加齢に伴う内在性レトロウイルスの復活は老化を強化する

哉百名

2023年1月8日 12:06

劉暁賢 21
劉存鵬 21
呉世明 21
張偉喜
Jing Qu
劉光輝 22
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脚注を表示するオープンアクセス公開日:2023年01月06日DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.017

ハイライト

内在性レトロウイルスの抑制はプログラム老化に寄与する

HERVKのアップレギュレーションは、自然免疫反応と細胞老化を誘発する

細胞外HERVKレトロウイルス様粒子は、若い細胞の老化を誘発する。

内因性レトロウイルスは、老化を緩和するための潜在的なターゲットとして機能する。
まとめ
内在性レトロウイルス（ERV）のようなウイルスに由来するある種のトランスポーザブル要素が、私たちのゲノムに眠っている間に目覚め、老化のプロセスに寄与するかどうか、またその方法はほとんど分かっていない。我々は、ヒトの老化細胞において、最も最近統合されたヒトERVであるHERVK（HML-2）が、ウイルス遺伝子を転写し、レトロウイルス様粒子（RVLP）を生成するためにアンロックされていることを見出した。このHERVK RVLPsは、若い細胞に老化の表現型を誘発する伝達メッセージを構成し、中和抗体でブロックすることができる。ERVの活性化は、老化した霊長類やマウスの臓器、高齢者のヒト組織や血清でも観察された。その抑制により、細胞の老化や組織の変性が緩和され、生体の老化もある程度緩和される。これらの知見は、ERVの復活が細胞老化や組織老化の特徴であり原動力であることを示している。
図解要約
図のサムネイルfx1
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キーワード
HERVK
老化
ドライバー
バイオマーカー
介入
はじめに
加齢は、生理的な衰えや慢性疾患の発症と関連しているが、その根底にある分子変化やメカニズムの多くは、まだ十分に解明されていない。過去数十年にわたる多大な努力により、エピジェネティックな変化や老化関連分泌表現型（SASP）因子の刺激など、老化関連の分子変化の原因となるいくつかの決定因子が同定されてきた。例えば、非長鎖末端反復（non-LTR）レトロトランスポゾンに属するsilent long-interspersed element-1 (LINE1) レトロトランスポゾンは、老化の過程で活性化し、老化に伴う表現型の一因である自然免疫反応を引き起こすことがある8,9,10,11,12,13,14,15。
LTRレトロトランスポゾンに属する別のクラスのレトロエレメント、内在性レトロウイルス（ERVs）は、古代のレトロウイルス感染の遺物で、進化の過程でゲノムに固定され、ヒトゲノムの約8％を占める。進化的圧力の結果、ほとんどのヒトERVs（HERVs）は変異や欠失を蓄積して、複製や転移の機能を停止させている20, 21。しかし、最近統合されたHERVK human mouse mammary tumor virus like-2 (HML-2) サブグループのように、HERVプロビラの進化的に若いサブファミリーは、Gag、Pol、Env、Proなどのウイルス粒子形成に必要なタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを維持している18,22。DNAが低メチル化された胚発生の特定の段階や癌のような特定の病的状態を除いて、23,24,25,26,27 HERVは、胚発生後の段階ではエピジェネティック制御などのホスト監視機構により転写的にサイレンシングされている。28,29。注目すべきは、ERVが老化の過程で宿主の監視から逃れられるかどうか、もしそうなら、細胞や生物の老化にどんな影響を及ぼすかについては、まだ十分に調べられていないことである。
本研究では、種を超えたモデルと複数の手法を用いることで、内在性レトロウイルスの復活が老化のバイオマーカーおよびドライバーとして未知の役割を担っていることを明らかにした。具体的には、細胞や組織の老化に関連する内在性レトロウイルスの発現を同定し、HERVKレトロウイルス様粒子（RVLP）の蓄積がレシピエント細胞における老化促進作用を仲介していることを明らかにした。さらに重要なことは、内在性レトロウイルスを介した老化促進作用を阻害することで、in vivoでの細胞の老化や組織の変性が緩和され、老化関連疾患の治療戦略開発の可能性が示唆されたことである。
研究成果
老化hMPCsにおけるHERVK発現の増大は、エピジェネティックな抑制と関連している
細胞老化は老化の主要な要因と考えられており、ヒトの早老症（Hutchinson-Gilford progeroid）の特徴である。ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（HGPS）およびウェルナー症候群（WS）。我々は以前、HGPSヒト間葉系前駆細胞（hMPC）（LMNAG608G/+ hMPC）またはWS hMPC（WRN-/- hMPC）が、老化に関連したβガラクトシダーゼ（SA-β-Gal）陽性細胞（図S1A）の増加によって特徴付けられる早期老化表現型（図1A）を再現したことを明らかにした。細胞増殖率の低下は、HGPSおよびWSのhMPCでも、複製的に老化した（RS）野生型（WT）hMPCと同様に、Ki67陽性細胞の減少およびクローン拡大能力の低下によって証明された（図S1B〜S1F）31, 32, 33, 34, 35, 37。
図サムネイル gr1
図1老化したhMPCではHERVKのエピジェネティックな抑制が観察される
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図1サムネイルfigs1
図S1老化hMPCにおけるHERVKの発現増加（図1に関連
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我々は、これらの早老モデルを利用して、ERVの活性化がヒトの細胞老化と関連しているかどうかを検証した。その結果、老化したhMPCでは、LTRなどのいくつかのトランスポゾンの発現が増加していることがわかった（図1B、S1G；表S1）。特に、レトロエレメントHERVK内部コード配列（HERVK-int）は、複製性及び早発性老化hMPCの両方で発現が増加していることが分かった（図1C及びS1H；表S1）。env、pol、gagを含むHERVK転写産物の異なる領域を標的とするプライマーを用いて、定量的逆転写酵素PCR（qRT-PCR）により、HERVKレトロエレメントは細胞老化の間に高度に発現し、老化マーカーp21Cip1（CDKN1A）が同様に増加し、一方ラミナ関連タンパク質LAP2（TMPO）は以前報告したように老化の間減少することが確認できた（図1D）。 38同様に、RNA蛍光in situハイブリダイゼーション（RNA-FISH）分析でも、HGPSとWSのhMPCでHERVK RNAシグナルの増加が見られた（図S1I）。LTR5_Hs、envおよびpolを標的とする異なる蛍光プローブを用いて1分子RNA-FISH（smRNA-FISH）を行ったところ、近接した共染色シグナルが検出され、LTR5_Hs（HERVKの転写調節領域）、envおよびpolを有するmRNA分子が老化hMPCsに存在することが示唆された（図1E）。
老化hMPCsにおけるHERVK転写の発現増加と一致して、HERVK-int領域とそれらのHERVKプロウイルス遺伝子座におけるCpG DNAメチル化レベルの減少（図1F、S1J、S1K）39，40と、HERVK-LTR5_Hsにおける抑制ヒストンマーク（H3K9me3）の減少と転写活性ヒストンマーク（H3K36me3）の増加（図1G、S1L）が観察された。これらのデータは、HERVKのエピジェネティックな抑制解除は、おそらくHERVKの転写に寄与しており、細胞の老化と関連していることを示している。
様々なタイプの老化したヒト細胞におけるHERVKのウイルス性タンパク質とRVLPsの蓄積
次に、内在性レトロウイルスの発現が上昇すると、HERVKタンパク質成分の産生、さらにはRVLPsの形成が誘発されるのかどうかを検討した。ウェスタンブロットと免疫蛍光染色分析により、早発性老化細胞とRS hMPCの両方でHERVK-Envタンパク質レベルの増加が見られた（図2A、2B、およびS2A）。さらに、HERVK-EnvをSPiDER-βGalまたはp21Cip1と共染色することにより、HERVK-Envの上昇は老化細胞集団でより顕著であることがわかった（図S2BとS2C）。HERVK mRNAとタンパク質のレベルの上昇に伴い、透過型電子顕微鏡（TEM）分析により、早発性老化細胞とRS hMPCの両方の細胞質にRVLPの蓄積を検出した。対照的に、RVLPは表現型の若い早期通過WT hMPCには非常に稀であった（図2CとS2D）。抗HERVK-Env抗体を用いた免疫-TEM解析41により、老化細胞では直径80から120 nmのRVLPがHERVK-Env抗体で標識されていることがわかった（図2D、S2E、S2F）。これらの発見は、老化したhMPCにおいて、HERVKのウイルスタンパク質とRVLPsの両方の産生が増加していることを示すものである。
図サムネイルgr2
図2HERVKウイルスタンパク質とRVLPsが老化細胞で増加している。
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図2サムネイル figs2
図2老化細胞におけるHERVKプロウイルス成分の増加（図2関連
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他のタイプの老化細胞におけるHERVKの発現を確認するために、初代ヒト線維芽細胞とhMPCを単離した。老化したhMPCモデルと同様に、RS初代線維芽細胞でHERVK-Envタンパク質レベルの増加が観察された（図2E、2F、S2G-S2I）。さらに、複製老化中のヒト線維芽細胞において、HERVK-LTR5_HsにおけるH3K9me3の占有率の低下とH3K36me3の占有率の上昇を見出した（図2G）。また、これらの老化した初代線維芽細胞ではRVLPの集積が増加していることが観察された（図2H）。さらに、老齢者由来の初代hMPCでは、若い人と比べて転写レベルが5倍以上増加していることから、HERVKの顕著な発現が認められた（図2I、S2J；表S2）。複合的な実験を通して、我々は、老化細胞における異常なHERVKの発現、ウイルスタンパク質とRVLPの蓄積を確認した。
HERVKの発現の増加が細胞の老化を促進する
内在性HERVKの活性化がどのように細胞老化に影響するかを決定するために、我々は、WT hMPCのHERVK-LTR5_Hsプロモーター領域を標的とするsgRNAと活性化タンパク質複合体（相乗的活性化メディエーター［SAM］）を含むCRISPR-dCas9媒介転写活性化（CRISPRa）システムを用いた（図S3A）42． 42 HERVK内在性レトロトランスポゾン要素の活性化をqRT-PCRとウェスタンブロッティングで確認した（図3A及びS3B）。我々は、標的HERVK活性化が、古典的な老化の特徴の誘導によって証明されるように、hMPCの老化を誘導することを見出した（図3B、3C、S3B、及びS3C）。内因性HERVKの抑制が細胞老化を抑制するかどうかをさらに評価するために、CRISPR-dCas9-KRAB転写不活性化（CRISPRi）システム43（図3D、S3D、S3E）を用いて、早期老化hMPCのHERVKを抑制すると、標的HERVK抑制がhMPC老化を緩和することが分かった（図3E、3F、S3E、およびS3F）。さらに、HERVK-interfering shRNA44,45を用いたHERVKのノックダウンも、早期老化に拮抗した（図3G、3H、およびS3G-S3I）。
図のサムネイル図3
図S3HERVKのアップレギュレーションがhMPCの老化を促進する（図3関連
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サムネイル gr3
図3HERVKの増加は老化を促進する。
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老化に伴うhMPCのHERVK遺伝子座のDNAメチル化の減少が観察されたので（図1FとS1K）、我々は、老化に伴うグローバルなメチル化低下を模倣するために、早期通過WT hMPCをDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）5-アザシチジン（5-AZA）で処理する実験を別に行った（図3I）。 46,47 全ゲノムバイサルファイトシーケンス（WGBS）分析により、治療後にHERVK要素におけるCpG DNAメチル化レベルの減少が確認された（図3JとS3J）。CRISPRaシステムによる標的HERVK活性化と一致して、5-AZA処理は、早期の細胞老化表現型と同時にHERVK RNAレベルの上昇をもたらした（図3K-3MおよびS3K）。対照的に、これらの老化表現型はHERVKノックダウンにより消失した（図S3L-S3N）。このことは、5-AZAがDNA脱メチル化によるHERVKの転写活性化を介して、少なくとも部分的に細胞老化を誘発することを示唆するものである。さらに、CRISPRaまたは5-AZA処理によって若年者由来の初代hMPCにおける内因性HERVKも活性化し（図S3OおよびS3P）、HERVKの転写活性化が細胞の老化を促進することを見出した（図3N-3Q）。以上のことから、宿主エピジェネティック機構の破壊とHERVK転写活性の標的操作を通じて、内因性HERVKのレベル向上がhMPC老化のドライバーであることを明らかにした。
HERVKの発現が自然免疫応答を引き起こす
HERVKにコードされたPolタンパク質は、逆転写活性を持ち、HERVK RNAをDNAに逆転写することができる16,17。それにより、ゲノムの外にさらにHERVK DNAが生成される。HERVK RNAの増加（図1DとS1I）と一致して、我々は、単一分子DNA-FISHによって老化hMPCの細胞質中のHERVK DNAの増加も観察した（図4AとS4A）。したがって、このような過剰な細胞質DNAは、DNAセンサーであるcGMP-AMP合成酵素（cGAS）によって認識され、自然免疫系の活性化を引き起こすのではないかと考えた（図4B）。実際、免疫沈降分析によって、早期通過の若いhMPCでは見られなかった細胞質HERVK DNA上でのcGASの著しい濃縮が確認された（図4C）。細胞質HERVK DNAがcGAS-Stimulator of interferon genes（STING）経路の活性化を誘発することを裏付けるように、2′3′-cGAMP量の増加（図4D）およびTANK-binding kinase 1（TBK1）、RelAおよびIFN調節因子3（IRF3）のリン酸化（図4E）が検出された。また、早発性老化hMPCでは、SASP因子51,52に分類されるIL1B（IL1β）およびIL6などの炎症性サイトカインの発現上昇が観察された（図4F、4G、S4B；表S3）。cGAS-STINGを介した自然免疫応答の活性化は、RS hMPC（図S4C〜S4E；表S3）およびRS線維芽細胞（図S4F〜S4H）においても明らかにされた。
図サムネイルgr4
図4HERVKの増加による自然免疫経路の活性化
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図サムネイル figs4
図S4自然免疫応答は老化細胞で活性化される（図4と関連あり
