンサー株を用いて、9Rz4 のランダムトランスポゾン変異体ライブラリーをスクリーニングし、AHL 産生に欠損を持つ変異体を探索した (Poulter et al., 2010)。AHLの産生に欠損を持つpagI変異体(図6A)が単離され、その表現型の特徴から、野生型株と比較してpagI変異体のフィルター滅菌上清を用いたS. pombeに対する生物活性がわずかに低下していることが判明した(図6A)。その後、上清をLC-HRMSで測定したところ、pagI変異株では親株に比べ、ヘルビコリンAおよびBレベルがそれぞれ2.5 ± 0.4 倍および2.6 ± 0.4 倍減少した(図6Bおよび図S4)。pagI変異体におけるヘルビコリンAおよびBの生産は、NB1変異体(例えば、アシルホモセリンラクトン生産者;ヘルビコリンA欠損)の上清を添加すると完全に回復したが、pagI変異体の上清を添加すると回復しなかった;S. pombeに対する抗生物質アッセイおよびヘルビコリンAおよびBレベルのLC-HRMS測定において示されるように(図S5)。野生型 9Rz4 または pagI 変異体の細菌培養に 2 μM の C4-HSL または C6-HSL を加えても、抗真菌分子の早期の生産は見られず (Evans, 2010)、ヘルビコリン A 生産を調節する複雑な制御ネットワークがあることが示唆された。野生型9Rz4とそのpagI変異株でhbcAの転写レベルを測定するために定量的リアルタイムPCR解析を行ったところ、pagI欠損バックグラウンドでは、ハービコリンA遺伝子群の転写レベルが〜45%減少していることが明らかになった(図6C)。


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図6
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結論と今後の方向性
真菌および菌類の作物病原菌は、農業における憂慮すべき問題であり、世界的な食糧安全保障のリスクと関連している。実際、これらの病原菌は適切な条件下で最大80%に達する作物損失を引き起こす(Fones et al.、2020)。この問題は、気候変動、単一栽培の実践、作物の多様性の喪失によって悪化している。さらに、単一標的の合成殺菌剤の使用が普及しているため、農薬に対する抵抗性の発達を促しています(Fones et al.) 現在、生物農薬は世界の農薬市場の~6%を占めるに過ぎないが、耐性進化の割合が低い、性能が高い、生物安全性や生分解性が高いといった特質に後押しされて、生物農薬の年間売上成長率は10~20%と推定される(Marrone, 2019)。

放線菌は現在、臨床および農業用途の抗生物質の主な供給源となっている(Krell & Matilla, 2022)。しかし、本研究が確認したように、植物関連細菌は新規抗生物質の潜在的な供給源である(Gavriilidouら、2022;Matillaら、2022;Mohiteら、2022;Roca & Matilla、2022)。驚くべきことに、植物関連細菌による特定の抗生物質化合物の生合成は、有益な微生物による農作物の保護に重要な役割を果たすことが示されている(Carrión et al, 2019; Hou & Kolodkin-Gal, 2020; Mendes et al.、2011)。まとめると、植物に付随する微生物は、既存の農業の課題に対する解決策を提供する非常に有望な可能性を持っています。したがって、今後の方向性としては、植物の生産性と健康を向上させるために有益な相互作用を促進する植物マイクロバイオームの工学化を目指すことになる(Ke et al.、2021)。

著者による貢献
Miguel A. Matilla: 概念化(リード)、データキュレーション(リード)、形式分析(リード)、資金獲得(リード)、調査(リード)、手法(リード)、プロジェクト管理(リード)、リソース(リード)、監督(リード)、検証(リード)、可視化(リード)、執筆-原案(リード)、執筆-レビューと編集(リード)。Terry J. Evans: 形式的分析(同)、調査(同)、方法論(同)、執筆-レビューおよび編集(同) Jesús Martín: データキュレーション(同)、形式的解析(同)、調査(同)、方法論(同)、ソフトウェア(同)、検証(同)、執筆 - 査読および編集(同) Zulema Udaondo: データキュレーション(同)、調査(同)、方法論(同)、ソフトウェア(同)、検証(同)、執筆-レビューと編集(同)。Cristina Lomas-Martínez:調査(同)、方法論(同)、執筆-レビューおよび編集(同) Míriam Rico-Jiménez: 調査(同); 方法論(同); 執筆 - レビューと編集(同). Fernando Reyes: Data curation (同); formal analysis (同); investigation (同); methodology (同); software (同); validation (同); writing - review and editing (同). George P. C. Salmond: 概念化(主); 形式分析(主); 資金獲得(主); 調査(主); 方法論(主); プロジェクト管理(主); 資源(主); 監督(主); 執筆 - 原案(主); 執筆 - 査読および編集(主).

謝辞
P. agglomerans 9Rz4株の寄贈を受けたKornelia Smalla氏に感謝する。また、Chris Gilligan、Richard Cooper、Juan Mataには、真菌、菌類、酵母の菌株を提供していただき、感謝する。Salmond研究室での研究は、Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; UK)によるGPCSへのアワードBB/N008081/1の支援を受けている。Matilla研究室での作業は、スペイン科学イノベーション省/Agencia Estatal de Investigación https://doi.org/10.13039/501100011033 (PID2019-103972GA-I00) からの助成金によって支援されました。CLMは、「Secretaría General de Universidades, Investigación y Tecnología de la Junta de Andalucía」、スペイン科学技術省、スペイン研究会議、Fondo Social Europeoからの「Promoción del empleo joven e implantación de la Garantía Juvenil en I+D+i 2021」(AND21_EEZ_M2_044)より支援を受けました。植物病原体を用いた作業は DEFRA ライセンス番号 50864/197900/1 に基づいて実施した。ゲノム配列決定は MicrobesNG® (http://www.microbesng.com)より提供された。

資金提供情報
Salmond 研究所での作業は、Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; UK) の BB/N008081/1 を GPCS に授与することで支援された。Matilla研究室での作業は、スペイン科学イノベーション省/Agencia Estatal de Investigación https://doi.org/10.13039/501100011033 (PID2019-103972GA-I00) からの助成金により支援された。

利益相反
著者らは、利益相反がないことを宣言する。


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