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一貫して、shRNAによるHERVKの阻害は、TBK1およびRelAのリン酸化レベルを減少させた（図4H）。さらに、STINGのノックダウンを介してHERVK活性化の下流エフェクターの1つをブロックすると、炎症反応とSASP発現の両方が減少し（図4IおよびS4I）、その結果、早発性老化hMPCの細胞老化が緩和されました（図4J）。さらに、HERVKをコードするPolの活性を阻害することができる強力なヌクレオシド逆転写酵素阻害剤であるアバカビルによって下流効果をブロックした（図4K）53。アバカビルで処理した老化hMPCは、HERVK DNA量の減少（図4L）と共に老化に関連する表現型のパネルの大幅な緩和を示した（図4M〜4O、S4J、およびS4K）。上記の機能喪失実験とは対照的に、CRISPRaシステムまたは5-AZA処理による内因性HERVKの活性化は、若いWT hMPCにおいて自然免疫応答の増強とSASPサイトカインの発現の上昇をもたらした（図4P-4S、S4L、S4M；表S4）。これらの知見から、HERVKの発現増加は、少なくとも部分的には自然免疫応答を誘発することによって、細胞老化の一因となる。
細胞外HERVK RVLPは細胞老化を誘導する
以前の研究では、腫瘍細胞由来のHERVK RVLPは培養液中に放出され、他の細胞に取り込まれることが示された54。本研究で老化細胞におけるHERVK RVLPの存在が観察されたので（図2C、2D、S2D-S2F）、老化細胞により産生されたHERVK RVLPが細胞外に放出されて非生存細胞へ老化シグナルを伝えることができるかと考えてみた（図5A)。この疑問に答えるために、我々は、高感度ddPCR（droplet digital PCR）技術55を用いて、WTおよび早期老化hMPCから採取した調整培地（CM）中のHERVK RNA（RVLPにパッケージされていると思われる遺伝物質）を検出した。早発性老化hMPCのCMでは、HERVK RNAレベルが若いWT hMPCのCMの5〜12倍であることがわかった（図5B）。さらに、酵素免疫吸着法（ELISA）とウェスタンブロッティングの両方で、早発性老化hMPCからのCM（図5CとS5A）、およびRS hMPCからのCM（図S5BとS5C）でHERVK-Envタンパク質レベルが増加していることが示された。さらに、TEMおよび免疫TEM解析により、80から120 nmの直径を持つRVLPが、主に老化hMPCの外側に検出された。いくつかのHERVKウイルス粒子は細胞表面から出芽するか、細胞表面に隣接して検出されたが（図5DおよびS5D）、いくつかの粒子は細胞外環境の被覆小胞内に含まれていた（図S5DおよびS5E）。
図のサムネイルgr5
図5老化細胞から放出されたRVLPが若い細胞の老化を誘導するHERVK
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図のサムネイル figs5
図S5老化細胞から放出されたHERVKが若い細胞の老化を誘導する、図5と関連する。
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次に、若いWTのhMPCから採取したCMをコントロールとして、HGPS、WS、RSのhMPCから採取したCM（Senescent Cell-conditional mediumまたはSC-CMと呼ぶ）で若いhMPCを処理した。TEM解析により、SC-CM処理群では、より多くの細胞外RVLPが若いhMPCの細胞表面に付着しているか、若い細胞に入り込んでいることがわかった（図5E）。SC-CM処理後、若いhMPCでHERVKの存在量の増加を観察し（図5F）、SC-CM中のHERVKが標的細胞内に伝達される可能性を示唆した。さらに、侵入したHERVKエレメントは、「老化促進」効果に関連していることがわかった。すなわち、SC-CMとインキュベートされた若いhMPCは、細胞の老化も促進した（図5F、5G、およびS5F）。
SC-CMに存在するHERVKが若いhMPCの老化を引き起こす主要な要因の一つであるかどうかをさらに調べるために、抗HERVK-Env抗体56を用いてHERVKの免疫除去を行った。ウェスタンブロッティングにより、抗HERVK-Env抗体とインキュベートした後のSC-CMでは、HERVK-EnvとGagの両方のタンパク質がプルダウンされたが、IgGコントロールとインキュベートしたSC-CMではプルダウンされなかったことが確認された（図S5G）。したがって、ELISAデータは、抗HERVK-Env抗体とのインキュベーション後にSC-CMからHERVK-Envが枯渇することを示した（図S5H）。予想通り、HERVK免疫枯渇後、表面に付着するHERVK RVLPが少なくなったか、または若いhMPCに存在することが観察された（図5H）。さらに、HERVKの免疫除去は、免疫除去を行わないSC-CMで処理したものと比較して、若いWT hMPCのHERVK存在量の減少および老化表現型の緩和をもたらした（図5I、S5I、およびS5J）。さらに、SC-CMはcGAS-STING経路を活性化し、若いhMPCのSASP遺伝子の発現を誘導した（図5F、5J、およびS5K）。重要なことは、STINGのノックダウンがSC-CMによって誘導された老化表現型を救ったことである（図5J、5K、S5K）。これは、SC-CMが内因性HERVK発現と同様に、自然免疫経路を活性化することによって少なくとも部分的に細胞老化を促進することを示唆している。これらのデータは、老化細胞で生成されたレトロウイルスHERVK要素がパラクライン様式で放出され、非老化細胞で細胞老化を誘発することを示唆している。
次に、細胞外のHERVK RVLPの感染が老化の直接的なドライバーであることを確認するために、Env内にGFPカセットを融合した合成された完全長HERVKを含む我々の構築した発現ベクターを用いてRVLPを生成した（図S5LとS5M）57,58。 57,58 次に、若いhMPCに精製HERVK RVLPを感染させ（図5Lと5M）、若いhMPCでHERVKとGFP断片のRNAレベルが共に上昇することを見出した（図S5N）。HERVK RVLPに感染した若いhMPCは、SC-CMで処理したものと同様に、典型的な早発性老化の表現型を示し（図5N）、免疫除去を伴うSC-CMに類似していた。抗HERVK-Env抗体によるHERVK RVLP中和は、HERVK RVLP誘発細胞老化を無効にし（図5O、S5O、S5P）、そのような無効化は、アバカビル処理によっても達成された（図5P、S5Q、S5R）。我々はさらに、HERVK RVLPを感染させた後、レシピエントhMPCのHERVK DNA上でcGASの濃縮が増加することを見出した（図5Q）。さらに、感染したhMPCにおいて、cGAS-STINGを介した自然免疫応答の活性化も検出された（図5R、5S、およびS5S）。注目すべきは、これらの表現型が抗HERVK-Env抗体による中和やアバカビルによる処理によって消失したことである（図5Rと5S）。これは、cGAS-STING経路がHERVK RVLPによる老化の獲得を駆動していることを示すものである。まとめると、我々のデータは、細胞外のHERVK RVLPが若い細胞に老化情報を伝達することを支持するものである。
内在性レトロウイルスは老化のバイオマーカーとして利用できる
次に、老化した霊長類とヒトの個体における内在性レトロウイルス要素のレベルを測定した。ERVWは、約2500万年前に類人猿と旧世界ザルが分岐した際に、祖先の生殖細胞に感染したために旧世界ザルに残存しているもう一つの内在性レトロウイルスサブファミリーである59,60。RT-qPCRの結果、加齢したカニクイザルではERVKおよびERVWの両要素が増加しており（図S6A）、入手可能な抗体を用いて61、生理的に加齢したカニクイザルの肺、肝臓、皮膚組織で、若い人と比較してERVW-Envタンパク質レベルが増加することが確認できた（図6A〜図6C）。また、p-RelA（図6B）およびSASP因子（図S6B-S6D）の発現上昇から明らかなように、老化したサル組織における自然免疫応答が増加していることも同様に見いだされた。さらに、HGPS患者の早期老化表現型を再現したWTとHGPSの両方のカニクイザルから分離した肺、肝臓、皮膚組織を比較すると62、HGPSカニクイザルではp-RelAとともにERVW-Envのタンパク質レベルも上昇していた（図6D〜図6F）。
図サムネイル Figs6
図S6内因性レトロウイルスの活性化と自然免疫経路のin vivoでの関連性（図6
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図1.サムネイルgr6
図6老化のバイオマーカーとしての内在性レトロウイルスの活性化
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最後に、我々は、HERVKの発現上昇が、生理学的老化の間にヒトの組織で観察されるかどうかを調べようとした。同様に、若いドナーおよび老齢のドナーから得た皮膚と血清サンプルにおいて、63 HERVK-Envの発現は、加齢とともに著しく増加した（図6G-6I; 表S2）。老齢者の血清中のHERVKが老化を促進する因子であるかどうかを確認するために、若い初代hMPCを、若年者または老齢者の血清を含む培地で培養した（図S6E）。驚くべきことに、老齢者の血清は、初代hMPCにおいてHERVKの存在量を増加させ、自然免疫反応を誘発し、細胞の老化を促進したが、この老化促進能力はHERVK免疫除去により消失した（図S6F-S6H）。これらの結果は、ヒト内在性レトロウイルスHERVKが、ヒトの老化を評価するバイオマーカーとして、また、組織や細胞の老化を緩和する治療標的として役立つ可能性を示している。
内在性レトロウイルスを標的とすることで組織の老化を緩和する
次に、老化したマウスでERVの発現を抑制することを試みた。ヒトと異なり、マウスは様々な活性を持つERVを保有しており、その中でもマウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）は、ベータレトロウイルスとして知られており、HERVK（HML-2）のものと最も近い関係にある。 64,65 加齢に伴い霊長類やヒトの組織で観察されるERVエレメントのレベル上昇と同様に、MMTV-Envレベルは、若いマウスに比べ加齢マウスの肺、肝臓、皮膚組織で上昇し、そこでの自然免疫や炎症経路の活性化も見られた（図S7A-S7C）。このように、ある程度の進化的保存性を持って、霊長類と齧歯類の両方のERVが老化中に再活性化されるのである。
図サムネイル Figs7
図S7内因性レトロウイルスの抑制によるマウスの組織老化の緩和、図7と関連あり
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関節の変性、すなわち変形性関節症（OA）は、加齢に伴う最も一般的な関節病理であり、間葉系前駆細胞の老化に起因するとされている。66,67,68,69,70,71,72 その病理は、Ki67陽性細胞数の減少および軟骨の厚みの減少によって特徴付けられる（図S7DおよびS7E）。加齢マウスでは、MMTVが関節軟骨で大幅に増加していることがわかった（図7A）。このことは、ERVのレベルの増加が、加齢に伴う関節変性の潜在的なドライバーである可能性を示唆している。一貫して、MMTVを抑制するためにCRISPRi-dCas9/sgMMTV（MMTVを標的とするsgRNA）を有するレンチウイルスの関節内注入を行ったところ（図7B、7CおよびS7F）、組織の老化の緩和を示す表現型を検出した（図7D、7E、S7G、およびS7H）。また、MMTV阻害により、軟骨の厚みや関節骨密度の増加、握力の強化によって明らかになったように、老化したマウスの関節の構造的および機能的な改善が観察された（図7F、7G、およびS7I）。
図サムネイル gr7
図7内在性レトロウイルスを標的とした組織老化の緩和
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アバカビルの投与が内在性レトロウイルスの老化促進作用を抑制することができるという我々の知見は（図4N、4O、5P、5S、S4K、およびS5R）、アバカビルを生体内の老化介入にさらに応用する基礎を築くものです。この目的のために、我々は22ヶ月齢のマウスの関節腔に毎週アバカビルを注射した（図7H）。CRISPRiシステムを用いたMMTVのレンチウイルスノックダウンと同様に、アバカビル投与は、老化の緩和と老化に伴う炎症の減弱によって証明されるように、軟骨の変性を低減することが分かった（図7I、7J、S7J、およびS7K）。また、軟骨の厚み、骨密度、握力の増加など、老化に関連した関節変性の緩和も検出された（図7K、7L、S7L）。最後に、アバカビルの投与によって老化したマウスの健康状態がより一般的に改善されるかどうかを検討しました。そこで、18ヶ月齢のマウスにアバカビルを毎日の飲料水に溶かして6ヶ月間投与した（図7M）。その結果、アバカビルを投与したマウスでは、未投与のマウスに比べ、握力の増加、総合的な身体能力の向上、短期記憶の向上が認められました（図7N-7P）。これらのデータは、生体内の内在性レトロウイルスの抑制が組織の老化を緩和し、ある程度は生体の老化も緩和することを示している。
考察
本研究では、様々な霊長類やげっ歯類の老化モデルを用いて、内在性レトロウイルスの活性化と老化の間に正のフィードバックループがあることを発見した。我々の包括的な解析は、複数の種におけるHERVKと老化の因果関係を解明し、酵母、ハエ、ネズミのモデルで老化に伴うERVの発現増加を示した先駆的な研究によって裏付けられた73,74,75。例えば、ショウジョウバエのトランスポゾーン要素であるジプシーの活性化は脊椎動物ERVと相同性を示し、老化ハエで報告されている76。さらに、関節リウマチや神経変性疾患などの老化関連疾患と、覚醒した ERV との相関を示唆する研究も出てきている42, 77, 78, 79, 80, 81 。この結果と同様に、HERVKを阻害することで、筋萎縮性側索硬化症（ALS）を含む神経変性疾患を軽減する試みが報告されている82,83。このように、ERVは老化を軽減し、生物全体の健康を増進するための薬物標的であると言える。
また、LINE1もレトロトランスポゾンエレメントの一種であり、老化や加齢に伴う変性において活性化され、ある種の老化促進作用を発揮することが知られている。しかし、LINE1がウイルス粒子を生成できないため、主に細胞自律的に作用するのとは異なり、我々の研究は、加齢によって復活した内在性レトロウイルス（AIR-ERV）が、破壊的な細胞自律的役割を果たすだけでなく、パラクライン様式で二次老化を誘発する証拠を提供する。
以上のように、私たちの研究は、小胞体ウイルスの活性化が細胞老化と組織老化の特徴であり、原動力であることを実験的に証明するものである。この研究成果は、老化のメカニズムを理解する上で新たな知見をもたらし、特にプログラム老化の理論を豊かにするものである。このように、私たちの研究は、老化の伝染性を理解するための基礎を築き、老化を科学的に評価する方法を確立し、老化を緩和するための臨床戦略を開発する道を開くものである。
研究の限界
我々は、HERVK RVLPが老化細胞から若い細胞へ伝播する過程を示す証拠を提供したが、ドナー細胞とレシピエント細胞によるウイルス粒子のエキソサイトーシスとエンドサイトーシスをリアルタイムでモニターするためには、より進んだ技術が必要である。HERVKを介した細胞老化を評価する場合、SA-β-gal活性だけでなく、複数の指標に基づいた慎重な判断が緊急に必要であることに注意すべきである86,87。加えて、HERVKの全長コピーを特定するためにショートリード配列決定を利用することができないので、無傷のHERVKプロウイルスが存在するかどうか、そしてHERVKプロウイルスの全ライフサイクルが老化中にどのように完了するかについてさらなる調査が必要である。HERVK/MMTVの標的阻害による老化抑制効果をhMPCとマウスで実証したように、今後の応用のためには、ヒト以外の霊長類での前臨床試験を行うことは大きな意義があると思われる。さらに、今後、大規模集団における年齢や種を超えた内在性レトロウイルスの発現プロファイルの特徴づけや、DNAメチル化、テロメア長など他の老化時計との比較検討も必要であろう。
STAR★Methods
主要リソース一覧
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
マウスモノクローナル抗HERVK-Env Austral Biologicals Cat# HERM-1811-5;

RID: AB_10891119
マウスモノクローナル抗HERVK-Gag Austral Biologicals Cat# HERM-1841-5;

RID: AB_10891407
ウサギポリクローナル抗ERVK7 United States Biological社 Cat# 302427

RRID: N/A
ウサギポリクローナル抗ERVW-1 Abcam Cat# ab179693;

RRID: N/A
ウサギの抗ホスホTBK1/NAK (Ser172) Cell Signaling Technology Cat# 5483;

RID: AB_10693472
ウサギ抗ホスホ-NF-κB p65 (p-RelA) (Ser536) (93H1) Cell Signaling Technology Cat# 3033S;

RID: AB_331284
ウサギ抗ホスホ-IRF-3 (Ser396) Cell Signaling Technology Cat# 29047S;

RID: AB_2773013
マウスモノクローナル抗STING R&Dシステムズ Cat#MAB7169;

RID: AB_10971940
マウスモノクローナル抗p16INK4a BD Biosciences Cat# 550834;

RID: AB_2078446
マウス抗LAP2 BD Biosciences Cat# 611000;

RID: AB_398313
ウサギの抗 p21Cip1 モノクローナル Cell Signaling Technology Cat# 2947s;

RID: AB_823586
Rabbit monoclonal anti-p21Cip1 Abcam Cat# ab188224;

RID: AB_2734729
マウスモノクローナル抗GAPDH Santa Cruz Biotechnology Cat#; sc-365062;

RID: AB_10847862
マウスモノクローナル抗β-アクチン Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-69879; RRID: AB_1119529
ウサギポリクローナル抗H3K9me3 Abcam Cat# ab8898;

RID: AB_1119529
ウサギポリクローナル抗H3K36me3 Abcam Cat# ab9050;

RID: AB_306966
マウスモノクローナル抗Ki67 ZSGB-Bio Cat# ZM-0166;

RID: AB_2890067
ウサギポリクローナル抗Ki67 Abcam Cat# ab15580;

RID: AB_443209
ウサギのモノクローナル抗cGAS (D1D3G) Cell Signaling Technology Cat# 15102S;

RID: AB_2732795
ウサギポリクローナル抗MMTV-Env Novus Biologicals, LLC Cat# NBP2-44179;

RRID: N/A
マウスモノクローナル抗IL1β Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-52012;

RID: AB_629741
正常なウサギのIgG Cell Signaling Technology Cat# 2729S;

RID: AB_1031062
正常なマウスIgG Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-2025;

RID: AB_737182
Alexa Fluo™ 568 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Invitrogen Cat# A10042;

RID: AB_2534017
Alexa Fluo™ 568 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen Cat# A-10037;

RID: AB_2534013
Alexa Fluor™ 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen Cat# A21202;

RID: AB_141607
HRP 標識 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ZSGB-Bio Cat# ZB2305;

RID: AB_2747415
HRP 標識ヤギ抗ウサギ IgG（H+L） ZSGB-Bio Cat# ZB2301;

RID: AB_2747412
6nm 金標識 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat# 115-195-146

RRID: N/A
生体試料
Cynomolgus monkey の若齢および老齢組織 Xieerxin Biology Resource N/A
WTおよびHGPSカニクイザル組織 Yunnan Key Laboratory of Primate Biomedical Research N/A
ヒト眼瞼皮膚サンプル北京ユニオン医科大学病院 N/A
ヒト血清サンプル昆明医科大学第一病院 N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
MEMα GIBCO Cat# 32571-101
DMEM/High Glucose HyClone Cat# SH30243.01
非必須アミノ酸(NEAA) GIBCO Cat# 11140076
ウシ胎児血清 (FBS) GIBCO Cat# 42Q7980K
ペニシリン／ストレプトマイシン（P/S） GIBCO Cat# 15140-163
GlutaMAX GIBCO Cat# 35050079
ゼラチン Sigma-Aldrich Cat# V900863
bFGF ジョイントプロテインセントラル Cat# BBI-EXP-002
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red GIBCO Cat# 12605010
0.25% Trypsin-EDTA (1X)、フェノールレッド GIBCO Cat# 25200072
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific Cat# H3570
THUNDERBIRD SYBR qPCR mix 東洋紡績株式会社 Cat# QPS-201(-)
4%パラホルムアルデヒド、PFA Dingguo, China Cat# AR-0211
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T9284
クリスタルバイオレット Biohao Biotechnology Co, Ltd., China Cat# C0502
TRIzol™ 試薬 Thermo Fisher Scientific Cat# 15596018
DMSO Sigma-Aldrich Cat# D2650
NP-40 Dingguo, China Cat# DH218
プロテイナーゼ K New England Biolabs Cat# P8107S
RNase A TAKARA Cat# 2158
EDTA Sigma-Aldrich Cat# EDS-500G
プロテアーゼインヒビターカクテル Roche Cat# 4693159001
X-gal Amresca Cat# 0428-25G
PVDF メンブレン Millipore Cat# IPVH00010
プロテイン A/G プラスアガロース Thermo Fisher Scientific Cat# sc-2003
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix Bio-Rad Laboratories, Inc. Cat# 186-4033
QX200™ EvaGreen用ドロップレットジェネレーションオイル Bio-Rad Laboratories, Inc. Cat# 1864005
MluI New England Biolabs Cat# R0198S
ClaI New England Biolabs Cat# R0197S
ESP3I/BsmB1 FERMENTAS Cat# FD0454
NheI New England Biolabs Cat# R3131S
ApaI New England Biolabs Cat# R0114S
KpnI-HF New England Biolabs Cat# R3142
BamHI-HF New England Biolabs Cat# R3136
5-AZA Sigma-Aldrich Cat# 320-67-2
アバカビル Selleckchem Cat# S3165
ポリブレン Sigma-Aldrich Cat# 107689
重要な市販アッセイ
BCA Protein Assay Kit Dingguo, China Cat# BCA02
Qubit™ dsDNA HS アッセイキット Thermo Fisher Scientific Cat# Q32854
Dynabeads™ Protein A Thermo Fisher Scientific Cat# 10002D
Ribo-Zero™ rRNA 除去キット Epicentre Biotechnologies Cat# RZH1046
NEBNext® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit for Illumina® New England Biolabs Cat# E7420L
DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN Cat# 69506
GoScript 逆転写システム Promega Cat# A5001
Lipofectamine 3000 トランスフェクション試薬 Thermo Fisher Scientific Cat# L3000015
QIAamp Viral RNA Mini Kit QIAGEN Cat# 52904
SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Fisher Scientific Cat# 34096
TURBO DNA-free™ キットサーモフィッシャーサイエンティフィック Cat# AM1907
ヒト IL6 ELISA キット BioLegend Cat# 430515
Human HERVK-Env Polyprotein ELISA Kit CUSABIO Cat# CBS-EL007812HU
2'3'-cGAMP ELISA キット Cayman Cat# 501700
DAB 染色キット ZSGB-BIO Cat# ZLI-9018; PV-9001; PV-9002
QuantiGene® ViewRNA ISH セルアッセイキット Thermo Fisher Scientific Cat# QVC0001
細胞老化検出キット-SPiDER-βGal DOJINDO Laboratories Cat# PL507
寄託データ
早発性hMPCとRS hMPCのRNA-seqデータ（生）本研究 CRA003282
WGBSの生データ（Prematurely senescent and RS hMPCs Liu et al.39 HRA001144
ビヒクルまたは5-AZAで処理したhMPCのWGBSの生データこの研究 HRA001879
CRISPRaシステムを用いてHERVKまたはNTCを標的とするsgRNAを導入したレンチウイルスを導入したWT MPC（P6）のRNA-seq生データこの研究 CRA003283は、WT MPC（P6）のRNA-seq生データ。
若齢および老齢のカニクイザルの肝臓組織のRNA-seq生データ Liu et al.66 CRA002965
若齢および老齢のカニクイザルの肺組織のRNA-seq生データ Ma et al.88 CRA002810
実験モデル細胞株
WT hMPCs (WT hESCs (Line H9) から派生) Wu et al.33 N/A
LMNAG608G/+ hMPCs Wuら.33 N/A
WRN-/- hMPCs Zhangら、Wuら32,33 N/A
個体の歯肉からプライマリ hMPC を分離 Ren et al.67 N/A
HEK293T ATCC 該当なし
ヒト初代真皮線維芽細胞 Zou et al.63 N/A
実験モデル生物／系統
C57BL/6J マウス SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co. N/A
オリゴヌクレオチド
qRT-PCR、ChIP-qPCR、ベクター構築用プライマー、およびDNA/RNA-FISH用プローブ、表S5参照本研究ではN/A
リコンビナントDNA
pLVTHM Didier Tronoより寄贈 Addgene plasmid #12247
psPAX2 Didier Tronoより寄贈 Addgene plasmid #12260
pMD2.G Didier Tronoからの贈り物 Addgene plasmid #12259
lentiSAM v2 Didier Tronoからの贈り物 Addgene plasmid #75112
lentiMPH v2 Didier Tronoからの寄贈 Addgene plasmid #89308
dCas9-KRAB Didier Tronoからの寄贈 N/A
HERVK RVLP コンストラクトこの研究 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
ImageJ (version 1.8.0) Schneider et al.100 https://imagej.net/Welcome
Leica LAS AF Lite (バージョン 2.6.0) Leica https://leica-las-af-lite.updatestar.com/
GraphPadPrism 8.0 グラフパッドソフトウェア株式会社 https://www.graphpad.com/
イメージラボ 4.0.1 Bio-Rad https://www.bio-rad.com/zh-cn/product/imagelab-software?ID=KRE6P5E8Z
PhenochartTM 1.0 フェノチャート https://www.akoyabio.com/support/software/phenochart-whole-slide-viewer/
ImageScope (バージョン 12.3.0.5056) Leica https://www.leicabiosystems.com/en-de/digital-pathology/manage/aperio-imagescope/
IMARIS 9.8 OXFORD INSTRUMENTs（オックスフォード・インストゥルメンツ） https://imaris.oxinst.cn/newrelease
ZEN 3.1 ZEISS https://www.micro-shop.zeiss.com/en/us/system/zen+software/software+zen/zen+-+basic+software/410135-1002-310
Analyze 10.0 アナライズダイレクト https://www.analyzedirect.com
TrimGalore (バージョン 0.4.5) Babraham Bioinformatics https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore
SAMtools (バージョン 1.6) Li et al.89 https://github.com/samtools/samtools
R (バージョン 4.0.2) N/A https://www.r-project.org/
pheatmap (バージョン 1.0.12) N/A https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/
ggplot2 (バージョン 3.3.2) N/A https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/
GSEA (バージョン 4.1) Subramanian et al.90 http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp
Fastp (バージョン 0.19.10) Chen et al.91 https://github.com/OpenGene/fastp
hisat2 (バージョン 2.0.4) Kim et al.92 https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml
HTSeq (バージョン 0.11.0) Anders et al.93 https://htseq.readthedocs.io/en/master/
featureCounts (バージョン 2.0.0) Liao et al.94 http://subread.sourceforge.net/featureCounts.html
STAR (バージョン 2.7.1b および 2.7.9a) Dobin et al.95 https://github.com/alexdobin/STAR
TEtranscripts (バージョン 2.2.1) Jin et al.96 https://github.com/mhammell-laboratory/TEtranscripts
DESeq2 (バージョン 1.29.8 および 1.26.0) Love et al.97 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html
bsmap (バージョン 2.90) Xi and Li98 https://hpc.nih.gov/apps/bsmap.html
ggpubr (バージョン 0.4.0) N/A https://cran.microsoft.com/snapshot/2021-09-26/web/packages/ggpubr/index.html
IGV (バージョン 2.8.12) Thorvaldsdottir et al.99 https://igv.org
新しいタブで表を開く
リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、主担当者である Dr. Guang-Hui Liu (ghliu@ioz.ac.cn) までお願いします。
材料の利用可能性
この研究では、新たな試薬は生成されませんでした。
実験モデルおよび被験者の詳細
動物およびヒトの試料と倫理
SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd から購入した C57BL/6J マウスは、中国科学院生物物理研究所および動物学研究所の動物飼育施設で飼育し、12 時間の明暗周期で換気したケージで標準実験食と水を自由摂取させた。すべてのマウス実験は、「動物を用いる研究の倫理的承認のための申請様式に関する原則」に従い、中国科学院動物学研究所の施設動物管理・使用委員会の事前承認を得た。マウスの麻酔はisofluraneで行い、安楽死はCO2で行った後、頸椎脱臼させた。すべてのカニクイザルの実験は、「霊長類の倫理的取り扱いに関する原則」に基づいて行われ、中国科学院動物学研究所の動物ケアおよび倫理委員会によって承認された。実験に使用した若齢および老齢のカニクイザルは、動物研究に適用されるすべての地方および連邦法を遵守し、北京の実験動物管理認定施設の認定を受けた謝爾心生物学資源で飼育された101。本研究で使用したカニクイザルは、過去の研究で報告されたものと同じである。101,102 肺、肝臓、皮膚のサンプルは、臨床歴や実験歴のない若齢（4-6 歳、雌 4、雄 4）および高齢（18-21 歳、雌 4、雄 4）のカニクイザル 8 例から収集した。HGPSカニクイザルは、以前の研究で説明されている62。北京のPLA306病院倫理委員会の承認のもと、指定された年齢の個体の歯肉から初代hMPCを単離した67。ヒト血清サンプルは、昆明医科大学第一病院研究倫理委員会の承認のもと、指定の健康なドナーの眼瞼整形術から入手した88。88 すべてのヒト試料は、健康な若年および高齢のドナーから入手した。ヒトドナーの年齢情報は、表S2に示した。
細胞培養
HEK293T細胞およびヒト線維芽細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS、GIBCO、Thermo Fisher Scientific）、2mM GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）、0.1mM非必須アミノ酸（NEAA、Thermo Fisher Scientific）、1％ペニシン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）添加のDulbeccoの変法イーグル培地（DMEM、Thermo Fisher Scientific）中、培養した。ヒトMPC（hMPC）は、90％MEMα（Thermo Fisher Scientific）、10％FBS、2mM GlutaMAX、0.1mM NEAA、1％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび1ng／mL bFGF（Joint Protein Central）を含むhMPC培養液中、0.1％ゼラチン（Sigma Aldrich）でコートしたプレート（CORNING）上に増殖させた。細胞はインキュベーター（Thermo Fisher Scientific）内で37℃、5% CO2で培養した。WT hMPCは、その後期継代（LP、P > 12）において複製的に老化し、早発性老化HGPS（LMNAG608G/+）およびWS（WRN-/-）hMPCモデルは、継代8-9（早発性老化モデルではLPと呼ぶ）において成長停止を示す。HGPSおよびWSモデルは、ヒト胚性幹細胞（hESC）のゲノム編集を行い、その後hMPCに誘導分化させることで構築されました33。
方法詳細
動物実験
MMTVのレンチウイルスノックダウンが、マウスの加齢に伴う関節変性を緩和するかどうかを評価するため。CRISPR-dCas9-KRAB発現空バックボーンを含むレンチウイルス（CRISPRi-Control）またはCRISPR-dCas9-KRABおよびMMTVシングルガイド（sg）RNAを含むレンチウイルス（CRISRRi-sgMMTV）を21ヶ月齢マウスの関節腔に4週間の間隔を置いて2回注射した（各群n＝12匹）。最初の注射から8週間後に握力を測定した。加齢に伴う関節変性に対するアバカビルの効果を調べるために、アバカビルを1％DMSOを含むPBSに溶解し、最終濃度が5mg／mLになるようにし、22ヶ月齢のマウスの関節腔に10μL注入した（各グループのn＝12）。最初の注射から8週間後に握力を測定した。長期経口投与実験では、18ヶ月齢のマウスに、0.4％DMSOを含む飲料水にアバカビルを最終濃度1 mg/mLで溶解し、合計3 mLを毎日投与し、対照として飲料水中の0.4％DMSOを投与した（各群n = 23匹）。アバカビル投与後6、12、24週目にマウスの体重、背部、被毛、皮膚、白内障、フィジカルスコアリング、握力を評価した。アバカビル投与後24週目にY迷路試験を実施した。
握力試験
マウスの握力は、握力計（Panlab Grid Strength Meter, LE902）を用いて評価した。簡単に説明すると、マウスの四肢を握力計の上部に乗せ、マウスによって握力計が離されるまで、一定の速度でグリッドの方向に沿って引っ張った。この作業を10回繰り返し、各時刻のピーク吸引力をデジタルフォーストランスデューサーに記録した。連続した10回の試行の平均値を各マウスの握力とした。各群のマウスの数（n）は図中に示されており、例えば、図7Nに示すように、飲料水中のビヒクルまたはアバカビルの場合はn＝23匹、図S7Iに示すように、CRISPRiシステムを用いてコントロールまたはsgMMTVを発現するレンチウイルスを関節腔に注入した場合はn＝12匹、図S7Lに示すように、ビヒクルまたはアバカビルを関節腔に注入した場合はn＝12匹のマウスを示した。
Y迷路試験
Y迷路試験は、各アーム間の角度が120°の同一長さの3本のアームからなるY字型アリーナ、カメラ、及び追跡ソフトウェアを備えたコンピュータを用いて行った。簡単に説明すると、マウスをY字迷路のいずれかのアームの端に置き、5分間迷路を自由に探索させた。カメラシステムは動物の行動変化を5分間記録した。マウスが3本のarmに連続して入ったことを反映したarm進入回数とターン回数（交互）の合計を短期空間記憶の評価とした。各群のマウスの数（n）は図中に示されており、例えば、図7Pに示すように、飲料水にアバカビルを入れた場合はn＝20匹、n＝22匹のマウスである。
インビボでの骨組織形態学的解析マイクロコンピュータトモグラフィー（Micro-CT)
マイクロコンピュータトモグラフィー（Micro-CT）スキャンは、PE Quantum FX（PerkinElmer）を用いて、生きているマウスに対して実施された。簡単に説明すると、マウスをイソフルランで麻酔し、以下の設定でスキャンを行った。脛骨近位部および大腿骨遠位部を、等方性ボクセルサイズ18μmのMicro-CTスキャナでスキャンした。X線管電圧は90kV，電流は160μAに設定し，露光時間は1秒とした．骨密度の定量化は、Analyze 10.0ソフトウェアを用いて、各マウスの膝関節部に対して行った。各群のマウス数（n）は図中に示されており、例えば、図7Gに示すように、CRISPRiシステムを用いてコントロールまたはsgMMTVを発現するレンチウイルスを関節腔に注入したマウスはn＝12であり、図7Lに示すように、ビークルを注入したマウスまたはアバカビルを関節腔に注入したマウスはn＝10であった。
ウェスタンブロッティング
細胞を1×SDS緩衝液（100mM Tris-HCl (pH = 6.8), 10% glycerol, 2% SDS and 2% 2-mercaptoethanol）で溶解し、105℃、10分間煮沸した。タンパク質濃度はBCA Kit (Dingguochangsheng Biotech)を用いて測定した。細胞ライセートをSDS-PAGE電気泳動にかけ、PVDF膜（ミリポア社）に電気泳動した。その後、膜を一次抗体、次にHRP結合二次抗体とインキュベートした。化学発光検出のため、ウェスタンブロットを基質（基質A：0.2 mM クマル酸、1.25 mM ルミナル、0.1 M Tris-HCl (pH = 8.5); 基質B：3% H2O2）とインキュベートし、1000 μLの基質Aと3 μLの基質B、またはSuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) を混合した。画像処理は、ChemiDoc XRS+ システム (Bio-Rad Laboratories, Inc.) 上の Image Lab ソフトウェアを使用して行った。タンパク質バンド強度の定量は、ImageJを用いて行った。GAPDHはローディングコントロールとして使用した。各アッセイについて、3つの独立した実験を行った（n = 3）。各群の動物の数（n）は、図中に示される；例えば、図6Bに示されるように、n＝8匹の若年および高齢のカニクイザル；図S7Bに示されるように、n＝5匹の若年および高齢のマウスである。ウェスタンブロッティングに使用した抗体は、主要なリソースの表に記載されている。
条件付け培地からのHERVKの免疫沈降(IP)
10％マイクロベシクル除去ウシ胎児血清（dFBS）を添加したhMPC培地で細胞を48時間培養し、100,000×gで16時間超遠心分離を経て調製した103。老化細胞からの調整培地約40mLを集め、0.2μmフィルター（Pall Corporation）でろ過し、Protein A/G Plus-Agarose（Santa Cruz Biotechnology）で4℃、2-3時間前洗浄した。次に、採取した上清を1/1000希釈のHERVK-Env抗体（Austral Biologicals）および新鮮なProtein A/G Plus-Agaroseと4℃で一晩インキュベートした。最後に、上清を回収し、ビーズをPBSで洗浄し、ウェスタンブロッティングに供した。
コンディショニング液からのマイクロベシクル粒子の精製
培地回収の前に、10% dFBS添加hMPC培地で48時間培養した。103 調整培地を回収し、対応する細胞数を数えた。同数の細胞から得た培地を、300 × g で 10 分間の細胞汚染除去、15,000 × g で 20 分間の遠心分離、 0.2 μm フィルター (Pall Corporation) によるろ過、110,000 × g で 2 時間の超遠心の後、マイクロベシクル精製に用いた103 ペレットを集め、等量の PBS で分離し、ウイルス RNA 分離またはウェスタンブロッティングに供した。
DNA/RNAの単離と定量（逆転写）PCR（qRT-PCR）
細胞からの全DNAは、DNeasy Blood & Tissue Kit（Tiangen）を用いて製造者の指示に従って抽出し、その後qPCR分析用に処理した。TRIzol（Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞全RNAを抽出し、DNase I処理をしてゲノムDNAの汚染を除去し、GoScript Reverse Transcription System（Promega）を用いてcDNAに逆転写した。(RT-)PCRは、CFX384 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories, Inc.)でTHUNDERBIRD qPCR Mix (TOYOBO)を用いて実施した。DNAのqPCR解析には5S rDNAを、RNAのqRT-PCR解析にはACTBまたはGAPDHを内部コントロールとして使用した。各群の動物またはドナーの数（n）を図中に示す；例えば、図2Iに示すように、若年または老齢の初代hMPCのヒトドナーはn＝4、図S6A、S6C、およびS6Dに示すように、若年または老齢のカニクイザルはn＝8であった。図S7Hに示すように、CRISPRiシステムを用いてコントロールまたはsgMMTVを発現するレンチウイルスを関節腔に注入したn＝11匹のマウス；および図S7Kに示すように、ビヒクルを注入したn＝10匹のマウス、またはアバカビルを関節腔に注入したn＝8匹のマウスを得た。qRT-PCRに使用した全てのプライマーを表S5に示す。
マイクロベシクルからのウイルスRNAの単離
RNAは、QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）を用いて、同数の細胞からの140μLの小胞懸濁液から、製造者の説明書に従って抽出された。簡単に説明すると、サンプルをあらかじめ用意したバッファーAVLとキャリアRNAと一緒にインキュベートした。エタノールを加えた後、サンプルをQIAamp Miniカラムにロードした。洗浄・溶出後、溶出したサンプルをTURBO DNA-free Kit (Thermo Fisher Scientific)を用いてDNase Iで処理した。すなわち、20μLの溶出サンプル（ウイルスRNA）に2μLのDNase Iと2.4μLの反応バッファーを加え、37℃、30分間インキュベートした。その後、不活性化試薬を用いてDNase Iを不活性化し、10,000×g、1.5分間の遠心分離により除去した。回収した上清を70℃で10分間加熱し、残存するDNase Iを失活させた。
ドロップレットデジタルPCR (ddPCR)
マイクロベシクルから精製したウイルスRNAを、GoScript Reverse Transcription Systemを用い、メーカーの説明書に従ってcDNAに逆転写した。次に、cDNAテンプレート、プライマー、QX200 ddPCR EvaGreen Supermix（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を含む反応液20μLを、QX200液滴生成器（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を使用してDG8カートリッジで70μL QX200™液滴生成オイル for EvaGreen（Bio-Rad Laboratories, Inc.）に混合しました。この液滴を 96 ウエルプレートに移し、PX1™ PCR Plate Sealer (Bio-Rad Laboratories, Inc.) で密封した。サーマルサイクラー（Bio-Rad Laboratories, Inc.）でPCR増幅した後、サンプルをQX200液滴リーダー（Bio-Rad Laboratories, Inc.）にかけ、各グループの同じ数の細胞からの微小小胞におけるHERVKの絶対コピー数を分析した。 ddH2Oと老化hMPCからのcDNAはそれぞれ陰性と陽性対照として使用された。各グループについて3つの生物学的複製を行った（n = 3）。
ELISA法
ヒトIL6 ELISAアッセイでは、培地を回収し、0.2μmフィルターでろ過した後、製造元の指示に従って抗IL6抗体コートプレート（BioLegend）でインキュベートした。検出抗体、Avidin-HRP、新たに混合したTMB基質、停止液とインキュベートした後、Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) を用いて450 nmで測定した。IL6レベルは、対応する細胞数に対して正規化した。各グループについて3つの生物学的複製を行った（n = 3）。
HERVK-Env ELISAアッセイでは、まずコンディショニング液またはヒト血清を、それぞれCentricon Plus-70 (Millipore) またはAmicon Ultra-15 (Millipore) を用いて100倍または10倍に濃縮した。コンディショニング液またはヒト血清中のHERVK-Envタンパク質は、Human HERVK-Env Polyprotein ELISA Kit（CUSABIO）を用いて、製造者の説明書に従って検出された。簡単に言うと、100μLの濃縮培地または血清をコーティングされたプレートに加え、37℃で2時間インキュベートした。ビオチン-抗体、アビジン-HRP、新しく混合したTMB基質および停止液とともにインキュベートした後、Synergy H1マイクロプレートリーダーを用いて、450nmで測定した。調整培地中のHERVK-Envレベルは、対応する細胞数に対して正規化した。各グループについて、3つの生物学的複製を行った（n = 3）。ヒト血清中のHERVK-Envレベルも定量し、各群でn = 30人のドナーを用いた。
2'3'-cGAMP ELISAキット（Cayman）を、細胞中の2'3'-cGAMPのレベルを測定するために使用した。同数の細胞ライセート50μLをプレートにロードし、2'3'-cGAMP HRPトレーサーおよび2'3'-cGAMPポリクローナル抗血清とともに室温で2時間振盪インキュベーションを行った。TMB 基質と停止液でインキュベートした後、Synergy H1 マイクロプレートリーダーを使用して 450 nm で測定した。2'3'-cGAMP レベルは対応する細胞数で正規化した。各群について3回の生物学的複製を行った（n = 3）。
免疫蛍光染色、免疫組織化学染色および顕微鏡検査
免疫蛍光染色のために、カバースリップ（Thermo Fisher Scientific）上に播種した細胞をPBSで2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、PBS中の0.4％トリトンX-100で透過させ、10％ロバ血清でブロッキングした。カバースリップは一次抗体とブロッキングバッファー中で4℃、一晩インキュベートし、その後二次抗体と室温で1時間インキュベートした。核はHoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific)で標識した。HERVK-Envとβ-ガラクトシダーゼの共染色は、Cellular Senescence Detection Kit-SPiDER-βGal (DOJINDO Laboratories) を用いて行った。簡単に説明すると、カバースリップ上に播種した細胞をPBSで2回洗浄し、4%PFAで3分間固定した後、SPiDER-βGalとともに37℃で30分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄し、通常の手順でHERVK-Envの免疫蛍光染色を行った。画像は、Leica SP5共焦点顕微鏡またはZEISS共焦点LSM900で撮影した。画像のZスタック3D再構成は、IMARISを用いて行った。Ki67陽性細胞の定量化には、各群に3つの生物学的複製を設定した（n = 3）。各複製で100個以上の細胞が定量された。各群のHERVK-Env蛍光強度の定量化は、3つの生物学的複製から100個以上の細胞から行った。
組織切片の免疫組織化学染色は、DAB染色キット（ZSGB-BIO）を用いて、製造者の指示書に従って行った。簡単に言うと、キシレンおよびエタノールを用いて脱パラフィンした切片を、10mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH = 6.0）を用いて抗原を回収する前に、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために3％H2O2溶液とインキュベートした。その後、切片を透過処理し、ブロックし、一次抗体と4℃で一晩、二次抗体と1時間インキュベートし、DAB基質溶液とHematoxylinで染色し、脱水し、マウントした。背景を除去するため、切片をPBSで5回、各回5分間洗浄した。画像はLEICA Aperio CS2 LSM900で撮影した。ホワイトバランスは画像を撮影する前に調整した。陽性細胞の比率を定量化した。各群の動物又はドナーの数（n）は、図中に示される；例えば、図6Cに示されるように、n＝5、7又は8匹の若い又は老化したカニクイザル；図6Fに示されるように、WT及びHGPSカニクイザルの二つの切片からのn＝5、10又は20フィールド；図6Hに示されるようにn＝5又は6人の若い又は老化したヒト皮膚ドナーの数である。図7Aに示すように、n＝8匹の若齢または高齢マウス；図S7Cに示すように、n＝5、6または8匹の若齢または高齢マウス；図S7Dに示すように、n＝7または10匹の若齢または高齢マウス；図S7Eに示すように、n＝8または11匹の若齢または高齢マウス；CRISPRiシステムを用いてコントロールまたはsgMMTVを発現するレンチウイルスを関節腔に注入した、図7Cに示すようにn＝12匹マウス。n＝10または11匹のマウスに、CRISPRiシステムを用いてコントロールまたはsgMMTVを発現するレンチウイルスを、図7Dに示すように関節腔に注射した；n＝11匹のマウスに、CRISPRiシステムを用いてコントロールまたはsgMMTVを発現するレンチウイルスを、図7Eに示すように関節腔に注射した；n＝11または12のマウスに、CRISPRiシステムを用いてコントロールまたはsgMMTVを発現するレンチウイルスを、図S7Gに示すように関節腔に注射した。図7Iに示すように、ビヒクルまたはアバカビルを関節腔に注入したn＝8または9匹のマウス；図7Jに示すように、ビヒクルまたはアバカビルを関節腔に注入したn＝7または8匹のマウス；および図S7Jに示すように、ビヒクルまたはアバカビルを関節腔に注入したn＝8または10匹のマウスを用意した。
サフラニン-O／ファストグリーン染色は、Servicebio Technology Co. (中国、北京)によって行われた。簡単に言えば、切片を60℃で一晩焼き、室温で20〜30分間冷却した後、70％エタノールで脱パラフィン化および水和した。その後，Weigertの鉄ヘマトキシリンで7分間，0.08% Fast Greenで3分間染色し，1.0%酢酸で10秒間すすぎ， 0.1% Safranin-Oで5分間染色し，0.5%酢酸と蒸留水ですすぎ，切片をマウントした．画像はLEICA Aperio CS2 LSM900で撮影した。少なくとも6箇所の関節軟骨の平均値を各マウスの関節軟骨の厚みとした。各群のマウス数は図中に示されており、例えば、図S7Eに示すように、n＝8匹の若齢マウスまたはn＝11匹の高齢マウス、図7Fに示すように、CRISPRiシステムを用いてコントロールまたはsgMMTVを発現するレンチウイルスを関節腔に注入したn＝12匹のマウス、図7Kに示すように、ビークルを注入したn＝10匹またはAbacavirを関節腔に注入したn＝8匹が示されている。
免疫蛍光染色および免疫組織化学染色に使用した抗体は、主要リソース表に記載されている。
(sm)RNA/DNA-FISHについて
RNA-FISH は、QuantiGene® ViewRNA ISH Cell Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。簡単に説明すると，カバースリップ（Thermo Fisher Scientific）上に播種した細胞を新鮮な4％ホルムアルデヒド溶液で固定し，Detergent Solution QCで透過処理し，Protease QCで消化した．Probe HERVK Alexa Fluor 488をProbe Set Diluent QFで希釈し、HB-1000 Hybridizer (Gene Company Limited) で41 + 1℃、3時間かけてウェルに添加した。カバースリップにWorking Pre-Amplifier Mix Solutionを30分、Working Amplifier Mix Solutionを30分、Working Label Probe Mix Solutionを30分、40 + 1℃でHB-1000 Hybridizerでインキュベートし、各ステップでPBS洗浄をした。核はDAPIで標識し、スライドをマウントしてLeica SP5共焦点顕微鏡でイメージングを行った。HERVK RNA-FISH蛍光強度は、3つの生物学的複製物から150以上の細胞から定量された。
細胞質におけるHERVK mRNAとDNAの検出は、単一分子（sm）-FISHによって行われた。HERVKに対するプローブの標的配列は、検出特異性を高めるためにペアに分割され、HERVKに対するプローブペアは、Spatial FISH, Co, Ltd.によって設計された。次に，細胞をDEPC処理したH2O中の0.2 M HClで10分間，DEPC処理したPBS中の5 μg/mL protein kinase Kで5分間それぞれ処理した．mRNAの検出のために、細胞をハイブリダイゼーションバッファー（10％脱イオン化ホルムアミド、2×SSC、10％デキストラン硫酸、2mM VRC）中のターゲティングプローブ対（各プローブについて10μM）とともに42℃で一晩、直接インキュベートした。HERVK DNAの検出のために、細胞を、37℃で1時間、2×SSC中の70％ホルムアミドで72℃で10分間、予め冷却したエタノールグラジエント（80％、90％、100％）で各グラジエントを1分間、RNase A（100 μg/mL in 2 × SSC）と連続して処理し、次に、ターゲティングプローブ対（各プローブについて10μM）をハイブリダイゼーションバッファ中で42℃にて一晩インキュベーションをした。洗浄バッファー（2×SSC, 30%ホルムアミド, 0.1%Triton-X 100, 2 mM VRC）で3回洗浄後，増幅プローブ（Spatial FISH, Co., Ltd.），蛍光プローブ（SFFP-001，Spatial FISH, Co., Ltd）を用いてHERVK mRNAおよびDNAの1分子検出を実現させた．最後に、細胞をDAPIでカウンターステインし、Leica SP5共焦点顕微鏡またはN-STORMで画像化した。細胞質内のHERVK DNAの蛍光スポットの相対数は、各サンプルの10以上の細胞から定量された。プローブ対の標的配列を表S5に示す。
(免疫-）透過型電子顕微鏡（TEM）
細胞をペレット化し、リン酸緩衝液（PB）（0.1M、pH = 7.4）を加えた 2.5%（vol/vol）グルタルアルデヒドで室温で 20 分間、その後 4°C で一晩固定した。ルーチンの重金属染色を実施した。簡単に言えば，細胞をPB中1% (wt/vol) 四酸化オスミウムで4℃，2時間ポスト固定し，段階的なエタノール系列を経て純粋アセトンに脱水し，段階的なアセトンと樹脂の混合物に浸潤し，純粋樹脂中に1.5% BDMAで包埋した。超薄切片（厚さ70nm）をミクロトーム（Leica EM UC6）で切り出し，酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色を行った．Immuno-TEMでは、35mmシャーレ（CORNING）に播種した細胞を、37℃のセルインキュベーターで温めた培養液中の2%ホルムアルデヒドで10分間、室温で1時間、4℃で一晩前固定し、1%ホルムアルデヒドに移し替えた。試料をエタノール勾配で脱水し，LR Gold樹脂勾配で浸潤させ，開始剤を含むLR Gold樹脂に包埋した。その後，Leica AFS2 を用いて，-20℃で 24 時間紫外線重合し，Leica EM UC7 を用いて切片化した．染色には、切片をPB（Jackson ImmunoResearch）中の2%BSAでブロックし、抗HERVK-Env抗体と室温で2時間インキュベートし、0.1%の低温新鮮ゼラチンを含むPBバッファで2分間5回洗浄し、6nm金ラベル抗マウス二次抗体と室温で1時間インキュベートしてからddH2O中1%のグルタルアルデヒドで固定した。ddH2Oで洗浄後，切片を室温で2%酢酸ウラニルで30分間染色し，TEM Spirit 120 kV（FEI Tecnai Spirit 120 kV）を用いて画像処理した．各群40個以上の細胞から、細胞あたりの金粒子で標識されたRVLPまたはHERVK RVLPの数を定量した。
プラスミド構築
HERVK44,45またはSTINGノックダウンベクターを作製するために、8特定のshRNAをレンチウイルスベクターpLVTHM (Addgene, #12247)のMluI/ClI部位にクローン化した。内因性HERVKを活性化するために、非標的コントロールsgRNA (sgNTC)104 またはHERVK LTRを標的とするsgRNA (sgHERVK)42 をESP3Iサイトを介してlentiSAM v2 vector (Addgene, #75112) にクローニングし、lentiMPH v2 (Addgene, #89308) とhMPCsに共導入をした。dCas9-KRABベースのシステム（CRISPRi-sgHERVK）およびdCas9-KRAB発現空バックボーン（CRISPRi-control）を用いた内在性HERVKを抑制する構築物はDidier Tronoの研究室（スイス、ローザンヌ、エコールポリテクニックフェデラルデローザンヌ（EPFL））からの親切な贈り物である43)我々はHERVK CRISPRaおよびCRISPRiシステムに用いられるsgRNAの標的特異性について検討した。まず、hg19アセンブリをもとにRepeatMaskerで注釈された繰り返し要素のゲノム上の位置を求め、LTR5_Hs（HERVKのプロモーター）に対する繰り返し要素のBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）データベースを構築した。sgRNAの配列を構築したLTR5_Hsデータベースと比較することにより、全LTR5_Hs要素の約30%が良好にマッチし（期待値［E値］＜1×10-5）、CRISPRaおよびCRISPRi sgRNAの標的となりうることがわかった。これは、最近発表された研究でHERVK転写活性化や抑制のために設計したsgRNAの標的効率と非常に一致した105，106．内在性MMTVを抑制するために、MMTVのLTR領域（GenBank: AB049193.1）を標的とするsgRNAをhttp://chopchop.cbu.uib.no/、BsmB1サイトを介してdCas9-KRAB発現空のバックボーンにクローニングした（CRISPRi-sgMMTV）。MMTVに対するsgRNAの特異性を調べるため、まずマウスアセンブリ（mm10版）をもとにRepeatMaskerで注釈した内在性MMTVのゲノム位置を取得し、完全長となりうるMMTVを3つ見いだした。sgRNAの配列とマウスLTR/ERVエレメントを比較した結果、設計したCRISPRi sgRNAは3つの全長MMTVのうち2つを標的とする高い可能性を示した（E値<0.05）。shRNAまたはsgRNAの標的配列を表S5に示す。
HERVK RVLPを産生するプラスミドを構築するために、完全長HERVKをN末端とC末端にそれぞれNheIとApaIサイトを持つ以前に発表された配列に従って合成した57，107。pEGFP-N3のKpnIサイトを高速突然変異誘発システム（トランスジェン）を用いて破壊し、pEGFP-N3-KpnI'と名付けた。HERVKはNheI/ApaIサイトを介してpEGFP-N3-KpnI'にクローニングされ、その発現はベクターのCMVプロモーターで駆動された。注目すべきは、HERVKの3'-LTRのストップシグナルのために、ベクターバックボーンのGFPはプリシンプルに発現しないことである。別のCMV-EGFPカセットをpEGFP-C1からPCR増幅し、HERVKのEnv領域内のpEGFP-N3-HERVKのKpnI部位に挿入したが、これは以前に発表した研究に従って設計した58,108)。HERVKウイルスタンパク質の発現を高め、RVLP産生を改善するために、58,108 HERVK発現プラスミドにはgag-pro-pol、 envあるいはrev断片があり、合成したHERVKを鋳型としてPCR増幅により作り、Env断片の場合はNheI/ApIサイトを介して、gag-pro-polとrev断片ではKpnI/BamHIサイトを介してpEGFP-N3ベクタにクローニングされた。なお、rev断片を増幅するために、リバースプライマーはC末端の63ヌクレオチドを追加でカバーするように設計されている。原理的には、Env領域内に新しいCMV-EGFPカセットを持つLTRを含む完全長HERVKはRVLPにパッケージすることができるが、他の断片はできない。
CRISPRaおよびCRISPRiに用いたsgRNAの配列、およびプラスミド構築に用いたプライマーを、表S5に示す。
HERVK RVLPおよびレンチウイルスの生産
HERVK RVLPの生産および精製は、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用いて全長HERVK構築物でHEK293T細胞をトランスフェクトすることにより行った。HERVKのウイルスタンパク質発現を高め、RVLPの生産とトランスフェクション能力を向上させるために、CMV-EGFPカセットを有する完全長HERVKを、他のHERVK発現プラスミド（gag-pro-pol、 env及び revをコードする）及びVSGプラスミドと共にHEK293T細胞へ共導入した。HERVK RVLPを含む上清をトランスフェクション後48時間と72時間に採取し、0.2μmのフィルターでろ過し、10万×gで2時間超遠心分離することにより濃縮し、空のベクターをトランスフェクトしたHEK293T細胞の培地から同じ手順でビークルを精製した。
70 HEK293T 細胞に、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent を用いて、パッケージングプラスミド pMD2.G (Addgene, #12260) および psPAX2 (Addgene, #12259) と共にレンチウイルスベクターをトランスフェクションし、レンチウイルスのパッケージを行った。トランスフェクション後48時間および72時間にレンチウイルスを含む上清を採取し、0.2μmフィルターでろ過し、19,400rpmで2.5時間超遠心して濃縮し、ウイルスペレットを懸濁してウイルス力価を評価した。ウイルスの精製は、生物学的安全レベル（BSL）-2実験室の安全規則に基づいて行った。
細胞処理
5-AZA 処理は、既報に従って行った。46,47 手短に言えば、WT hMPCs（P6）を播種し（処理後の通過0（P0）として記録）、500 ng/μL 5-AZA（ddH2O に溶解）で 1 回通過（約 4-6 日）処置した。5-AZAを添加した培地は2日おきに交換した。その後、細胞を継代し、新鮮な培地で培養した。P2後処理（5-AZA処理から6日後）で、Ki67免疫蛍光染色、SA-β-gal活性分析、RNA/DNA抽出のために細胞を採取した。
アバカビル処理アッセイは、以前の研究に記載されているように実施された53。簡潔には、HGPS hMPCs（P7）は、異なる濃度（0.2μM、1μMおよび10μM）のアバカビルで2継代にわたり処理された。処理中、細胞は2日ごとに培養液を交換し、異なる濃度（0.2μM、1μM、10μM）のAbacavirを添加した培地で培養した。細胞密度や形態から、最低濃度（0.2μM）のAbacavirによる処理がHGPS hMPCの早発性老化を緩和するのに最適な効果を示すことがわかりました。そこで、以下の実験では、アバカビル処理の最終濃度として0.2μΜを使用した。処理後、細胞を回収し、Ki67免疫蛍光染色、SA-β-gal活性分析およびRNA/DNA抽出を行った。
HERVK RVLPによる感染のために、WT hMPC（P6）を播種し（P0後処理）、ポリブレン（Sigma-Aldrich）の存在下で24時間HERVK RVLPとともにインキュベートした。HERVK RVLPの感染感度を高めるために、次にhMPCを1,200×gで2.5時間遠心分離に付し、2継代の培養後、細胞をKi67免疫蛍光染色、SA-βgal活性分析およびRNA／DNA抽出のために処理した。HERVK RVLPをブロックするために、IgGまたは抗HERVK-Envで37℃インキュベーターで30分間前処理した。
レンチウイルス導入のために、WT hMPC（P6）、HGPSまたはWS hMPC（P5）を播種し（処理後のP0）、ポリブレン存在下でレンチウイルスとともに24時間インキュベートした。2回の継代後、細胞を、Ki67免疫蛍光染色、SA-βgal活性分析およびRNA/DNA抽出のために処理した。
コンディショニングメディウム処理には、指示された細胞培養から採取した50％の培地と50％の新鮮な培地を混合し、ポリブレン（Sigma-Aldrich）の存在下で、2日ごとに培地を交換しながら、初期継代のWT hMPC（P5）の培養に使用した。SC-CM（HGPS（P7）、WS（P7）、WT（LP、P14））もポリブレンなしで若齢hMPCの老化を促進したが、効果が現れるまでに長い時間を要した。細胞は継代した後、Ki67免疫蛍光染色、SA-β-gal活性分析、RNA/DNA抽出のために回収した。若い細胞の表面に付着している調整液からのRVLPを検出するために、細胞を調整液で12時間処理し、TEM分析に供した。
若年者（18-25歳、n = 5）または老齢者（65-80歳、n = 5）のプールしたヒト血清で培養するために、若年ドナーの歯肉から分離した初代hMPCを通常のhMPC培養液で24時間前培養した。PBSで3回洗浄後、10％ヒト血清含有培地で2継代培養し、さらに分析のためにhMPCを回収した。
クローン拡大アッセイ
ゼラチン（シグマ社製）をプレコートした6ウェルプレート（コーニング社製）の1ウェルに5000個の細胞を播種し、およそ10日間培養した。その後、細胞を4% PFAで30分間固定し、10% Crystal Violetで30分間染色した。相対的な細胞積分密度は、ImageJ ソフトウェアを使用して計算された。各グループについて3つの生物学的複製を行った（n = 3）。
SA-β-gal 染色
SA-β-gal 染色は、以前に記載されたように行った。33,109 簡単に言えば、細胞を 2%(w/v)ホルムアルデヒドと 0.2%(w/v)グルタルアルデヒドを含むバッファで 5分間固定し、1 mg/mL X-gal を含む染色バッファと 37℃で一晩インキュベートした。光学顕微鏡を用いてSA-β-gal染色した細胞を観察し、ImageJソフトウェアを用いてSA-β-gal陽性細胞のパーセンテージを算出した。各グループについて3つの生物学的複製を行う（n = 3）。各複製で100個以上の細胞を定量化した。
ChIP-qPCR
ChIP-qPCRは、いくつかのマイナーな修正を加えて、以前に記載された110のように実施した。簡単に言うと、細胞をPBS中の1％ホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、次に125mMグリシンによってクエンチした。次に、細胞を氷上で10分間溶解し、Covaris S220 Focused-ultrasonicatorを使用して超音波処理に供した。回収した上清を、2.3μgの指示抗体またはIgGを予め結合したDynabeads Protein A (Thermo Fisher Scientific)と共に4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、サンプルをプロテイナーゼK（New England Biolabs）で消化し、サーモミキサー上で68℃、2時間逆架橋した。DNAはフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコールを用いて抽出し、qPCR解析に供した。各群について3回の生物学的複製を行った（n = 3）。各生物学的複製に対して、4つの技術的複製を行った。cGASの免疫沈降のために、固定11後に抽出した細胞の細胞質画分を、抗cGAS抗体-またはIgG-結合Dynabeads Protein Aと4℃で一晩インキュベートした。細胞質画分には原則的に存在しない5S rDNAのqPCR解析により、核ゲノム汚染の排除を行った。各グループについて4回の技術的複製を行った（n = 4）。ChIP-qPCRデータは、fold enrichmentとして表示される。簡単に言うと、ネガティブコントロール（IgG）サンプルには「1」の値が与えられ、その後、他のすべては、このネガティブコントロールサンプルの倍数変化として正規化されることになる。ChIP-qPCRに使用したプライマーを表S5に示す。
鎖特異的RNA配列決定(RNA-seq)
鎖特異的RNA-seqライブラリーを調製し、配列決定はNovogene Bioinformatics Technology Co. Ltd.によって調製された。簡単に説明すると、TRIzol試薬を用いて1×106個の細胞から2重ごとにtotal RNAを抽出し、ゲノムDNAを除去した。RNA濃度はQubit® RNA Assay KitとQubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。RNAサンプルの調製とライブラリ構築には、1サンプルあたり合計3μgのRNAを使用した。その後、Epicentre Ribo-Zero™ rRNA Removal Kit (Epicentre) を用いてリボソームRNAを除去し、エタノール沈殿によりrRNAのない残渣を廃棄した。NEBNext® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit for Illumina® (New England Biolabs) を用いて、メーカーの説明書に従ってシーケンス用ライブラリーを調製した。High-throughput sequencingはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで行った。
RNA-seqデータ処理
RNA-seqデータの処理パイプラインは、以前に報告されている71,101。ペアエンド生リードをTrimGalore (version 0.4.5) (Babraham Bioinformatics) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) でトリミングし、STAR (version 2.7.1a) または hisat2 (version 2.0.4) を用いてUCSC genome browser databaseから得たヒト (Homo sapiens) hg19またはカニクイザル (Macaca Fascicularis) MacFas5.0 参照ゲノムへマップした。 92,95 高品質のマッピングリード（マッピング品質スコア20以上）を用い、HTSeq (version 0.11.0) または featureCounts (version 1.6.4) によりリードをカウントした。97 hMPCsについては、DESeq2 R package (version 1.29.8) によりカットオフ「｜log2 (fold change)| > 0.5 and adjusted p value < 0.05」で差分発現遺伝子 (DEGs) を算出した。SASP遺伝子は先行研究から入手した。9 遺伝子セット濃縮解析（GSEA）は、GSEAアプリケーション（バージョン2.2.4）により実施した90。
繰り返し配列の発現量解析
反復性エレメントの発現量を評価するために、STARソフトウェア（バージョン2.7.9a）を用いて、"--outFilterType BySJout --winAnchorMultimapNmax 100 --outFilterMultimapNmax 100 --outFilterMismatchNoverLmax 0. "をパラメーターとしてクリーンリードをヒト（Homo sapiens）hg19参照ゲノムにマップした。 95 トランスポゾンの定量と差分解析は、TEtranscriptsソフトウェア（バージョン2.2.1）を用いて計算した96 。TEtranscriptsは、遺伝子量とトランスポゾン量を同時にカウントし、差分解析にはRパッケージDESeq2（バージョン1.26.0）を利用した。そして、「｜log2(fold change)| > 0.2 and FDR < 0.05」のカットオフで、差次的に発現する反復要素を計算した。繰り返し要素のクラスはRepeatMasker内でアノテーションされ、LTR、LINE、SINE、DNA（DNAトランスポゾンとしても知られている）、サテライト、およびいくつかのRNA繰り返しに分類される。
全ゲノムバイサルファイトシーケンス（WGBS）ライブラリ構築とシーケンシング
DNeasy Blood & Tissue Kits (QIAGEN)を用いて2×106個の細胞からゲノムDNAを抽出し、ソニケーターを用いて100-300 bpに切断した後、バイサルファイト処理、塩基配列決定、塩基配列決定を行った。その後、バイサルファイト処理、ライブラリ作成、品質管理、シークエンスは、Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd.に依頼した。
WGBSデータ処理
WGBSのデータ解析は、既報の通り行った。91 次に、クリーニングしたリードを、bsmap (version 2.90) を用い、"-v 0.1 -g 1 -R -u" のパラメータでUCSC genome browser databaseから得たヒト (Homo sapiens) hg19 reference genomeにマッピングした98。メチル化レベルの検出精度を確保するため、各CpG部位の順鎖および逆鎖リードを結合し、深さが5以上のCpG部位のみを下流の解析に残した。反復性エレメント座位における相対的なCpG DNAメチル化レベルを算出するため、RepeatMaskerで注釈された各反復性エレメントのゲノム座位をUCSCゲノムブラウザから取得した。そして、RepeatMaskerで注釈された各反復要素の平均CpG DNAメチル化レベルを算出し、R（バージョン4.0.2）のggpubr Rパッケージ（バージョン0.4.0）により統計解析を実施した。
定量化・統計解析
すべてのデータはPRISMバージョン8ソフトウェア（GraphPad Software）を用いて統計解析した。結果は、平均値±SEMで示した。p値＜0.05は統計的に有意（＊）、p値＜0.01およびp値＜0.001は高度に統計的に有意（＊＊および＊＊＊）とした。
データおよびコードの利用可能性
すべてのデータセットは、National Genomics Data CenterのGenome Sequence Archiveに、示されたとおりのアクセッション番号で寄託されている。早発性老化およびRS hMPCsのRNA-seq生データ。CRA003282。早発性老化細胞およびRS hMPCsのWGBS生データ。HRA001144.39 ビヒクルまたは5-AZA処理hMPCsのWGBSの生データ。HRA001879. CRISPRaシステムを用いてHERVKまたはNTCを標的とするsgRNAを含むレンチウイルスを導入した後のWT hMPCs（P6）に対する生のRNA-seqデータ。CRA003283。若齢および老齢のカニクイザルの肝組織のRNA-seq生データ。CRA002965.66 若年および老齢のカニクイザルの肺組織のRNA-seq生データ。CRA002810.88 この研究で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、リクエストに応じてリード・コンタクトから入手できる。
謝辞
TEM解析については中国科学院生物物理研究所生物画像センター（CBI）に、TEM試料作製についてはC. Pengに、TEM操作についてはL. Zhangに、それぞれ感謝の意を表したい。また、イムノTEM試料作製にご協力いただいたY. Li（清華大学）にも感謝いたします。FISH実験にご協力いただいたZ. Zhang、Y. Tao (Spatial FISH, Co., Ltd)、イメージングスキャンにご協力いただいたS. Li、J. Hao (the Center of Imaging facility of the Institute of Zoology and Institute of Biophysics [Chinese Academy of Sciences]) に感謝の意を表する。また、G. Pei博士の洞察に富んだコメントに感謝したい。動物実験にご協力いただいたJ. Jia、L. Huang、W. Wang、事務局でご協力いただいたL. Bai、Q. Chu、L. Tian、 J. Lu、 Y. Yang、 X. Li、 J. Chen、 R. Bai、 X. Jingに感謝の意を表します。また、本研究を支援していただいた中国霊長類生物医学研究連合（CPBRA）、中国加齢バイオマーカーコンソーシアム（ABC）に感謝します。本研究は、中国国家重点研究開発プログラム（2020YFA0804000）、中国科学院戦略的重点研究プログラム（XDA16000000）、中国国家重点研究開発プログラム（2022YFA1103700, 2018YFC2000100、2018YFA0107203、2020YFA0112200、2019YFA0802202、2020YFA0803401、2021YFF1201005、2022YFA1103800、2019YFA0110100）、中国国立自然科学基金（81921006, 82125011、92149301、92168201、91949209、92049304、92049116、32121001、82192863、82122024、82071588、31970597、81861168034、31900524、32100937、32000510、32200610、82201727)です。STI2030-主要プロジェクト（2021ZD0202400）、CAS若手基礎研究プロジェクト（YSBR-076およびYSBR-012）、北京自然科学基金プログラム（Z190019）、K. C. Wong Education Foundation (GJTD-2019-06, GJTD-2019-08)、Pilot Project for Public Welfare Development and Reform of Beijing-affiliated Medical Research Institutes (11000022T000000461062), the Youth Innovation Promotion Association of CAS (E1CAZW0401).All Rights Reserved, CAS青年革新推進協会（E1CAZW0401）、CAST青年エリート科学者支援プログラム（YESS20200012）、中国科学院情報化計画（CAS-WX2021SF-0301、CAS-WX2022SDC-XK14、CAS-WX2021SF-0101）、テンセント財団（2021-1045）などがあります。
著者の貢献
G.-H.L.、J.Q.、W.Z.が研究の構想を練り、実験全般を監修した。X.L.は細胞培養を行い、ウェスタンブロッティング、qRT-PCR、ddPCR、ChIP-qPCR、免疫蛍光染色などの機能・機構解析に関連する実験を実施した。Z.L.はバイオインフォマティクス解析を行った。Z.W.は、細胞培養とシークエンスライブラリーの構築を行った。J.R.は原稿執筆を行った。L.S.はヒト血清の試料を提供した。Y.F.さんは、カニクイザルおよびヒトの免疫組織化学染色を行った。Y.N.はHGPSカニクイザルの試料を提供した。G.C.とL.L.はsmRNA/DNA-FISHを実施した。X.J.は線維芽細胞の培養と機能解析を行った。Q.J., Y.E.Z., S.T., Yingao Caiはバイオインフォマティクス解析に協力した。B.Z.は、免疫組織化学染色の統計解析を行った。C.W.は細胞培養を行った。Q.W.は模式図の作図を手伝った。K.Y.はベクターの構築を手伝った。W.L.は動物実験のオーガナイズを行った。A.Z.はウイルスの精製を手伝った。W.J., Q.Z., J.C.I.B., C.R.E., F.L., F.T. はプロジェクトの監督に協力した。G.-H.L., J.Q., W.Z., J.R., X.L., Z.L., Z.W., Z.J., Yusheng Cai, S.W., M.S. は原稿執筆，校閲，編集を行った。また、全著者が原稿の査読を行った。
利害関係者の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
補足情報
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表S1. 図1に関連する、複製および早発性老化hMPCにおける差次的に発現する反復要素
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表S2. 本研究で使用したサンプル情報、図2および図6関連
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表S3. 複製および早発性老化hMPCにおける差次的発現遺伝子、図4関連
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表S4. CRISPR活性化システム（CRISPRa）を用いて非標的コントロールsgRNA（sgNTC）またはHERVKを標的とするsgRNA（sgHERVK）を発現するレンチウイルスを導入したWT hMPCs（P6）における差次発現遺伝子、図4と関連付けられます。
.xlsxのダウンロード (.02 MB)
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表S5. 本研究で使用したプライマーとプローブのリスト、STAR Methods関連
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記事情報
出版履歴
発行日 2023年1月6日
受理されました。2022年12月8日
改訂版受理 2022年10月13日
受理：2022年10月13日 2022年2月24日
出版時期
インプレス、ジャーナル・プリプルーフ
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.017

著作権について
© 2022 The Author(s). 発行：エルゼビア株式会社
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図
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図のサムネイル gr1
図1HERVKのエピジェネティックな抑制が老化hMPCsで観察される。
図1サムネイルfigs1
図S1図1に関連した老化hMPCにおけるHERVKの発現の増加
図サムネイルgr2
図2HERVKウイルスタンパク質とRVLPが老化細胞で増加している。
図2サムネイルfigs2
図2老化した細胞におけるHERVKプロウイルス成分の増加、図2に関連して
図サムネイルfigs3
図S3HERVKのアップレギュレーションはhMPCの老化を促進する、図3に関連する。
図3サムネイルgr3
図3HERVKの増加は老化を促進する。
サムネイルgr4
図4HERVKの増加は、自然免疫経路を活性化する。
図サムネイル Figs4
図S4自然免疫応答が老化細胞で活性化する（図4と関連あり
図サムネイルgr5
図5老化細胞から放出されるHERVK RVLPsは若い細胞の老化を誘導する
図5サムネイルfigs5
図5老化細胞から放出されたHERVKが若い細胞の老化を誘導する、図5と関連する図
図5.図5と関連する図
図S6内因性レトロウイルスの活性化と自然免疫経路のin vivo解析（図6関連
図サムネイルgr6
図6老化のバイオマーカーとしての内在性レトロウイルスの活性化
図サムネイル figs7
図S7内因性レトロウイルスの抑制によるマウスの組織老化の緩和、図7関連
図サムネイル gr7
図7内因性レトロウイルスを標的とした組織の老化の緩和

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